UNIVERSIDAD AUTNOMA METROPOLITANA
Unidad Xochimilco
Divisin de Ciencias Biolgicas y de la Salud
Tronco Comn Divisional
Mdulo: Procesos Celulares Fundamentales
Mtodos bsicos para el aislamiento e identificacin de
entero-bacterias del agua.
Aura Ramrez VegaCarlos Martnez MartnezClaudia Larios AyalaIrving
Quiroz MartnezJulia Mara Turcio Julia Mara
Docente:Dr. Jorge Antonio Amzquita Landeros
Grupo: BB12A
IntroduccinConsiderando que estudio de las enfermedades
transmisibles ocasionadas por microorganismos patgenos.Constituye
el objeto de transformacin del mdulo Procesos Celulares
Fundamentales (PCE) del Tronco Comn Divisional de Ciencias
Biolgicas y de la Salud (TCD de CBS).
Objetivo El Objetivo del presente texto es introducir a los
alumnos de este mdulo en el manejo de los mtodos bsicos empleados
en el laboratorio de microbiologa, tomando como modelo el
aislamiento e identificacin de entero-bacterias a partir de
muestras de agua.Objetivos Especficos. El alumno aprenda a preparar
la muestra y a sembrarla por estra cruzada para obtener colonias
aisladas. El alumno aprenda a preparar la muestra y a sembrarla
estra cruzada pata Obtener colonias aisladas. El alumno aprenda a
observar y determinar las caractersticas macroscpicas y
microscpicas de las colonias aisladas. As como, obtener cultivos
puros. El alumno conozca los fundamentos de las pruebas bioqumicas
y realice las que se requieren para identificar a las
entero-bacterias.Principios tericosLas Enterobacteriaceae son
bacilos gramnegativos, distribuidas en la naturaleza en forma
amplia. Se encuentran en el suelo, en el agua, sobre las plantas y
como su nombre lo indica se encuentran dentro del tracio intestinal
dc los seres humanos y de los animales. Se aslan con mucha
frecuencia de clnicas,La familia Enterobacteriaceae est formada por
aproximadamente 31 gnero y 139 especies y miles de serotipos.
Algunos miembros de la familia siempre se asocian a enfermedades
cuando se aslan en el hombre, por ejemplo: Shigella Salmonella,
Yersinia pestis. Mientras que otros son miembros de la flora normal
que producen infecciones oportunistas, por ejemplo: Escherichia
coli, Klebsiella pneumomiae, Proteus mirabilis.Las entero-bacterias
son causantes de un gran nmero de enfermedades infecciosas en el
humano, entre las ms comunes se encuentran los sndromes diarreicos
y disntricos, causados por cepas de Escherichia coli, Salmonella y
Shigella. La fiebre tifoidea, causada por especies de Salmonella.
Se tienen casos de neumona causados por Klebsiella pneumomiae.
Especies de Proteus mirabilis, E. coli y varios miembros del grupo
Klebsiella Enterobacteriaceae se aslan de heridas traumticas,
contaminadas con tierra o material vegetal o de incisiones
abdominales despus de una ciruga. El shock endotxico es una
manifestacin potencialmente letal de la infeccin par
entero-bacteria.
Metodologa y Resultados.La metodologa descrita consta de cuatro
sesiones:1. Preparacin de las muestras y cultivo en un medio
selectivo 2. Aislamiento y observacin de las caractersticas
macroscpicas y microscpicas de las enterobacterias3. Pruebas
bioqumicas para enterobacterias4. Identificacin de las
enterobactriasObtencin de la muestra:La tcnica empleada para
obtener la muestra con la que se trabajara en el laboratorio, fue
la misma que se emple en el resto de las unidades pertenecientes a
la Universidad Autnoma Metropolitana (UAM).Es decir, se aplic la
tcnica de medio chorro para la toma de muestra en un frasco estril
de 100mL. Las muestras totales recolectadas fueron cuatro,
pertenecientes a distintos medios donde se encuentra agua en
diferentes condiciones (charco de agua sucia, cubeta con agua de
lluvia, agua de la llave y agua estancada del rio Lerma),
posteriormente las muestras recolectadas fueron rotuladas con la
finalidad de mantener cierto orden con los frascos. Cabe mencionar
que durante la toma de muestra, se trat de realizar de la manera ms
estril posible, esto con la finalidad de no contaminar el agua y
que alterara a los resultados; adems la toma de muestra se realiz
el mismo da en el que se realizara la parte experimental de la
investigacin.PRIMERA SESIN: Antes de comenzar a trabajar fue
importante realizar la esterilizacin de rea de trabajo para evitar
cualquier tipo de contaminacin.Para el cultivo de la muestra estas
fueron tratadas de dos maneras:1. Dilucin de la muestra 1:10, que
consiste en tomar 1ml de la muestra y diluirla en 9ml de Solucin
Salina Isotnica estril (SSI) 2. Muestra directa, sin ningn tipo de
dilucin En ambos casos el cultivo se realiz de la misma manera: Con
ayuda de un el asa bacteriolgica estril se tom una pequea cantidad
de la muestra de agua y se procede a estriar el inoculo en la caja
de Petri sobre el agar siguiendo un patrn de cuatro cuadrantes y
una estra abierta. Cada agar se sell con un pedazo de masking y se
etiquet con los datos requeridos; especificando el nmero de muestra
y si era diluida o no diluida. Las cajas de agar MacConkey se
llevaron a incubar durante 24 horas.SEGUNDA SESION:Despus de que
las muestra incubaron durante 24 horas se procedi a la seleccin de
colonias desarrolladas de agar MacConkey. En el caso de las
muestras obtenidas de: charco de agua sucia, cubeta con agua de
lluvia, agua de la llave y agua estancada del rio Lerma se encontr
un crecimiento o desarrollo de una colonia bacteriana observando
mayor desarrollo en el cultivo no diluido a comparacin con el
cultivo diluido. Se procedi a realizar la resiembra de las colonias
desarrolladas en agar MacConkey para obtener cultivo puro de
bacterias.Posteriormente se realiz la observacin microscpica de los
cultivos seleccionados por Tincin de Gram. Siguiendo la metodologa
de la prctica se prepar el frotis y la tincin para la observacin
microscpica de las colonias cultivadas y as determinar si las
enterobacterias presentes eran de carcter Gram+ o Gram-
Al observar las tinciones al microscopio se determin que las
enterobacterias presentes en dicha muestra eran de carcter Gram+
debido a que presentaban una coloracin azul violeta. TERCERA
SESION:Prueba Catalasa: Enzima que descompone el perxido de
hidrogeno en oxgeno y agua oxigenada. Las bacterias que con
Catalasa positiva liberan oxigeno que se manifiesta con la
liberacin de pequeas burbujas.
Prueba Oxidasa: Todas las enterobacterias dan una reaccin
negativa. Pseudomona y Neisseria son positivas. Las bacterias
oxidasa positivas producen un color negro o azul intenso en 10seg.
La reaccin se considera positiva si ocurre entre los 10 y 60
segundos posteriores. Si el desarrollo de color se da despus de 60
segundos la prueba se considera Negativa.
Prueba Muestra 1Muestra 2Muestra 3Muestra 4
Catalasa++++
Oxidasa++++
Siembra en medios para pruebas bioqumicas:1. Prueba Voges
Proskauer / Rojo de metiloCon el asa bacteriolgica tomar un inoculo
ligero del cultivo puro de bacterias y suspenderlo en un tubo con
caldo VP-RM
2. Citrato de SimmonsCon el asa bacteriolgica tomar un inoculo
ligero del cultivo puro y simbralo en forma de una estra abierta
sobre el rea inclinada del medio.3. IndolCon el asa bacteriolgica
tomar un inoculo poco denso del cultivo puro de bacterias y
simbralo en el medio SIM a 3mm del fondo del tubo.
4. Caldo UreaCon el asa bacteriolgica tomar un inoculo poco
denso del cultivo puro de bacterias y simbralo en el caldo
urea.
5. Agar Hierro Triple Azcar (TSI)Con el asa bacteriolgica se
toma un inoculo poco denso del cultivo puro de bacterias y simbralo
por picadura en el fondo y en forma de una estra en la
superficie
Se realizaron los mismos pasos en cuatro ocasiones, una con cada
muestra diferente. Todos los tubos se dejaron incubar durante 24
horas
CUARTA SESIN:
Interpretacin de las pruebas de identificacin bioqumica
1) Voges-Proskauer / Rojo de metilo Prueba positiva: Color rojo
en el medio (presenciad e acetona) Prueba negativa: Color amarillo
cobrizo en el medio *El tubo control debe dar una reaccin
negativa2) Rojo de Metilo Prueba positiva: Color rojo en el medio
Prueba retardada: Color anaranjado Prueba negativa: Color amarillo
en el medio*El tubo control debe dar una reaccin negativa3) Citrato
de Simmons Prueba positiva: Crecimiento con color azul intenso en
la zona inclinada del pico de flauta Prueba negativa: No se observa
crecimiento ni cambio de color *El tubo control debe dar una
reaccin negativa4) Indol Prueba positiva: Color negro en la
picadura o en todo el tubo Prueba negativa: Ausencia de color negro
en todo el tubo*El tubo control debe dar una reaccin negativa5)
cido Sulfhdrico (H2S) Prueba positiva: Aparicion de un color rojo 1
o 3 minutos despus de adicionar el reactivo Prueba negativa: Color
amarillo *El tubo control debe dar una reaccin negativa6)
Movilidad: Obsevar medio SIM Prueba positiva: El medio SIM debe
encontrarse turbio Prueba negativa: solo debe existir crecimiento a
lo largo de la picadura *El tubo control debe dar una reaccin
negativa7) Ureasa Prueba positiva: Color rosa fuerte en el caldo
urea Prueba negativa: Color amarillo o sin cambio en el caldo
urea*El tubo control debe dar una reaccin negativa8) Agar Hierro
Triple Azcar (TSI) Pico de flauta rojo/Profundidad amarillo: Medio
Alcalino/cido (Alc/A). Glucosa fermentada; lactosa o sacarosa no
fermentada. Pico de flauta amarillo/Profundidad amarillo: Medio
cido/cido (A/A). Glucosa, lactosa y/o sacarosa fermentada.
Resultados:PruebaMuestra 1Muestra 2Muestra 3Muestra 4
Voges ProskaeurNegativaNegativaNegativaPositiva
Rojo de MetiloNegativaPositivaNegativaNegativa
Citrato de SimmonsPositivaPresenta crecimiento con ligero cambio
de coloracin hacia un tono azul verdosoPositivaPresenta ligero
crecimiento con cambio de coloracin hacia un tono azul
intensoNegativaPresenta ligero crecimiento con cambio de coloracin
hacia un tono azul intensoPositivaPresenta ligero crecimiento con
cambio de coloracin hacia un tono azul intenso
IndolNegativaNegativaNegativaPositiva
cido Sulfhdrico (H2S)PositivaNegativaNegativaPositiva
MovilidadPositivaNegativaNegativaNegativa
UreasaPositivaNegativaNegativaPositiva
TSI (hierro triple azcar)NegativaPico de flauta rojo y
Profundidad amarillo.Medio Alcalino/cido (Alc/A).PositivaPico de
flauta rojo y Profundidad amarillo.Medio Alcalino/cido
(Alc/A).NegativaPico de flauta rojo y Profundidad amarillo.Medio
Alcalino/cido (Alc/A).PositivaPico de flauta rojo y Profundidad
amarillo.Medio Alcalino/cido (Alc/A).
UNIVERSIDAD AUTNOMA METROPOLITANA
Unidad Xochimilco
Divisin de Ciencias Biolgicas y de la Salud
Tronco Comn Divisional
Mdulo: Procesos Celulares Fundamentales
Anlisis de las muestras recolectas de Rectora
Por:Alicia Maribel Curiel RojoDelfina Garca BetanzoLucero Edith
Gonzlez CruzGrisel Loeza CoatzozonMelina Trejo Lara
Docente:Dr. Jorge Antonio Amzquita Landeros
Grupo: BB12A
Recoleccin de la muestra
El propsito de esta investigacin es evidenciar la presencia de
Enterobacterias en el agua de los bebederos de las distintas
unidades de la UAM (Universidad Autnoma Metropolitana)Cabe resaltar
que en la Rectora de la UAM no hay bebederos como en la UAM X sin
embargo cuentan con dosificadores de agua, de los cuales fueron
seleccionados 5 al azar para la toma de muestra.En cada uno de los
dosificadores seleccionados se aplic la tcnica de medio chorro para
la toma de muestra en un frasco estril marcado para identificar el
dosificador seleccionado y dicho frasco se mantuvo en un medio
refrigerante hasta el momento que se us en el laboratorio, lapso
que no fue mayor a 1 hora.Dispensadores seleccionados:1)
Dosificador de Coordinacin general de administracin y relaciones
laborales (2do piso)
2) Dosificador de Tesorera adjunta de control patrimonial (3er
piso)
3) Dosificador de Direccin de recurso humanos (2do piso)
4) Dosificador de Direccin de Tecnologas de la informacin (1er
piso)
5) Dosificador de la caseta de vigilancia en la entrada
principal (planta baja)
Trabajo en laboratorio
PRIMERA SESIN: Sembrado en Agar MacConkey
Antes de comenzar a trabajar fue importante realizar la
esterilizacin de rea de trabajo para evitar cualquier tipo de
contaminacin.
Para el cultivo de la muestra estas fueron tratadas de dos
maneras:
1) Dilucin de la muestra 1:10, que consiste en tomar 1ml de la
muestra y diluirla en 9ml de Solucin Salina Isotnica estril (SSI)
2) Muestra directa, sin ningn tipo de dilucin
En ambos casos el cultivo se realiz de la misma manera: Con
ayuda de un el asa bacteriolgica estril se tom una pequea cantidad
de la muestra de agua y se procede a estriar el inocuo en la caja
de Petri sobre el agar siguiendo un patrn de cuatro cuadrantes y
una estra abierta.
Cada agar se sell con un pedazo de masking y se etiquet con los
datos solicitados; especificando el nmero de muestra y si era
diluida o pura.
Las cajas de agar MacConkey se llevaron a la estufa para
dejarlas incubar a 37 C durante 24 horas. SEGUNDA SESIN:
Aislamiento y observacin de las caractersticas macroscpicas y
microscpicas de las Enterobacterias.
Despus de que las muestra incubaron durante 24 horas se procedi
a la seleccin de colonias desarrolladas de agar MacConkey. En el
caso de las muestras de Rectora de los 10 cultivos totales solo 2
presentaron desarrollo de colonias bacterianas, ambas
correspondieron a la muestra nmero 5 (Dosificador de la caseta de
vigilancia en la entrada principal) observando mayor desarrollo en
el cultivo puro a comparacin con el cultivo diluido.
Las colonias observadas presentaron las siguientes
caractersticas:COLONIA 1Muestra PuraCOLONIA 2Muestra 1:10
MORFOLOGIA COLONIAL
FormaCircularCircular
ColorAmarillo / DoradoAmarillo / dorado
ElevacinUmbilicada con rugosidadUmbilicada con rugosidad
BordeIndefinidoIndefinido
ConsistenciaViscosaViscosa
TamaoGrande y puntiformeGrande y puntiforme
OpacidadAusenteAusente
SuperficieIrregularIrregular
De las dos muestras sealadas se procedi a realizar la resiembra
de las colonias desarrolladas en agar MacConkey para obtener
cultivo puro de bacterias.
Observacin microscpica de los cultivos seleccionados por Tincin
de Gram.
Siguiendo la metodologa de la prctica se prepar el frotis y la
tincin para la observacin microscpica de las colonias cultivadas y
as determinar si las enterobacterias presentes eran de carcter
Gram+ o Gram-
Al observar las tinciones al microscopio se determin que las
enterobacterias presentes en dicha muestra eran de carcter Gram+
debido a que presentaban una coloracin azul violeta. Tambin se
observ la presencia de un hongo en segundo plano
TERCERA SESIN: Pruebas bioqumicas para Enterobacterias.
Pruebas de identificacin bioqumica de los cultivos puros
seleccionados Prueba Catalasa: Enzima que descompone el perxido de
hidrogeno en oxgeno y agua oxigenada. Las bacterias que con
Catalasa positiva liberan oxigeno que se manifiesta con la
liberacin de pequeas burbujas.Prueba Oxidasa: Todas las
enterobacterias dan una reaccin negativa. Pseudomona y Neisseria
son positivas. Las bacterias oxidasa positivas producen un color
negro o azul intenso en 10seg. La reaccin se considera negativa si
ocurre entre los 10 y 60 segundos posteriores. Si el desarrollo de
color se da despues de 60 segundos la prueba se considera
Negativa.
Resultados obtenidos en las muestras de rectora: COLONIA
1Muestra PuraCOLONIA 2Muestra 1:10
PRUEBAS BIOQUIMICAS
CATALASA + +
OXIDASA
Prueba Catalasa en muestra pura
Prueba Catalasa en muestra diluida 1:10
-
Prueba Oxidasa en muestra puraPrueba Oxidasa en muestra diluida
1:10
Siembra en medios para pruebas bioqumicas:1) Prueba Voges
Proskauer / Rojo de metiloCon el asa bacteriolgica tomar un inoculo
ligero del cultivo puro de bacterias y suspenderlo en un tubo con
caldo VP-RM
2) Citrato de SimmonsCon el asa bacteriolgica tomar un inoculo
ligero del cultivo puro y simbralo en forma de una estra abierta
sobre el rea inclinada del medio.
3) IndolCon el asa bacteriolgica tomar un inoculo poco denso del
cultivo puro de bacterias y simbralo en el medio SIM a 3mm del
fondo del tubo.
4) Caldo UreaCon el asa bacteriolgica tomar un inoculo poco
denso del cultivo puro de bacterias y simbralo en el caldo
urea.
5) Agar Hierro Triple Azcar (TSI)Con el asa bacteriolgica se
toma un inoculo poco denso del cultivo puro de bacterias y simbralo
por picadura en el fondo y en forma de una estra en la
superficie
Se realizaron los mismos pasos en tres ocasiones, la primera sin
bacterias para los tubo de control, la segunda para los tubos con
la muestra pura y la tercera para los tubos con las muestra diluida
1:10 Todos los tubos se dejaron incubar a 37 C durante 24 horas
CUARTA SESIN: Lectura de pruebas bioqumicas
Interpretacin de las pruebas de identificacin bioqumica
9) Voges-Proskauer / Rojo de metilo Prueba positiva: Color rojo
en el medio (presenciad e acetona) Prueba negativa: Color amarillo
cobrizo en el medio *El tubo control debe dar una reaccin
negativa
10) Rojo de Metilo Prueba positiva: Color rojo en el medio
Prueba retardada: Color anaranjado Prueba negativa: Color amarillo
en el medio*El tubo control debe dar una reaccin negativa
11) Citrato de Simmons Prueba positiva: Crecimiento con color
azul intenso en la zona inclinada del pico de flauta Prueba
negativa: No se observa crecimiento ni cambio de color *El tubo
control debe dar una reaccin negativa
12) Indol Prueba positiva: Color negro en la picadura o en todo
el tubo Prueba negativa: Ausencia de color negro en todo el tubo*El
tubo control debe dar una reaccin negativa
13) cido Sulfhdrico (H2S) Prueba positiva: Aparicion de un color
rojo 1 o 3 minutos despus de adicionar el reactivo Prueba negativa:
Color amarillo *El tubo control debe dar una reaccin negativa
14) Movilidad: Obsevar medio SIM Prueba positiva: El medio SIM
debe encontrarse turbio Prueba negativa: solo debe existir
crecimiento a lo largo de la picadura *El tubo control debe dar una
reaccin negativa
15) Ureasa Prueba positiva: Color rosa fuerte en el caldo urea
Prueba negativa: Color amarillo o sin cambio en el caldo urea*El
tubo control debe dar una reaccin negativa
16) Agar Hierro Triple Azcar (TSI) Pico de flauta
rojo/Profundidad amarillo: Medio Alcalino/cido (Alc/A). Glucosa
fermentada; lactosa o sacarosa no fermentada. Pico de flauta
amarillo/Profundidad amarillo: Medio cido/cido (A/A). Glucosa,
lactosa y/o sacarosa fermentada. Pico de flauta rojo/Profundidad
rojo: Medio Alcalino/Alcalino (Alc/Alc). Reaccin negativa, no hay
fermentacin de ninguno de los carbohidratos.
COLONIA 1Muestra PuraCOLONIA 2Muestra 1:10
PRUEBAS BIOQUIMICAS
Voges ProskaeurNegativaNegativa
Rojo de MetiloNegativaNegativa
Citrato de SimmonsPositivaPresenta crecimiento con ligero cambio
de coloracin hacia un tono azul verdosoPositivaPresenta ligero
crecimiento con cambio de coloracin hacia un tono azul intenso
IndolNegativaNegativa
cido Sulfhdrico (H2S)NegativaNegativa
MovilidadPositivaPositiva
UreasaPositivaPositiva
TSI (hierro triple azcar)PositivaPico de flauta rojo y
Profundidad amarillo.Medio Alcalino/cido (Alc/A).PositivaPico de
flauta rojo y Profundidad amarillo.Medio Alcalino/cido (Alc/A).
TSIGASH2SRMVPINDCITUREMOV
TRIBUTO I: Escherichiae
GNERO : Escherichia
E.coli
GNERO: Shigella
Grupos: A,B,CAlc/A---- / +
S.SonneiAlc/A----
TRIBU II: Edwarsiellae
GNERO: Edwarsiella
E.TardaAlc/A-+
TRIBU III: Salmonelleae
GENERO: SalmonelleaeAlc/A--++
TRIBU IV: Citrobactereae
GENERO: Citrobacter
C.freundii
C.koseriAlc/A--++ / -+
TRIBU V: Klebsielleae
GENERO: Klebsiella
K.pneumoniae
k.axytoca
GENERO: Enterobacter
E.aerogenes
E.cloacae
GENERO: Hafnia
H. AlvesAlc/A-- / +-+
GENERO: Pantoea
P.agglomeransAlc/A- / +-- / +- / ++ / -+
GENERO: Serratia
S. marcescensAlc/A-- / +- ++
TRIBU VI: Proteeae
GENERO: Proteus
P. vulgarisAlc/A-+++
P.mirabilisAlc/A-+ / -+++
GENERO: Morganella
M.morganiiAlc/A--+++
GENERO: Providencia
P.rettgeriAlc/A---++++
P.stuartiiAlc/A---++ / -
P.alcalifaciensAlc/A--++
TRIBU VII: Yersinieae
GENERO: Yersinieae
Y. enterocoliticaAlc/A---+ / -
Las reas sombreadas indican las Reacciones clave + / - del 50%
al 90% de las cepas Positivas - / + del 50% al 90% de las cepas
NegativasAnlisis de resultados
Clasificacin de EnterobacteriasNumero de Reacciones
PositivasReacciones Positivas
TRIBUTO I:
GNERO: Shigella
Grupos: A,B,C5* TSI Alc/A* GAS* H2S* VP* IND
S.Sonnei5* TSI Alc/A* GAS* H2S* VP* IND
TRIBU II: Edwarsiellae
GNERO: Edwarsiella
E.Tarda3* TSI Alc/A* VP* MOV
TRIBU III: Salmonelleae
GENERO: Salmonelleae5* TSI Alc/A* VP* IND* CIT* URE* MOV
TRIBU IV: Citrobactereae
GENERO: Citrobacter
C.koseri6* TSI Alc/A* H2S* VP* CIT* URE* MOV
TRIBU V: Klebsielleae
GENERO: Hafnia
H. Alves5* TSI Alc/A* H2S* RM* IND* MOV
GENERO: Pantoea
P.agglomerans7* TSI Alc/A* GAS* H2S* RM* IND* CIT* MOV
GENERO: Serratia
S. marcescens6* TSI Alc/A* H2S* RM* IND* CIT* MOV
TRIBU VI: Proteeae
GENERO: Proteus
P. vulgaris4* TSI Alc/A* VP* URE
* MOV
P.mirabilis5* TSI Alc/A* IND* CIT* URE* MOV
GENERO: Morganella
M.morganii5* TSI Alc/A* H2S* VP* URE* MOV
GENERO: Providencia
P.rettgeri7* TSI Alc/A* GAS* H2S* VP* CIT* URE* MOV
P.stuartii6* TSI Alc/A* GAS* H2S * VP* CIT* MOV
P.alcalifaciens5* TSI Alc/A* H2S* VP* CIT* MOV
TRIBU VII: Yersinieae
GENERO: Yersinieae
Y. enterocolitica5* TSI Alc/A* GAS* H2S * VP* URE
TSI Alc/A: Agar hierro triple azcar, Alcalino/cido H2S: Sulfuro
de Hidrogeno RM: Rojo de Metilo VP: Voges Proskauer IND: Indol CIT:
Citrato de Simmons URE: Ureasa (Caldo urea) MOV: Movilidad N
(negritas y subrayado): Reacciones Clave
Despus de realizar las pruebas necesarias se pudo determinar la
presencia de Enterobacterias en las muestras del agua recolectadas
en uno de los dispensadores de la Rectora de la UAM que est
localizado en la caseta de vigilancia de la entrada principal y en
base a la identificacin bioqumica las posibles bacterias presentes
en dicha muestra podran ser: Shigella, Grupos A, B, C Shigella, S.
Sonnei Edwarsiella, E. Tarda Salmonelleae Citrobacter, C. Koseri
Hafnia, H. Alves Pantoea, P. Agglomerans Serratia, S. Marcescens
Proteus, P. Vulgaris Proteus, P. Miriabilis Morganello, M. Morganii
Providencia, P. Rettgeri Providencia, P. Stuartii Providencia, P.
AlcalifaciensEs importante resaltar que le objetivo de esta
investigacin es solo evidenciar la presencia de las
Enterobacterias, ya que si se desea especificar cul es el organismo
presente en dichas muestras se tendra que proceder a realizar las
pruebas especficas correspondientes.
UNIVERSIDAD AUTNOMA METROPOLITANA
Unidad Xochimilco
Divisin de Ciencias Biolgicas y de la Salud
Tronco Comn Divisional
Mdulo: Procesos Celulares Fundamentales
PRACTICA DE LABORATORIO.
lvarez Romn Thania SarahiAroz Vsquez AlbertoCorrales Andrade
Tania GabrielaNavarrete Gonzlez Diana AlejandraValerio Ordua Sofa
Lizeth
Docente:Dr. Jorge Antonio Amzquita Landeros
Grupo: BB12A
Resultados Para estas sesiones se trabaj nicamente con las
muestras de agua de los bebederos de la UAM-Xochimilco, ya que los
bebederos de la UAM-Iztapalapa se encontraban sin servicio.Primera
SesinPreparacin de las muestras y cultivo en un medio selectivoI.
Preparacin de la zona estril para trabajo microbiolgico II. Cultivo
de la muestra de agua en el medio MacConkey III. Manejo de material
contaminado
En la primera sesin se realiz los cultivos de las muestras de
agua de los bebederos de la UAM-X, y se realiz la dilucin 1:10 en
agua en los tubos de ensayo. Se hizo la siembra y diluciones en
medio MacConkey por estra cruzada, las muestras se sembraron por
duplicado y se dej incubar a 37 durante 24 horas.
Segunda SesinAislamiento y observacin de las caractersticas
macroscpicas y microscpicas de enterobacterias I. Solucin de las
colonias desarrolladas en el agar MacConkey II. Resiembra de las
colonias desarrolladas de agar en MacConkey para obtener cultivo
puro de bacterias III. Observacin microscpica de los cultivos
seleccionados
En esta sesin no hubo desarrollo de colonias en 24 horas, de los
medio de cultivo MacConkey de las muestras de agua de los bebederos
de la UAM-X.Realizamos la identificacin de colonias en medios de
cultivo del agua de los bebederos de Rectora.Se realiz la
observacin macroscpica de la morfologa de las colonias
seleccionadas del agar MacConkey
Se realiz de igual modo la resiembra de las colonias
seleccionadas desarrolladoras del agar MacConkey y se hizo la
observacin microscpica con la Tincin de Gram.
En este cuadro se muestra que estructura tie cada uno de los
colorantes utilizados. ColoranteEstructura que tie
LugolAlmidn, glicgeno, cilios, flagelos.
Verde rpidoCitoplasma, ncleo.
GiemsaGrnulos citoplasmticos, ncleo.
AcetocarmnCromosomas en clulas mitticas
Azul alcianoTeido de estructuras con proporcin de
carbohidratos.
Amarillo de MetaniloMicelios y levaduras.
Tabla 1. ResultadosCaractersticas de las bacterias
observadasCOLONIA 1RectoraCOLONIA 2Rectora diluido
Morfologa Colonial
FORMAIrregularIrregular
COLORMarrnRoja
ELEVACINPlanaPlana
BORDEErosionadoContinuo
CONSISTENCIAMucosaMucosa
TAMAOMedianaMediana
OPACIDADOpacoOpaco
SUPERFICIELisaLisa
Morfologa Microscpica
Tincin de GramNegativasNegativas
Pruebas Bioqumicas
CATALASAPositivoPositiva
OXIDASAPositivoNegativa
UREANegativaNegativa
GLUCOSANegativaNegativa
LACTOSANegativaNegativa
SACAROSANegativaNegativa
MOVILIDADNegativaNegativa
Ac. SULFHIDRICONegativaNegativa
INDOLNegativaNegativa
ROJO DE METILONegativaNegativa
VOGES PROSKAUERNegativaNegativa
CITRATO DE SIMMONSPositivaNegativa
Tercera SesinPruebas bioqumicas para enterobacterias.I. Pruebas
de identificacin bioqumica de los cultivos puros seleccionados.II.
Observacin microscpica de los cultivos puros seleccionados.
En la tercera sesin se realizaron las pruebas para la
identificacin de las enterobacterias de los cultivos en los tubos
de ensayo.Realizamos 7 diferentes pruebas con distintas tcnicas
para poder observar posteriormente los resultados, las cuales
fueron:
a) Prueba de catalasa:Colocamos sobre el portaobjeto con el asa
bacteriolgica una pequea porcin del cultivo puro de las bacterias
del medio Mac- Conkey y despus agregamos una gotita de agua
oxigenada sobre la muestra, las muestras resultaron positivas,
liberaron oxgeno.
b) Prueba de oxidasa:Con el asa bacteriolgica colocamos una
porcin del cultivo puro y lo extendimos sobre el papel filtro. Le
agregamos 2 gotas de reactivo. Las bacterias resultaron positivas
para la muestra de rectora y se hizo lo mismo con las muestras de
rectora diluida (1:10) y sus resultados fueron negativos.
c) Prueba Voges-Proskauer / Rojo de metilo:Con el asa
bacteriolgica tomamos un inoculo denso del cultivo y lo suspendimos
en el tubo de caldo. Las dos muestras resultaron negativas.
d) Citrato de Simmons:Con el asa bacteriolgica tomamos un
inoculo ligero del cultivo y lo sembramos en forma de estra
abierta. Se sembraron dos muestras una de rectora diluida (1:10) y
la otra fue de rectora no diluida. La muestra de rectora diluida
resulto negativa y La muestra de rectora no diluida resulto
positiva.
e) IndolCon el asa bacteriolgica colectamos un inoculo denso del
cultivo y lo sembramos por picaduras en el medio SIM a 3 mm del
fondo del tubo. Las dos muestras resultaros negativas.
f) Caldo ureaCon el asa bacteriolgica colocamos un inoculo poco
denso del cultivo y los sembramos den el caldo urea. Las dos
muestras resultaron negativas.
g) Agar hierro triple azcar
inoculo poco denso del cultivo y lo sembramos por picadura en el
fondo y en forma de estra por la superficie. Las dos muestras
resultaron negativas.
UNIVERSIDAD AUTNOMA METROPOLITANA
Unidad Xochimilco
Divisin de Ciencias Biolgicas y de la Salud
Tronco Comn Divisional
Mdulo: Procesos Celulares Fundamentales
REPORTE DE LABORATORIO
Por: Cruz Hernndez BrendaDimas Guzmn CristianHernndez Acosta
Juan CarlosJernimo Hernndez EduardoVentura Maqueda Diana
Docente:Dr. Jorge Antonio Amzquita Landeros
Grupo: BB12A
INTRODUCCINLa microbiologa se ocupa generalmente de organismos
tan pequeos que no pueden ser vistos a simple vista por el ojo
humano. Debido a la naturaleza de esta disciplina, el microscopio
tiene una importancia crucial; la mayor parte de los conocimientos
sobre los microorganismos se han descubierto con
microscopio.[footnoteRef:1]. [1: Lansing M. Prescott, John P.
Harley, Donald A. Klein, Microbiologa, quinta edicin, editorial Mc
Graw Hill, 2014, pgina 19.]
La mayora de microorganismos patgenos presentan caractersticas
fsico-qumicas, estas caractersticas son importantes para la
deteccin de estos microorganismos. Los mtodos empleados en el
laboratorio son los siguientes 1. preparacin de las muestras y
cultivo en un medio selectivo, 2. Aislamiento y observacin de las
caractersticas macroscpicas y microscpicas de las enterobacterias,
3. Pruebas bioqumicas para enterobacterias, 4. Identificacin de las
enterobacterias.Las bacterias pertenecientes a la familia
Enterobacteriaceae son los aislamientos bacterianos recuperados con
ms frecuencia de muestra clnicas;[footnoteRef:2] como alumnos del
rea de ciencias biolgicas y de la salud, es imprescindible que
estemos familiarizados con la teora y prctica que implica el
proceso de aislamiento e identificacin de enterobacterias. [2:
Koneman et al., 1999, p. 172]
OBJETIVO GENERAL-Identificar enterobacterias a partir de su
morfologa y pruebas bioqumicas especficas.OBJETIVOS
PARTICULARES.-Aprender a sembrar por tcnica de estra cruzada para
obtener colonias aisladas.-Identificar caractersticas morfolgicas,
macroscpicas y microscpicas de las colonias aisladas.-Obtener
cultivos puros mediante el resembrado de colonias aisladas.-Conocer
los fundamentos tericos de las pruebas bioqumicas con la finalidad
de realizar una lectura apropiada de stas, as como contar con la
tcnica adecuada para realizar las pruebas seleccionadas de
identificacin de enterobacterias.
MARCO TERICO.Preparacin y tincin de las muestrasAunque los
microorganismos vivos se pueden examinar directamente con un
microscopio ptico, a menudo hay que fijarlos y teirlos para
aumentar la resolucin y acentuar las caractersticas morfolgicas
para su estudio en el futuro.FijacinLas clulas teidas que se
observan en el microscopio deben parecerse lo ms posible a las
clulas vivas. La fijacin es un proceso por el cual se conservan y
fijan en su posicin las estructuras internas y externas de las
clulas de los microorganismos.Colorantes y tincin simple:Los
numerosos tipos de colorantes empleados para teir microorganismos
poseen dos caractersticas en comn: 1. Todos poseen grupos cromfobos
(grupos con dobles enlaces conjugados que dan el color al
colorante), 2. Pueden unirse a las clulas mediante enlaces inicos,
covalentes o hidrfobos. Por ejemplo, un colorante cargado
positivamente se une a estructuras cargadas negativamente de la
clula. Los colorantes ionizables se pueden dividir en dos clases
generales tomando como base la naturaleza de su grupo cargado.
Colorante bsico: Azul de metileno, fucsina bsica, cristal violeta,
safranina, verde malaquita. Colorante cido: Eosina, rosa de bengala
y fucsina cida. Tincin diferencial.Los mtodos de tincin diferencial
clasifican a las bacterias en grupos diferentes segn sus
propiedades de tincin. La tincin de Gram, desarrollada por el mdico
Dans Christian Gram, en 1884, es el mtodo de tincin ms ampliamente
utilizado en bacteriologa. Se trata de un mtodo de tincin
diferencial porque divide a las bacterias en dos clases. Gram
negativas Gram positivas
Agar MacConkeyExisten numerosos medios de cultivo con cualidades
y usos distintos, en esta prctica, por las razones expuestas a
continuacin, se usar el Agar MacConkey, el cual es un medio de
cultivo selectivo para el aislamiento, recuperacin y diferenciacin
de Enterobacteriaceae. Por su contenido de sales biliares y cristal
violeta resulta inhibitoria de bacterias Gram-positivo y de algunas
bacterias Gram-negativas exigentes; pues tales sales son secretadas
al intestino para la digestin de lpidos, siendo as un medio
propicio para enterobacterias. Contiene, adems, lactosa como nica
fuente de carbono; fermentadores fuertes de lactosa, como
Escherichia, Kleibsiella y Enterobacter, producen colonias rojas;
fermentadores lentos, como Citrobacter, Providencia, Serratia y
Hafnia, pueden aparecer sin color despus de 24h o rosa plido en
24-48h; Proteus, Edwarsiella, Salmonela y Shigella, producen
colonias transparentes, al no fermentar lactosa.[footnoteRef:3] [3:
Koneman et al., 1999]
Pruebas bioqumicas para identificacin de EnterobacteriaceaeEn
base a las caractersticas macroscpicas observadas en medios de
cultivo y a la tincin de Gram, se puede hacer una identificacin
primaria de las caractersticas morfolgicas de las colonias
sembradas. Sin embargo, una identificacin concluyente se basar en
la presencia o ausencia de diferentes enzimas, las cuales dirigen
el metabolismo de las bacterias a lo largo de uno o ms caminos que
pueden ser detectados por medios especiales usados en las tcnicas
de cultivo in vitro[footnoteRef:4] Tales medios son las pruebas
bioqumicas, sustratos con indicadores sobre los cuales reaccionan
estas enzimas, dependiendo de la enzima a detectar ser la prueba
aplicada; gracias a esto se puede determinar un perfil bioqumico
que permitir hacer una clasificacin de la especie bacteriana. Las
pruebas Utilizadas en la presente prctica son.[footnoteRef:5] [4:
Koneman et al. 1999, p 173] [5: Bustos at al. 2007.]
Prueba catalasa: Detecta la enzima catalasa con el uso de HO que
se descompone en oxgeno y agua; por lo que hay desprendimiento de
burbujas. Prueba oxidasa: Detecta la enzima citocromo oxidasa, que
se encuentra en organismos anaerobios y anaerobios facultativos.
Voges-Proskauer/Rojo de Metilo: Mide la conversin de acetona en
diactilo; identifica la produccin de cidos fuertes a partir de
glucosa. Citrato de Simmons: Detecta microorganismos que utilizan
citrato de sodio como nica fuente de carbono. SIM: Sirve para
detectar la presencia de la enzima triptofanasa a partir de la
produccin de indol; detecta movimiento bacteriano; identifica la
liberacin de azufre en forma de HS. Caldo urea: Detecta la enzima
ureasa a partir de la liberacin de amoniaco. Kliger (TSI):
Determina el tipo de azcares que fermenta la bacteria.
METODOLOGAPara llevar a cabo la prctica es necesario tener
contemplados varios aspectos como lo son:-Materiales y mesa de
trabajo en perfecto orden y limpieza.-Utilizacin de bata, guantes y
cubrebocas.-Entender perfectamente la metodologa de la prctica para
obtener resultados y conclusiones adecuadas y verdicas (una forma
para evitar el olvido de algn rubro es mediante la realizacin de
una bitcora, en la que por cada sesin se escribir el nombre de la
prctica a realizar; precauciones; materiales; metodologa y as,
tambin, alguna recomendacin).
PRIMERA SESIN: Sembrado en Agar MacConkey1. Esterilizacin:
esterilizacin de rea de trabajo2. Cultivo de la muestra de agua de
los bebederos de la UAM Cuajimalpa y UAM Lerma En la primera sesin
se procede a cultivar muestras de agua en el agar MacConkey; la
muestra HO 1 la obtuvimos de los bebederos de la UAM Cuajimalpa, la
muestra HO 2 se obtuvo de los garrafones de la UAM Lerma.
Se procedi a cultivar las muestras de agua, de las cuales se
hicieron 2 cultivos de cada uno de los bebederos (uno diluido y
otro sin diluir), en total se hicieron 10 cultivos de cada una de
las unidades de la UAM.La manera de cultivar las muestras fue la
siguiente: 1) Se esteriliz el asa bacteriolgica al rojo vivo en la
flama del mechero y para enfriar se sumergi en el agar (sto se
realiz cada vez que se iba a hacer un cultivo). 2) Se toma la
muestra de agua con el asa y se procede a estriar la misma en el
agar. 3) Cada agar se sell con un pedazo de masking y se etiquet
con los datos solicitados. 4) Las muestras se llevaron a la estufa
para dejarlas incubar.
SEGUNDA SESIN: Tincin de Gram y Resembrado.1. Seleccin de
colonias desarrolladas de agar MacConkey2. Resiembra de las
colonias desarrolladas en agar MacConkey para obtener cultivo puro
de bacterias.3. Observacin microscpica de los cultivos
seleccionados por Tincin de Gram.
24 horas despus de la siembra de las muestras de agua de los
bebederos de las unidades Lerma y Cuajimalpa de la UAM en el agar
MacConkey, no se present desarrollo de las bacterias.Debido a sto,
para realizar la resiembra de las colonias, se tuvo que pedir
muestras en las cuales s hubo desarrollo de las colonias de
bacterias (agua del ro Lerma).Se resembraron las colonias que tenan
las siguientes caractersticas: 1) Colonias rojas; 2) Colonias
rosadas y 3) Colonias blancas. Se dividi un nuevo agar MacConkey en
3 secciones y en cada uno se resembr cada una de las colonias.Para
resembrar la colonia se esteriliz el asa bacteriolgica al rojo vivo
y para enfriarla se sumergi en el agar, seguido de sto se colecto
la colonia y se deposit en la seccin que le corresponda en el nuevo
agar (esto se realiz para cada una de las resiembras). Al finalizar
la resiembra se sellaron los agar con masking y se llevaron a la
estufa para la incubacin.
Para preparar el frotis se lavaron (con agua y jabn) y
desengrasaron (con gotas de alcohol-acetona) los portaobjetos, para
que no resulte difcil la observacin de las bacterias.Se coloc una
gotita de SSI en el portaobjetos seguido de una pequea porcin del
cultivo que fue resembrado y se mezclaron hasta quedar una mezcla
homognea, se extendi la muestra hasta quedar una fina capa y se fij
pasando el portaobjetos por la flama del mechero (a una altura
hasta donde fuera soportable el calor al dorso de la mano).Para
realizar la tincin de Gram, se cubri el frotis con cristal violeta
durante 1 minuto, pasado el minuto se lav con lugol y
posteriormente se elimin el exceso de lugol con agua, seguido, se
dej resbalar alcohol-acetona hasta que no se desprendiera el color
y se lav inmediatamente con agua, finalmente se coloc una gota de
safranina a la preparacin (durante un minuto) y se lav, se dej
secar perfectamente y se observ el resultado en el microscopio.
TERCERA SESIN: Pruebas bioqumicas para enterobacteriasPruebas de
identificacin bioqumica de los cultivos puros seleccionados Prueba
Catalasa: Procedimiento.1. Colocar una gota de agua oxigenada sobre
un portaobjetos con ayuda de una pipeta Pasteur2. Suspender la
bacteria3. Detectar la formacin de burbujasPrueba Oxidasa:
Procedimiento.1. Poner un trozo de papel de filtro sobre un
portaobjetos.2. Depositar una porcin del cultivo y extenderlo sobre
el papel filtro 3. Aadir 2 gota del reactivo de oxidasa.
Siembra en medios para pruebas bioqumicas:1. Siembra en TSI
(medio inclinado color anaranjado) Con el asa bacteriolgica se toma
un inoculo ligero del cultivo puro y se siembra en forma de una
estra abierta sobre el rea inclinada del medio y se deja incubar.2.
Siembra en caldo urea (caldo de color rosa): Con el asa
bacteriolgica tomar un inoculo ligero del cultivo puro , se
suspende en el caldo y se agita el asa dentro de este. Dejar
incubar el tubo.3. Siembra en Citrato de Simmons (Medio inclinado
color verde): Con el asa bacteriolgica tomar un inoculo ligero del
cultivo puro y simbralo en forma de una estra abierta sobre el rea
inclinada del medio y dejar incubar.4. Siembra en caldo semislido
de SIM (color ambar): Con el asa bacteriolgica tomar un inoculo
ligero de cultivo puro y sembrarlo por picadura en el caldo
semislido y dejar incubar el tubo.5. Siembra en caldo Voges
Proskauer/Rojo de metilo (Color ambar): Con el asa bacteriolgica
tomar un inoculo ligero del cultivo puro, suspenderlo en el caldo y
agitar el asa dentro de este. Dejar incubar el tubo En la tercer
sesin pudimos observar el re-aislamiento satisfactorio de las
colonias de las muestras del ro Lerma, se procedi a realizar las
pruebas bioqumicas ya enlistadas para as conocer caractersticas
enzimticas de las colonias aisladas.En relacin a las muestras de
las unidades Cuajimalpa y Lerma de la UAM, nuevamente no hubo
desarrollo de bacterias 48 horas despus del cultivo.CUARTA SESIN:
Lectura de pruebas bioqumicas1. Interpretacin de las pruebas de
identificacin bioqumica: determinar los resultados de las pruebas
bioqumicas para saber el metabolismo de la bacteria identificada y
as saber su familia y especie2. Manejo de material contaminado
COLONIA 1COLONIA 2
MORFOLOGIA COLONIAL
FORMALOBULADOONDULADO
COLORBLANCAROJO
ELEVACIONPLANAPLANA
BORDEINDEFINIDOBLANCO DELGADO
CONSISTENCIAVISCOSAVISCOSA
TAMAOGRANDEGRANDE
OPACIDADOPACO-------------
SUPERFICIEIRREGULARIRREGULAR
MORFOLOGA MICROSCPICA
TINCIN GRAMNEGATIVANEGATIVA
PRUEBAS BIOQUIMICAS
CATALASAPositivaPositiva
OXIDASA Positiva Negativa
UREAPositivaPositiva
TSI (hierro triple azcar)PositivaPico de flauta rojo y
Profundidad amarillo.Medio Alcalino/cido (Alc/A).PositivaPico de
flauta rojo y Profundidad amarillo.Medio Alcalino/cido (Alc/A).
MOVILIDADPositivaPositiva
Ac. SULFHIDRICONegativaNegativa
INDOLPositivaPositiva
ROJO DE METILONegativaNegativa
VOGES PROSKAEURNegativaNegativa
CITRATO DE SIMMONSPositivaPresenta crecimiento con ligero cambio
de coloracin hacia un tono azul verdosoPositivaPresenta ligero
crecimiento con cambio de coloracin hacia un tono azul intenso
COLONIA 3
MORFOLOGIA COLONIAL
FORMA LOBULADO
COLORROSA
ELEVACIONCONVEXA
BORDEIRREGULAR
CONSISTENCIAVISCOSA
TAMAOMEDIANA
OPACIDADSI
SUPERFICIEIRREGULAR
MORFOLOGA MICROSCPICA
TINCIN GRAMNEGATIVA
PRUEBAS BIOQUIMICAS
CATALASAPOSITIVA
OXIDASAPOSITIVA
UREANEGATIVA
GLUCOSAPOSITIVO
LACTOSAPOSITIVO
SACAROSAPOSITIVO
MOVILIDADPOSITIVO
Ac. SULFHIDRICONEGATIVO
INDOLNEGATIVO
ROJO DE METILOPOSITIVO
VOGES PROSKAEURNEGATIVO
CITRATO DE SIMMONSPOSITIVO
TSIGASH2SRMVPINDCITUREMOV
TRIBUTO I:
GNERO :
E.coliAlc/A---- / +
GNERO:ShigellaAlc/A----
Grupos: A,B,C
S.Sonnei
TRIBU 2: EdwarsiellaeAlc/A-
GNERO: Edwarsiella
E.TardaAlc/A--+
TRIBU 3: Salmonelleae
GENERO: Salmonelleae
TRIBU 4: Citrobactereae
GENERO: CitrobacterAlc/A--++ / -
C.freundii
C.koseri
TRIBU 5: Klebsielleae
GENERO: Klebsiella
K.pneumoniae
k.axytoca
GENERO: Enterobacter
E.aerogenes
E.cloacaeAlc/A-- / +-
GENERO: Hafnia
H.alvesAlc/A- / +-- / +- / ++ / -
GENERO: Pantoea
P.agglomeransAlc/A-- / +- +
GENERO: Serratia
S. marcescens
TRIBU 6: ProteeaeAlc/A-++
GENERO: ProteusAlc/A-+ / -++
P. vulgaris+
P.mirabilisAlc/A--++
GENERO: Morganella+
M.morganiiAlc/A---+++
GENERO: ProvidenciaAlc/A---+
P.rettgeriAlc/A--+
P.stuartii+
P.alcalifaciens+
TRIBU 7: YersinieaeAlc/A---+ / -
GENERO: Yersinieae
Y. enterocoliticaAlc/A---+/-
RESULTADOS:
CITRATO DE SIMMONS CRECIMIENTO DE LA BACTERIA OBSERVACIN DE
BACILOS A 40xOBSERVACION DE COCOS A 40X CALDO UREAHIERRO TRIPLE
AZCAR VP-RM (CRECIMIENTO DE LA BACTERIA)
CALDO SEMISOLIDO SIM RESIEMBRA DEL CULTIVO BACTERIANO