1 Practica Numero 1: Preparación de Medios de Cultivo. -Introducción: Los medios de cultivo son una mezcla de nutrientes que, en concentraciones adecuadas y en condiciones físicas optimas, permiten el crecimiento de los microorganismos. Estos medios son esenciales en los Laboratorios de Microbiología por lo que un control en su fabricación, preparación, conservación y usos asegura la exactitud, confiabilidad y reproducibilidad de los resultados obtenidos. En los laboratorios de microbiología se utilizan diferentes tipos de medios de cultivo que pueden ser preparados en forma líquida o sólida. Usualmente para preparar un medio sólido, se parte de un medio líquido al que se le añade un agente solidificante como el agar, la gelatina o la silicagel. Los medios de cultivo se pueden clasificar de acuerdo a la naturaleza de sus constituyentes en: MEDIOS NATURALES O COMPLEJOS: Constituidos por sustancias complejas de origen animal o vegetal, las que son usualmente complementadas por la adición de minerales y otras sustancias. En ellos no se conocen todos los componentes, ni las cantidades exactas presentes de cada uno de ellos. MEDIOS DEFINIDOS O SINTETICOS: Son los medios que tienen una composición química definida cuali y cuantitativamente. Generalmente se usan en trabajos de investigación.
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Practica Numero 1: Preparación de Medios de Cultivo.
-Introducción: Los medios de cultivo son una mezcla de nutrientes
que, en concentraciones adecuadas y en condiciones físicas optimas,
permiten el crecimiento de los microorganismos. Estos medios son
esenciales en los Laboratorios de Microbiología por lo que un control
en su fabricación, preparación, conservación y usos asegura la
exactitud, confiabilidad y reproducibilidad de los resultados
obtenidos.
En los laboratorios de microbiología se utilizan diferentes tipos de
medios de cultivo que pueden ser preparados en forma líquida o
sólida. Usualmente para preparar un medio sólido, se parte de un
medio líquido al que se le añade un agente solidificante como el agar,
la gelatina o la silicagel.
Los medios de cultivo se pueden clasificar de acuerdo a la naturaleza
de sus constituyentes en:
MEDIOS NATURALES O COMPLEJOS: Constituidos por
sustancias complejas de origen animal o vegetal, las que son
usualmente complementadas por la adición de minerales y
otras sustancias. En ellos no se conocen todos los
componentes, ni las cantidades exactas presentes de cada uno
de ellos.
MEDIOS DEFINIDOS O SINTETICOS: Son los medios que tienen
una composición química definida cuali y cuantitativamente.
Generalmente se usan en trabajos de investigación.
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De acuerdo al uso del medio de cultivo, estos se clasifican en:
MEDIOS DE ENRIQUECIMIENTO: Son medios líquidos que
favorecen el crecimiento de un tipo de microorganismos en
particular. Permiten aumentar el número de microorganismos
de este tipo. Usualmente contienen una o más sustancias
inhibidores del crecimiento de los microorganismos con
excepción de los que se quieren cultivar.
MEDIOS SELECTIVAS: Son parecidos a los de enriquecimiento,
se diferencian por medios sólidos y están diseñados para el
aislamiento de microorganismos específicos.
MEDIOS DIFERENCIALES: Son medios que contienen
indicadores de productos derivados de la actividad microbiana
de los microorganismos. No contienen ningún tipo de sustancia
con actividad antimicrobiana. Permiten revelar características
fisiológicas de los microorganismos.
Los medios de cultivo se pueden preparar en el laboratorio a partir
de cada uno de sus constituyentes básicos, o por simple
rehidratación de productos asequibles comercialmente (medios d
cultivo deshidratado). Generalmente se prefiere el uso de los medios
de cultivo deshidratados porque, además de simplificar el trabajo,
con ellos se tiene mayor probabilidad de obtener resultados
reproducibles.
Para su preparación se deben tener en cuenta los siguientes
aspectos:
Prepararlos sólo a partir de productos que provengan de
fabricantes o proveedores que suministren productos de
calidad.
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Utilizar agua destilada o desmineralizada con una calidad
microbiológica y fisicoquímica adecuada.
Utilizar materiales de vidrio bien lavado y enjuagado con agua
destilada o desmineralizada.
Controlar el tiempo y la temperatura recomendada durante su
esterilización. Nunca se deben exceder las condiciones
señaladas por el fabricante.
ALMACENAMIENTO DE LOS MEDIO DE CULTIVO.
Los medios de cultivo deshidratados se deben almacenar en envases
sellados bajo las condiciones que señale el fabricante. Generalmente
se almacenan en un lugar fresco (entre 15° y 25°), con poca humedad
y protegidos de la luz solar directa. Nunca se deben almacenar cerca
de autoclaves, hornos, ni otras fuentes de calor o vapor.
Los medios de cultivo deshidratados son higroscópicos. Cuando los
envases de estos medios de cultivo deshidratados son abiertos para
su uso inicial, se debe tener la precaución de cerrarlos tan pronto
como sea posible y mantenerlos bien cerrados para prevenir la
entrada de humedad. La absorción de agua produce cambios de pH,
formación de grumos, decoloraciones del polvo, etc., lo cual indica
que deben ser descartados porque pueden haber sufrido cambios
químicos o estar contaminados.
Una vez que el medio de cultivo ha sido preparado y esterilizado,
puede almacenarse a temperatura ambiente por un periodo máximo
de 2 semanas protegido de la luz, o por periodos mayores a 12-15°C.
Sin embargo, almacenados bajo refrigeración entre 2 y 8°C se
prolonga la vida útil de los mismos, (nunca por debajo de 0°C porque
se destruye la estructura del gel). Los medios de cultivo se deben
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mantener en recipientes bien cerrados para evitar su deshidratación
y cuando se usa tapón de algodón, se debe colocar por encima una
envoltura de papel (Craft).
Otro punto importante a tomar en cuenta, es que cada lote de medio
de cultivo preparado debe pasar por un riguroso proceso de control
de calidad, en donde se determinan sus propiedades fisicoquímicas
(apariencia, pH, etc.) y microbiológicas (esterilidad y promoción de
crecimiento) verificando que cumplan con los requisitos de calidad
establecidos y por ende demostrar que son aptos para su uso.
-Objetivo: Al finalizar el trabajo práctico nosotros como estudiantes
estaremos en capacidad de:
Preparar medios de cultivo a partir de sus ingredientes y a
partir de medios de cultivo deshidratados.
Indicando el método de esterilización apropiado.
-Fundamento: La preparación adecuada de un medio de cultivo nos
permite disponer de los nutrientes y condiciones necesarias para
favorecer el crecimiento de los microorganismos en el laboratorio.
-Materiales:
Cajas de Petri (5). Abatelenguas (1). Mechero (1). Jeringa (1).
Medio de Cultivo Agar
Sangre (1).
Agua Destilada (1). Tapón (1). Campana Extractora (1).
1. Para la toma de la muestra: Se tomó un hisopo estéril, se froto
y raspo suavemente en la parte posterior de la garganta,
tomando la muestra de las amígdalas.
2. Descargamos el hisopo en la caja de Petri de Sal y Manitol,
siempre cerca del mechero, como medida de precaución.
3. Se descargó el hisopo en una parte de la caja de Petri y así se
fue girando a 90° grados la caja de Petri y con ayuda del aza
bacteriológico se fue arrastrando la descarga en forma de
zigzag.
4. Posteriormente serramos la caja de Petri y la rotulamos, para
así guardarla y esperar si creció o no la bacteria.
-Resultado: Como resultado final, después de dejar crecer la
bacteria nos percatamos que creció Staphylococcus Áureos, donde
sus colonias presentaron un color amarillo que esto nos dice que es
coagulasa positivo. También queriéndose mostrar un color rosado
identificado como coagulasa negativo, pero no se extendió como
debería de ser, así que nos quedamos con el amarillo.
-Conclusión: En esta práctica que podría decirse sencilla pero muy
importante pudimos observar como se muestra una colonia, su
forma color de Staphylococcus.
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Practica Numero 3: Siembra en Medios de Cultivo.
-Introducción: Un cultivo es un método para la multiplicación de
microorganismos, tales como hongos, bacterias y parásitos, en el
que se prepara un medio óptimo para favorecer el proceso deseado.
Un cultivo es deseado como un método fundamental para el estudio
de las bacterias y otros microorganismos que causan enfermedades
en medicina humana.
Un microorganismo se puede sembrar en un medio líquido o solido
de agar. Los medios de cultivo contiene distintos nutrientes que van,
desde azúcares simples asta sustancias complejas como la sangre o
el extracto de caldo de carne. Para aislar o purificar una especie
bacteriana a partir de una muestra de forma por muchos tipos de
bacterias, se siembra en un medio de cultivo solido donde las células
que se multiplican no cambian de localización; tras muchos ciclos
reproductivos, cada bacteria individual genera por escisión binaria
una colonia macroscópica compuesta por decenas de millones de
células similares a la original. Si esta colonia individual se siembra a
su vez en un nuevo medio crecerá como cultivo puro de un solo tipo
de bacteria.
La principal diferencia entre en un medio de cultivo sólido y uno
liquido es que el medio de cultivo contiene 1,5-2% de agar-agar,
mientras que el líquido no contiene agar-agar.
Muchas especies bacterianas son tan parecidas morfológicamente
que es imposible diferenciarlas solo con el uso del microscopio. En
este caso, para identificar cada tipo de bacteria, se estudian sus
características bioquímicas sembrándolas en medios de cultivo
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especiales. Así, algunos medios contienen un producto que inhibe el
crecimiento de la mayoría de las especies bacterianas, pero no la del
tipo que se desea averiguar si está presente. Otra veces, el medio de
cultivo contiene determinados azucares especiales que solo pueden
utilizar algunas bacterias. En algunos medios se añaden indicadores
de pH que cambian de color cuando uno de los nutrientes del medio
es fermentado y se generan catabolismos ácidos. Si las bacterias son
capaces de producir fermentación, generan gases que pueden ser
detectados cuando el cultivo se realiza en un tubo cerrado.
Con otros cultivos se puede identificar si las bacterias producen
determinación de enzimas que digieren los nutrientes. Así, algunas
bacterias con enzimas hemolíticas (capaces de romper glóbulos
rojos) producen hidrolisis y cambios apreciables prosaicamente en
las placas de agar-sangre.
Los diferentes medios y técnicas de cultivo son esenciales en un
laboratorio de microbiología de un hospital, pues sirven para
identificar las bacterias causadas de las enfermedades infecciosas y
los antibióticos a los que son sensibles esas bacterias. Los cultivos
suelen usarse en medicina para determinar agentes patógenos en
fluidos corporales (como por ejemplo la sangre y orina).
Los medios de cultivo, para poder ser utilizados y garantizar que los
resultados obtenidos a partir de ellos sean confiables, deben cumplir
con los siguientes requisitos:
-Disponibilidad de nutrientes.
-Consistencia adecuada del medio.
-Presencia o ausencia de oxígeno y otros gases.
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-Condiciones adecuadas de humedad (mantener en frigorífico).
-Luz ambiental.
-pH adecuado.
-Temperatura.
-Esterilidad.
En la siembra en medios de cultivo estos son algunos ejemplos de lo
que se puede observar en cada uno de ellos:
AGAR SANGRE: Enterococcus cultivo en agar sangre
donde creció a las 24 horas colonias de
Enterococcus faecalis. Tienen un tamaño entre 0.5 y
1 mm, a menudos opacos y blancos, que suelen ser
α hemolíticos o no hemolíticas, aunque algunos
casos aparecen β hemolíticas.
AGAR MACCONKEY: Es un medio diferencial porque
contiene lactosa y un indicador de pH (rojo neutro).
Las bacterias capaces de fermentar lactosa
producirán un cambio en el pH del medio por
l iberación de productos ácidos. Como consecuencia
sus colonias aparecerán de color fucsia/violeta,
contrastando con la coloración amarillenta de las
colonias incapaces de fermentar la lactos a.
AGAR AZUL DE METILENO (EMB): Las colonias
fermentadoras son de color rosado. Escherichia Coli
fermenta los azucares y forma colonias verdes con
bril lo metálico. Las colonias no fermentadoras son
incoloras
AGAR SALMONELLA SHIGELLA: Las cepas de Shigella
y la mayoría de Salmonella presentan colonias
incoloras. Colonias trasparentes con centro negro:
Proteus y algunas Salmonellas. Las bacterias
fermentadoras de Lactosa presentan colonias rojas
a rosadas.
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-Objetivo: Practicar el aislamiento de bacterias en el Laboratorio
utilizando la técnica de siembra en cajas de Petri.
-Fundamento: En el manejo de muestras contaminadas o cultivos
mixtos en los que se encuentran diversos microorganismos, el primer paso para proceder a su estudio es el aislamiento, es decir la separación de cada uno de los posibles integrantes microbianos de la muestra. Existen diversos métodos para conseguir esta separación, la mayoría de ellos basados en la inmovilización de las células microbianas en la superficie de los medios de cultivo sólidos. Al depositar una célula bacteriana o una levadura en un punto del medio de cultivo, ésta quedará inmovilizada en ese punto y en él se reproducirá por absorción de los nutrientes del medio. Las nuevas células generadas permanecerán igualmente inmóviles y tras sucesivas generaciones conformarán lo que denominamos una "colonia" que no es más que un montón de células derivadas de una sola célula madre inicial, es decir, un clon de la bacteria o levadura depositada al sembrar. Esta colonia es visible al ojo humano y presenta diferentes características según el microorganismo que la genera. Esto nos permite distinguir las diferentes poblaciones microbianas que se encuentran en la muestra sembrada y separarlas transfiriendo una colonia de cada tipo a un nuevo medio de cultivo estéril, a estos cultivos los
consideraremos "puros" por poseer un sólo tipo de microorganismo. (El fundamento es válido teniendo en cuenta sólo microorganismos cultivables)
-Material: Cajas de Petri con Agar Sangre (2).
Caja de Petri con Agar Macconkey (1).
Cepas de Streptococcus.
Cepas de Staphylococcus áureos.
Mechero (1). Asa Bacteriológica (1).
Cinta Mástil (1). Marcador (1).
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-Procedimiento:
1. Esterilizamos el asa bacteriológica, enfriamos en el medio en un lado del cultivo, con el asa levantar la bacteria, para llevarla al nuevo cultivo, pero nunca separar el asa del mechero para un mejor funcionamiento.
2. Levantamos la tapa de la placa donde se va a sembrar, depositamos el inoculo en el primer sector (descarga) hacer un zigzag, pero solo tocando 2 o 3 veces la descarga.
3. Y a si nuevamente esterilizamos el asa la dejamos enfriar en una parte de la placa sin tocar el inocuo, giramos e 90 grados e hicimos estrías en zigzag y así lo repetimos dos veces más, cerramos la placa.
4. Las rotulamos y las dejamos incubar durante 24 horas, para así ver si creció alguna bacteria.
-Resultados: En esta tabla se muestra que nos creció en los medios
que nos tocó: AGAR MACCONKEY: En esta podemos
observar que torno un color rosado esto quiere decir que es fermentadora de
lactosa y esto también hace que su pH baje a menos de 6,8 y ase este color
característico. AGAR SANGRE: En este medio podemos
observar un color blanquecino característico de Staphylococcus áureos y
son β hemolíticas, también podemos observar que sus colonias son redondas unas separadas y otras juntas. AGAR SANGRE: En este medio podemos observar que es un Streptococcus β
hemolíticos con un color como amarillento y en colonias redondas separadas y juntas.
-Conclusión: En esta práctica podemos observar cómo se manifiestan las bacterias en los diferentes cultivos bacteriológicos.
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Practica Numero 4: Antibiograma.
-Introducción: Es la prueba microbiológica que se realiza para determinar la susceptibilidad (sensibilidad o resistencia) de una bacteria a un grupo de antibióticos. Las técnicas de antibiograma son las utilizadas en el laboratorio de microbiología para estudiar la actividad de los antimicrobianos frente a los microorganismos responsables de las infecciones.
Se considera como antimicrobiano cualquier sustancia con capacidad de matar o al menos de inhibir el crecimiento de los microorganismos y que sea susceptible de utilización como tratamiento en los pacientes. Pueden ser naturales, sintéticos o semisintéticos (modificación química de un compuesto natural). La
historia moderna de los antibióticos comienza con el descubrimiento de sustancias presentes en unos microorganismos capaces de matar a otros microorganismos. La utilización de antibióticos supuso un avance enorme en la esperanza de vida de las personas que padecían procesos infecciosos, aunque también supuso un aumento en los niveles de resistencia antibiótica.
El antibiograma tiene cuatro utilidades principales:
La utilidad básica del antibiograma es la instauración de un tratamiento antibiótico correcto al paciente. Es necesario conocer si el microorganismo responsable de la infección posee mecanismos que le confieran inmunidad frente a algún antibiótico para no incluirlo como terapia.
En cuanto al tratamiento el antibiograma no sólo es necesario en la instauración, también resulta útil en el seguimiento e incluso en la confirmación de tratamientos empíricos. En ocasiones la enfermedad infecciosa resulta grave y se comienza el tratamiento antes de conocer los datos de sensibilidad de la cepa. El
antibiograma tiene que confirmar, o en su caso corregir el
tratamiento.
Otra aplicación de las técnicas de estudio de resistencia es la epidemiología. Es necesario detectar el aumento de los niveles de resistencia en los aislamientos clínicos para tomar medidas correctoras.
Por otro lado también puede tener utilidad diagnóstica porque el perfil de resistencia puede en algún caso orientar en la identificación bacteriana.
Existen multitud de antimicrobianos en el mercado y el número sigue creciendo porque el desarrollo de más mecanismos de resistencia por parte de los microorganismos se traduce en un esfuerzo mayor por fabricar más y mejores antibióticos. No es necesario contrastar la eficacia de todos los antibióticos para cada aislamiento bacteriano. Los criterios que se siguen para seleccionar que antimicrobianos se ensayan respondes a factores de diversa índole:
Factores microbiológicos: Tipo de agente infeccioso y mecanismos de resistencia descritos previamente en su especie.
Factores farmacológicos: Tipo de antimicrobiano y parámetros de absorción, distribución y eliminación.
Factores del paciente: Tipo de infección. Factores de riesgo y estado general de salud. Situación inmunológica e hipersensibilidad.
Experiencia anterior referente a los patrones de resistencia antibiótica más habituales para cada especie.
Estos son los resultados que deberían de aparecer en un
antibiograma:
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Resultado del Disco anterior:
PLANTAS DE ESTUDIO RESISTENCIA SUSCEPTIBLE
CUACHALALATE X Se observan cambios de coloración. ESTAFIATE X
EUCALIPTO X Se observan cambios de coloración. QUINA AMARILLA X Se observan cambios de coloración.
TOMILLO X
ANTIBIÓTICOS RESISTENCIA SUSCEPTIBLE
AMIKACINA XXX
AMPICILINA XXX CARBENICILINA XXX
CEFOTAXIMA XXX CEFTRIAXONA XXX
CLORANFENICOL XXX GENTAMICINA XXX
NETILMICINA XXX NITROFURANTOINA XXX
TRIMETROPIM SULFAMEROXAZOL XXX
-Objetivo: Observar la sensibilidad de bacterias a la acción de
diversos antibióticos.
-Fundamento: El antibiograma lo que hace es evaluar la
sensibilidad de un microorganismo a ciertos medicamentos.
Los parámetros para elegir los antibióticos a probar son los
siguientes:
Factores microbiológicos: Tipo de agente infeccioso y mecanismos
de resistencia descritos previamente en su especie.
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Factores farmacológicos: Tipo de antimicrobiano y parámetros de
absorción, distribución y eliminación.
Factores del paciente: Tipo de infección. Factores de riesgo y estado
general de salud. Situación inmunológica e hipersensibilidad.
Experiencia anterior referente a los patrones de resistencia
antibiótica más habituales para cada especie.
-Material:
Cepas de Streptococcus y
Staphylococcus en placa de
agar nutri tivo.
Ca ja de Petri con agar
Muel ler-Hinton en placa de
agar nutri tivo.
Discos de antibióticos para
gran pos i tivos .
Discos de antibióticos para
gran negativos .
Pinzas metálicas. Tubos con solución salina
estéri l .
Hisopos estéri les . Mecheros .
Asas Bacteriológicas Tuvo 0.5 del Nefelómetro
de McFarland.
Cinta Másti l . Plumón permanente.
-Procedimiento:
1. Con el asa bacteriológica previamente esterilizada y enfriada,
se tomó una pequeña porción de la colonia bacteriana a
estudiar.
2. En un tubo conteniendo solución salina estéril, hicimos una
suspensión al tubo 0.5 del Nefelómetro
3. Con un hisopo estéril tomamos bacterias de la suspensión,
mojando y presionando el hisopo sobre las paredes del tubo de
ensaye para evitar el exceso de suspensión.
4. Se tomó la placa de Mueller-Hinton, se sostuvo con la mano
izquierda, se levantó la tapa ligeramente y se procedió a
realizar el extendido de la suspensión bacteriana rotando el
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hisopo uniformemente por toda la superficie de la placa,
girando la placa varias veces.
5. Se desechó el hisopo en un recipiente ya flameado en el
mechero.
6. Con ayuda de la pinza, se colocó los discos individuales, sobre
la superficie de la placa de cultivo de Mueller-Hinton, este
procedimiento se hiso teniendo encendido un mechero para
poder evitar cualquier tipo de contaminación.
7. Incubamos las placas en un promedio de 24 horas, para así
poder observar las reacciones.
-Resultado: En este apartado tuvimos la mala suerte de no poder
observar las reacciones correspondientes, esto fue por un mal
manejo y un mal extendimiento de la suspensión.
-Conclusión: En esta práctica debíamos de haber observado un gran
funcionamiento de lo que son las reacciones antibióticas, pero por
un mal funcionamiento, no logramos hacerlo, pero esto nos llevó a
pensar que si llega a haber otra práctica de este tipo ahora si hacerlo