Presentation PraenaTest WH

LifeCodexx AG

PrenaTest

Setting standards in NIPT in Europe

Dr. Wera HofmannCSO LifeCodexx AGBelgrade, 2015-02-27

LifeCodexx AG as a German leading company in the field of molecular diagnostics has been setting standards in Europe with PrenaTest since 2012:

First product to European market in Aug. 2012First CE-certified testPrenaTest detects fetal trisomies 21, 18 and 13 with a sensitivity of 99% and a false-positive rate of 0.1% for singleton and multiple pregnanciesPrenaTest successfully validated for gonosomal aneuploidiesLowest no call rate in industry: 0.6%Clear result no risk scoreFirst company with guaranteed turnaround time < 1 week (PrenaTest Express)Over 20.000 samples successfully analyzed since launchProprietary QuantYfeX assay for quantification of the fetal DNA amount at the beginning of the analysis: fast call back if a new blood sample is needed Positive reimbursement decision in Germany (Erprobungsregelung) following LifeCodexx AG request, positive decision expected in Switzerland soonPrenaTest - The NIPT leader in EuropeQuality Made in Germany

What is NIPT?

According to International Society for Prenatal Diagnosis (ISPD) NIPT is an advanced screening method for women at increased risk of common fetal aneuploidiesNumerous publications with first experiences in the clinical application

Non-invasive prenatal testing (NIPT) - new option in prenatal care

1997: detection of cffDNA fragments in maternal plasmaScientific Basis of NIPT cell free fetal DNA (cffDNA)

Detection: starting week 4Fetal fraction: 2 40 %Stability: < 2 hoursCharacteristics:

short fragments, 80 % < 200 bpreleased from trophoblast cells (placenta) by apoptosis / necrosis* Lo et al., Lancet 1997; 350:485-7

Die Methode basiert auf der Entdeckung aus dem Jahr 1997, dass im Blut einer schwangeren Frau neben eigenen kurzen zellfreien DNA-Fragmenten auch zu durchschnittlich ca. 10 % Bruchstcke fetaler DNA vorkommen.

Diese zellfreie fetale DNA (cffDNA abgekrzt) stammt aus apoptotischen Trophoblastenzellen, also aus der Plazenta. Die Fragmente sind ungefhr ab der 4. SSW im Blut der Mutter nachweisbar und der Gehalt steigt im Lauf der Schwangerschaft an (Anteil ca. 2 40%)

Wichtig ist in diesem Zusammenhang, dass die Fragmente eine sehr kurze Halbwertszeit besitzen (Stabilitt unter 2 Stunden), d.h. Wenige Stunden nach der Geburt des Kindes sind keine solchen Fragmente mehr im Blut der Mutter nachweisbar. (Im Gegensatz zu fetalen Zellen, von denen man schon lnger wei und die noch Jahre nach der Geburt im Blut der Mutter verbleiben.)*

Since 2008:Massively Parallel (Shotgun) Sequencing (MPS) for NIPT

Very high throughput, short reads (36bp)15 million reads / sample16 plex; 12( samples per run (HiSeq2500)

Random MPS is the best validated method with the vast majority of NIPT dataTechnical Basis of NIPT Next Generation Sequencing (NGS)

PraenaTest Process Overview

Regulatory environment for next generation sequencing (NGS) based aneuploidy tests in EuropeIn-Vitro Diagnostics Directive 98/79/EG* of the European Union, national laws:

The software must be CE marked and monitored by a Notified Body The Legal Manufacturer must ensure the application of a full quality assurance system

(EN ISO 13485)

PraenaTest is the first NIPT performed in Europe in accordance with these regulatory requirements. * List B, Appendix II, IVD Products

Method Overview1. Blood collection2. Plasma preparation3. Extraction of cell free DNA5. Preparation of a genomic library6. next generation sequencing4. Quantification of fetal DNA (QuantYfeX)Streck cell-free DNA BCT labelled with sample barcode, patient name and patient birthdate

Fr unsere Analyse wird der Schwangeren also Blut abgenommen, das Plasma gewonnen und die gesamte zellfreie DNA isoliert (also das Gemisch aus mtterlicher und fetaler zellfreier DNA, wir knnen zu keinem Zeitpunkt der Analyse die fetale DNA von der mtterlichen trennen!)

Von diesen DNA-Fragmenten wird eine sogenannte genomische Bibliothek angelegt und die Fragmente werden sequenziert. Wir benutzen dabei sehr kurze Sequenzbruchstcke von 36 bp fr die Analyse, und davon sehr viele (ber 10 Millionen, wie auf spterer Folie dargestellt).*

Method Overview1. Blood collection2. Plasma preparation3. Extraction of cell free DNA5. Preparation of a genomic library6. next generation sequencing4. Quantification of fetal DNA (QuantYfeX)Minimum of plasma volume isolated: 3,5 ml

Fr unsere Analyse wird der Schwangeren also Blut abgenommen, das Plasma gewonnen und die gesamte zellfreie DNA isoliert (also das Gemisch aus mtterlicher und fetaler zellfreier DNA, wir knnen zu keinem Zeitpunkt der Analyse die fetale DNA von der mtterlichen trennen!)

Von diesen DNA-Fragmenten wird eine sogenannte genomische Bibliothek angelegt und die Fragmente werden sequenziert. Wir benutzen dabei sehr kurze Sequenzbruchstcke von 36 bp fr die Analyse, und davon sehr viele (ber 10 Millionen, wie auf spterer Folie dargestellt).*

Method Overview1. Blood collection2. Plasma preparation3. Extraction of cell free DNA5. Preparation of a genomic library6. next generation sequencing4. Quantification of fetal DNA (QuantYfeX)*

Fr unsere Analyse wird der Schwangeren also Blut abgenommen, das Plasma gewonnen und die gesamte zellfreie DNA isoliert (also das Gemisch aus mtterlicher und fetaler zellfreier DNA, wir knnen zu keinem Zeitpunkt der Analyse die fetale DNA von der mtterlichen trennen!)

Von diesen DNA-Fragmenten wird eine sogenannte genomische Bibliothek angelegt und die Fragmente werden sequenziert. Wir benutzen dabei sehr kurze Sequenzbruchstcke von 36 bp fr die Analyse, und davon sehr viele (ber 10 Millionen, wie auf spterer Folie dargestellt).*

Method OverviewQuantYfeXProprietary qPCR-Assay1. Blood collection2. Plasma preparation3. Extraction of cell free DNA5. Preparation of a genomic library6. next generation sequencing4. Quantification of fetal DNA (QuantYfeX)4. Add on: determination of fetal sexMinimum 4% cffDNA for singleton and8% cffDNA for multiple pregnancies

Fr unsere Analyse wird der Schwangeren also Blut abgenommen, das Plasma gewonnen und die gesamte zellfreie DNA isoliert (also das Gemisch aus mtterlicher und fetaler zellfreier DNA, wir knnen zu keinem Zeitpunkt der Analyse die fetale DNA von der mtterlichen trennen!)

Von diesen DNA-Fragmenten wird eine sogenannte genomische Bibliothek angelegt und die Fragmente werden sequenziert. Wir benutzen dabei sehr kurze Sequenzbruchstcke von 36 bp fr die Analyse, und davon sehr viele (ber 10 Millionen, wie auf spterer Folie dargestellt).*

Method Overview

1. Blood collection2. Plasma preparation3. Extraction of cell free DNA5. Preparation of a genomic library6. next generation sequencing4. Quantification of fetal DNA (QuantYfeX)*

Fr unsere Analyse wird der Schwangeren also Blut abgenommen, das Plasma gewonnen und die gesamte zellfreie DNA isoliert (also das Gemisch aus mtterlicher und fetaler zellfreier DNA, wir knnen zu keinem Zeitpunkt der Analyse die fetale DNA von der mtterlichen trennen!)

Von diesen DNA-Fragmenten wird eine sogenannte genomische Bibliothek angelegt und die Fragmente werden sequenziert. Wir benutzen dabei sehr kurze Sequenzbruchstcke von 36 bp fr die Analyse, und davon sehr viele (ber 10 Millionen, wie auf spterer Folie dargestellt).*

Method Overview1. Blood collection2. Plasma preparation3. Extraction of cell free DNA5. Preparation of a genomic library6. next generation sequencing4. Quantification of fetal DNA (QuantYfeX)Illumina Sequencing Technology:HiSeq2500Single-reads

PraenaTest expressHigh outputRapid run (7h)20 samplesrun 48h128 samples

Fr unsere Analyse wird der Schwangeren also Blut abgenommen, das Plasma gewonnen und die gesamte zellfreie DNA isoliert (also das Gemisch aus mtterlicher und fetaler zellfreier DNA, wir knnen zu keinem Zeitpunkt der Analyse die fetale DNA von der mtterlichen trennen!)

Von diesen DNA-Fragmenten wird eine sogenannte genomische Bibliothek angelegt und die Fragmente werden sequenziert. Wir benutzen dabei sehr kurze Sequenzbruchstcke von 36 bp fr die Analyse, und davon sehr viele (ber 10 Millionen, wie auf spterer Folie dargestellt).*

Bioinformatic analysis in the case of a fetal trisomy 21

Um sich die konkreten Zahlen besser vorstellen zu knnen ist hier ein Beispiel fr eine solche Auswertung gegeben.

Fr die Probe im Beispiel wurden ca. 14,8 Millionen solcher kurzer Sequenzbruchstcke insgesamt gelesen (Unser Minimum fr die Analyse ist 10 Millionen).

Das hrt sich viel an, deckt aber in der Realitt trotzdem nur ca. 8 % des gesamten Genoms ab.

Von diesen 14,8 Millionen Reads (wie man die Sequenzbruchstcke nennt) werden dann nur ca. 6,8 Millionen dem humanen Referenzgenom auerhalb der sog. Repetitiven Elemente zugeordnet (das menschliche Genom besteht zu ber 50% aus Repetitiven Elementen. Reads die in diesen Bereichen gemappt werden, werden aussortiert und knnen fr die weitere Analyse nicht verwendet werden).

Von den 6,8 Millionen unique reads passen wiederum ca. 5,7 Millionen ganz genau ohne Abweichung nur ein einziges Mal. Es werden also auch nochmal Sequenzen aussortiert, die an einer oder mehreren Stellen dieser 36 bp nicht exakt passen oder die zwei oder mehrmals passen wrden.

Und von diesen 5,7 Millionen gehren dann ca. 70000 zum Chromosom 21, das entspricht im Normalfall dann 1,25 % des Gesamtgenoms.

Diese 1,25% knnen auch bei Schwangeren mit gesunden Feten (also ohne Trisomie 21) leicht schwanken, es gibt hier eine natrliche Varianz, aber wenn der Prozentsatz ber ein Normalma hinaus nach oben abweicht, also etwa bei 1,32 Prozent liegt, dann liegt in der Regel eine Trisomie 21 vor. Wir htten dann also nicht 70000 Reads vom Chromosom 21 sondern ca. 73000, es geht also um eine 1,05 fache Erhhung, die die Methode zuverlssig detektiert.*

Method Bioinformatic analysis of the sequencing dataAlignment of the fragments to the respective chromo-some by comparison with a human reference genome in the public data baseCounting of the sequences per chromosome, calculation of percentage (e.g. % chromosome 21)Sequencing and AlignmentQuantification

Diese kurzen Sequenzbruchstcke werden dann durch einen Vergleich mit einem humanen Referenzgenom (ist in ffentlichen Datenbanken verfgbar) dem entsprechenden Chromosom zugeordnet.

Im nchsten Schritt werden die Sequenbruchstcke pro Chromosom einfach gezhlt und der prozentuale Anteil pro Chromosom ausgerechnet, z.B. der Prozentsatz vom Chromosom 21.*

Examples:

* Median calculations of chromosomal percentages of more than 400 samples having normal karyotypeMethod Bioinformatic analysis of the sequencing dataQuantification

Karyotype% Chr 13% Chr 18% Chr 2146XX / 46XY*3.61 %2.97 %1.27 %47XX+13 / 47XY+13 3.65 %2.97 %1.27 %47XX+18 / 47XY+183.61 %3.02 %1.27 %47XX+21 / 47XY+213.61 %2.97 %1.32 %

Diese kurzen Sequenzbruchstcke werden dann durch einen Vergleich mit einem humanen Referenzgenom (ist in ffentlichen Datenbanken verfgbar) dem entsprechenden Chromosom zugeordnet.

Im nchsten Schritt werden die Sequenbruchstcke pro Chromosom einfach gezhlt und der prozentuale Anteil pro Chromosom ausgerechnet, z.B. der Prozentsatz vom Chromosom 21.*

Method z-score Calculation

z-score calculation:z-score 3 T21 positive < 3 T21 negativeThe z-score represents the distance between the value measured for a given sample and the median of the reference set in terms of the median absolute deviation (MAD) z-score of 1 = exactly 1 deviation z-score of 3 = 3 deviations

Example for a frequency distribution of z-scores

Und dieses Normalma der Abweichung, die auch bei gesunden Feten vorkommen kann, und den Cut-off, bei dem eine Trisomie 21 vorliegt, genau zu definieren, muss man diesen Prozentsatz dann in zuverlssige Werte bertragen. Ein solcher gelufiger Wert aus der Statistik ist der sogenannte z-score.

Man betrachtet bei einem z-score nicht den prozentualen Anteil fr sich allein, um zu entscheiden, ob der aussagekrftig ist oder nicht, sondern man bezieht den gemessenen Anteil an Chromosom 21-DNA auf ein Referenzset von anderen Proben.

In der Formel sieht man, dass man zur Errechnung des z-score vom gemessenen Prozentsatz der konkreten Probe den Median des Prozentsazes eines Referenzsets abzieht (Median ist sowas hnliches wie der Mittelwert) und das ganze teilt durch die mittlere absolute Abweichung (also sowas hnliches wie die Standardabweichung) des gesamten Referenzsets.

Der z-score stellt also den Abstand der Messgre ..... (Satz beim ersten Bulletpoint lesen)

Wenn man sich Hufigkeitsverteilungen von solchen z-scores anschaut, dann sieht man, dass die z-scores von euploiden Proben in ihrer Hufigkeit eine Gau-Verteilung aufweisen. Am hufigsten kommen z-scores um 0 vor, nach oben wird es weniger, nach unten wird es weniger. Mit einem Abstand von 1 oder 2 Standardabweichungen kommen immernoch manchmal Werte fr euploide Proben vor, aber bei einem Cut-off von 3 kommen statistisch keine Werte von euploiden Proben mehr vor. Wenn ein gemessener Wert also 3 oder mehr Standardabweichungen vom Mittel des Referenzsets abweicht, ist das ein klarer Hinweis auf das Vorliegen einer Trisomie 21.

Bei einem z-score kleiner als drei ist also die Schlussfolgerung, der Fet weist keine Trisomie 21 auf, bei einem z-score von 3 oder grer weist das dann deutlich auf das Vorliegen einer Trisomie 21 hin.*

PraenaTest result report - negative

PraenaTest result report - positive

PraenaTest Test performance

PrenaTest clinically validated for singleton pregnancies

Two independent studies performed:European Validation Study (EVS 2012) Samples from women with high risk pregnancies provided by Sequenom (SCS 2013)Results published in peer-reviewed journalsStumm et al. Prenatal Diagnosis 2012Stumm et al. Prenatal Diagnosis 2014

* Within the EVS, one result was false-negative for trisomy 21 and one result was false-positive for trisomy 18 (a sample with an aberration of chromosome 10).

EVS 2012SCS 2013totalCorrect classified (total)466/468*340/340806/808Trisomy 13 (n)5/53/38/8Trisomy 18 (n)8/86/614/14Trisomy 21 (n)40/4134/3474/75Total detection rate98.11%100%98.97%False-positive rate1/4140.24%0/2970%1/7110.14%

as well as for multiple pregnancies

Launch: Feb. 6th, 2014 Generally to be applied after IVF, egg donation and other infertility treatmentsNew performance qualification of the PrenaTest validated by own R&D study and a joint study with samples kindly provided by collaboration partner Sequenom All positive T21 cases correctly classified (1 monochorionic, concordant; 5 dichorionic,discordant)

ReferenznT21T18T13Sehnert et al. 201152--Leung et al. 2013811-Lau et al. 2013121--Canick et al. 2013277--Gil et al. 20132759*-1* one T21 not detectedPraenaTest ValidationGroemminger et al. 201462**6--** 60 twins and 2 tiplets; 6 T21 cases in twins

*

Gonosomal aneuplodies recently validated as well

Launch: June 30th, 2014Offered as extra option to interested pregnant women

*

PrenaTest is independently confirmed in clinical applicationSince PrenaTest introduction:

Generally increased applications of prenatal diagnosis methods (+3,6%) after FTS, primarily in an intermediate risk (1:300 1:50) cohort (+10,7%)Decreasing number of invasive procedures by 67,4%

# of successfully reported samples:17,527 (since launch)

Insuspicious results:97.8% (n= 17,134)*

Affected cases:Trisomy 13: 0.12% (n= 19 / 16,310)*Trisomy 18:0.37% (n= 61 / 16,310)Trisomie 21:1.68% (n= 295 / 17,527)

Turner Syndrome:0.24% (n= 5 / 2,105)*Klinefelter Syndrome:0.24% (n= 5 / 2,105)47XYY Syndrome:0.14% (n= 3 / 2,105)TripleX Syndrome:0.24% (n= 5 / 2,105)

Twins: 3.75% (n= 396)

Discordant results :False positive: 1 x T13, 16 x T18, 5 x T21, 1x Klinefelter SyndromeFalse negative: 1 x T13, 1x T18, 1x T21

General PrenaTest performance parameter:Overall false positive rate (FPR): 0.13%Overall detection rate: 98.7%Failure rate due to low cffDNA fraction in first blood samples: 1.2% Overall no call rate: 0.6%

High test accuracy for PrenaTest confirmed in diagnostic routine(2014-12-31*)

*

Patient profile Age of womenMore than 45% of women are older than 35 years

*

Patient profile In which week of pregnancy is the PrenaTest done?Possible from gestational week 9+0 onwards; used only by 2%The highest peak at week 13 corresponds to the time of the nuchal translucency measurements

*

Patient profile Indications for the application of NIPTIncreased maternal ageIncreased risk for aneuploidy based on first trimester screening The third important reason for doing NIPT is listed as other medical reasons, mainly representing women with anxiety and a strong psychological need for assurance, even in the absence of indicators for a fetal trisomy.

*

PraenaTest New insights

Test material originates from trophoblast cells, thus fetoplacental discrepancies have to be taken into account

No conclusions can be drawn regarding structural chromosomal aberrations

Mosaics are not recognizable or cannot fully be ascertained quantitatively

depends on degree of mosaicism and amount of cffDNA

Consider confined placental mosaics

NIPT is much more sensitive in detecting CPM then CVS. by Rava et al. 2013 More precisely: investigate cell-free placental DNA

Vanishing twins

Limitations of NIPT - Discordant results between NIPT and IPT ! 100 % can never be achieved in clinical practice! All positive cases must be confirmed by karyotyping

False positive resultsFalse negative results

Turkey: Fetus payraceus

Singleton pregnancy; gestational week17+2positive z-score of chr. 21: 13.5cffDNA 20.7% (QFX) and 9.2 (rMPS/Y reads)

Invasive prenatal testing:

AC: 46,XY

Confirmation:started as a multiple pregnancy (ICSI); deceased fet still recognizable in week 17 +2 (US examination)Before birth:New blood test (week 38 +2) with a negative z-score of chr 21: -0.3 cffDNA fraction 21.7%After birth:Cultered cells of placental tissue of the fetus payraceuskaryotype 47,XX,+21

Grmminger et al. J. Clin. Med. 2014

PrenaTest - recent successful case studiesCase report 1

*

Hungary: Vanishing Twin

Singleton pregnancyBorderline z-score of chr. 21: 3.4cffDNA fraction 13.44%

Gender not clearly determined using QFX; 3% based on Y reads for chr. YInterpretation: consider possibility of a vanishing twin with trisomy 21

Confirmation: started as a multiple pregnancy (using ART); Sex of the living fetus is female

Grmminger et al. J. Clin. Med. 2014

Case report 2

*

Correlation between z-score chr. 21 and cffDNA

*

Germany: Confined Placental Mosaicism (CPM)

positive z-score of chr. 18: 4.6cffDNA fraction 10.1%

Invasive prenatal testing:

AC: 46,XYPlacenta tissue/FISH: 80% T18 mosaicism

Frequency of CPM about 1-2%; Artan et al. [1995] reported 4.8%

Case report 3

Germany: T21 mosaicism

Examined as part of R&DKaryotyp using CVS:

47,XX,+21[10]/46,XX [ 5]

Confirmed:

positive z-score of chr. 21 is 7.4cffDNA 16.68%

In clinical study:

T21 mosaicism 47,XY,+21[6]/46,XY[34]z-score: 0.5cffDNA 7%

Case report 4

Germany: T18 deletion

z-score of chr. 18: -6.3inconspicuous for trisomy 18Indication for (partial) deletion

of chr.18

Invasive prenatal testing:

Prenatal quicktest with markers for chr. 13, 18, 21, and sex chromosomes: diploid signal constellationArray-CGH: 18q22.1q23(63,909,745-78,010,032)x1 dn; 14 Mb-deletion with at least 12 genes involved

Termination of pregnancy

Case report 5

Germany: Triple X

z-scores of chr. 13/18/21 < -3

z-score for chr. X: 8.49

Additional findings: additional chr X; fetal Klinefelter-Syndrom/maternales Triple XConfirmation: maternal TripleXWhen prevalence of 1:1000 of Triple X = clear limitation in the detection of fetal gonosomal aneuploidies

Case report 6

New! Effects of Low Molecular Weight Heparin medication in pregnant women opting for PraenaTest Low molecular weight heparin (LMWH) is often used as prophylaxis against venous thrombosis during such pregnancies.In pregnant women on LMWH medication the cell-free plasma DNA contains, in comparison to an average plasma sample, a higher proportion of small DNA fragments with an unusually high Guanosin-Cytosin (GC)-content.This biases NIPT-results so that they cannot be interpreted correctly not reported by anybody before!The disturbing effect of LMWH can be cleared away by taking the blood sample for NIPT right before the next application of LWMW when the plasma level is lowest.manuscript submitted in NEJM

*

*

NIPT is a new, but rapidly evolving field in the area of prenatal care

PraenaTest is increasingly established in prenatal diagnosis with very high test accuracy and very low failure rate

The first NIPT for fetal trisomies 21, 18 and 13 available in Europe, which is in accordance with the In-Vitro Diagnostics Directive 98/79/EG of the European Union

No stand alone test but complements present non-invasive prenatal methods

NIPT is capable of detecting common fetal aneuploidies with almost similar accuracy as chorion villus sampling (CVS) and amniocentesis (AC), but without any risk for miscarriage

The number of invasive tests can be reduced substantially, procedure-related fetal losses can be avoided

Limits of NIPT method are better described; further clarification is necessary in a strong collaboration between gynecologists specialized in ultrasonography and geneticists

Considering additional findings as incidental findings; high importance of genetic counseling

Summary - NIPT - PrenaTest

Thank you very much.

Backup

QuantYfeX Quality Control for PraenaTest

Specific regions of the human genome are modified by methylation and differ in their pattern from mother to child (Differential methylation).the DNA sequence is identical, but: maternal DNA is not methylated,fetal DNA is methylated.

Specific enzymes digest only non-methylated DNA methylated DNA remains intact.

specific, hypomethylated DNA region of maternal originspecific, hypermethylated DNA region of fetal origin (target)specific reference DNA region of both fetal and maternal origin

reference-specific VIC-labelled flourescent probetarget-specific FAM-labelled flourescent probeGrmminger et al. J. Clin. Med.2014,3(3), 679-692; http://www.mdpi.com/2077-0383/3/3/679

based on qPCR platformQuantitative PCR of two regions in the genome:One region which is not digested by the used enzyme,One region which is digested depending on the methylation.

PCR signal for a) represents the mixture of maternal and fetal DNA (100%)PCR signal for b) represents only the fetal proportion (x %)LightCycler 480 Systema)b)

QuantYfeX principle of cffDNA assayAssay Design multiplex fluorescent probe quantitative real-time PCR assaymaternal DNAfetal DNAno restriction sitesmethylation sensitive restriction sitesInsensitive markersensitive marker(total DNA)(fetal DNA)maternal DNAfetal DNA

Detection of Y-chromosomal region

Y-chromosomal sequences origination from male fetuses are detectable. autosomal und gonosomal DNA of maternal and fetal origin Y-chromosomal DNA of fetal origin

DNA-sample of a pregnancy with a male fetusDNA-sample of a pregnancy with a female fetusQuantYfeX assay principle for gender determination (1/2)

QuantYfeX assay principle for gender determination (2/2)Gender determinationNo respectivematernal DNA region existingmale fetal DNA(detection of male specific DNA sequences)

Target gene: SRYGender determination

QuantYfeX principle of cffDNA assayAssay Design multiplex fluorescent probe quantitative real-time PCR assaymaternal DNAfetal DNAno restriction sitesmethylation sensitive restriction sitesInsensitive markersensitive marker(total DNA)(fetal DNA)maternal DNAfetal DNA

Detection of Y-chromosomal region

Y-chromosomal sequences origination from male fetuses are detectable. autosomal und gonosomal DNA of maternal and fetal origin Y-chromosomal DNA of fetal origin

DNA-sample of a pregnancy with a male fetusDNA-sample of a pregnancy with a female fetusQuantYfeX assay principle for gender determination (1/2)

QuantYfeX assay principle for gender determination (2/2)Gender determinationNo respectivematernal DNA region existingmale fetal DNA(detection of male specific DNA sequences)

Target gene: SRYGender determination

https://www.neb.com/products/e6040-nebnext-dna-library-prep-master-mix-set-for-illuminaMethod Library Preparation/Poolingautomated protocol:32-48 samples/batch

vs. manual protocol:8-12 samples/batch

Die Methode basiert auf der Entdeckung aus dem Jahr 1997, dass im Blut einer schwangeren Frau neben eigenen kurzen zellfreien DNA-Fragmenten auch zu durchschnittlich ca. 10 % Bruchstcke fetaler DNA vorkommen.

Diese zellfreie fetale DNA (cffDNA abgekrzt) stammt aus apoptotischen Trophoblastenzellen, also aus der Plazenta. Die Fragmente sind ungefhr ab der 4. SSW im Blut der Mutter nachweisbar und der Gehalt steigt im Lauf der Schwangerschaft an (Anteil ca. 2 40%)

Wichtig ist in diesem Zusammenhang, dass die Fragmente eine sehr kurze Halbwertszeit besitzen (Stabilitt unter 2 Stunden), d.h. Wenige Stunden nach der Geburt des Kindes sind keine solchen Fragmente mehr im Blut der Mutter nachweisbar. (Im Gegensatz zu fetalen Zellen, von denen man schon lnger wei und die noch Jahre nach der Geburt im Blut der Mutter verbleiben.)*Fr unsere Analyse wird der Schwangeren also Blut abgenommen, das Plasma gewonnen und die gesamte zellfreie DNA isoliert (also das Gemisch aus mtterlicher und fetaler zellfreier DNA, wir knnen zu keinem Zeitpunkt der Analyse die fetale DNA von der mtterlichen trennen!)

Von diesen DNA-Fragmenten wird eine sogenannte genomische Bibliothek angelegt und die Fragmente werden sequenziert. Wir benutzen dabei sehr kurze Sequenzbruchstcke von 36 bp fr die Analyse, und davon sehr viele (ber 10 Millionen, wie auf spterer Folie dargestellt).*Fr unsere Analyse wird der Schwangeren also Blut abgenommen, das Plasma gewonnen und die gesamte zellfreie DNA isoliert (also das Gemisch aus mtterlicher und fetaler zellfreier DNA, wir knnen zu keinem Zeitpunkt der Analyse die fetale DNA von der mtterlichen trennen!)

Von diesen DNA-Fragmenten wird eine sogenannte genomische Bibliothek angelegt und die Fragmente werden sequenziert. Wir benutzen dabei sehr kurze Sequenzbruchstcke von 36 bp fr die Analyse, und davon sehr viele (ber 10 Millionen, wie auf spterer Folie dargestellt).*Fr unsere Analyse wird der Schwangeren also Blut abgenommen, das Plasma gewonnen und die gesamte zellfreie DNA isoliert (also das Gemisch aus mtterlicher und fetaler zellfreier DNA, wir knnen zu keinem Zeitpunkt der Analyse die fetale DNA von der mtterlichen trennen!)

Von diesen DNA-Fragmenten wird eine sogenannte genomische Bibliothek angelegt und die Fragmente werden sequenziert. Wir benutzen dabei sehr kurze Sequenzbruchstcke von 36 bp fr die Analyse, und davon sehr viele (ber 10 Millionen, wie auf spterer Folie dargestellt).*Fr unsere Analyse wird der Schwangeren also Blut abgenommen, das Plasma gewonnen und die gesamte zellfreie DNA isoliert (also das Gemisch aus mtterlicher und fetaler zellfreier DNA, wir knnen zu keinem Zeitpunkt der Analyse die fetale DNA von der mtterlichen trennen!)

Von diesen DNA-Fragmenten wird eine sogenannte genomische Bibliothek angelegt und die Fragmente werden sequenziert. Wir benutzen dabei sehr kurze Sequenzbruchstcke von 36 bp fr die Analyse, und davon sehr viele (ber 10 Millionen, wie auf spterer Folie dargestellt).*Fr unsere Analyse wird der Schwangeren also Blut abgenommen, das Plasma gewonnen und die gesamte zellfreie DNA isoliert (also das Gemisch aus mtterlicher und fetaler zellfreier DNA, wir knnen zu keinem Zeitpunkt der Analyse die fetale DNA von der mtterlichen trennen!)

Von diesen DNA-Fragmenten wird eine sogenannte genomische Bibliothek angelegt und die Fragmente werden sequenziert. Wir benutzen dabei sehr kurze Sequenzbruchstcke von 36 bp fr die Analyse, und davon sehr viele (ber 10 Millionen, wie auf spterer Folie dargestellt).*Fr unsere Analyse wird der Schwangeren also Blut abgenommen, das Plasma gewonnen und die gesamte zellfreie DNA isoliert (also das Gemisch aus mtterlicher und fetaler zellfreier DNA, wir knnen zu keinem Zeitpunkt der Analyse die fetale DNA von der mtterlichen trennen!)

Von diesen DNA-Fragmenten wird eine sogenannte genomische Bibliothek angelegt und die Fragmente werden sequenziert. Wir benutzen dabei sehr kurze Sequenzbruchstcke von 36 bp fr die Analyse, und davon sehr viele (ber 10 Millionen, wie auf spterer Folie dargestellt).*Um sich die konkreten Zahlen besser vorstellen zu knnen ist hier ein Beispiel fr eine solche Auswertung gegeben.

Fr die Probe im Beispiel wurden ca. 14,8 Millionen solcher kurzer Sequenzbruchstcke insgesamt gelesen (Unser Minimum fr die Analyse ist 10 Millionen).

Das hrt sich viel an, deckt aber in der Realitt trotzdem nur ca. 8 % des gesamten Genoms ab.

Von diesen 14,8 Millionen Reads (wie man die Sequenzbruchstcke nennt) werden dann nur ca. 6,8 Millionen dem humanen Referenzgenom auerhalb der sog. Repetitiven Elemente zugeordnet (das menschliche Genom besteht zu ber 50% aus Repetitiven Elementen. Reads die in diesen Bereichen gemappt werden, werden aussortiert und knnen fr die weitere Analyse nicht verwendet werden).

Von den 6,8 Millionen unique reads passen wiederum ca. 5,7 Millionen ganz genau ohne Abweichung nur ein einziges Mal. Es werden also auch nochmal Sequenzen aussortiert, die an einer oder mehreren Stellen dieser 36 bp nicht exakt passen oder die zwei oder mehrmals passen wrden.

Und von diesen 5,7 Millionen gehren dann ca. 70000 zum Chromosom 21, das entspricht im Normalfall dann 1,25 % des Gesamtgenoms.

Diese 1,25% knnen auch bei Schwangeren mit gesunden Feten (also ohne Trisomie 21) leicht schwanken, es gibt hier eine natrliche Varianz, aber wenn der Prozentsatz ber ein Normalma hinaus nach oben abweicht, also etwa bei 1,32 Prozent liegt, dann liegt in der Regel eine Trisomie 21 vor. Wir htten dann also nicht 70000 Reads vom Chromosom 21 sondern ca. 73000, es geht also um eine 1,05 fache Erhhung, die die Methode zuverlssig detektiert.*Diese kurzen Sequenzbruchstcke werden dann durch einen Vergleich mit einem humanen Referenzgenom (ist in ffentlichen Datenbanken verfgbar) dem entsprechenden Chromosom zugeordnet.

Im nchsten Schritt werden die Sequenbruchstcke pro Chromosom einfach gezhlt und der prozentuale Anteil pro Chromosom ausgerechnet, z.B. der Prozentsatz vom Chromosom 21.*Diese kurzen Sequenzbruchstcke werden dann durch einen Vergleich mit einem humanen Referenzgenom (ist in ffentlichen Datenbanken verfgbar) dem entsprechenden Chromosom zugeordnet.

Im nchsten Schritt werden die Sequenbruchstcke pro Chromosom einfach gezhlt und der prozentuale Anteil pro Chromosom ausgerechnet, z.B. der Prozentsatz vom Chromosom 21.*Und dieses Normalma der Abweichung, die auch bei gesunden Feten vorkommen kann, und den Cut-off, bei dem eine Trisomie 21 vorliegt, genau zu definieren, muss man diesen Prozentsatz dann in zuverlssige Werte bertragen. Ein solcher gelufiger Wert aus der Statistik ist der sogenannte z-score.

Man betrachtet bei einem z-score nicht den prozentualen Anteil fr sich allein, um zu entscheiden, ob der aussagekrftig ist oder nicht, sondern man bezieht den gemessenen Anteil an Chromosom 21-DNA auf ein Referenzset von anderen Proben.

In der Formel sieht man, dass man zur Errechnung des z-score vom gemessenen Prozentsatz der konkreten Probe den Median des Prozentsazes eines Referenzsets abzieht (Median ist sowas hnliches wie der Mittelwert) und das ganze teilt durch die mittlere absolute Abweichung (also sowas hnliches wie die Standardabweichung) des gesamten Referenzsets.

Der z-score stellt also den Abstand der Messgre ..... (Satz beim ersten Bulletpoint lesen)

Wenn man sich Hufigkeitsverteilungen von solchen z-scores anschaut, dann sieht man, dass die z-scores von euploiden Proben in ihrer Hufigkeit eine Gau-Verteilung aufweisen. Am hufigsten kommen z-scores um 0 vor, nach oben wird es weniger, nach unten wird es weniger. Mit einem Abstand von 1 oder 2 Standardabweichungen kommen immernoch manchmal Werte fr euploide Proben vor, aber bei einem Cut-off von 3 kommen statistisch keine Werte von euploiden Proben mehr vor. Wenn ein gemessener Wert also 3 oder mehr Standardabweichungen vom Mittel des Referenzsets abweicht, ist das ein klarer Hinweis auf das Vorliegen einer Trisomie 21.

Bei einem z-score kleiner als drei ist also die Schlussfolgerung, der Fet weist keine Trisomie 21 auf, bei einem z-score von 3 oder grer weist das dann deutlich auf das Vorliegen einer Trisomie 21 hin.*

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