Presentation Kel 3

Techniques for Analysis of Plant Phenolic Compounds

Harlyanti M. Mashar (14/373337/PFA/1448)Dyah Aryantini (14/373377/PFA/1462)La Ode Muhammad Fitrawan (15/387430/PFA/10519)Nofran Putra Pratama (15/387440/PFA/10633)

Pendahuluan...

Tumbuhan

Sumber Fenolik

Dapat bertindak sebagai Antioksidan (untuk mencegah penyakit jantung, mengurangi peradangan,

menurunkan kejadian kanker dan diabetes, dll)

Struktur Dasar Asam Fenolik dan Favonoid

Cincin aromatis dengan satu atau lebih gugus

hidroksi

Klasifikasi Fenolik

- Fenol sederhana

- Polifenol (berdasarkan jumlah unit fenol dalam molekul)

Fenolik tanaman terdiri dari : fenol sederhana, kumarin, lignin, lignan, tanin

terkondensasi dan terhidrolisis, asam fenolik dan flavonoid.

Ekstraksi dan analisis senyawa fenolik

?

Preparasi SamplePreparasi dan ekstraksi tergantung pada :

- Sifat matriks sampel

- Sifat kimia fenolik (struktur molekul, polaritas, konsentrasi, jumlah cincin aromatik dan kelompok hidroksil)

Teknik Persiapan- Pengeringan sampel menggunakan freeze-drying, pengeringan

dengan udara atau pengeringan dengan oven.

- Penyerbukan sampel untuk memperoleh ukuran partikel tertentu, untuk sampel cair dilakukan dengan sentrifugasi.

- Filtrasi dan pemurnian menggunakan sistem pemisahan bila diperlukan.

- Proses defatting untuk menghilangkan minyak dari sampel yang mengandung lipid.

1. Overview Ekstraksi Fenolik Teknik umum dalam ekstraksi fenolik menggunakan pelarut (organik

atau anorganik)

Parameter yang dapat mempengaruhi hasil fenolat

Waktu Ekstraksi Suhu

Ratio Pelarut

jumlah ekstraksi berulang dari sampelWaktu Ekstraksi

Jenis Pelarut

1.1 Phenolic Acid Extraction

– Asam fenolik umumnya ada dalam bentuk bebas, esterifikasi atau glikosilasi pada tanaman

Ayumi et alMengekstraksi asam

fenolik bebas pada beras

– Asam fenolik bebas dalam beras diekstraksi dengan etanol 70% pada suhu kamar diikuti dengan sentrifugasi.

– Ekstrak lalu diberi HCl 4 M HCl dan fraksi fenolik dipisahkan menggunakan etil asetat dan dikeringkan dengan anhidrat disodium sulfat.

– Asam fenolik esterifikasinya diekstraksi dengan menghilangkan asam fenolik bebas dan lipid masing-masing menggunakan etanol 70% dan heksan.

– Fraksi etil asetat kering diberikan 1 M NaOH yang mengandung 0,5% natrium borohidrida (NaBH4), kemudian disentrifugasi untuk mendapatkan supernatan yang jernih.

1.2. Flavonoid Extraction

– Ekstraksi dengan : metanol, etanol, aseton, air atau campuran dari pelarut ini dengan metode refluks.

– Setelah ekstraksi, glikosida flavonoid sering dihidrolisis menjadi bentuk aglikon dengan menggunakan HCl bawah N2.

– Berbagai jenis bahan tanaman herbal dengan 50% metanol diasamkan dengan HCl 1,2 M.

– Ditambahkan Asam askorbat untuk mencegah oksidasi campuran.

– Hidrolisis glikosida flavonoid dilakukan selama 2 jam pada 80 ° C

Haghi and Hatami Mengekstraksi Flavonoid dari berbagai jenis tanaman herbal

1.3 Anthocyanin/Proanthocyanidin Extraction

Ekstraksi dengan : pelarut yang diasamkan seperti air, aseton, etanol, metanol atau campuran pelarut berair.

Methanol merupakan pelarut yang paling umum dan efektif untuk mengekstraksi antosianin; Namun, metanol merupakan polutan lingkungan dan lebih toksik, sehingga digunakan etanol.

2. Modern Extraction Techniques for Phenolics

Persiapan sampel dan penghapusan zat yang tidak diinginkan untuk kuantifikasi yang akurat dari fenolat adalah penting, tetapi prosedur ekstraksi adalah penentu utama untuk pemisahan dan recovery fenolat.

2.1. Ultrasound-Assisted Extraction (UAE)

> 20 kHz; ekstraksi senyawa organik dan anorganik dari matriks padat dengan menggunakan pelarut cair.

Produksi gelombang suara yang menciptakan kavitasi gelembung gas pada jaringan sampel, memecah dinding sel, sehingga melepaskan isi sel.

Radiasi Ultrasonik

Sonikasi

Pelarut + sampel --> Sonikasi dibawah suhu kontrol pada waktu tertentu.Ekstrak yang diperoleh di pengaruhi juga oleh gelombang frekuensi dan distribusi gelombang ultrasonik

Metode

Mode statis : Ekstraksi dalam bejana tertutup, tidak ada penambahan pelarut secara terus menerus

Mode Dinamis : Ekstraksi dalam bejana, penambahan pelarut terus menerus, yang memungkinkan ekstraksi secara efisisen dan efektif.

Tujuan : Mencegah degradasi setiap senyawa thermolabil oleh panas.

UAE

Ekstraksi senyawa Fenolik (Potentilla atrosanguinea dan Pinus radiate), UAE lebih efektif dari Maserasi, tetapi kurang efektif dari Refluks, MAE dan UMAE

a : Total Phenolic Content ; b : Gallic acid equivalent

Extraction of biologically active compounds using UAE

2.2 Microwave-Assisted Extraction (MAE)

300 MHz dan 300 GHz; Meningkatkan pergerakan molekul pada bahan atau dipol pelarut, sampel menjadi panas; Dehidrasi sel dari penguapan; sel pecah; zat aktif keluar.

Gelombang Mikro Radiasi

- Penggunaan pelarut organic yang sedikit- Waktu ektraksi yang minimal (< 30 menit)- Hasil ekstraksi yang optimal

Keuntungan

Sampel Thermolabil

Pelarut (Heksan, kloroform dan toluene) atau campuran dengan pelarut tidak jernih, mencegah terjadinya degradasi sel.Pilih pelarut yang sesuai berdasarkan titik didih, factor disipasi dan tetapan dialektrik.

Pelarut polar memiliki tetapan dielektrik tinggi dan dapat menyerap gelombang mikro yang lebih sehingga menghasilkan senyawa fenolat yang optimum.Faktor disipasi : kekuatan pelarut untuk melepaskan energi panas yang diserap pada sampel

Pelarut Umum pada MAE

Polifenol : dipol yang dapat menyerap energy gelombang mikro karena memiliki gugus hidroksil.

Ekstraksi senyawa flavonoid dari Radix Astragalus, pelarut yang digunakan 60-100% v/v etanol; 10-40 mL pelarut/ g bahan; selama 5-30 menit iradiasi; 70-130oC; 200-1000 W dengan microwave. Ekstraksi paling efekif menggunakan 25 mL etanol 90% selama 25 menit pada suhu 110OC dengan kekuatan 1000 W.

Optimized Conditions for Phenolic Extraction from Plant-based Foods Using MAE

a : Total Phenolic Content

2.3. Ultrasound/Microwave Assisted Extraction (UMAE)

MAE : Mekanisme dielektrik untuk memanaskan sampel dan ekstraksi senyawa bioaktif tanaman.

UAE : Meningkatkan perpindahan massa dan meningkatkan penetrasi pelarut terhadap sampel.

UMAE : Teknik yang optimum untuk mengurangi waktu ekstraksi, volume pelarut yang minimal, hasil ekstraksi yang optimum.

Prinsip

Ekstraksi Flavonoid pada Spatholobus suberectus.UMAE : 20 mL/ g pelarut-sampel setelah 7,5 menit.Metode lain : 40 – 120 mL/ g setelah 30 – 3.600 menit.Ekstraksi senyawa likopen pada Tomat.UMAE : Ekstrak 97,4% Likopen selama 367 detik.UAE : Eksrak 89,4% likopen selama 1.746 detik.

Perbandingan UMAE

2.4. Supercritical Fluid Extraction (SFE)

- Menurunkan persyaratan pealrut organil toksik- Aman dan selektif tinggi- Waktu ekstraksi minimal- Pemisahan ekstrak dari cairan super kritis (SCF) terjaga (CO2, metana, etana,

propane, ammonia, etanol, benzene dan air)- Degradasi senyawa yang diekstraksi dapat dihindari- Kontaminasi sampel dengan kotoran pelarut jauh lebih rendah.

Keuntungan

Penentuan senyawa fenolik dari minyak biji delima. Metode SFE memberikan hasil signifikan yang lebih tinggi dibandingkan metode eksraksi lainnya.Penentuan total fenolik dan aktivitas antioksidan dengan menggunakan pelarut konvensional, metode SFE lebih tinggi dibandingkan metode MAE.

2.5. Subcritical Water Extraction (SCWE)

- Metode sederhana- Kualitas ekstrak tinggi- Waktu ekstraksi rendah - Ramah lingkungan karena pelarut air- Metode alternatif untuk ekstraksi total fenolik dalam jumlah besar tanpa residu

pelarut organik toksik.

Keuntungan

Air menjadi subkritis pada suhu 100-347OC dengan tekanan (10-60 bar) untuk menjaga dalam bentuk cair (dibawah 220OC).Pengurangan kondisi sub kritis oleh tetapan dielektrik air karena pemecahan ikatan hydrogen antar molekul. Air pada suhu kamar memiliki polaritas tinggi dan tetapan dielektrik mendekati 80.Penyesuaian tekanan pada SCWE dan suhu pada 250OC, tetapan dielektrik menjadi 27 (seperti etanol)

Ekstraksi antrakuinon dari mengkudu, aktivitas antioksidan pada ekstrak SCWE lebih tinggi dari ekstrak etanol dengan maserasi dan UAE.

Perbandingan

2.6. High Hydrostatic Pressure Extraction (HHPE)

Pemanfaatan tekanan hidrolik mom-thermal super tinggi (1.000 – 8.000 bar), bekerja atas dasar fenomena transportasi massa.HHPE menunjukan perbedaan tekanan besar antara membran sel bagian dalam dan bagian luar dan memungkinkan pelarut untuk menembus ke dalam sel yang menyebabkan kebocoran komponen sel. HHPE juga dapat menyebabkan deformasi sel dan denaturasi protein, yang dapat mengurangi selektivitas sel dan meningkatkan hasil ekstraksi.

Prinsip

Ekstraksi senyawa fenolik dengan HHPE pada buah-buahan seperti Maclura pomifera, antosianin dari anggur, flavonoid dari propolis, polifenol dari daun teh hijau menunjukan hasil yang lebih tinggi.

2.7. Metode Ekstraksi Lainnya

Metode non-termal; energi rendah; meningkatkan pemecahan membrane sel dan perpindahan massa. PEF pada kubis merah, strawberi, anggur yang diekstaksi menunjukan total fenolik yang tinggi.PEF pada jus apel yang diekstaksi menunjukan senyawa fenolik yang rendah.

Pulsed Electric Field (PEF)

Metode otomatis dengan bantuan nitrogen pada suhu dan tekanan tinggi; pelarut menembus ke dalam sel tanaman dan mencegah degradasi senyawa fenolik.

Accelerated Solvent Extraction (ASE)

Metode ekstraksi fenolik bebas dan terikat. Fenolik bebas diekstraksi dengan air di bawah atmoser nitrogen selama 20 menit. Residu dihidrolisis dengan NaOH selama 1 jam dibawah N2 dalam ruangan gelap pada suhu kamar.Ekstrak basa ditambahkan HCl untuk mencapai pH 2, disentrifugasi, dan ekstrak digunakan untuk penentuan fenolik terikat.

Sequential Alkaline Extraction

Fenolik pada tanaman sebagian besar berkaitan dengan polisakarida dinding sel tanaman oleh ikatan hidrofilik dan hidrofobik.Penambahan enzim, mungkin menghancurkan ikatan pada matriks dinding sel.Hidrolisis enzimatik menggunakan kombinasi pectinase, selulase dan hemiselulase ditunjukan untuk meningkatkan ekstraksi fenolik dari limbah padat Raspberry.

Ekstraksi Enzimatik

Singkatnya, MAE, UMAE, SFE dan Metode ekstraksi pelarut bertekanan seperti SCWE dan HHPE merupakan metode ekstraksi yang cepat dan efisien untuk mengekstraksi analit dari matriks tanaman dengan alasan kurangnya kebutuhan pelarut organik dan waktu ekstraksi yang cepat.

3. Quantification of Phenolics3.1. Spectrophotometric Assays

3.2. Gas Chromatography

3.3. High Performance Liquid Chromatography

3.4. Other Assays for Separation and Quantification of Phenolics

3.1. Spectrophotometric Assays– Spektrofotometri adalah salah satu teknik yang relatif sederhana untuk

kuantifikasi fenolat pada tanaman

– Metode The Folin-Denis & Folin Ciocalteu banyak banyak digunakan tes spektrofotometri untuk mengukur jumlah fenolat dalam bahan tanaman selama bertahun-tahun

– Kedua metode didasarkan pada pengurangan kimia yang melibatkan reagen yang mengandung tungsten dan molibdenum

– Produk dari pengurangan ini dengan adanya senyawa fenolik memiliki warna biru dengan spektrum penyerapan cahaya luas sekitar 760 nm.

– Reagen untuk kedua metode tidak bereaksi secara khusus hanya dengan fenol, tetapi juga dengan zat lain seperti asam askorbat, amina aromatik dan gula

3.2 Gas Chromatography– Kromatografi gas (GC) adalah teknik lain yang diterapkan untuk pemisahan,

identifikasi dan kuantifikasi senyawa fenolik seperti asam fenolik, tanin dan flavonoid kental

– Dengan GC, kuantifikasi fenolat dari matriks makanan mungkin melibatkan langkah pembersihan seperti penghapusan lipid dari ekstrak, pelepasan fenolat dari obligasi glikosida dan ester di enzimatik, alkaline dan asam media dan kimia langkah modifikasi, seperti transformasi ke derivat yang lebih mudah menguap

– Ada beberapa jenis reagen yang digunakan untuk memodifikasi dan menciptakan derivat volatile. Etil dan metil kloroformat, diazometana dan dimetil sulfoksida dalam kombinasi dengan metil iodat yang digunakan untuk membuat metil atau etil ester fenolat

3.3 High Performance Liquid Chromatography– HPLC adalah teknik yang lebih disukai untuk pemisahan dan kuantifikasi

senyawa fenolik. Berbagai faktor yang mempengaruhi analisis HPLC fenolat, termasuk pemurnian sampel, fase gerak, jenis kolom dan detektor

– Secara umum, fenolat dimurnikan diterapkan untuk instrumen HPLC memanfaatkan fase terbalik C18 kolom (RP-C18), foto dioda detektor array (PDA) dan polar pelarut organik diasamka

– Biasanya, sensitivitas HPLC dan deteksi didasarkan pada pemurnian fenolat dan pra-konsentrasi dari matriks kompleks ekstrak tanaman mentah.

3.4 Other Assays for Separation and Quantification of Phenolics– Kromatografi kertas (PC) dan kromatografi lapis tipis (TLC) adalah dua teknik partisi yang

digunakan untuk memisahkan fenolat dalam makanan.

– PC adalah metode sederhana dan tidak terlalu digunakan dibandingkan dengan HPLC dan GC. Salah satu contoh aplikasi penggunakan PC yaitu digunakan untuk memisahkan dan mengidentifikasi senyawa fenolik dari daun teh dengan butanol / asetat asam / air sebagai fase gerak. Dalam penelitian lain, flavonoid, asam fenolik dan glycoflavones telah dipisahkan dari tiga sayuran berdaun hijau menggunakan PC

– TLC adalah teknik yang lebih kuat daripada PC untuk menganalisis fenolat, terutama di ekstrak tumbuhan mentah. Fenolat dalam ekstrak tumbuhan mentah dapat dipisahkan dengan sejumlah teknik TLC, yang murah dan menyediakan untuk beberapa deteksi di plate TLC sama dalam waktu yang singkat analisis

KESIMPULAN– Sereal, sayuran dan buah konsumsi memberikan kontribusi untuk kesehatan

manusia yang lebih baik dan menurunkan risiko penyakit. Manfaat ini mungkin tergantung secara signifikan pada fenolik dari makanan ini.

– Dalam pemanfaatan senyawa fenolik kita harus mengetahui cara untuk menemukan, memodifikasi dan menggunakan teknik untuk ekstraksi, pemisahan dan kuantifikasi senyawa ini dari sumber alami. Metode ini harus sederhana, cepat, ramah lingkungan dan komprehensif.

– Ulasan ini telah disajikan gambaran teknik ekstraksi mutakhir untuk mengisolasi dan memurnikan fenolat dari sumber berbasis tumbuhan, dan memberikan informasi tentang beberapa pemisahan dan identifikasi metode canggih untuk fenolat tanaman.

TERIMA KASIH TERIMA KASIH

Prinsip UAE : Prinsip ekstraksi ultrasonik adalah dengan meningkatkan transfer massa yang disebabkan oleh naiknya penetrasi pelarut ke dalam jaringan tumbuhan lewat efek kapiler. Gelembung kavitasi akan terbentuk pada dinding sel tanaman akibat adanya gelombang ultrasonik. Efek dari pecahnya gelembung kavitasi ini dapat mengakibatkan peningkatan pori-pori dinding sel. Gelembung kavitasi akan terpecah disebabkan oleh tipisnya bagian kelenjar sel tumbuhan yang dapat mudah rusak oleh sonikasi (Melecchi dkk. 2006). Hal ini yang menyebabkan proses ekstraksi dengan menggunakan gelombang ultrasonik menjadi lebih cepat dari metode konvensional dengan cara maserasi maupun ekstraksi soxhlet. Medium yang dilewati akan mengalami getaran yang disebabkan oleh gelombang elektronik. Getaran yang diberikan gelombang ultrasonik akan memberikan pengadukan yang intensif terhadap proses ekstraksi. Proses Pengadukan akan meningkatkan osmosis antara bahan dengan pelarut sehingga akan mempercepat proses ekstraksi . kandungan fenolik pada suhu 60 0C senyawa fenolik mengalami degrdasi yang signifikan disebabkan oleh pengaruh suhu tinggi dan lama waktu pemaparan gelombang ultrasonik yang mengakibatkan berkurangnya kandungan fenolik.

Prinsip MAE : gelombang mikro yang terdapat di microwave dapat meningkatkan suhu pelarut pada bahan, yang dapat menyebabkan dinding sel pecah dan zat-zat yang terkandung di dalam sel keluar menuju pelarut, sehingga rendemen yang dihasilkan meningkat.

– Semakin lama bahan terpapar oleh radiasi gelombang mikro mengakibatkan pecahnya jaringan bahan sehingga akan mengeluarkan senyawa terlarut (solute) ke dalam pelarut (solvent).

– Adanya energi gelombang mikro mengakibatkan terjadinya pergerakan molekuler yang akan menimbulkan panas sehingga akan merusak dinding sel atau jaringan pada bahan. Rusaknya dinding sel atau jaringan ini akan mengakibatkan keluarnya senyawa terlarut (solute). Namun, semakin lama terpapar energi gelombang mikro juga dapat menyebabkan degradasi senyawa hasil ekstraksi. Semakin lama ekstraksi menyebabkan larutan menjadi jenuh dan daya ekstraknya menurun sehingga penambahan waktu tidak akan memberikan konsentrasi nyata

– Prinsip SWE : untuk menurunkan polaritas solvent air sehingga mendekati polaritas solut senyawa flavonoid (antosianin), dilain fihak juga menyebabkan penurunan tegangan permukaan air sehingga meningkatkan difusitasnya. Dalam kondisi demikian sifat kelarutan solut oleh solvent menjadi meningkat disamping itu molekul-molekul air akan bergerak bebas ke/dari jaringan tanaman yang diekstrak dan transfort solut antosianin keluar sel menjadi lebih cepat.

– Metode ekstraksi Subcritical water adalah pengunaan air sebagai pelarut dengan temperatur diantara titik didih (10 o C) dan temperature kritis air (37 o C) dengan tekanan di atas 1 atm