Aislamiento e identificacin de hongos a partir de diversos
sustratos
INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS
BIOLGICAS LABORATORIO DE MICOLOGA GENERAL Y MDICA
Aislamiento e identificacin de hongos a partir de diversos
sustratos
Grupo 3QM2 Equipo 5
Seccin 2
Yong Mendoza Samantha Blancas Napoles Citlali Margarita Ubaldo
Lazcano Adolfo Ernesto
SEPTIEMBRE 2010
Septiembre 2010
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Aislamiento e identificacin de hongos a partir de diversos
sustratos
NDICEObjetivos Introduccin Diagramas de flujo Resultados
Morfologa colonial y microscpica cepas tipo Alternaria sp.
Aspergillus flavus Aspergillus niger Aspergillus terreus
Cladosporium sp. Curvularia sp. Fusarium sp. Geotrichum sp. Mucor
sp. Paecilomyces sp. Pestalotia sp. Penicillium sp. Rhizopus
nigricans Neurospora sp. Trichoderma sp. Ulocladium sp.
Cunninghamella sp. Syncephalastrum sp. Zigorrhynchus sp. Pichia sp.
Candida albicans Saccharomyces cerevisiae Hansenula sp. Rhodotorula
sp. Cryptococcus neoformans Muestras clnicas Muestras clnicas (uas,
pelo o escamas de piel) Exudado farngeo Morfologa colonial y
microscpica cepas identificadas Hongo 1 Hongo 2 Hongo 3 Hongo 4
Discusin de resultados Conclusiones Referencias 03 04 06 09 09 09
10 10 10 11 11 12 13 13 14 14 15 16 16 17 18 18 19 19 19 20 20 20
21 21 21 21 22 23 23 24 26 28 31 35 36
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sustratos
OBJETIVOS1) Objetivo general: Mediante la aplicacin de diversas
tcnicas llevar a cabo el aislamiento de algunos gneros de hongos
para su posterior identificacin. a. Objetivo Particular 1: A partir
de muestras clnicas como uas, pelo o escamas de piel; aislar hongos
dermatofitos causantes de algunas micosis superficiales. i.
Objetivo especfico 1.1: Obtener bajo los cuidados apropiados,
muestras clnicas de por lo menos dos pacientes. ii. Objetivo
especfico 1.2: Conocer diferentes medios de cultivos tiles en el
asilamiento de hongos dermatofitos (Sabouraud y Micobiotic). b.
Objetivo Particular 2: Mediante un exudado farngeo, llevar a cabo
el aislamiento de hongos levaduriformes, en especial del gnero
Candida. i. Objetivo especfico 2.1: Implementar la tcnica apropiada
para la realizacin de un exudado farngeo. ii. Objetico especfico
2.2: Aprender y aplicar la tcnica de siembra por estra cruzada y
estra abierta. c. Objetivo Particular 3: Mediante la siembra de
diferentes tipos de sustratos naturales asilar hongos saprobios
para su posterior identificacin. i. Objetivo especfico 3.1: Poner
en prctica diferentes tipos de tcnicas de aislamiento segn el tipo
de sustrato empleado (por impronta, siembra por punto, siembra
masiva, por exposicin de placas y por diluciones). ii. Objetivo
especfico 3.2: Conocer la aplicacin de algunos tipos de medios de
cultivo como Rosa de Bengala (RB) y Papa Dextrosa Agar (PDA). iii.
Objetivo especfico 3.3: Obtener colonias puras mediante una
resiembra en tubo para su posterior descripcin colonial. iv.
Objetivo especfico 3.4: Comparar la morfologa colonial de cepas
tipo. v. Objetivo especfico 3.5: Conocer e implementar las dos
tcnicas de microcultivo y poner de manifiesto las ventajas y
desventajas de cada una de ellas. vi. Objetivo especfico 3.6:
Llevar a cabo la observacin microscpica tipo de algunos gneros de
hongos saprobios. vii. Objetivo especfico 3.7: Realizar la
observacin microscpica de las preparaciones obtenidas mediante la
tcnica de microcultivo para la identificacin de, al menos, el gnero
de los hongos problema.
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Aislamiento e identificacin de hongos a partir de diversos
sustratos
INTRODUCCINLos hongos constituyen un grupo muy numeroso de
organismos, actualmente se han descrito aproximadamente 500 000,
sin embargo se estima que pueden llegar a existir hasta 1.5
millones de especies. Presentan una gran distribucin en la
naturaleza, contribuyendo a la descomposicin de la materia orgnica
y participando en los ciclos biolgicos. Slo un pequeo nmero de
ellos son patgenos de animales y plantas1. La denominacin de hongos
proviene de sus representantes ms sobresalientes, los hongos con
sombrerillo (griego, mykes; latn, fungus)2. Inicialmente, los
hongos fueron clasificados dentro del Reino Plantae, ya que fueron
considerados como organismos inmviles presentando estructuras que
se asientan firmemente en el sustrato sobre el que crecen. Sin
embargo, al haber sido aplicada la biologa molecular en los
estudios taxonmicos se ha observado que los hongos se encuentran ms
prximos al reino Animalia que al Plantae3. En el sistema actual de
clasificacin, los hongos se encuentran clasificados en el dominio
Eukarya4 y constituyen el Reino Fungi, que se divide en cuatro
Phyla denominados: y y y y Ascomycota. Es el ms extenso y comprende
el 50% de los hongos conocidos y aproximadamente el 80% de los
hongos patgenos. Basidiomycota. Zygomycota. Chytridiomycota5.
Los hongos en los que no se conoce su reproduccin sexual,
constituyen un grupo heterogneo denominado Deuteromicetos, hongos
imperfectos o mitospricos, que representan el segundo grupo ms
numeroso y que tambin incluye patgenos humanos6. Todos los hongos
son organismos eucariotas y poseen varios cromosomas como Candida
albicans con siete cromosomas, Aspergillus nidulans con ocho o como
el caso de Saccharomyces cerevisiae con diecisis cromosomas. Tienen
un nuclolo rico en RNA y organelos citoplsmicos, como mitocondrias,
vacuolas, retculo endoplsmico, aparato de Golgi y ribosomas 80 S.
Su citoplasma est limitado por una membrana de fosfolpidos. Aunque
comparten muchas estructuras, las clulas de los hongos se
diferencian de las de las plantas en la composicin de la pared
celular y en la carencia de cloroplastos y clorofila; y de las
animales en la presencia de ergosterol en la membrana citoplsmica7.
Aunque la celulosa se encuentra presente en ciertos hongos, muchos
de ellos poseen paredes no celulsicas. La quitina, un polmero de N-
acetil- D- glucosamina es un constituyente comn de las paredes
celulares fngicas. En algunas especies existen otros polmeros como
mananos, galactanos o quitosn8.Hongos y Actinomicetos alergnicos.
Revista Iberoamericana de Micologa. Schlegel, Hans G. Microbiologa
General. 3 dem 1. 4 Brock, Biologa de los microorganismos. 5 dem 1.
6 Ibdem. 7 Ibdem. 8 dem 4.1 2
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sustratos
Los hongos son tpicamente quimioorganotrofos y tienen pocos
requerimientos nutricionales. Muchas especies pueden crecer en
ambientes extremos con bajos PH o altas temperaturas hasta de 62C y
esto, junto con la ubicuidad de las esporas fngicas, hace que sean
los contaminantes ms frecuentes de alimentos, medios de cultivo
microbianos, etc9. Este grupo de organismos presentan bsicamente
dos tipos de morfologas: una denominada filamentosa y otra
unicelular o levaduriforme. Al microscopio ptico, los hongos
filamentosos presentan unas estructuras tubulares que se denominan
hifas10. Las hifas crecen en masa formando el micelio que puede
verse fcilmente sin ayuda del microscopio11. En la mayora de los
hongos filamentosos, las hifas son tabicadas y presentan septos que
delimitan las diferentes clulas. Sin embargo, los hongos del Phylum
Zygomycota presentan hifas que carecen de septos y se denominan
cenocticas12. La mayora de los hongos presentan reproduccin sexual
y asexual. El estado sexual se denomina teleomorfo o meisosprico, y
el asexual anamorfo o mitosprico. Es relativamente comn que un
mismo hongo tenga dos nombres, el del estado anamorfo y el del
estado teleomorfo, ya que suelen haberse descubierto y nombrado de
forma independiente13. A partir del micelio, algunas hifas buscan
la superficie donde forma esporas o conidios. Los conidios son
esporas asexuales, a menudo muy pigmentadas y resistentes a la
desecacin, que sirven como forma de dispersin del hongo en nuevos
hbitat. Cuando se forman los conidios, cambia el color blanco del
micelio adquiriendo el de stos que puede ser negro, rojo,
azul-verdoso, amarillo o marrn14. Las esporas sexuales se producen
tras la fusin de los ncleos de dos hifas sexualmente compatibles o
de dos levaduras y posterior meiosis. La morfologa de las esporas
sexuales es muy variada y tiene gran inters para la identificacin
fngica15. Los hongos que presentan crecimiento levaduriforme
generalmente dan lugar a colonias lisas que recuerdan a las bateras
en medios de cultivo slidos. Dichas colonias se encuentran formadas
por agregados de clulas individuales denominadas levaduras que se
dividen por gemacin o por fisin binaria. En algunos casos las
clulas hijas no se separan de la clula madre, formndose cadenas
cortas denominado pseudomicelio. Un pequeo grupo de hongos, pero de
gran importancia en Micologa clnica, presentan tanto un crecimiento
levaduriforme como micelial que se denominan dimorfos16
Ibdem. dem 1. 11 dem 4. 12 dem 1. 13 Ibdem. 14 dem 4. 15 dem 1.
16 Ibdem.9 10
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Aislamiento e identificacin de hongos a partir de diversos
sustratos
Aislamiento e identificacin de sustratos .
Medios de cultivo : Papa Dextrosa Agar (PDA) Sabouraud Dextrosa
Agar (SDA) Rosa de Bengala (RB)
REVISIN DE CAJAS Tenemos que observar hongos que esten aislados
para realizar una resiembra con el fin de obtener un cultivo
axenico .
EN EL FONDO COLOCAR GLICEROL PARA MANTENER LA HUEMDAD DEL AGAR Y
FAVORECER EL CRECIMIENTO DE L HONGO
SIEMBRA DE SUSTRATOS Obtencin de muestra proveniente de
productos comestibles . En este caso *Tortilla *Pan *Madera
RESEMBRAR POR PUNTO LOS HONGOS AISLADOS
*COLOCAR SOBRE LA VARILLA DE VIDRIO EL CUBO DE 1 cm CBICO.
INOCULAR POR PUNTO EL CUBO POR LAS CUATRAS CARAS . COLOCAR UN
CUBREOBJEETOS ENCIMA DEL CUBITO .
Criterios a considerar para eleccin de hongo: *que sea un hongo
uniforme *Preferentemen te aislado
Si l a muestra llegara a a ser de suelo podremos encontrar un
sistema de diluciones
iNCUBARA A 28C POR 2 DAS
METODO TRADICIONAL NECESITAMOS MATERIAL ESTERIL *UNA CAJA DE
PETRI DE VIDRIO * UN PORTAOBJETOS *VARILLA DE VIDRIO *CUBOS DE AGAR
DE 1cm3
.
TCNICAS DE AISLAMIENTO *Por punto *Por estria *Por impronta *Por
exposicion de placa
Incubar las cajas a 28C DURANTE 2 DAS
REVISIN DE MEDIOS, PARA ESTE MOMENTO TENDREMOS UN CULTIVO
AXENICO , ES DECIR, PURO CON UN SOLO HONGO . HABREMOS LOGRADO PARA
ESTE PASO EL AISLAMIENTO DE NUESTRO HONGO.
PARA LA IDENTIFICACIN TENEMOS QUE REALIZAR UN MICROCULTIVO QUE
EN ESTA OCASION LO REALIZAREMOS POR DOS TECNICAS : TRADICIONAL Y
ACTUAL
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sustratos
TCNICA ACTUAL
COLOCARLO EN LA PARTE OPUESTA AL CORTE DEL AGAR. INOCULAR EN LAS
CUATRO PAREDES DEL CUBO POR PUNTO .CUBRIR CON UN CUBREOBJETOS.
SE INCUBAN LOS MICROCULTIVOS A 28C POR DOS DAS
OBSERVAMOS EN EL MICROSCOPIO, PARA LA IDENTIFICACION DE
ESTRUCTURAS DE REPRODUCCIN QUE NOS LLEVE COMO MNIMO A GNERO.
NECESITAMOS : *CAJA DE SABOURAUD DEXTROSA AGAR * BISTURI
*CUBREOBJETOS (2)
AL TERMINAR EL MICROCULTIVO POR ESTA TCNICA SE ASEMEJARA A UNA
CARITA FELIZ .
EN EL CASO DEL MICROCULTIVO SE DEBE DE TENER EN CUENTA EL TIEMPO
DE INCUBACIN
PARA LA SEGUNDA PREPARACIN RETIRAMOS EL CUBO DE AGAR Y LO
COLOCAMOS EN FORMOL DICHO CUBO . COMOCAMOS EN EL PORTA UNA GOTA DE
AZUL LACTOFENOL Y ENCIMA UN CUBREOBJETOS . FIJAMOS CON BARNIZ
CON AYUDA DEL BISTURI EN UNO DE LOS EXTREMOS DE LA CAJA MARCAR
UNA LINEA QUE TENGA CUADRITOS DE Icm POR LADO Y CORTARLOS .
REALIZAR PREPARACIONES
PARA LA PRIMERA COLOCAMOS EN UN PORTAOBJETOS UNA GOTA SE AZUL
ALGODON LACTOFENOL Y ENCIMA EL CUBREOBJETOS , POSTERIORMENTE SELLAR
CON BARNIZ.
LEVANTAR DOS DE ESOS CUADRITO ( SI ES NECESARIO 2) PARA TENER AL
FINAL DOS CUBITOS DE Icm POR LADO.
SE REALIZARA UN MICROCULTIVO POR CADA HONGO DEL CUAL SE TENGA UN
CULTIVO PURO.
TCNICA TRADICIONAL *RETIRAR EL GLICEROL *AGREGAR FORMOL AL 10%
PARA MATAR AL HONGO Y FIJAR ESTRUCTURAS POR HORA Y MEDIA .
REALIZAREMOS DOS PREPARACIONES UNA CON EL CUBREOBJETOS Y OTRA
CON EL PORTAOBJETOS QUE SOPORTABA EN CUBO DE AGAR .
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Aislamiento e identificacin de hongos a partir de diversos
sustratos
CADA UNA DE LAS COLONIAS DE LOS CULTIVOS PUROS QUE OBTUVIMOS SE
DESCRIBIRN EMPLEANDO PARAMETROS COMO COLOR, TEXTURA,
SUPERFICIE.
Muestras de la Cabeza: recoger las escamas, los pelos (con
raz).
Muestras de las Uas: tomar fragmentos pequeos de las uas.
SE SEMBRARAN LAS MUESTRAS DE UAS, PELO Y PIEL EN MYCOBIOTIC, POR
LA TCNICA DE PUNTO .
COLOR *ANVERSO *REVERSO ESTE PARAMETRO ES MUY IMPORTANTE PARA
PODER PREDECIR UN HONGO CON MICELIO HIALINIO O MELANICO
Muestras de la Piel: se deben recoger abundantes escamas de la
zona lesionada, preferiblemente de los bordes o bien pasar un trozo
de moqueta especial y estril varias veces por la lesin.
Lesiones en mucosas: se recoger un exudado mediante una torunda.
Se tomarn preferiblemente dos muestras, una para examen microscpico
y otra para la siembra en un medio de cultivo.
SE REALIZARA UN EXUDADO FARINGEO Y SE SEMBRAR EN BIGGY PARA
DESCARTAR PRESENCIA DE LEVADURAS Y EN GELOSA SANGRE .
TEXTURA *ALGODONOSA *VELLOSA *ATERCIOPELADA *GRANULOSA
*PULVERULENTA *CREMOSA
TOMA DE MUESTRA
LA MUESTRA PODR SER DEPOSITADA EN UNA CAJA PETRI O EN
PORTAOBJETOS.
SE INCUBAN POR 15 DIAS A 28C
SUPERFICIE *LISA *ACUMINADA *PLEGADA *CEREBRIFORME *UMBILICADA
*CRATERIFORME
Tratamiento de muestras clnicas
ELECCIN DEL MEDIO DE CULTIVO BIGGY MYCOBIOTIC GELOSA SANGRE PARA
EXUDADO FARINGEO
NO SE OBSERVO CRECIMIENTO ALGUNO EN LOS TUBOS Y DEL CRECIMIENTO
DE BIGGY SE REALIZA UN FROTIS QUE SE TIE CON LA TCNICA DE GRAM
.
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Aislamiento e identificacin de hongos a partir de diversos
sustratos
RESULTADOSy Morfologa colonial y microscpica de cepas tipo
Alternaria sp.
17
Textura Superficie Color Anverso Color Reverso Pigmento
difusible al medio
Vellosa Plana Negro con bordes blancos Negro No
18
19
Doctor Fungus (http://www.doctorfungus.org ) Fecha de consulta:
13/septiembre/2010. dem 17. 19 MYCOTA Les contaminants fongiques du
patrimoine culturel (http://mycota-crcc.mnhn.fr ) Fecha de
consulta: 13/septiembre/2010.17 18
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sustratos
Aspergillus flavus Textura Superficie Color Anverso Color
Reverso Pigmento difusible al medio. Pulverulenta X Verde olivo
Blanco No
Aspergillus niger Textura Superficie Color Anverso Color Reverso
Pigmento difusible al medio Pulverulenta X Negro Blanco No
Aspergillus terreus Textura Superficie Color Anverso Color
Reverso Pigmento difusible al medio Aterciopelada Plegada Blanco-
caf claro Blanco No
20
20
Ibdem.
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sustratos
Cladosporium sp. Textura Superficie Color Anverso Color Reverso
Pigmento difusible al medio Aterciopelada Plegada Negro Negro
No
21
Curvularia sp. Descripcin de morfologa colonial no realizada
22
21 22
Ibdem. dem 17.
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sustratos
Fusarium sp.
23
Textura Superficie Color Anverso Color Reverso Pigmento
difusible al medio
Vellosa X Blanco Violeta Violeta
24
23 24
Ibdem. Ibdem.
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Aislamiento e identificacin de hongos a partir de diversos
sustratos
Geotrichum sp. Aspecto Superficie Color Anverso Color Reverso
Pigmento difusible al medio Seco Plegada Blanco Blanco No
25
Mucor sp. Textura Superficie Color Anverso Color Reverso
Pigmento difusible al medio Algodonosa Invade todo el medio Blanco
Blanco No
26
25 26
Ibdem. Ibdem.
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sustratos
Paecilomyces sp. Textura Superficie Color Anverso Color Reverso
Pigmento difusible al medio Vellosa X Blanco Blanco No
27
Pestalotia sp. Textura Superficie Color Anverso Color Reverso
Pigmento difusible al medio Vellosa X Blanco Blanco con puntos
negros Durazno
28
27 28
Ibdem. Danish Seed Health Centre. Faculty of Life Sciences.
(http://www.dshc.life.ku.dk ) Fecha de consulta:
13/septiembre/2010.
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Penicillium sp.
29
Textura Superficie Color Anverso Color Reverso Pigmento
difusible al medio
Aterciopelada o pulverulenta Plegada Verde Blanco No
30
31
dem 17. dem 19. 31 dem 17.29 30
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sustratos
Rhizopus nigricans Textura Superficie Color Anverso Color
Reverso Pigmento difusible al medio Algodonosa Invade superficie
del medio Blanco con puntos negros Blanco No
32
Neurospora sp.
Textura Superficie Color Anverso Color Reverso Pigmento
difusible al medio
Granulosa X Anaranjado Blanco No
32
Ibdem.
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Aislamiento e identificacin de hongos a partir de diversos
sustratos
Trichoderma sp.
33
Textura Superficie Color Anverso Color Reverso Pigmento
difusible al medio
Vellosa X Blanco/ Sectorizacin verde Blanco Amarillo
34
33 34
Ibdem. Ibdem.
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sustratos
Ulocladium sp. Textura Superficie Color Anverso Color Reverso
Pigmento difusible al medio Vellosa/Aterciopelada Plana Negro-
Blanco Negro No
Cunninghamella sp. Descripcin de morfologa colonial no
realizada
35
35
Ibdem.
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Aislamiento e identificacin de hongos a partir de diversos
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Syncephalastrum sp. Descripcin de morfologa colonial no
realizada
36
Zigorrhynchus sp. Textura Superficie Color Anverso Color Reverso
Pigmento difusible al medio Algodonosa Invade medio de cultivo
Blanco Blanco No
Pichia sp. Aspecto Superficie Color Anverso Color Reverso
Pigmento difusible al medio Seco Lisa Blanco Blanco No
36
Ibdem.
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sustratos
Candida albicans Elevacin Aspecto Superficie Color Anverso Color
Reverso Pigmento difusible al medio Convexa Hmedo/ Cremoso Lisa
Blanco Blanco No
Saccharomyces cerevisiae Textura Superficie Color Anverso Color
Reverso Pigmento difusible al medio Cremosa Lisa Blanco- Beige
Blanco No
Hansenula sp. Textura Superficie Color Anverso Color Reverso
Pigmento difusible al medio Cremosa Lisa Beige Beige No
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Rhodotorula sp. Textura Superficie Color Anverso Color Reverso
Pigmento difusible al medio Cremosa Lisa Salmn Salmn No
Cryptococcus neoformans Textura Superficie Color Anverso Color
Reverso Pigmento difusible al medio Mucoide Lisa Blanco Blanco
No
y Muestras clnicas.o Muestras de uas, pelo o escamas de
piel.
Una vez llevado a cabo la siembra de las muestras clnicas de
ambos pacientes se obtuvieron los siguientes resultados:
Paciente 1 Tipo de muestra Escamas de piel Siembra Por punto
Temperatura de incubacin 28C Tiempo de incubacin 15- 30 das Medio
de Sabouraud Sin crecimiento Medio Micobiotic Sin crecimiento
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Paciente 2 Tipo de muestra Ua Siembra Por punto Temperatura de
incubacin 28C Tiempo de incubacin 15- 30 das Medio de Sabouraud
Crecimiento bacteriano. Medio Micobiotic Crecimiento bacteriano El
crecimiento bacteriano fue confirmado mediante un frotis teido por
la tcnica de Gram. Exudado farngeo.
o
Una vez realizado el exudado farngeo para ambos pacientes, la
muestra fue inoculada en dos placas con diferentes medios de
cultivo y aislados mediante la tcnica de estra cruzada. Los
resultados fueron los siguientes:
Paciente 1: Samantha Yong M. Exudado farngeo Por estra cruzada
28C 24- 48 h Crecimiento bacteriano. Contaminacin por hongos
filamentosos. Medio de Gelosa Sangre Crecimiento bacteriano El
crecimiento bacteriano fue confirmado mediante un frotis teido por
la tcnica de Gram. Tipo de muestra Siembra Temperatura de incubacin
Tiempo de incubacin Medio de Sabouraud Paciente 2: A. Ernesto
Ubaldo L. Tipo de muestra Exudado farngeo Siembra Por estra cruzada
Temperatura de incubacin 28C Tiempo de incubacin 24- 48 h Medio de
Sabouraud Crecimiento bacteriano Medio de Gelosa Sangre Crecimiento
bacteriano Medio de Biggy Sin crecimiento El crecimiento bacteriano
fue confirmado mediante un frotis teido por la tcnica de Gram.
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Aislamiento e identificacin de hongos a partir de diversos
sustratos
y Morfologa colonial y microscpica de cepas identificadaso Hongo
1Morfologa colonial Sustrato Tortilla Medio de cultivo Papa
Dextrosa Agar (PDA) Temperatura de incubacin 28C Textura Granulosa
Superficie X (cultivo en tubo) Color Anverso Anaranjado/Durazno
Color Reverso Blanco Pigmento difusible al medio No De acuerdo con
la morfologa colonial podemos deducir que se trata de un hongo
filamentoso, con micelio macrosifonado, septado hialino. Los cul
deber ser confirmado con la morfologa microscpica.
Morfologa microscpica Tcnica de microcultivo Actual Colorante
empleado Azul de algodn lactofenol Temperatura de incubacin 28C
Micelio Macrosifonado, septado, hialino Conidios Artroconidios
irregulares Posibles gneros identificados Neurospora sp. Y
Geotrichum sp. La presencia de artroconidios nos lleva a pensar en
ambos gneros, sin embargo la forma irregular que poseen nos obligan
a inclinarnos por Neurospora sp. lo cual deber confirmarse con la
morfologa colonial. Una vez comparadas, tanto la morfologa colonial
como la microscpica, con las descripciones de las cepas tipo
podemos confirmar que el hongo 1 se trata de Neurospora sp. Sin
embargo estas observaciones nos impiden determinar la especie de la
cual se trata.
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Aislamiento e identificacin de hongos a partir de diversos
sustratos
o Hongo 2Morfologa colonial Sustrato Hoja Medio de cultivo Papa
Dextrosa Agar (PDA) Temperatura de incubacin 28C Textura
Aterciopelado /Pulverulento Superficie Plana Color Anverso Verde
Color Reverso Blanco Pigmento difusible al medio No La morfologa
colonial nos indica la presencia de un hongo filamentoso, segn a
sus caractersticas podemos pensar en la posible presencia de un
micelio macrosifonado, septado, hialino; lo cual deber ser
corroborado con microscopa.
Tcnica de microcultivo Colorante empleado Temperatura de
incubacin Micelio Conidios Posibles gneros identificados
Morfologa microscpica Tradicional Azul de algodn lactofenol 28C
Macrosifonado, septado, hialino Fialoconidios Penicillium sp.
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Aislamiento e identificacin de hongos a partir de diversos
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Penicillium sp. Hongo ambiental con micelio areo tipo
fialoconidios, emite pigmentos de color blanco algodonosos o azul
verdoso. Hifas septadas que se ramifican y dan lugar a los
conidiforos que originan las filides que portan microconidios lisos
o rugosos37.
38
37 38
dem 19. Ibdem.
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Aislamiento e identificacin de hongos a partir de diversos
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o Hongo 3Morfologa colonial Sustrato Madera Medio de cultivo
Papa Dextrosa Agar (PDA) Temperatura de incubacin 28C Textura
Vellosa Superficie Plana Color Anverso Blanco con sectorizacin de
color verde Color Reverso Blanco Pigmento difusible al medio
Amarillo La morfologa colonial de ste hongo nos indica que se trata
de un hongo filamentoso, macrosifonado, septado, hialino; los cual
ser corroborado mediante la observacin microscpica.
Tcnica de microcultivo Colorante empleado Temperatura de
incubacin Micelio Conidios Posibles gneros identificados
Morfologa microscpica Tradicional y Actual Azul de algodn
lactofenol 28C Macrosifonado, septado, hialino Microconidios
Tichoderma sp.
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Aislamiento e identificacin de hongos a partir de diversos
sustratos
La forma caracterstica de los conidios de Trichoderma sp., en
conjunto con su peculiar morfologa colonial debido a la
sectorizacin que sufre en medida que la colonia envejece; nos
llevaron a identificar ste hongo bajo el gnero antes mencionado.
Sin embargo, la determinacin de la especie no fue posible bajo las
tcnicas aplicadas. Para tales fines ser necesario recurrir a
pruebas bioqumicas y de biologa molecular.
Trichoderma sp. Es un hongo filamentoso imperfecto que pertenece
a la clase de los Deuteromicetes. La forma sexual se encuentra
dentro Phylum Ascomycota. ste gnero posee alrededor de 2 especies
distintas39. Sus colonias son vellosas o lanosas, de crecimiento
rpido, suelen ser de color blanco, verde amarillento o verdes. Los
conidiforos son hialinos y septados. Las filides pueden ser ovoides
o elipsoidales, aisladas o agrupadas en pequeos grupos de 2 o 3.
Los conidios son unicelulares, redondos, lisos o rugosos, se
producen en masas mucilaginosas formando aglomerados en la punta de
las filides40. Trichoderma es un hongo cosmopolita y ubicuo, es
considerado un hongo saprobio en el medio exterior y es un
contaminante muy comn aunque es poco patgeno. Se encuentra
implicado en alergias de tipo I y III, y algunos casos raros de
micosis en individuos inmunodeprimidos. Diversas especies producen
metabolitos antifngicos y numerosas micotoxinas41. El gnero
Trichoderma posee un inters agro- alimentario en la produccin de
celulosa y hemicelulosa y como un potenciador de sabores. Algunas
especies son utilizadas en la lucha biolgica por la proteccin de
arboles y cultivos vegetales contra el ataque de agentes
fitopatgenos42.
Filide
Microconidios
Micelio hialino septado
Ibdem. Ibdem. 41 Ibdem. 42 Ibdem.39 40
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sustratos
o Hongo 4Morfologa colonial en placa Medio ambiente Papa
Dextrosa Agar (PDA) 28C 48 h Aterciopelada Acuminada Verde
amarillento Rojo Rojo
Sustrato Medio de cultivo Temperatura de incubacin Tiempo de
incubacin Textura Superficie Color Anverso Color Reverso Pigmento
difusible al medio
Sustrato Medio de cultivo Temperatura de incubacin Tiempo de
incubacin Textura Superficie Color Anverso Color Reverso Pigmento
difusible al medio
Morfologa colonial en tubo Madera Papa Dextrosa Agar (PDA) 28C
Ms de 72 horas Pulverulenta Plana Caf ocre Caf Rojo pardo
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Aislamiento e identificacin de hongos a partir de diversos
sustratos
Tcnica de microcultivo Colorante empleado Temperatura de
incubacin Micelio Conidios Posibles gneros identificados
Morfologa microscpica Actual Azul de algodn lactofenol 28C
Macrosifonado, septado, hialino Fialoconidios Aspergillus sp.
La morfologa tan peculiar encontrada en numerosos conidiforos
nos ha llevado a la bsqueda de la probable especie, para ello se
realizo una comparacin, tanto de morfologa colonial como
microscpica, para varias especies de Aspergillus. Encontrando las
siguientes dos opciones:
Aspergillus versicolorMorfologa microscpica: Micelio
macrosifonado, hialino, tabicado (2-4micras). Cabezas aspergilares
que miden de 40-50 micras de dimetro, con conidiforos largos
cenocticos, con vesculas subesfericas de 10-20 micrmetros, con dos
series ( pequeas y grandes ) en un ngulo aproximado de 180 de
conidios redondos equinulados de 2030 micrmetros. Clulas de Hlle
pueden estar presentes43. Morfologa colonial: Colonia de lento
crecimiento en comparacin con otras especies del mismos gnero, de
textura pulverulenta a granulosa, de color verde amarillento al
inicio, tornndose caf oscuro u ocre con el paso del tiempo; al
reverso se observa una pigmentacin rojiza tornndose rojo fardo a
caf debida a al pigmento secretado que es difusible al medio44.
45
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Bonifaz A. Micologa Mdica Bsica. Ibdem. 45 dem 19.43 44
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sustratos
Aspergillus glaucus chevalieri
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Ibdem. Biotechnologie, vues pdagogiques. ltima actualizacin:
05/07/2006.
(http://py.guillaume1.free.fr/site%20microbiologie/page_microscopie/microscopie.htm
)46 47
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Aislamiento e identificacin de hongos a partir de diversos
sustratos
DISCUSIN DE RESULTADOSy Morfologa colonial y microscpica de
cepas tipoPara la determinacin de la morfologa colonial de una cepa
determinada, es importante considerar diferentes variables, ya que
la alteracin de una de ellas puede afectar de manera significativa
la morfologa colonial observada. Entre las variables a considerar
se encuentra el medio de cultivo, para lo cual es recomendable
llevar a cabo la descripcin colonial en placas de Papa Dextrosa
Agar (PDA) o Sabouraud. Usar otros medios de cultivo como Czapek,
Malta Agar (MA) o Czapek Yeast Agar (CYA) pueden interferir con el
crecimiento fngico, alterando significativamente la morfologa
colonial. Adems el empleo de medios en tubo inclinado, en la mayora
de las ocasiones, dificulta la observacin en cuanto a la superficie
colonial. Para ello, siempre es recomendable llevar a cabo la
descripcin morfolgica en placa. Otro factor muy importante a
considerar es la temperatura de incubacin, ya que el crecimiento
colonial puede verse alterado, en especial en hongos dimrficos.
Finalmente, la edad del cultivo es otro factor importante, se
recomienda llevar la descripcin despus de 72 horas de incubacin con
la finalidad de poder observar el desarrollo de conidios y la
produccin de posibles pigmentaciones. Para poner de manifiesto las
variaciones que pueden ocasionar la alteracin de alguno de los
factores antes mencionados, podemos observar el caso de Aspergillus
niger para el cual tenemos que48: Medio de cultivo MA Temperatura
de incubacin 26C Morfologa colonial (Anverso) Morfologa colonial
(Reverso)
48
dem 19.
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sustratos
MA
37C
Czapek
26C
Czapek
37C
CYA
26C
CYA
37C
Resulta evidente la diferencia que existe entre cada uno de los
medios de cultivo y la temperatura de incubacin; es justamente all,
donde radica la importancia que tiene el control de estos factores.
De igual forma los aspectos a describir en la morfologa colonial
son totalmente subjetivos, es decir, dependen totalmente del
individuo que los observe; mientras que un sujeto describe, por
ejemplo, una colonia como aterciopelada otra persona puede
considerar que se trata de una Septiembre 2010 Pgina 32
Aislamiento e identificacin de hongos a partir de diversos
sustratos
colonia pulverulenta. Pero cul de las dos descripciones es la
correcta?, eso depende de la apreciacin de cada persona y nicamente
la experiencia puede dotarnos de la habilidad para realizar
descripciones ms exactas.
y Muestras clnicasLas muestras clnicas merecen un tratamiento
especial por diversas situaciones, la primera de ellas refiere a
las medidas de bioseguridad que debemos tener al manejarlas, ya que
son una posible fuente de infeccin. Por otro lado, al trabajar una
muestra clnica, tenemos en nuestras manos la salud de otra persona;
por ello es muy importante que cada procedimiento sea realizado con
el mayor cuidado posible para poder ofrecer un diagnstico correcto.
Por otro lado la toma de muestras es un paso determinante en el
proceso de diagnstico, ya que una mala toma de la misma puede
alterar completamente los resultados. Tal es el caso del exudado
farngeo realizado al paciente 1, el cual fue contaminado por hongos
filamentosos. Las causas posibles de dicha contaminacin son: y y y
y Exposicin de la placa fuera del rea de seguridad ofrecida por el
mechero. Empleo excesivo de tiempo en la realizacin del exudado
farngeo. No proporcionar al paciente la comodidad y confianza
requerida para dicho procedimiento. Desconocimiento total sobre las
indicaciones del procedimiento a realizar por parte del
paciente.
Es importante remarcar que en este tipo de tcnicas es muy
importante la destreza y habilidad, que slo proporcionan la
experiencia, para una apropiada manipulacin. Por ello, es necesario
tomar en cuenta la carencia de experiencia como un factor
determinante en los resultados obtenidos.
y Morfologa colonial y microscpica de cepas identificadasPara el
correcto aislamiento de una colonia, el primer paso determinante es
seleccionar el sustrato, es importante elegir aquel que no se
encuentre sumamente contaminado ya que la presencia de bacterias
puede interferir con nuestro trabajo. Tal cual ocurri con uno de
los sustratos empleados (durazno), que al encontrarse en tan mal
estado result imposible aislar las levaduras observadas gracias a
una preparacin en fresco por la constante contaminacin por bacilos
Gram negativos. Por otro lado, el sembrar diferentes sustratos en
una misma placa ocasion una gran interferencia en el aislamiento,
ya que la invasin total de hongos algodonosos contamin colonias que
pudieron ser candidatas para la resiembra en tubo y fue necesario
su desecho.
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sustratos
El aislamiento de un hongo no siempre es cosa fcil, una vez
realizada la resiembra en tubo podemos enfrentarnos a diversas
situaciones, por ejemplo, a una contaminacin o un tubo sin
crecimiento lo que invariablemente refleja la falta de cuidado en
la tcnica de resiembra. Sin embargo, existen ocasiones en las que
nuestro tubo de resiembra muestra seales de posible contaminacin
pero no podemos afirmarlo a ciencia cierta, entonces qu debemos
hacer?, un tubo del cual no estamos seguros de su pureza es
recomendable realizar algunas pruebas a la colonia. Un ejemplo de
lo anterior fue lo acontecido con el hongo 3 (que ha sido
identificado como Trichoderma sp. ) que al observarse crecimiento
de color verde en ciertas regiones de la colonia de color blanco se
pens , en primera instancia, que se trataba de una contaminacin.
Sin embargo, al llevar a cabo una resiembra en placa a partir de la
colonia del tubo, pudimos constatar que esa sectorizacin era propia
del hongo aislado y que en ningn momento se trat de una
contaminacin. As, est caracterstica de sectorizacin result ser un
factor determinante para la identificacin. Una vez conseguido el
aislamiento, el primer paso para la identificacin es realizar un
microcultivo, para lo cual es importante tomar en cuenta algunos
factores importantes como: y y y El tiempo de incubacin. Si se
trata de un hongo patgeno o no, para poder decidir si empleamos la
tcnica tradicional o la actual. Manejo cuidadoso al realizar las
preparaciones con la finalidad de conservar en el mejor estado
posible las estructuras de reproduccin asexual, ya que algunos
hongos poseen estructuras muy frgiles como Trichoderma sp. y el mal
manejo puede dificultarnos la posterior observacin microscpica.
Finalmente es necesario mencionar que para una buena
identificacin, es importante considerar en todo momento la
descripcin de la morfologa colonial como de la microscpica. Ya que,
a veces, podemos confundir alguna caracterstica con otro hongo; sin
embargo, al apoyarnos siempre de ambas descripciones podemos estar
seguros de nuestros resultados.
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Aislamiento e identificacin de hongos a partir de diversos
sustratos
CONCLUSIONESLos hongos se encuentran presentes en cada rincn del
planeta, los encontramos en toda la materia en descomposicin, en
plantas, en animales y an parasitando otros hongos. Desde la
antigedad han desempeado un papel fundamental sobre el planeta
Tierra y hoy da continan permitiendo, en gran medida, la vida
misma. Para poder llevar a cabo un estudio pleno sobre un hongo en
particular, es necesario, en primera instancia, aislar dicho
organismo. Mientras que la descripcin de la morfologa colonial como
microscpica, nos permiten llevar a cabo una primera identificacin
del organismo para su posterior estudio y aplicacin en otras reas
del conocimiento. Es por ello que el aislamiento e identificacin de
hongos resulta de vital importancia, no slo en el rea mdica, tambin
nos puede brindar enormes beneficios en otras reas como la
veterinaria, la agricultura, la fitopatologa, la biotecnologa,
entre otras. La obtencin de buenos resultados depende, en gran
medida, de la eleccin adecuada de las tcnicas y condiciones a
emplear segn sea requerido. Es decir, es importante considerar la
naturaleza de la muestra a analizar y de los recursos con los que
se dispone. A pesar de los buenos resultados que ofrecen las
tcnicas empleadas, es una realidad que cada una de ellas requiere
del desarrollo de habilidades y destrezas por parte de la persona
que las lleva a cabo. Adems, para el estudio ntegro de un
organismo, es importante considerar otro tipo de tcnicas para su
plena identificacin, como pruebas bioqumicas o de biologa
molecular.
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sustratos
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