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Prctica 1: Separacin de pigmentos foliares. Anatoma foliar
Extraccin y separacin de pigmentos foliares
En esta prctica vamos a separar pigmentos foliares, de esta
manera podremos clasificar la planta y mediante la cromatografa
podremos saber qu tipos de pigmentos tiene. El principal objetivo
es saber distinguir si la planta posee carotenos, clorofila y
antocianina dependiendo de los colores obtenidos. Posteriormente lo
someteremos a una lmpara incandescente y observaremos su
fluorescencia. Procedimiento y resultados
1. Homogenizar el tejido vegetal en un mortero con 20 ml de
etanol al 95%, aadindole una pizca deCO3Ca para neutralizar los
tejidos cidos y prevenir la prdida parcial de Mg2+ de las
clorofilas.
2. Filtrar a travs de papel de filtro en un embudo. La
solucin
resultante contiene una mezcla de pigmentos (clorofila a y b,
diversos carotenoides, etc) y numerosas molculas incoloras solubles
en etanol.
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3. Para realizar la cromatografa en papel, tomar una pequea
fraccin del extracto y ponerlo en la placa Petri. Depositar sobre
ella un trozo de papel de filtro en forma de "V" tumbada. Esperar a
la separacin de los pigmentos por cromatografa.
4. Tomar 5 ml del extracto y ponerlo en un tubo de ensayo
limpio. Aadir 5 ml de ter de petrleo, agitar para mezclarlo bien y
esperar a que se produzca la separacin de dos fases de distinto
color.
Xantofilas
Carotenoides
Clorofila a
Clorofila B
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5. Ayudndonos de la pipeta Pasteur, recoger la capa superior
(fase etrea) que contiene las clorofilas y poner en un nuevo tubo
de ensayo. En la capa inferior (etanol) han quedado los
carotenoides.
6. Aadir 5 ml de metanol acuoso al 92% v/v y mezclar. Esperar a
la separacin de dos fases, una superior de un tono ms intenso y que
corresponde a la clorofila a, mientras que en la inferior permanece
la clorofila b.
Fase etrea (Clorofilas)
Carotenoides
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En el foco de luz comprobamos cual de los tubos de ensayo
presenta color rojizo, y vemos que el que tiene clorofila a (1
tubo) es el que desprende cierto color rojizo.
Cuestiones Por qu las plantas son verdes?
Clorofila a
Clorofila b
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Porque contienen clorofila. La clorofila es verde porque es
capaz de absorber la luz violeta, roja y azul, y reflejar la verde.
Por qu se produce la distribucin cromatogrfica obtenida de los
pigmentos? Se produce debido a que aquellos que tienen una mayor
afinidad con el etanol tienden a ascender con mayor velocidad que
los dems. El grosor de las bandas depende de la cantidad del
pigmento en la disolucin. A qu se debe el fraccionamiento de los
pigmentos en los distintos disolventes orgnicos? Es debido a la
distintas polaridad y afinidad de los distintos disolventes
orgnicos con los pigmentos. Cmo explicaras el resultado obtenido en
el experimento de fluorescencia? Se produce a que la clorofila
cuando es expuesta a la lmpara absorbe rojo y azul que no puede
transmitirlo para realizar la fotosntesis y por tanto lo desprende
en color rojizo. Qu te sugieren estas imgenes? Imagen 1 Esta imagen
es una representa una molcula de clorofila. La estructura de las
molculas de clorofila tiene dos partes: un anillo de porfirina y
una cadena larga llamada fitol. El fitol es una cadena
hidrocarbonada con carcter hidrfobo. La cadena del fitol sirve para
anclar la molcula de clorofila en la estructura anfiptica de los
complejos moleculares en que residen las clorofilas. El color verde
de la clorofila es debido a la absorcin de luz realizada por
aquellas molculas que contienen dobles enlaces. Imagen 2
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Esta imagen corresponde a la de un cloroplasto. A ste le est
llegando la luz solar siendo absorbida por la clorofila que la
refleja en forma de radiacin verde. Imagen 3. En esta imagen vemos
como los pigmentos de clorofila (a y b) y carotenos tienen una
mayor absorbancia de la radiacin de onda corta que de la radiacin
de onda larga. Qu ocurrira si iluminas a una planta nicamente con
luz monocromtica de longitud de onda 525 nm. ?
Que la planta no absorbera a penas nada de luz y emitira su
color verde habitual. Glosario: Pigmento: Un pigmento es una
sustancia que refleja un color de luz diferente al color de la luz
absorbida. Cloroplasto: Los cloroplastos son los orgnulos celulares
que en los organismos eucariontes fotosintetizadores se ocupan de
la fotosntesis. - Cromoplasto. Los cromoplastos son un tipo de
plastos, orgnulos propios de la clula vegetal, que almacenan los
pigmentos a los que se deben los colores, anaranjados o rojos, de
flores, races o frutos. Cromoplasto: Son un tipo de plastos,
orgnulos propios de la clula vegetal, que almacenan los pigmentos a
los que se deben los colores, anaranjados o rojos, de flores, races
o frutos. Carotenoides: Los carotenoides son pigmentos orgnicos del
grupo de los isoprenoides. Su color, que vara desde amarillo plido,
pasando por anaranjado, hasta rojo oscuro, se encuentra
directamente relacionado con su estructura.
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Antocianinas: Las antocianinas son pigmentos hidrosolubles que
se hallan en las vacuolas de las clulas vegetales y que otorgan el
color rojo, prpura o azul a las hojas, flores y frutos.
Cromatografa: Es un conjunto de tcnicas basadas en el principio de
retencin selectiva, cuyo objetivo es separar los distintos
componentes de una mezcla, permitiendo identificar y determinar las
cantidades de dichos componentes. Espectro de absorcin: muestra la
fraccin de la radiacin electromagntica incidente que un material
absorbe dentro de un rango de frecuencias. Fluorescencia: es un
tipo particular de luminiscencia, que caracteriza a las sustancias
que son capaces de absorber energa en forma de radiaciones
electromagnticas y luego emitir parte de esa energa en forma de
radiacin electromagntica de longitud de onda diferente.
Observacin de la anatoma foliar
Relacin con el metabolismo fotosinttico
Materiales.
Hojas de plantas C3 , C4 y CAM Portas y cubres Bistur
Microscopio Agua destilada
Procedimiento experimental.
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1. Realizar cortes transversales de tres tipos de hojas,
intentado hacer
dichos cortes lo ms finos posibles para una optima observacin
a
travs del microscopio. Para cortar la hoja de la planta C4
se
utilizar un trozo apical del tallo, en el que se encuentran
varias
hojas enrolladas (hojas amplexicaules), o se doblarn las hojas
en
varias partes para incrementar la superficie de corte.
2. Una vez realizados los cortes sern montados en el porta con
una
gota de agua, se coloca el cubre y se realizar la
observacin.
Resultados.
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Observacin CAM:
Estas plantas tienen dos carboxilaciones separadas
temporalmente:
Fijacin nocturna de CO2. Esta primera fase se da en la noche,
cuando tienen los estomas abiertos. A travs de ellos la planta
capta CO2 atmosfrico y la fosfoenolpiruvatocarboxilasa lo incorpora
por carboxilacin al fosfoenolpiruvato que se transforma en
oxalacetato, se desprende un grupo forfato; el oxaloacetato formado
de la prefijacin de CO2 es reducido en el citosol a malato mediante
la NAD-malato deshidrogenasa, el malato es bombeado con gasto de
energa a las vacuolas, donde se va acumulando como cido mlico y es
almacenado, provocando que el contenido vacuolar sea muy cido
(cerca de pH 3) durante la noche.
Con la salida del sol, los estomas se cierran previniendo la
prdida de agua e impidiendo la adquisicin de CO2. El cido mlico
sale de la
Epidermis
Clornquima
Haz vascular
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vacuola y se descarboxila liberando el CO2 y cido pirvico el
cual es devuelto al ciclo tras ser fosforilado con ATP, produciendo
nuevamente fosfoenolpiruvato. Ya que los estomas estn cerrados, el
CO2 liberado internamente no puede escapar de la hoja y en lugar de
esto es reducido a carbohidrato por la operacin del ciclo C3 PCR.
La concentracin elevada en el interior de CO2 suprime efectivamente
la oxigenacin-fotorrepiratoria de la ribulosa 1-5 bifosfato y
favorece la carboxilacin.3
Este mecanismo de concentracin de CO2 permite disminuir la
probabilidad de que entre un O2 en el sitio activo de la RuBisCO
por lo que la eficiencia fotosinttica es mayor. Las plantas CAM
suelen ser crasas (no todas) y relegadas a ambientes secos (tambin
existen CAM acuticas); esto es debido a su bajo rendimiento total
fotosinttico (ya que la absorcin de dixido de carbono est limitado
a la cantidad de MA que se puede almacenar en la vacuola) por lo
que son malas competidoras con las plantas C3 o C4. Existen plantas
CAM constitutivas o adaptativas (estas ltimas slo tienen
metabolismo cido de crasulceas bajo estrs hdrico, etc.).
Estas plantas resuelven el problema de prdida de agua durante la
fotosntesis al abrir sus estomas solo durante la noche cuando la
temperatura es menor y la humedad del ambiente es comparativamente
alta
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Observacin C3
Las plantas denominadas C3 en el haz encontramos una capa de
clulas aplanadas que conforman la cutcula, tiene una funcin
protectora, por el envs, entre estas clulas se sitan las clulas
guardia que dejan espacios, los estomas por donde ingresa y salen
fluidos como el CO2, una fila de clulas vegetales alargadas
conforman el parnquima en empalizada, cada una de las clulas que
conforman el parnquima se encarga de realizar fotosntesis. El
metabolismo C3 es una serie de reacciones en las cuales participan
gran cantidad de molculas y enzimas para finalmente obtener los
carbohidratos necesarios para la nutricin y algunos compuestos de
desecho. El ciclo de Calvin es tambin llamado ciclo C3, ya que aqu
por medio del ATP y NADPH formado en la primera etapa de la
fotosntesis (fase lumnica), es utilizado para la fijacin del CO2,
en un compuesto de tres tomos de carbono, el 3-Fosfoglicerato,
proceso el cual ocurre en una segunda etapa de la fotosntesis,
denominada fase oscura. En esta reaccin bioqumica toma gran
relevancia una enzima rubisco que combina una molcula de CO2 con el
material de partida, un azcar de
Epidermis
Mesfilo
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cinco carbonos llamado RIbulosa-1,5-bifosfato, obteniendo as dos
molculas de 3-fosfoglicerato.
Observaciones C4:
Clulas buliformes
Haz vascular
Vaina mestomtica
Clornquima
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El proceso de metabolismo consiste en la captacin del dixido de
carbono en las clulas del mesfilo de la planta pero el CO2, en vez
de utilizarse inmediatamente en el ciclo de Calvin, reacciona con
el fosfoenolpiruvato (PEP) gracias a la catlisis de la enzima
fosfoenolpiruvato carboxilasa. El producto final de la reaccin
entre el PEP y el CO2 es el oxalacetato, que posteriormente se
convierte en malato. El malato se transporta hacia las clulas de la
vaina, donde es descarboxilado, produciendo el CO2 necesario para
el ciclo de Calvin, adems de piruvato. Este ltimo pasa nuevamente
al mesfilo donde se transforma por medio de ATP en
fosfoenolpiruvato, para quedar nuevamente disponible para el ciclo.
La ventaja de este proceso radica en el hecho de que al estar la
rubisco encerrada en las clulas de la vaina se le impide la
posibilidad de que reaccione con oxgeno en situaciones en las
cuales la concentracin de CO2 sea muy baja, por lo cual se reduce
considerablemente la prdida de energa y de CO2 a travs de la
fotorrespiracin. Incluso las molculas de dixido de carbono
generadas por la fotorrespiracin se reutilizan a travs del PEP, que
captura aquellas en el mesfilo para que ingresen al ciclo de
Calvin.
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Qu te sugieren estas imgenes? Imagen 1 Es una planta de tipo
CAM. Las cuales son ms eficientes. Imagen 2 Es una planta de tipo
C4 y son las ms productivas. Imagen 3 Es una planta de tipo C3, son
las ms abundantes y estn en climas hmedos y templados. Imagen 4 Es
una planta de tipo C4, son las ms productivas. Qu ventajas ofrece
cada metabolismo? Las tipo CAM son ms eficientes, las C4 son las ms
productivas y las C3 son las ms abundantes. Glosario Metabolismo:
es el conjunto de reacciones bioqumicas y procesos fsicoqumicos que
ocurren en una clula y en el organismo. Fotosntesis: es la
conversin de materia inorgnica en materia orgnica gracias a la
energa que aporta la luz. Parnquima: tejido vegetal constituido por
clulas de forma aproximadamente esfrica o cbica y con espacios de
separacin. Clulas del haz: cara superior de la hoja, normalmente ms
brillante y lisa, y con nervadura menos patente que en la cara
inferior o envs. Clulas de la vaina: ensanchamiento del pecolo o de
la hoja que envuelve el tallo.
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Metabolismo cido de Crasulceas (CAM): el nombre de metabolismo
cido hace referencia a la acumulacin de cidos orgnicos durante la
noche por las plantas que poseen este mecanismo de fijacin de
carbono. Esta va metablica es semejante a la va C4, sin embargo en
la va CAM la separacin de los dos carboxilaciones no es espacial,
como ocurre en las plantas C4, sino temporal. Carboxilacin: este
mecanismo de concentracin de dixido de carbono permite disminuir la
probabilidad de que entre un O2 en el sitio activo de la rubisco
por lo que la eficiencia fotosinttica es mayor. Descarboxilacin: es
la reaccin qumica en la cual un grupo carboxilo es eliminado de un
compuesto en forma de dixido de carbono (CO2).
David Martnez Requena Grupo 2