Présentation de mon stage de dut

CARACTÉRISATION DE MÉTHODES

D’ANALYSES SUR LES PRODUITS

LAITIERS

LABORATOIRE DÉPARTEMENTAL VÉTÉRINAIRE DU FINISTÈRE

• Création en 1961

• Accrédité COFRAC

• Une centaine d’employés

• Locaux de 4300m2

LES DIFFÉRENTS SECTEURS D’ACTIVITÉ

• Santé Animale

• Microbiologie des aliments et de l’eau

• Chimie Alimentaire, eau, environnement

• Administratif

LE SERVICE CHROMATOGRAPHIEAnalyses pour la qualité des :

• Eaux naturelles et de traitement

• Animaux d’élevage

• Produits laitiers

Les principaux clients :

• DDASS

• DSV

• Industriels privés

ANALYSES SUR LES PRODUITS LAITIERS

• Teneur en eau

• Matière sèche non grasse

• pH

• Acidité oléique

• Indice de peroxyde

• Dosage carotène, acide énantique, sitostérol

LES TRACEURS DANS LES PRODUITS LAITIERS• La CE vend des produits à prix réduits

• Marque de reconnaissance : ajout de traceurs

• Il existe 2 catégories : Chimique : acide énantique (B0)

sitostérol (B1)

Physique : vanilline (A0)

carotène (A2)

LES MÉTHODES D’ANALYSES

ÉTUDIÉES

DOSAGE DU CAROTÈNE

• Détermination de la pureté du carotène

• Gamme d’étalon

• Mesure des échantillons par un spectrophotomètre à 440nm

PRINCIPE DU DOSAGE

• Mesure de l’absorbance

• Loi de Beer Lambert :

A = E l C

Avec E le coefficient d’extinction

DOSAGE DE LA VANILLINE

Principe :• Extraction• Détermination RP-HPLC

Conditions chromato : Pompe : débit 1.0mL/min Injecteur : 20µL Détecteur : UV à 306nm Colonne : RP18 (merck 5µm) Phase mobile : eau(dont 3%acide acétique)

-méthanol (70:30, v/v)

PRINCIPE DE LA HPLC

• Séparation des constituants

d’un mélange

LES DIFFÉRENTS TYPES DE HPLC

1 - chromatographie d'adsorption2 - chromatographie de partage (en phase directe(2A) ou inverse(2B))3 - chromatographie d'échange d'ions (+ chromatographie ionique)4 - chromatographie de paires d'ions5 - chromatographie d'exclusion

6 - chromatographie d'affinité7 - chromatographie adaptée à la séparation d'énantiomères

• En phase inverse l’éluant est plus polaire que la phase stationnaire

• Donc silice greffée dans la colonne

HPLC en phase inversée

PHASE MOBILE

Deux possibilité :

Gradient d’élution : variation de la concentration de l’éluant

(utilisé pour les mélanges complexes)

Mode isocratique : concentration constante

VALIDATION ET CARACTÉRISATION DE MÉTHODES

• Méthode validation basée sur

la Norme XPT 90-210 AFNOR de décembre 1999

« Protocole d’évaluation d’une méthode alternative d’analyse physico-chimique quantitative par rapport à une méthode de référence »

• Trois plans à suivre de type A, B et C

PLAN DE TYPE A

Il permet de caractériser :

La linéarité

La limite de quantification

La limite de détection

LA LINÉARITÉ

• Connaître jusqu’où la mesure est linéaire

• Caractérisation de l’étalonnage

• Réalisation d’un plan à 5 niveaux de concentration et 5 répétitions

• Vérification par des calculs statistiques

LIMITES DE QUANTIFICATION ET DE DÉTECTION• Il existe 3 méthodes :

Issue de l’étude de la linéarité

Issue de l’étude du blanc de matrice

Par vérification d’une limite choisie :

Une concentration choisie

10 prises d’essais identiques

Dans des conditions de répétabilité

Vérification par calculs statistiques

• Limite de détection = LQ/3

PLAN DE TYPE B

• Il permet de contrôler les effets de la matrice sur la mesure

• Réalisation d’ajouts dosés

• Vérification de la présence d’interférences

• C’est la spécificité de la méthode

PLAN DE TYPE C

• Il permet d’estimer la répétabilité et la justesse de la méthode

• Comparaison

méthode de référence/méthode alternative

LA CARACTÉRISATION

• Valider une méthode de référence

• Les étapes à suivre : Linéarité

Limites de détection et de quantification

Répétabilité et reproductibilité

• Les facteurs étudiés dépendent de la manipulation

APPLICATIONS

LE CAROTÈNE

• La linéarité de l’appareil:

Gamme d’essais de 0.55 à 2.75 µg/mL en étalon de carotène

La linéarité est validée

Etude de la linéarité des traceurs A2 dans le beurre par spectroscopie

y = 0,3061x

R2 = 0,9977

0,000

0,100

0,200

0,300

0,400

0,500

0,600

0,700

0,800

0,900

1,000

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3

Concentration A2 (µg/mL)

Ab

sorb

ance

• Limites de détection et de quantification :

1) Essais à 0.1µg/mL

Limite non vérifiée

2) Essais à 0.2µg/mL

Limite de quantification à 0.2µg/mL validée

Limite de détection est 0.067µg/mL

• Répétabilité :

10 mesures avec des ajouts de 21µg de carotène dans le beurre non tracé

Rendement de 99%

• Linéarité de la manipulation :

Gamme de 0.55 à 2.75 µg/mL par ajouts

Etude de la linéarité des traceurs A2 dans le beurre par spectroscopie

y = 0,334xR2 = 0,9369

0,000

0,100

0,200

0,300

0,400

0,500

0,600

0,700

0,800

0,900

1,000

1,100

1,200

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3

Concentration A2 (µg/mL)

Abso

rban

ce

LA VANILLINE

•Linéarité de l’appareil:

Gamme d’étalons de 0.25 à 2 µg/mL

La linéarité est validée

Etude de la linéarité des traceurs A0 dans le beurre par chromatographie

y = 819571x

R2 = 0,9901

0

500000

1000000

1500000

2000000

0 0,5 1 1,5 2 2,5

Concentration A0 (µg/mL)

Air

e d

u p

ic

• Limites de détection et de quantification :

1) Essais à 0.2µg/mL

Limite non vérifiée

2) Essais à 0.25µg/mL

Limite de quantification à 0.25µg/mL validée

Limite de détection est 0.083µg/mL

• Répétabilité et reproductibilité :

10 échantillons mesuré avec 2 répétitions pour une concentration de 0.5µg/mL

Rendement de 107%• Linéarité de la

manipulation :

Gamme de 0.25 à 2 µg/mL avec des ajouts dans le beurre

Etude de la linéarité des traceurs A0 dans le beurre par chromatographie

y = 610624x

R2 = 0,9712

0

500000

1000000

1500000

2000000

0 0,5 1 1,5 2 2,5

Concentration A0 (µg/mL)

Air

e d

u p

ic

CONCLUSION

Les méthodes d’analyses du carotène et de la vanilline sont caractérisées