Présenté par Olivier DELORME Laboratoire de Biologie Moléculaire et Séquençage, IBGC, UMR CNRS 5095/Université Victor Segalen Bordeaux 2 Sous la direction de MM. François DOIGNON et Didier THORAVAL Étude de la régulation des protéines Rho3 et Rho4: recherche des kinases responsables de la phosphorylation de la RhoGAP Rgd1 chez la levure Saccharomyces cerevisiae
Étude de la régulation des protéines Rho3 et Rho4: recherche des kinases responsables de la phosphorylation de la RhoGAP Rgd1 chez la levure Saccharomyces cerevisiae. Présenté par Olivier DELORME. Sous la direction de MM. François DOIGNON et Didier THORAVAL. - PowerPoint PPT Presentation
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Présenté par Olivier DELORME
Laboratoire de Biologie Moléculaire et Séquençage, IBGC, UMR CNRS 5095/Université Victor Segalen Bordeaux 2
Sous la direction de MM. François DOIGNON et Didier THORAVAL
Étude de la régulation des protéines Rho3 et Rho4:
recherche des kinases responsables de la phosphorylation de
la RhoGAP Rgd1 chez la levure Saccharomyces cerevisiae
Le cycle de régulation des protéines Rho3 et Rho4
Rho3/4
Rho3/4
GDP
GTP
Rgd1 GEF
Forme active
Forme inactive
Pi GDP
GTP
La protéine Rgd1 (Related GAP Domain 1)
FCH RhoGAP
Fes-CIP4 Homology
Coiled-coil
Rho GTPase Activating Protein
D’après Roumanie et al., 2000
La protéine Rgd1 est phosphorylée
H. Fernandes.2005
Où se trouvent les sites de phosphorylation ?
S336
? ?
La phosphorylation régule l’activité de Rgd1p
H. Fernandes. 2005
L’activité RhoGAP augmente lorsque Rgd1 est sous forme non phosphorylée
Rgd1
Rho3
Rho4
Kinases?
Phosphatases?
Quels sont les mécanismes qui régulent Rgd1p ?
Objectifs
Participation à l’étude de la régulation des protéines Rho3 et Rho4
Etude de la régulation de Rgd1p
Recherche des kinases
Recherche des kinases de Rgd1p
– Approche ciblée : • Analyse des souches mutées pour les gènes codant
pour les kinases potentielles de Rgd1p
– Approche globale:• Analyse des souches mutées pour les gènes codant
pour les kinases• Approche par la protéomique : le Proto-Array
Approche ciblée : les kinases potentielles
Mkk2p et Bck1pRgd1pMkk2pBck1p
Complexe protéique
PKA (Tpk1, Tpk2, Tpk3)
Ipl1p
Ipl1 Aurora B
?
GAPRgd1p GAP MgcRacGAPp
Activité AMPc dépendante, la quantité d’AMPc varie au cours de la croissance
Stratégie d’analyse
Extraction Protéines totales
Western Blot
Prélèvement des cellules
Détection et Quantification par caméra CCD
Détection des bandes présentes sur la membrane
Acquisition d’une image
Acquisition des valeurs d’intensité des bandes
Calculs des rapports P/nP pour chaque extrait et détermination du seuil