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Recuperacin de ovocitos de ovarios de vacas sacrificadas del
camal Don Goyo - Arequipa!!
Adan Meneses Cruz!!Laboratorio de Biotecnologia Animal, Programa
Profesional de Ingeniera Biotecnologica, Universidad Catolica de
Santa Maria - Arequipa. !!!Resumen!!La recuperacin y conservacin de
ovocitos in vitro e in vivo de vacas de alta calidad es una de las
tcnicas mas importantes en la mejora gentica de ganado vacuno. Esta
tcnica sirve como base para otras tcnicas aun mas complejas como,
clonacin, inseminacin in vitro y transferencia de embriones. Ademas
el trabajo no consiste en solo recuperar ovocito viables sino en
clasificarlos, para poder seleccionar los mejores. !!En la presente
practica de laboratorio se recuper ovocitos de ovarios de vacas
sacrificadas en el centro de beneficio Don Goyo en el departamento
de Arequipa, se utiliz 2 mtodos de recuperacin; corte o incisin al
ovario y inyeccin. Posteriormente se observo los ovocitos en un
microscopio y estereoscopio y finalmente se los clasificaos de
acuerdo a sus caractersticas morfolgicas como zona pelucida,
aspecto del citoplasma y caractersticas de la membrana
plasmatica.!!Palabras clave: ovocito, estereoscopio, zona pelucida,
ovario.!!Abstract !!The recovery and preservation of oocytes in
vitro and in vivo high quality cows is one of the most important
techniques in breeding cattle. This technique is the basis for
other even more complex techniques such as cloning, in vitro
fertilization and embryo transfer. Besides, the job is not only to
recover but to classify viable oocyte, to select the best. !!In the
present laboratory practice oocytes in ovaries of slaughtered cows
profit center Don Goyo in the department of Arequipa, recovered two
recovery methods I use are; cutting or incision the ovary and
injection. Then the oocytes were observed under a microscope and
stereoscope and finally the considered of according to their
morphological characteristics as zona pellucida, cytoplasm
appearance and characteristics of the plasma membrane. !!Keywords:
egg, stereoscope, zona pellucida, ovary.!1. Introduccin!!La mejora
gent ica de vacas en la biotecnologia animal, consiste
principalmente en el cruce selectivo de ejemplares con caracter s t
icas fenot ip icas a l tamente deseables como, mejores tasas de
produccin de leche, carne, mejor clidas de leche, un desarrollo mas
rpido de musculatura, etc. Para poder llevar a cabo estas mejores,
se utiliza tcnicas como clonacion, inseminacin in vitro y
transferencia de embriones. El xito de estas tcnicas consiste en la
calidad de los !!
!!!gametos masculinos y femeninos; el semen y vulos u ovocitos.
!!El control de la calidad del semen de un toro, es una tarea
sencilla y en muchos casos rutinaria, la cual consiste en una
evaluacin de la motilidad, viabilidad y morfologa de los
espermatozoides utilizando un microscopio, en cambio la
recuperacin, clasificacin y conservacin de ovocitos viables y
adecuada es una tarea mas complicada. Ademas los ovocitos son mas
difciles de conseguir y son
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mas escasos, normalmente las vacas maduras solo produce 1
ovocito por ciclo estral. Para vencer este obstculo, se puede
realizar una sper ovulacion inducida por hormonas.!!Luego se
procede con la obtencin o recuperacin de ovocitos, esta etapa se
puede hacer por dos diferentes estrategias; la p r imera es t ra
teg ia cons is te en una recuperacin in vivo, en donde de realiza
un lavado de las trompas y ovarios utilizando un medio clular
especial que asegure la supervivencia del ovocito; y la segunda
estrategia consiste en el recuperacin de los ovocitos in vitro de
los ovarios de una vaca sacrificada. !!El ultimo paso es la
clasificaron del ovocito recuperado, esta se realiza mediante la o
b s e r v a c i n d e l a s c a r a c t e r s t i c a s mor fo lg
icas de l ovoc i to usando un estereoscopio o un microscopio y se
evala siguiendo una serie de criterios como la integridad de la
zona pelucida, apariencia del citoplasma, membrana plasmatica, etc.
!!2. Marco terico!!La aplicacin de los procedimientos de
fertilizacin in vitro (FTV) en la reproduccin bovina se ha
incrementado en los ltimos aos y en un futuro puede llegar a ser
utilizada en programas de gran escala en la produccin comercial de
embriones in vitro. Dentro de este concepto, la recoleccin de
ovocitos es un paso necesario para poder llegar a establecer estos
programas de FIV.!!Los ovarios contienen un elevado nmero de
folculos que se encuentran en diferentes estados de desarrollo
(primordiales, en crecimiento, atrsicos), de los cuales solamente
una pequea proporcin va a ser utilizada durante la vida
reproductiva del animal. La recoleccin de ovocitos permite
recuperar y aprovechar fo l cu los no ovulatorios, que bajo
condiciones fisiolgicas se tornaran en folculos atrsicos.!!!La
obtencin de ovarios provenientes de vacas sacrificadas en el
matadero suministra una fuente abundante de ovocitos obtenidos a
bajo costo, provenientes de animales en diferentes estados del
ciclo estral, que pueden
ser madurados, fertilizados y cultivados in vitro hasta estados
avanzados del desarrollo embrionario.!!2.1 Origen de los ovocitos.
!!a) H e m b r a s v i v a s : e s t a t c n i c a d e
recuperacin de ovocitos se aplica cuando la vaca posee un alto
valor gentico, teniendo caractersticas muy buenas. Se escoge ademas
animales que son frtiles, evitando hembras prepberes, gestantes,
infertiles y aquellas hembras que no responden al tratamiento de
sper ovulacion. Las tcnicas mas usadas son:!!
- OPU: Ovum Pick Up: la cual es una aspiracin transvaginal
guiada por ultrasonido. Esta tecnica permite la recuperacin de
ovocitos mediante aspiracin al vaco, generalmente se usa animales
con pre-tratamiento hormona. !!
OPU no requiere que el animal tenga un ciclo reproduct ivo
normal , cuando se usa conjuntamente con tcnicas de fecundacin in
vitro, se acorta el intervalo generacional y aumenta la mejora
gentica maternal produciendo mas progenie que por mtodos
convencionales. !!b) Hembras ovariectomizadas: utilizando esta
tcnica se obtiene pocos ovocitos a un elevado precio, ademas es
necesario tratar a las hembras con hormonas (FSH), y es necesario
conocer la situacin fisiolgica/ patolgica de las hembras como raza,
edad, estado de lactacin, nutricin, estado reproductivo, etc.!!
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c) Hembras de matadero: esta consiste la fuente principal de
ovocitos, es una tcnica de bajo costo, recogiendo un elevado numero
de ovoc i tos en func in a l as hembras sacr ificadas, una de las
desventajas principales es el desconocimiento total o parcial de la
situacin fisiolgica/ patolgica de la hembra donante. !
Los principales factores tcnicos que afectan la eficiencia de la
aspiracin transvaginal guiada por ultrasonido son el procedimiento
de obtencin, el dimetro de la aguja usada y la presin de aspiracin.
!!Los factores biolgicos son; el momento del ciclo estral en el
cual se realiza la aspiracin, las condiciones corporales del
animal, la raza, la edad y el tipo de estimulacin del crecimiento
folicular. !!2.2 Tcnicas de recogida de los ovocitos. !!a)
Diseccin:!!Consiste en aislar cada folculo ovrico del resto de
tejido con ayuda de pinzas y tijeras, liberando posteriormente los
ovocitos tras la ruptura controlada del folculo intacto. !!En esta
tcnica, el dimetro y atresia del folculo son conocidos, el
rendimiento es elevado; se obtiene 90 a 100 ovocitos por 100
folculos seleccionados, la mayor proporcin de los ovocitos son de
buena calidad (60%), una de las limitaciones consiste en el tiempo
pues solamente se puede experimentar con pocos ovocitos.!!b)
Aspiracin: !!Consiste en la puncin y extraccin del contenido de los
folculos mediante una aguja
conectada a una jeringa u otro mtodo de succin. Este es el
metido mas usado cuando se trabaja con ovocitos de bovino. !Se
obtiene un menor rendimiento; de 30 a 60 ovocitos por cada 100
folculos aspirados, menor calidad del cumulus ( disgregacin de las
clulas), menor proporcin de ovocitos de buena calidad (45%), se
tiene una mayor rapidez de recogida y es necesario una seleccin mas
estricta. !!!c) Slicing: !!Consiste en realizar cortes
longitudinales y transversales con una hoja de bistur en la
superficie de los ovarios para liberar los ovocitos. Esta tcnica
presenta mayor porcentaje de ovocitos recuperados por ovario, pero
con una menor proporcin de ovocitos de buena calidad ( 30 a 45%),
los ovocitos recuperados presentan menor integridad del cumulus.
Una de sus principales ventajas es la mayor rapidez de recogida de
ovocitos. !!d) Otros mtodos: !!Digestin del tejido ovrico con
tripsina durante 1 hora y posterior filtracin y separacin de
ovocitos/ ovario. !!Digestin de tejido ovrico con colagenasa
(ovocitos preantrales)!!2.3 Seleccin de los ovocitos. !!Parmetros
visuales: !!
3 o ms capas de clulas del cumulus !!(Mayor % blastocistos:
>5 capas) Intercambio de metabolitos y seales entre ovocito y c
lu l as de l cumu lus madu rac in citoplasmtica!Desechar ovocitos
denudados o con cumulus incompleto!Geshi et al. (1999): terneros a
partir de ovocitos madurados sin cumulus en un medio de maduracin
suplementado con piruvato sdico y sin suero.!!!!!!
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Cmulus compacto vs cumulus expandido!!Blond in and S i rard
(1992) : cumulus ligeramente expandido vs cumulus compacto o
expandido!Wurth and Kriup (1992): cumulus ligeramente expandido y
clulas ms oscuras vs cumulus compacto y clulas brillantes.!!
Apariencia homognea del citoplasma vs heterognea!!
Nagano et al. (1999): citoplasma heterogneo > potencial de
desarrollo embrionario: presentan una mejor distribucin de los
grnulos corticales (ME) disminucin de la poliespermia!!2.4 Sistemas
de maduracion in vitro !!- Medios de maduracin!!Se puede utilizar
diferentes medios, de soluciones salinas a medios mas complejos
como por ejemplo:!TCM 199: sales, piruvato sdico, lactato sdico,
aminocidos, vitaminas, purinas,..+/- tampones: Hepes, bicarbonato
sdico!pH: 7.2-7.4!Osmolaridad: 285-320 mOsm/kg.!!!-
Suplementos!!Estos son los encargados de proporcionar condiciones
mas especificas, varian de acuerdo a cada especie animal. !Sueros:
fuente de protenas, cidos grasos, VV, hormonas, factores de
crecimiento, ..!Suero fetal bovino, suero de vaca en celo, suero de
buey Hormonas: FSH, LH, estrgenos:!Epidermal Growth
Factor!Cisteina, cisteamina, -mercaptoetanol: precursores del
glutation!Glutatin: su concentracin intracitoplasmtica aumenta
durante la maduracin Protege al ovocito de reacciones
oxidativas!Favorece la descondensac in de la cromatina formacin del
PN masculino!!- Condiciones de cultivo !!Temperatura: la
temperatura mas adecuada para el cultivo de ovocitos es de 38.5
grados Centgrados. !
Si < 25 C: se producirn anormalidades del huso cromosmico !Si
> 40 C: causara poliespermia. !Atmsfera: es estrictamente
necesario utilizar una incubadora con 5% CO2, sobretodo si el medio
de MIV contiene bicarbonato. Si es posible el cultivo se debe
realizar en una incubadora de CO2 humidificada. !!Tiempo: el tiempo
de maduracion y 24 h (vaca), 26 h (oveja), 27 h (cabra), 40-44h
(cerda)!!- Sistemas de maduracin!!Se puede utilizar , diferentes
sistemas; !!
Microgotas 50 o 100 l recubiertas por aceite mineral.!Placas de
4 pocillos: 500 l!Placas de petri : 2 ml!Co-cultivo: clulas de la
granulosa!
clulas Vero: clulas de rin de Green monkey. Esttico sin clulas /
no esttico + clulas granulosa.!!2.5 Factores que afectan el
ovocito!!
Dimetro del folculo. !!Cuando se obtiene ovocitos procedentes de
folculos pequeos (1-2 mm) estos tienen maduracin nuclear pero son
inmaduros citoplasmticamente.!Ovocitos procedentes de folculos
medianos (2-5 mm) o grandes (5-8mm): poseen un porcentaje de
maduracin nuclear mayor.!!
Dimetro del ovocito. !!Existe una relacin entre el tamao del
folculo y el desarrollo del ovocito, y tambin existe una relacin
entre el crecimiento del ovocito y su capacidad del desarrollo in
vitro. !!Competencia meitica aparece cuando el ovocito alcanza el
80-90% de su tamao pero hasta que no alcanzan su tamao mximo, no
puede completar la maduracin citoplasmtica (Thibault et al).!! 90
m: Incapaces de reiniciar la meiosis
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Folculo4: ovocito 117.2 m!115 m: reinican la meiosis/ 120 m:
maduracin nuclear y citoplasmtica!!
Morfologa del ovario!!Gandolfi et al. (1997) seala: !!A)
Presencia de un folculo > 10 mm dimetro!B) Presencia de ms de 10
folculos de 2 a 5 mm de dimetro y ninguno de >10 mm!C) Presencia
de menos de 10 folculos de 2 a 5 mm de dimetro y ninguno de > 10
mm!!
Edad!!Se recomienda evitar trabajar con animales prepberes o muy
adultos. !Un factor muy importante es el estado hormonal Ciclo
estral.!!Para mejorar estos factores se recomienda tratamientos
hormonales (FSH o PMSG)!!!3. Materiales y mtodos!!3.1 Materiales!!-
Ovarios de vacuno recolectados post
morten.!- Cloruro de sodio 0,9%.!- Vaso de precipitados de 200
ml.!- Jeringa de 5 ml.!- Placas petri.!- Pinzas.!
Fig. 1. Materiales utilizando en la practica.!
- Visturi.!- Tijera. !- Pipetas.!- Papel toalla.!- Guantes.!-
Estereoscopio.!- Microscopio.!!3.2 Procedimiento. !!Se recolecto
ovarios de una vaca la cual habia sido sacrificada. Se los almaceno
a bajas temperaturas para evitar la muerte de los ovocitos, es
recomendable que el proceso de almacenamiento no dure mas de 8
horas, de lo contrario se veria comprometida la integridad de los
ovocitos.!!Luego se corto el tejido muscular que se encontraba
cerca del ovario.!Fig. 2. Se cort el tejido perifrico del
ovario,
utilizando pinzas y bistur. !!- Se lav el ovario con suero
fisiologico 3 veces. !
Fig. 3. Se lav el ovario para eliminar la sangre. !
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Metodo de corte.!!Despus de lavar el ovario, se lo coloc sobre
una placa petri, se seleccion un folculo de 3 mm de dimetro, se
sujet el ovario y se lo realiz un corte superficial de manera
transversal al folculo seleccionado. Se vaci todo el contenido
folicular sobre una lamina porta-objetos y se lo observ en el
microscopio o estereoscopio. !
Fig. 4. Se utiliz para este mtodo ovarios de vaca con mltiples
folculos.!!
Mtodo de aspirado folicular. !!Despus de lavar el ovario, se lo
coloc sobre una placa petri, se seleccion un folculo de 3 mm de
dimetro, se sujet el ovario y se aspir el contenido del folculo
utilizando una jeringa de 5 ml, luego se vaci el contenido del
folculo sobre una lamina porta-objetos. Se observ en un microscopio
o estereoscopio y finalmente se evalu la calidad de los ovocitos.
!
Fig. 5. Mtodo de aspirado folicular.!!
!4. Resultados !!Despus de realizar los dos mtodos propuestos en
la practica, se pudo localizar ovocitos de manera exitosa
utilizando ambos mtodos.!
Fig. 6. Visualizacin de un ovocito obtenido por el mtodo de
aspirado folicular, utilizando un microscopio ptico, con objetivo
10X.!!En ambos ovarios utilizados se encontr ovocitos, a pesar de
que haba transcurrido un tiempo considerable desde la muerte de la
vaca. !
Fig. 7. Visualizacin de un ovocito obtenido por el mtodo de
corte, utilizando un estereoscopio.!!Ademas de localizarlos se los
evalo de acuerdo a sus principales caractersticas morfolgicas,
utilizando !!Se pudo observar ovocitos a diferentes estadios de
maduracin, as como diferentes calidades de estos. !!
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5. Conclusiones.!!Se pudo concluir:!!Primero, el metido de
puncin folicular, tuvo mejores resultados que el mtodo de
corte.!!Segundo, la localizacion del los ovocitos usando un
microscopio optimo es mas fcil y rpida que usando el
estereoscopio.!!Tercero, la recuperacin de ovocitos es una tcnica
compleja que requiere mucha experiencia y conocimiento del operador
para poder ser llevada a cabo con xito y en poco tiempo. !!6.
Discusin.!!Los resultados encontrados coinciden con lo reportado
por Takagi et. al. que menciona mayores valores de ovocitos para el
mtodo de aspiracin, que para el mtodo de corte seriado. Esto podra
deberse a que cuando se realizan los cortes, parte del liquido
folicular escapa. !!6. Aporte biotecnologico.!!La recuperacin de
ovocitos en biotecnologa puede ser usada en casos de que se tenga
una vaca con excelentes caractersticas y esta no puede quedar
preada cuando se le practica una inseminacin artificial, a pesar de
tener una calidad buena. !!En estos casos se puede recuperar los
ovocitos de la vaca, a la cual ha sido sper
ovulara usando hormonas, la recuperacin se realiza in vivo
usando la tcnica de aspiracin transvaginal guiada por ultrasonido.
Se utiliza !!un medio de recuperacin de ovocitos rico en aminocidos
y a los ovocitos recuperados se los clasifica de acuerdo a su
estadio de maduracin.!!A los ovocitos que han sido clasificados
como aptos, se los puede inseminar in vitro. Luego se los cultivo
en medios celular especfico, por ejemplos Dulbeccos o RPMI, luego
cuando el embrin a llegado a un estado de estabilidad. el embrin se
implanta en una vaca de comprobada fertilidad, la cual por lo menos
ha salido preada una ves. !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
!!!!!!!!!
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!Cuestionario
1. Indicar otras mtodos de recuperacin de ovocitos. !- Diseccion
. consiste en aislar cada folculo del resto de tejido con ayuda de
pinzas y
tijeras , liberando posteriormente os ovocitos tras la ruptura
controlada del folculo intacto
- Recogida en masa: se realiza uun digestin del tejido ovrico
con tripsina durante 1 hora y luego se realizas una
filtracionovocitos/ ovario.
- Digesion del tejido ovrico con colagenasa. !2. Que aspectos
deberan de tomarse en cuenta para hacer la clasificacin de
ovocitos. !
!Durante mucho tiempo se ha intentado relacionar la morfologa
del ovocito con el potencial de desarrollo del futuro embrin por
ello es tan importante dar unos parmetros definidos respecto a lo
que se considera un ovocito con una buena morfologa y por lo tanto
con una buena calidad. De forma general se considera un ovocito
maduro de buena calidad a aquel que presenta una forma esfrica, con
una zona pelcida regular, un corpsculo polar intacto y con un
citoplasma homogneo y sin inclusiones. As mismo presentar una buena
expansin de las clulas del cmulus y clulas de la corona radiata.
Segn estas caractersticas podramos dividir los ovocitos segn su
calidad en: Grado A excelentes: COC S con citoplasma granular
homogneo, y con 4 o ms capas de clulas del cmulos. Grado B buenos:
COC S con citoplasma granular homogneo y con 2-3 capas de clulas
del cmulus. Grado C regulares-malos: ovocitos parcial o totalmente
denudados o con las clulas del cmulus expandidas y con el
citoplasma no homogneo y oscurecido. -7- Eckert and Niemann (1995)
demostraron que no se encuentran diferencias en el potencial
desarrollo entre los ovocitos de tipo A y B, por lo que en nuestro
estudio los clasificaremos en excelentes-buenos y regulares-malos.
Segn De Santis (2007), la seleccin de ovocitos con las mejores
caractersticas morfolgicas no aseguran la llegada a buen trmino de
los embarazo por lo que se debern de buscar parmetros ms fiables.
!
3. Indique la clasificacin, diferencias y las caractersticas de
lo folculos y las caractersticas de los ovulos en cada una de sus
etapas. !!
Desde la fecundacin y hasta que tiene lugar la transferencia en
el tero materno, los !embriones siguen un desarrollo que es
valorado por los embrilogos diariamente. Aquellos
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embriones que hayan llevado una correcta evolucin y se
encuentren en mejor estado son los que sern seleccionados para su
transferencia.!!Dicha valoracin se realiza fundamentalmente
siguiendo criterios morfolgicos (nmero de clulas, grado de
fragmentacin, presencia de vacuolasetc), y teniendo en cuenta el da
de desarrollo embrionario en el que se encuentran. No obstante,
existe una gran heterogeneidad debido a la existencia de diferentes
criterios de valoracin y a la subjetividad derivada de la
observacin realizada por los embrilogos. La Asociacin para el
Estudio de la Biologa Reproductiva (ASEBIR) estableci en 2007 una
clasificacin con cuatro categoras dentro de las cuales se
clasifican los embriones antes de su transferencia. Esta
clasificacin est basada en los resultados obtenidos de estudios
multicntricos realizados en centros de reproduccin nacionales y en
la literatura cientfica publicada. En base a ellas, las cuatro
categoras que se establecen son:!!!Categora A: Embrin de ptima
calidad con mxima capacidad de implantacin.!Categora B: Embrin de
buena calidad con elevada capacidad de implantacin.!Categora C:
Embrin regular con bajas posibilidades de implantacin.!Categora D:
Embrin de mala calidad con muy pocas posibilidades de
implantacin.!!!!!
4. Insique y seale con imgenes los vulos que deben de estar
listos para una fertilizacin de embriones In vitro. !!
El mtodo ms comn y efectivo es la evaluacin morfolgica del
embrin, usando criterios estndar que califican los embriones de
acuerdo a la cantidad de clulas, rasgos del ncleo y el citoplasma,
cubiertas embrionarias, procesos de degeneracin celular, y
caractersticas asociadas al tiempo de cultivo embrionario. Dichos
criterios establecen varias categoras en funcin de la velocidad de
divisin, del grado de fragmentacin del embrin, asimetra de las
blastomeras, multinucleacin, etc. En este sistema, el embrilogo,
realizando un seguimiento diario, crea un registro de cada embrin
con el objetivo de comparar cada una de las caractersticas y de
acuerdo a estas transferir solo el mejor embrin.!
Los embriones son rutinariamente cultivados entre dos y cinco
das, e incluso hasta seis das despus de la recuperacin de los
ovocitos. A veces es muy difcil decir qu embriones son los mejores,
especialmente cuando slo tienen dos o tres das en cultivo. Varios
embriones procedentes de una misma pareja pueden parecer muy
similares en esta etapa. Por ello en algunos casos y dependiendo de
las condiciones de la mujer y el nmero de embriones, es
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recomendable llevarlos al estado de blastocisto, cultivndolos In
Vitro hasta por cinco das. Solo los embriones ms sanos llegan al
estado de blastocisto, en cultivo alrededor del 40% de los
embriones alcanzan este estado. Los embriones que no logran
avanzar, en la mayora de los casos son cromosmicamente anormales y
no tienen la capacidad de mantener un embarazo saludable. As, el
mayor beneficio de extender el cultivo del embrin hasta el da cinco
es una seleccin natural de los embriones de mejor calidad. Esto se
traduce en un aumento en el nmero de embarazos y una reduccin en el
riesgo de embarazos mltiples.!
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