EQUIPO 1 Mariana Delgado Domínguez Silvana Tapia Cabrera Alejandra Jimenez Molotla Yailín Fernández López PRÁCTICA 4: “SEPARACIÓN DE AMINOÁCIDOS DE JUGOS DE FRUTOS POR CROMATOGRAFÍA BIDIMENSIONAL EN CAPA FINA” INTRODUCCIÓN La cromatografía fue inventada por el botánico ruso Mikhail Tswett a principios del siglo XX, empleando esta técnica para separar algunos pigmentos de las plantas, el nombre de este método viene del griego choma (color) y graphein (escritura); el cual es un método de separación, identificación y determinación de los componentes químicos de mezclas complejas ocupando dos fases inmiscibles entre ellas. En la cromatografía en capa fina, se utiliza una placa( generalmente de aluminio) que se recubre con fase estacionaria que puede ser alúmina o silica gel, en la cual se presentara un fenómeno de adsorción selectiva. La fase móvil ascenderá por capilaridad por la placa arrastrando a su paso los componentes de la mezcla (o también llamados solutos) logrando separarlos; las fases involucradas en este tipo de cromatografía son: solido-liquido, las separaciones están basadas en las diferencias en la velocidad de migración entre los componentes de la fase móvil, polaridad (generalmente la fase estacionaria será más polar que la fase móvil, de forma que los componentes menos polares se desplazaran con una mayor velocidad) , tamaño de la partícula, temperatura, pureza de los disolventes, entre otros. La cromatografía bidimensional, se basa en desarrollar un cromatograma con dos fases móviles distintas en diferentes direcciones.(Aguilar, 2009) En la cromatografía, en general se fundamentan en las velocidades de migración de las distintas sustancias que se quieren separar , que están gobernadas por su solubilidades relativas en la fase estacionaria polar y la fase móvil no polar . En un solo paso de separación cada soluto se distribuye entre ambas fases de acuerdo con su coeficiente de partición ( es una constante de equilibrio definido) .Para un
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PRÁCTICA 4: “SEPARACIÓN DE AMINOÁCIDOS DE JUGOS DE FRUTOS POR CROMATOGRAFÍA BIDIMENSIONAL EN CAPA FINA”
INTRODUCCIÓNLa cromatografía fue inventada por el botánico ruso Mikhail Tswett a
principios del siglo XX, empleando esta técnica para separar algunos pigmentos de las plantas, el nombre de este método viene del griego choma (color) y graphein (escritura); el cual es un método de separación, identificación y determinación de los componentes químicos de mezclas complejas ocupando dos fases inmiscibles entre ellas. En la cromatografía en capa fina, se utiliza una placa( generalmente de aluminio) que se recubre con fase estacionaria que puede ser alúmina o silica gel, en la cual se presentara un fenómeno de adsorción selectiva. La fase móvil ascenderá por capilaridad por la placa arrastrando a su paso los componentes de la mezcla (o también llamados solutos) logrando separarlos; las fases involucradas en este tipo de cromatografía son: solido-liquido, las separaciones están basadas en las diferencias en la velocidad de migración entre los componentes de la fase móvil, polaridad (generalmente la fase estacionaria será más polar que la fase móvil, de forma que los componentes menos polares se desplazaran con una mayor velocidad) , tamaño de la partícula, temperatura, pureza de los disolventes, entre otros. La cromatografía bidimensional, se basa en desarrollar un cromatograma con dos fases móviles distintas en diferentes direcciones.(Aguilar, 2009)
En la cromatografía, en general se fundamentan en las velocidades de migración de las distintas sustancias que se quieren separar , que están gobernadas por su solubilidades relativas en la fase estacionaria polar y la fase móvil no polar . En un solo paso de separación cada soluto se distribuye entre ambas fases de acuerdo con su coeficiente de partición ( es una constante de equilibrio definido) .Para un sistema de solventes y un tipo de papel determinado , cada sustancia tiene un valor de Rf característico. Una mezcla compleja que no se separa por completo en un solo cromatograma en papel usa la cromatografía bidimensional en papel. Basada en el principio anterior , con la diferencia en la técnica , la muestra se aplica en una esquina y el cromatograma se corre en forma paralela a uno de los bordes del papel, al terminar el primer cromatograma la hoja se rota 90º y se realiza una cromatografía paralela al segundo borde utilizando otro sistema desolventes. Dado que cada compuesto migra a una velocidad característica en un sistema de solventes determinado, la segunda cromatografía debería incrementar en grado sustancial la separación de la mezcla de componentes.( Braitwaite,1985)
Figura 1.2 En ésta foto se puede mostrar una cromatoplaca, la cual contiene las 6 muestras de los jugos problemas, los cuales como se puede apreciar tuvieron una elución correcta a lo largo de la cromatoplaca. 2° mezcla de solventes
Se utilizó la técnica de cromatografía en capa fina, la cual se basa en la separación de las moléculas absorbidas a la capa de gel de sílice de la cromatoplaca mediante el flujo de la columna de la mezcla de solventes de agua, butanol y ácido acético. La fase estacionaria es la celulosa y la móvil los disolventes. Según la solubilidad que tienen los aminoácidos de la muestra respecto de las dos fases así fue su movilidad Las manchas de los aminoácidos se observaron sobre la placa desarrollada, por la una solución de ninhidrina rociada y al después ponerla en la estufa.
Los aminoácidos aparecieron como manchas púrpura sobre un fondo ligeramente amarillento. Sin embargo, la prolina (que no produce amonio libre al reaccionar con ninhidrina) genera una mancha de color amarillo oscuro.
Se utilizó la ninhidrina debido a que sirve para la determinación de aminoácidos con el grupo amino libre .La ninhidrina (hidrato de tricetohidrindeno) reacciona con aminoácidos que tengan el grupo amino libre, dando lugar a la formación de amoniaco y anhídrido carbónico, con reducción del reactivo (ninhidrina) a hidrindantina. La hidrindantina reacciona a su vez con el amoniaco y otra molécula de ninhidrina para dar un compuesto de adición doble que presenta una coloración azul-púrpura. La ninhidrina reacciona con los aminoácidos formando aductos coloreados según la reacción:
El reparto de los aminoácidos en el papel se debe a su naturaleza química. Las fórmulas de los compuestos usados como patrón son:
El reparto que se obtiene es el siguiente: los aminoácidos apolares son los que mejor interaccionan con el solvente y son arrastrados por él; la lisina presenta la menor movilidad debido a que al pH del solvente, este aminoácido presenta sus dos grupos amino cargados positivamente por lo que interacciona mal con el solvente, mayoritariamente apolar (n-butanol). Los demás aminoácidos se separan entre los aminoácidos apolares y el básico.
Al determinar los factores de retención se puede observar que el triptofano es el que mayor factor de retención obtuvo, esto debido a que es el que tiene mayor afinidad por el disolvente y el de menor factor de retención fue la histidina, es decir, tuvo menor afinidad por el disolvente.
CONCLUSIONESEsta técnica de separación cromatográfica es de las más simples, además de que nos permitió estudiar esta técnica y cualitativamente observar la reacción producida por medio de la ninhidrina que permite identificar aminoácidos ya que la reacción de los aminoácidos con ninhidrina se debe a la presencia del grupo α–NH2 en los
mismos observándose así una coloración morada o magenta. La prolina no tiene dicho grupo libre, sino –NH- ya que forma parte del anillo de pirrolidina, y al reaccionar con ninhidrina se forma un color amarillo….El factor de retención depende de la afinidad de los aminoácidos con el disolvente o
eluyente utilizado y esto mismo depende del tipo de aminoácido que se utilice, es decir si son polares, apolares, neutros, etc., por lo cual es importante esta técnica ya que de esta manera se nos facilitaran saber las características del aminoácido que se este utilizando.
REFERENCIAS.Aguilar Zamora Emanuel 2009, Manual del Instituto Politécnico Nacional Escuela Nacional de Ciencias Biológicas Químico Bacteriólogo Parasitólogo, México.
.Braitwaite,L.and F,J .Smith 1985 Cromatographic Methods 43 ed,Chapman and Hall ,N.Y paginas 98-101
PRÁCTICA 5: SEPARACIÓN DE UNA MEZCLA DE AZUL DE METILENO Y FLUORESCEINA USANDO CROMATOGRAFÍA POR ADSORCIÓN
INTRODUCCIÓN
La cromatografía consiste en una serie de métodos que sirven para la separación de una mezcla de solutos. Se basa en la diferente velocidad con que se mueve cada uno de los solutos a través de un medio poroso, arrastrados por un disolvente en movimiento. El fundamento de la cromatografía consiste en el reparto o distribución diferencial de dos o más compuestos (solutos) entre dos fases, una de las cuales permanece fija, por lo que se denomina fase fija o estacionaria y otra que fluye a través de ella, por lo que se le denomina fase móvil o eluyente. Como la fase estacionaria debe permanecer fija, su estado físico se limita a sólidos y líquidos, en tanto que la fase móvil requiere ser un líquido o un gas para poder fluir.Las separaciones por cromatografía de reparto, son particularmente interesantes para los compuestos solubles en agua. La cromatografía por adsorción es el fenómeno de adhesión superficial cuyo mecanismo consiste en interacciones bipolares. Esta utiliza una fase líquida móvil y una fase estacionaria sólida. Se puede tener en columnas o en capa fina. En esta cromatografía se sobresalta porque la diferencia principal es la composición de la fase móvil; esta es de tal naturaleza que cuando el material se aplica al adsorbente, el soluto queda inmovilizado. La migración empieza hasta que se añade una fase móvil.(Castellan, 1990)
Existen ciertas sustancias sólidas, químicamente inertes, que tienen la propiedad de adsorber o fijar débilmente en su superficie a una gran cantidad de compuestos. La fortaleza con la que se adsorben las sustancias sobre un adsorbente dado varía de un compuesto a otro. Entre los adsorbentes más usuales: sílica Gel (óxido de silicio), alúmina (óxido de aluminio), celulosa, fluorosil (silicato de magnesio) y sulfato de calcio. La separación se realiza por la diferente tendencia de adsorción de los compuestos orgánicos por la fase estacionaria. La fase móvil desplaza y disuelve a los componentes de la mezcla según sea su afinidad por la fase estacionaria es decir, los componentes más polares estarán adsorbidos con más fuerza y serán más difíciles de separar de la fase estacionaria que los componentes poco polares. Los menos polares no presentan una interacción importante con la fase estacionaria (gel de sílice) y no serán retenidos. En un proceso de adsorción los componentes de la mezcla son adsorbidos por la fase estacionaria con diferente intensidad de tal forma que el proceso adsorción. (Carrillo, 2009)
Figura 1.0 En este perfil de elución se observan claramente dos picos el primero corresponde a la separación de fluoresceína ya que es el primer componente de la mezcla que se obtuvo, enseguida se observa un lapso en el que no se obtuvo ningún componente, es decir que las absorbancia fueron casi constantes y finalmente se observa otro pico que corresponde al azul de metileno ya que el colorante que se obtuvo al final.
3. Especifique y defina los elementos del sistema cromatográfico para esta
separación
Fase Estacionaria: Silica Alcalina. Puede ser un sólido poroso que funciona de soporte para la elución y poseen alta capacidad de adsorción, interacciona con los compuestos a separar por puentes de hidrogeno e interacciones electrostáticas.Fase Móvil: Agua y Etanol ácido. También conocida como eluyente es una mezcla de solventes que arrastra a los componentes que se encuentran adheridos a la fase estacionaria, son de gran importancia pues determinan con sus interacciones y afinidad el perfil de elución.Columna: Columna de Vidrio: Es el instrumento de soporte de la fase estacionaria, en este caso se utiliza un trozo de lana-cristal para poder retener la silica en la columna.Gradiente: Agua y cambio a Etanol ácido. Consiste en utilizar mezclas variables de dos o mas sustancias de distinta polaridad, la relación de volumen de los disolventes varía según el propósito y permite una elución mejorada.Mezcla: Es un conjunto de 2 o más sustancias que pueden ser separadas por un método físico o químico.
4. Defina el término adsorción y describa, empleando fórmulas, cuales son las
fuerzas intermoleculares que participan en el proceso.
Adsorción: Fenómeno por el cual moléculas de un gas o de un líquido se fijan dentro de una fina capa superficial de determinada sustancia en estado sólido.
Fluoresceína
La fluoresceína es una sustancia muy polar debido a los electrones no compartidos, esta misma característica presenta el agua, sabemos que lo polar disuelve lo polar por lo tanto la fluoresceína se disuelve en el agua, por lo tanto lo que eluye son ambas sustancias.
El azul metileno eluye con el etanol acido (ambas sustancias no polares) por que entre estas dos se da una competencia por el adsorbente, ya que se sabe que adsorbentes con superfiece activa alta adsorben a compuestos no polares
Azul de metileno etanol
DISCUSIÓN:A simple vista se observó que el primer elemento en separarse fue la fluoresceína y posteriormente el azul de metileno.En el perfil de elución se observan dos elevaciones:
La primera se detecto a una longitud de onda de 493 nm que corresponde al agua, como sabemos el agua es una sustancia polar por lo tanto disolverá compuestos semejantes. En la mezcla de colorantes el componente mas polar es la fluoresceína, por lo tanto la elevación en el perfil de elución corresponde a la separación de este compuesto.
Hay algunos volúmenes en los que a diferentes longitudes de onda la absorbancia es mínima lo cual indica que durante este lapso no se separo ningún componente de la mezcla.
La alúmina (fase estacionaria) tiene una superficie activa alta, por lo cual adsorberá mejor a compuestos no polares; al no presenta polaridad, el etanol y azul de metileno competirán por ser adsorbidos, lo cual les permitirá que eluyan juntos, es por esto que se en el cromatograma se observa el segundo pico ya que este fue detectado a 668nm que corresponde a la longitud de onda para el etanol.
CONCLUSIONES:. En esta cromatografía se aplico el principio básico polar disuelve polar, esto es lo que hizo posible que separar a la fluoresceína de acuerdo a su polaridad, finalmente el otro componente se pudo separar ya que la fase estacionaria presentaba una superficie activa alta lo cual le hace tener gran afinidad por los compuestos no polares, al haber dos compuesto no polares en la cromatografía (azul de metileno y etanol) esto competirían por ser adsorbidos lo que ocasiono que eluyeran juntos.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Carillo del Ángel José de Jesús 2009 MANUAL DEL INSTITUTO POLITECNICO NACIONALESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLOGICASDEPARTAMENTO DE BIOQUIMICA 4IM2 SECCION III 2011500079
para medir, en función de la longitud de onda, la relación entre valores de una misma magnitud fotométrica relativos a dos haces de radiaciones y la concentración o reacciones químicas que se miden en una muestra. También es utilizado en los laboratorios de química para la cuantificación de sustancias y microorganismos. Hay varios tipos de espectrofotómetros, puede ser de absorción atómica o espectrofotómetro de masa y visuales.
Este instrumento tiene la capacidad de proyectar un haz de luz monocromática a través de una muestra y medir la cantidad de luz que es absorbida por dicha muestra. Esto le permite al operador realizar dos funciones:
1. Dar información sobre la naturaleza de la sustancia en la muestra2. Indicar indirectamente qué cantidad de la sustancia que nos interesa está
presente en la muestra
La espectrofotometría de absorción en las regiones ultravioleta y visible del espectro electromagnético es, posiblemente, la más utilizada en la práctica del análisis cuantitativo de todas las técnicas espectroscópicas. Asimismo, puede resultar de utilidad como técnica auxiliar para la determinación de estructuras de especies químicas.(Murali,1980)
La química es importante para realizar la lectura de un líquido en cualquier material volumétrico. Para esto deben coincidir la curva (más bien la tangente de ésta)(la parte central)con el aforo o graduación. Siempre teniendo la vista perpendicular a ambas.
El líquido restante del menisco que queda por encima del aforo (en caso de ser cóncavo), generalmente queda en el recipiente una vez vertido el contenido.(Rand,1969)
CONTROL DE LA EXACTITUD DE LA LONGITUD DE ONDANO APTO PARA FOTOCOLORÍMETROS NI AUTOANALIZADORES
Frecuencia del control:
El control se podrá realizar en espectrofotómetros con selector continuo de
longitudes de onda, no así en fotocolorímetros de filtro ni en autoanalizadotes, ya que en estos no se pueden realizar espectros de barrido.
Definición: Grado de concordancia entre la longitud de onda que indica el seleccionador y la longitud de onda de referencia requerida. Se expresa en nm.
Fundamento: Se utiliza el método del punto isosbéstico: el rojo Congo tiene la particularidad que los espectros de las formas ácida y básica del colorante en igual concentración presentan la misma absorbancia a una longitud de onda denominada "punto isosbéstico" (PI). Esta longitud de onda es independiente de la concentración del colorante y de la temperatura de trabajo por lo cual resulta un parámetro fijo de referencia. Si el punto isosbéstico hallado experimentalmente difiere del teórico, indica que existe un corrimiento en la longitud de onda .(Frings,1979)
OBJETIVO GENERALRealizar pruebas de control de calidad de un espectofotómetro para determinar la respuesta instrumental del equipo.
OBJETIVO ESPECIFICO
Analizar las siguientes pruebas: proporcionalidad o linealidad fotométrica, exactitud de la escala de longitud de onda, presencia de radiación dispersa, ancho de banda y exactitud para determinar la respuesta de diferentes equipos espectofotométricos.
PROCEDIMIENTO
A) Se determinó el volumen mínimo de lectura y se observó el “Efecto menisco”.
Se ajustó el aparato a cero con aire, a una longitud de onda de 500 nm. Se
colocaron 0.2 ml de la solución dicromato de potasio al 0.08 % y se tomó la
primera lectura. Se agregaron 0.2 ml de la solución nuevamente y se registró la
lectura. Se repitió la adición de la misma cantidad de solución tomando las
lecturas hasta que permaneciera constante. Se determinó el volumen mínimo de
D) Ancho de la banda (ranura de salida)Se leyó la transmitancia del sulfato de níquel al 20 % a 510 nm, se ajustó
previamente el aparato a 0 y 100 %T con HCI al 1 %. Se considera que hay cambios
en el ancho de banda cuando hay decrementos del 3 %T con respecto a la lectura
original (inciso B) (ver manual, Tabla 6, pág 39)
E) Exactitud fotométricaEn una espectrofotómetro que trabaje en la región ultravioleta, se determinó la
absorbancia de una solución de referencia de dicromato de potasio. Se ajustó el
instrumento al aire y a 100 %T con H2SO4 0.005 M. La lectura se efectuó en una
cubeta de cuarzo de 1 cm de paso de luz, (ver Tabla 7, pág 40)
COMPORTAMIENTO INTEGRAL DEL ESPECTROFOTÓMETRO
a) Prepare por duplicado la curva de calibración de acuerdo a la siguiente tabla
Tabla No. 1 Preparación de la curva de calibración del sulfato de níquel, (ver manual, pág 37)
Se determinó la absorbencia de cada tubo de ambas series, a 400 nm ajustando al
100 % T con el tubo 1 y 1 ' respectivamente, (Tabla 8, pág 40)
RESULTADOS Y ANALISISTabla 1. Determinación Del Volumen Mínimo De Lectura Y “Efecto Menisco”
La luz atraviesa de manera uniforme a un volumen mínimo de lectura de 1mL y presenta un efecto menisco a 0.8mL de la sustancia de bicromato (0.08%) a 500nm de longitud de onda.
Corrimiento (nm) = p. isosbéstico hallado – p. isosbéstico teórico
El punto isosbéstico teórico del Rojo Congo es 541 nm. Corrimiento (nm) = 420 – 500 = 80 nm Ya que los limites de aceptabilidad se encuentran en un corrimiento de entre +/- 3 nm y un intervalo optimo de entre +/-2 nm, se determino que existe un gran corrimiento en la longitud de onda, mayor a 3 el cual fue de 101.Se debe tomar en cuenta que las mediciones se detuvieron en ese intervalo por lo cual no se llego a las mediciones adecuadas para obtener el punto isosbestico real para las tres disoluciones. Absobancia de color Rojo. 500‐560B) Linealidad o proporcionalidad fotométrica
Tabla 4. Linealidad o proporcionalidad fotométricaSolución de NiSO4. 6H20 al 20 %
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS1:Murali Dharan. Control de calidad de instrumentos y equipamientos de laboratorio. En: Murali Dharan. Control de Calidad en las Laboratorios Clínicos. Madrid: Ed. Reverté S.A; 1980. p. 145-62.