Presented By นายอนุสรณ์ ดิษฐสวรรค์ รหัส 51312333

การวเคราะหหาแอมเฟตามนในปสสาวะคนโดยใช HS- SPME และ GC

Determination of amphetamine in human urine

by headspace solid-phase microextraction and gas

chromatography

Presented By นายอนสรณ ดษฐสวรรค รหส 5

1312333

สารเสพตด AMP = Amphetamine MA = Methamphetamine MDA= 3,4-methylenediamine

amphetamine MDMA= 3,4-methylenediamine

methamphetamine MDEA= 3,4-methylenediamine

ethylamphetamine

กฎหมายยาเสพตด และ การออกฤทธ

ยาเสพตดใหโทษ (ตาม พ.ร.บ.ยาเสพตด 2522)

- ประเภทท 1 ยาเสพตดใหโทษชนดรายแรง เชน แอมเฟตามน , เมทแอมเฟตามน , ยาอ สารออกฤทธ

อนพนธของแอมเฟตามนส ( MDA MDMA MDE )

- เปนกลมออกฤทธกระตนระบบประสาทสวนกลาง คอ กระตนหรอ เพมการทำางานตอระบบประสาทสวนกลาง มฤทธทำาใหหวใจเตนเรว ความดนโลหตสง กระปรกระเปรา

วธการวเคราะห

•Headspace (HS)•Solid-phase microextraction (SPME)

•Gas Chromatography ( GC )

Headspace (HS) การนำาเอาไอของสารตวอยางทอยในชองวาง

H eadspace ไปวเคราะหหาองคประกอบตาง ๆ  โดยเทคนคแกสโครมาโตกราฟ  

วธ Headspace ตวอยางทเปนของแขง ของเหลว หรอ แกส จะถกใสใน vial และปดฝา

สนท หลงจากนนจงอน vial เพอทำาใหสารประกอบทระเหยไดแยกออกจากตวอยางในรป

ของแกสไปอยในชน headspace ซงอยเหนอชน ของแขงหรอของเหลว ตวอยางทเปนแกสจะเขาไป

อยในชน headspace มากนอยแคไหนขนอยกบ คา partition coefficient ของสารแตละชนด

ใชในการวเคราะหหาสารระเหยงายและกงระเหยในสารและ

ของเหลวทางชววทยา เชน สารเสพตด ยาลดอาการเศราซม สเตย

รอยด แอลกอฮอล ยาแกปวด เปนตน

SPME(Solid-phase

microextraction)

SPMEสาร polymer ท coated

บน silica fiber จะทำาหนาท absorb สารตวอยางทเปน Volatile Compounds ใน

ขวดเกบตวอยาง แลวนำา fiber ท absorb สารตวอยางแลว

มาฉดใน injector port ของ GC หรอ - GC MS

สาร polymer ท coatedบน fiber จะแตกตางกนโดยขนอยกบ สารตวอยางทเรา

ตองการวเคราะห

ขอดของการใช SPMEใชงาย

คาใชจายตำา ไมตองใชตวทำาละลายในการสกด

ใชไดกบสารตวอยาง ทมคณสมบตเปนสารทระเหยได SPME ยงสามารถใชรวมกบเทคนค Liquid Chromatography ( LC )

Gas Chromatography ( GC )ทำาหนาทในการแยกองคประกอบของสารทสามารถระเหยกลายเปนไอ (Volatile organic compounds)ไดเมอ

ถกความรอน กลไกทใชในการแยกองคประกอบตางๆ ในสารตวอยางอาศยหลกของความชอบทแตกตางกนขององคประกอบในตวอยางทมตอเฟส 2 เฟส คอ Stationary

phase และ Mobile phase

ดเทคเตอรทใชในการตรวจ สารประกอบอนทรย ประกอบดวย

แกสไฮโดรเจนจะถกจดใหตดไฟ ดวย heater ไฟฟาทอยใกลๆ กบ

Flame jet

แกสพาและสารตวอยางทออก จากคอลมนจะเขาสเปลวไฟ ทำาให

สารเกดไอออนไนเซชน ไดเปน อเลกตรอนจะวงไปยง Flame jet

ไอออนบวกจะเคลอนทไปยงอเลกโท รด สญญาณทเกดถกสงไปยง อ

เลกโทรมเตอร และบนทกสญญาณดวยเครองบนทกโครมาโทแกรม

Flame ionization detector (FID)

Introductionการศกษาของการทดลองใช SPME ในชวง 10 ป

ทผานมาเปนทยอมรบกนวา SPME มสมรรถนะสงในการเตรยมตวอยางโดยเรมพฒนาขนครงแรกใน

ป ค.ศ.1989 มการวเคราะหสารโมเลกลใหญในตวอยางชวภาพทหลากหลาย เชน ปสสาวะ เลอด

และเสนผม

การศกษางานวจยในครงนประเมนและหาปจจยบางตวทมผลตอคา recovery เพอนำาไปในการสกด

แอมเฟตามนจากปสสาวะโดย HS-SPME

สารเคมทใชในการทดลอง

สารเคม ( Methanol , K2CO3 , NaCl และKOH ) สารละลาย AMP , MA , MDA , MDMA และMDEA จาก United Nations International Drug Control Programme

- เตรยมในเมทานอลทความเขมขน062. , 0.65 , 0.69 , 0.71 และ 072 mg/ml ตามลำาดบ

อปกรณสำาหรบการทดลอง

อปกรณ SPME และไฟเบอร100 µm polydimethylsiloxane

( 100 µm PDMS) สำาหรบสาร Volatiles

ตวอยางปสสาวะทปราศจากยา เกบจากผชายสขภาพด สำาหรบเตรยมสารมาตรฐานในปสสาวะและปสสาวะ

ควบคม

ขวดสกดตวอยาง เปนขวดแกวปรมาตร 9ml พรอมฝาปดแบบยางซลโคน และฝาอลมเนยมสำาหรบปดผนก

สภาวะของเครอง Gas Chromatography ( GC )

การวเคราะหใชเครอง GC 8000 Top ของ ThermoQuest Italy

คอลมนชนด AT-5 ขนาด30m .x 0.25m. I.D. ซงเปน (ความหนาของฟลม 025. µm)

ตวตรวจวด FID แกสตวพาใชฮเลยม ทอตราการไหล 1 ml/min.

อณหภมสำาหรบแยกสาร เรมตน 40ºc เปนเวลา 1 นาท และเพมขน 220ºc ไปจนถง 280ºc ทอตรา 20ºc/นาท และคงทเปนเวลา 5 นาท

วเคราะหดวยโปรแกรม C-R6A Chromatopac

การเตรยมตวอยางดวย SPMEนำาขวดแกวสำาหรบสกด ชงเกลอใสลงไปในขวด

ตามดวยตวอยางปสสาวะและรบปดผนกฝาทนท ใหความรอนทอณหภมเหมาะสมตามเวลาทกำาหนด

นำาไปฉดเขาเครอง GC โดยสารถกดดซบเปนเวลา 1 นาท

ทำาความสะอาดไฟเบอรโดยใหความรอนท 250ºc เปนเวลา 1 ชวโมง เปนประจำาทก

วน

ผลการทดลองและการอภปราย

จากการทดลองขนตนโดยการใช HS-SPME จากงานวจยทอางองพบขอแตกตางของคา recovery ระหวาง ตวอยาง

ปสสาวะท spiked ดวย AMP หรอ MA และท spiked ดวย MDA หรอ MDMA หรอ MDEA

ดงนนจงแยกพฒนาวธการสกดสำาหรบ AMP และ MA ออกจาก

MDA , MDMA และ MDEA

การพฒนากระบวนการของ HS-SPME สำาหรบ AMP และ MA

พบวาทอณหภม 60 ºc ใหคา recoveries ทดทสด จงใชอณหภมนในการศกษาพารามเตอรตวตอ

ไป

เตรยมขวดแกวตวอยาง และชง K2CO3 นำาหนก 1 กรม ใสลงในขวดไป ใสปสสาวะท spiked

ดวย AMP (1559 ng/ml) ปรมาตร 1ml

เวลาทเหมาะสมสำาหรบการดดซบสาร คอ 15 นาท หลงจากการทดสอบทเวลาตางกน 3 เวลา (5 , 10 และ 15 นาท) จงถกมานำาใชเพอปรบปรงความ

แมนยำาตอไป

สารกลมแอมเฟตามนส การระเหยขนอยกบปจจยพนฐานบางตว เชน pH หรอความอมตวของเกลอ คา recoveries ของการสกดใหผลคงทหากมการปรบ

พารามเตอรเหลานใหเหมาะสม

พบวาผล recovery ของ AMP ทใช K2CO3 (1g/ml, จดอมตว) อณหภม60 ºc และเวลาท การดดซบสารทดทสด 15 นาท ใหคา

recoveries ทดทสด

Calibration curves , คาrecoveries และขดจำากดตำาสดของ

วธ HS-SPME สำาหรบวเคราะห AMP และ MA

Chromatogram AMP

Fig. 1. GC-FID Chromatogram of AMP. A urine sample containing 5000 ng AMP analysed by the HS-SPME method Conditions are in the text.

0 18

การพฒนาขนตอนการเตรยมตวอยางดวย วธ HS-SPME สำาหรบ MDA , MDMA

และ MDEA วธขางตนทใชกบ AMP และ MA เมอนำามาใชกบ

MDA , MDMA และ MDEA จะใหคา recovery ท ตำาเหมอนกนทง 3 สาร

ตวอยางปสสาวะท spiked ดวย MDA สกดทสภาวะ แตกตางจากทใชกบ AMP และ MA ( อณหภมทใช และปรมาตรตวอยาง )

เนองจาก MDA ใหคา recovery ตำามาก เมอใชอณหภม 60ºc ดงนนจงใช ปสสาวะท spiked ทมความเขมขนสงกวาคอ

2760 ng/ml อณหภม 70ºc คา recoveries กยงคงตำา จงเพมอณหภมใหสงขน คอ 80 ,90 และ 100ºc เปนเวลา

45 นาท พบวาท 90ºc ใหผลทดทสด ดงตาราง

สำาหรบปรมาตรของตวอยางถกทดสอบเพอปรบปรง sensitivity ของวธ โดยการเปรยบเทยบปสสาวะท spiked ดวย MDA (2760

ng/ml) เปน 90ºc นาน 45 นาท และ 1 5 นาทสดทายใหทำาการดดซบ แตละปรมาตรใหม

การทำาซำาสองครง คาเฉลยของคา recoveries ของ MDA แสดงดงตาราง ปรมาตรตวอยางท

เหมาะสมคอ 4ml เนองจากใหคา sensitivity สง

Calibration curves , คาrecoveries และขดจำากดตำาสดของวธ

HS-SPME ในการวเคราะห MDA , MDMA และ MDEA

สรปผลการทดลอง

SPME เปนเทคนคทเรว ไมใชตวทำาละลายใน การสกด ซงเปนทางเลอกหนงของการเตรยม

ตวอยางสำาหรบวเคราะหกลมแอมเฟตามนสใน ตวอยางชววตถ นอกเหนอจากวธดงเดมคอการ

สกดดวยตวทำาละลาย และของแขง วตถประสงค ในการศกษานเพอใหไดคา recovery ทสงทสด

โดยใช HS-SPME ดงนนวธการหา AMP และMA ในปสสาวะจงถกพฒนาแยกกบวธสำาหรบหา

MDA , MDMA และ MDEA

THANKS FOR

ATTENTION

Question?