PRAĆENJE ZDRAVLJA I BOLESTI LABORATORIJSKIH …½.-Grabarević_Praćenje... · •Prijenos infektivnog agensa: izlaganje „sentinela” stelji, vodi i hrani uzetoj iz kaveza pokusnih

PRAĆENJE ZDRAVLJA I BOLESTI LABORATORIJSKIH ŽIVOTINJA

Prof. dr. sc. Željko Grabarević Zavod za veterinarsku patologiju

Veterinarski fakultet Sveučilišta u Zagrebu

• Mikrobiologija i bolesti

Praćenje zdravlja i prevencija bolesti

Bolesti laboratorijskih životinja

Interakcija bolesti i pokusa

FELASA – teaching sylabus for category C

NAŠ TEČAJ: praćenje zdravlja i bolesti laboratorijskih životinja (2 h)

• Trenutni status (stanje) jedinke koje se odnosi na kliničke, patološke i fiziološke pojave pokazuje da li je jedinka zdrava ili ne

ZDRAVSTVENO STANJE

Mikrobiološki čimbenici (infekcije) Okoliš Genetski čimbenici

• CILJ:

Stvoriti životinje koje zadovoljavaju zahtjeve mikrobiološke kvalitete

Održavanje mikrobiološke kvalitete kroz čitavo vrijeme uzgoja/ trajanja pokusa (sastavni dio svakog sustava kvalitete (GLP, AAALAC, ISO)

Mikrobiološka standardizacija

Infekcije: Klinički manifestne Latentne

Utjecaj na: fiziologiju lab. životinja i rezultate istraživanja

(ponašanje, prirast, imunološki odgovor….. Kontaminacija biološkog materijala Zdravlje ljudi (zoonoze)

• Životinje

• Biološki materijal

• Osoblje

• Oprema

Mogući načini ulaska infekcije:

FELASA: Recomendation for the health monitoring of rodent and rabbit colonies in breading and experimental units (Laboratory animals (2002) 36, 20-42)

• Definirati „mikrobiološki entitet”

• Koliko životinja pregledati?

• Koliko često?

• Što tražiti?

• Koje metode koristiti?

• „mikrobiološki entitet” – osobna procjena (kavez/ prostorija)

• Više vrsta životinja u jednom entitetu

Frekvencija monitoringa i veličina uzorka - frekvencija

• Monitoring kolonija – najmanje kvartalno • Bolesne (simptomi koji se ne očekuju u

istraživanju) i mrtve životinje razudba

• Češći monitoring:

Više različitih pokusa

Česti unos novih životinja, naročito iz različitog podrijetla uzgoja

Česti ulazak osoblja i često mijenjanje osoba koje rade sa životinjama

Pojava infekcije

Frekvencija monitoringa i veličina uzorka - frekvencija

Pretpostavke:

• Infekcija oba spola

• Populacija > 100 životinja

• Nasumično uzorkovanje

• Nasumična distribucija infekcije

Frekvencija monitoringa i veličina uzorka - veličina uzorka

Veličina uzorka za različite stupnjeve pouzdanosti

Pretpostavljena učestalost inf. %

95% 99% 99,9%

10 29 44 66

20 14 21 31

30 10 13 20

40 6 10 14

50 5 7 10

log (stupnja pouzdanosti) _____________________

log N (% neinficiranih)

= veličina uzorka

10

• Životinje „stražari”, indikatori

• Kolonije GM i imunodeficijentnih životinja

• Slobodni od mikroorganizama za čiji monitoring služe (pr. Pneumocystis spp.)

• Prijenos infektivnog agensa: izlaganje „sentinela” stelji, vodi i hrani uzetoj iz kaveza pokusnih životinje ili stavljanje u kavez s pokusnim životinjama

Frekvencija monitoringa i veličina uzorka - „sentinel animals”

Preporučeni minimum frekvencije monitoringa, veličina uzorka za kolonije glodavaca i kunića, metode

Frekvencija Dob Broj životinja

Virusologija Bakteriologija Parazitologija Patologija

Svaka 3 mjeseca

> 8 tjedana

10 + + + +

KARANTENA - najmanje 4 tjedna

Metode testiranja i uzorci

Virusološka pretraga

• Serologija (ELISA, IFA)

• Western blot, PCR

Bakteriološka pretraga

• Dišni sustav: nazofarinks, dušnik

• Probavni sustav: ileocekalna tonzila, feces

• Spolni sustav: prepucij, vagina

Metode testiranja

Parazitološka pretraga

• Crijeva, feces

• Serologija (Encephalitozzon cuniculi)

• IFA (Giardia sp.)

Patološka pretraga

• Razudba

• Histopatologija

• Dodatne metode (IHC …)

Metode testiranja

Prikaz rezultata monitoringa

• Charles River Laboratories (www.criver.com)

• B&K Universal (www.bku.com)

• Ellegard Göttingen Minipigs (www.minipigs.dk)

• Jackson Laboratories (www.jax.org)

• RCC (www.rcc.ch)

Prikaz rezultata monitoringa

Čimbenici koji utječu na procjenu promjenjene morfologije

• Uzorkovanje i procesiranje tkiva – SOP – Kvaliteta razudbe – Provjera težine organa – Autoliza – Vrste fiksativa – Histološka priprema

• Životinja – Vrsta, soj, spol, dob – Spontane bolesti – Fiziološke promjene – Normalne histološke varijacije

Čimbenici koji utječu na procjenu promjenjene morfologije

• Čimbenici okoliša

– Prehrana

– Temperatura

– Osvjetljenje

– Zvuk

Myocoptes musculinus

Uzročnici (preporučeni monitoring) bolesti

BAKTERIJE Pasteurellaceae Pasteurella pneumotropica o Respiratorni patogen, supkutani apscesi, mastitis o Često latentna infekcija u glodavaca stres ili

imunosupresija bolest

Pasteurella multocida o Fakultativni patogen kod kunića (proljeće, jesen) o Respiratorna infekcija, pneumonija, septikemija,

konjunktivitis

P. pneumotropica – apscesi na plućima

P. multocida - konjunktivitis

P. multocida - pneumonija

Clostridium piliforme

• Tyzzerova bolest • Miševi, hrčci,

kunići

Cilia-Associated Respiratory (CAR) Bacillus o miš, štakor (kunić)

o asimptomatske infekcije o ponekad – kontagiozna, sporo progresivna i

nekontrolirana kronična respiratorna bolest (CRD) štakora i kunića(gubitak težine, smetnje disanja, peribronhijalna limfoidna hiperplazija)

o utjecaj na rezultate istraživanja

Salmonella spp.

o Naročiti problem u institucijama s više vrsta istraživanja i više vrsta životinja

o Osoblje o S. typhimurium (miš, štakor) o S. enteritidis (zamorčić)

Streptobacillus moniliformis

o Miš, štakor (prirodni domaćin), zamorčić o Zoonoza – bolest štakorskog ugriza o Miš (C57BL/6!) – oticanje cervikalnih limfnih

čvorova, septikemija, kronični artritis o Zamorčić – lokalni apscesi o Danas - rijetka

Streptococcus spp.

o hemolitični (S. pneumoniae), hemolitični

o Važni kod imunodeficijentnih životinja o Respiratorne infekcije, septikemija, kutani

apscesi, mastitis

Staphylococcus spp.

o Najčešće S. aureus o Ubikvitarne bakterije, životinja čovjek (osoblje – rezervoar!) o Apscesi na mjestu ugriznih i kirurških rana, pneumonija

Citrobacter rodentium

o Inficira miševe (C3H/HeJ, C57/BL/6,DBA/2J i NIH Swiss) o Transmisivna hiperplazija kolona miševa, hiperplastični

kolitis, kataralni enterokolitis, kolitis s prolapsom rektuma o Bolest utječe na imunološka, nutritivna i onkološka

istraživanja

Helicobacter spp.

o Miš, štakor o H. hepaticus, H. bilis o Kronični hepatitis u odraslih imunokompetentnih

miševa o Tiflokolitis i prolaps rektuma u imunodeficijentnih

miševa o Stalno otkrivanje novih vrsta

Corynebacterium bovis

o Korinebakterijska hiperkeratoza atimičnih golih miševa (scaly skin)

o Hiperkeratoza, pojačana konzumacija vode, gubitak težine o Imunokompetentni miševi – mogući rezervoar (neobavezan monitoring )

Respiratorna mikoplazmoza

Mycoplasma pulmonis o Miš, štakor o Gnojna upala gornjih dišnih prohoda i pluća, hiperplazija BALT-a o Sklonost sekundarnim bakterijskim infekcijama o Dispneja, šmrcanje, „trljanje” očiju, iscjedak iz očiju i nosa

Druge bakterije:

Bordetella bronchiseptica Corynebacterium kutscheri Lawsonia intracellularis Leptospira spp. Pseudomonas aeruginosa

Dermatofiti: Microsporum spp. Trychophyton spp.

VIRUSI

Coronavirusi • Mouse hepatitis virus (MHV) o Više sojeva – različiti tropizam: enterotropni, politropni (mozak,

pluća, jajnici, epididimis) o Smanjuje broj NK stanica, inficira monocite i makrofage…

• Sialodacryoadenitis virus (SDAV/RCV rat corona virus)

o Vrlo kontagiozan, kratka inkubacija o Sialoadenitis, povećani limfni čvorovi na vratu, oftalmološke i

respiratorne lezije o Smanjeno uzimanje hrane, gubitak težine, ↓ rasplodnu

sposobnost

Parvovirusi

o Dosta rašireni o Niski morbiditet o Perzistentna infekcija Miš: o Mice minute virus (MMV) – smetnje u plodnosti, poremetnje

rasta i razvoja o MPV-1a (adaptiran stničnim kulturama) – supresija T-

staničnog odgovora in vitro … Štakor: o Rat virus (RV), rat parvovirus (RPV) Kunić o Rabbit parvovirus Hrčak: o Hamster parvovirus (HPV) (sirijski naročito osjetljivi!)

Respiratorni virus štakora (RRV)

o Štakori - svi sojevi osjetljivi o Najčešće do 8-12 tjedana o Intersticijska pneumonija o Mijenja histološku sliku kod inhalacijskih studija, ↑ smrtnost u

anesteziji

Norovirus

o Familija Caliciviridae o Humani (epidemijski gastroenteritisi ), goveđi, mišji, svinjski o Murine norovirus 1 (MNV-1) (opisan 2003) • Dosta raširen i dugo vremena ostaje u okolišu • Diseminirana infekcija i encefalitis u imunodeficijentnih

miševa • Vjerojatno može imati utjecaj na istraživanje dendritičkih

stanica i urođene imunosti • (WARD et al., Toxicologic Pathology, 34:708–715, 2006)

Sendai virusne infekcije

o Sendai virus (parainfluenca virus 1) o Miš, štakor, hrčak, zamorčić o Proliferacija i regeneracija bronhijalnog i bronhiolarnog epitela,

upalni infiltrati u plućima

Theiler‘s murine encephalomyelitis virus (TMEV)(mouse polio)

o Miš, štakor, zamorčić o Rijetko se pojavljuje (imunokompromitirani) o Akutni encefalitis, poliomijelitis, demijelinizacija → paralize,

konvulzije

Lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV)

o Porodica Arenavirusa o Prenose miševi i hrčci o Primljivi zamorčići, štakori, kunići, čovjek (zoonoza!-simptomi

od strane CNS-a, mijalgija, groznica) o Choriomeningitis, bolest imunih kompleksa

Drugi virusi:

Lactate dehidrogenase elevating virus (LDEV) o Važan kontaminant biološkog materijala (pasaže!) Reovirus tip 3 o Miš, štakor o Pancitotropan – nekroze po jetri, srcu, povećanje slezene … Hemoragijska bolest kunića o Calicivirus

PARAZITI

Nematode o Koloniziraju različite

dijelove probavnog sustava o Oxyuriasis • Syphacia spp., Aspiculuris

tetraptera • Kolitis, promjene u

ponašanju i imunološkom odgovoru

o Lab. životinje – trebale bi biti slobodne od parazita (invazije najčešće supkliničke, ali mogu utjecati na istraživanje

o Znak loših higijenskih uvjeta

Ektoparaziti

o Grinje, buhe, uši o Svrbež, dermatitis o Myobia musculi, Radfordis sp.

Pneumocistoze

Pneumocystis murina (miš), Pneumocystis carinii (štakor) o Vrlo rasprostranjen u okolišu o Problem kod imunodeficijentnih sojeva o Dispneja, cijanoza, „smanjivanje”

Encephalitozoon cuniculi

o Najčešće kunići i zamorčići o Izlučuje se putem urina o Granulomatozni nefritis i encefalitis (često subklinički)

Druge bolesti (neinfekciozne)

o Često kod starijih jedinki o Amiloidoza o Kalcifikacije mekih tkiva o Glomerulopatije o Spontani tumori

Endokrine neoplazije o najčešći spontani tumori u štakora (Sprague-Dawley, Wistar Han

i F344) o Hipofiza, štitna i nadbubrežna žlijezda

Tumori mliječne žlijezde

o Učestalost kod ženki CD štakora - 30 do 50% o Najčešće fibroadenomi i karcinomi

Hemolimfatične neoplazije (štakor)

Leukemija – LGL leukemija, Fischer, Wistar, nije virusne etiologije Limfomi Kožni limfom (mycosis fungoides) Histiocitni sarkom, Sprague-Dawley, Wistar

Distrofična mineralizacija (kardijačna kalcinoza)

o Miš (DBA/2, BALB/c i sl.)

o Može dovesti do kongestivnog zatajenja srca i uginuća

Traumatska oštećenja kože

Barbering (trihotilomanija) Rane od traumatskih ozljeda (tučnjave, ugriza) o Dosta česta pojava o Može zahvatiti značajan broj životinja o Komplikacija sa sekundarnim bakterijskim infekcijama (može

sličiti zaraznim bolestima kože)

Barbering

Ugrizne rane

Limforetikularne i hemotopetske neoplazije miševa

o Često uzrokovane retrovirusima! o Česte kod atimičnih miševa, SCID, BALB/c o Limfomi, mijelogena leukemija, histiocitni sarkom

• Infekcija → uginuće

• Subklinička infekcija → utjecaj na tjelesnu težinu, ponašanje; patološke promjene – poteškoće u interpretaciji prilikom toksikoloških studija

• Respiratorne bolesti → uginuće prilikom anestezije

• Infekcija → imunomodulacija (supresija ili ponekad aktivacija imunološkog odgovora)

• Utjecaj na reprodukciju (smanjena plodnost, pobačaji, mrtvorođene životinje)

• Kontaminacija biološkog materijala

• Modulacija onkogeneze (mogući utjecaj mikroorganizma na onkološke studije)

Bolest – istraživanje - rezultati

Izvori slika korištenih u prezentaciji:

Zavod za veterinarsku patologiju, Veterinarski fakultet Sveučilišta u Zagrebu

Charles River Laboratories

HVALA NA PAŽNJI !

• Životinje bi trebale biti dostavljene sa svjedodžbom o trenutnom zdravstvenom stanju

• Karantena

• (trenutno ne postoji općeprihvaćeni program kontrole zdravlja nehumanih primata – osim preporuka – FELASA Laboratory Animals (1999), suppl. 1, 3-51)

Kontrola zdravlja u kolonijama nehumanih primata

• Serološka pretraga

• Pretraga fecesa

• Brisevi

• Obdukcija uginulih životinja (u koloniji/ pokusu)

• Redovita kontrola zdravlja osoba koje rade sa nehumanim primatima

• FELASA recommendations for the health

monitoring of breeding colonies and

experimental units of cats, dogs and pigs

(Laboratory Animals (1998), 32, 1-17).

• FELASArecommendations for the health

monitoring of experimental units of calves,

sheep and goats

(Laboratory Animals (2000), 34, 329-350).

• Doktor veterinarske medicine

• Kontrola zdravlja – ovisno o lokalnim uvjetima (prisutnost određenih mikroorganizama)

• Karantena za nove životinje u uzgoju/ pokusu

• Laboratorijske pretrage

• Obdukcija mrtvih i pobačenih životinja

Kontrola zdravlja laboratorijskih mačaka, pasa i svinja: veličina uzorka i frekvencija

Frekvencija

Veličina uzorka Pretrage

Dob Broj životinja Virusi Bakterije Paraziti

Svaka 3 mjeseca

Odbijene 2 - + +

2-7 mjeseci 4 + + +

8 mjeseci 4 + + +

Zebrice

• Zebrafish International Resource Center

• (http://zebrafish.org/zirc/home/guide.php)

• Monitoring morbiditeta i mortaliteta ribe (dnevni)

• Promjene u ponašanju i izgledu ribe → izdvajanje od ostalih → eutanazija

• Mrtve ribe → izdvajanje os ostalih PREGLED

Fixing Zebrafisch for Histopathology (ZIRC protokol)

Post-mortem autolysis and putrefaction (post-mortem decomposition caused by non‐pathogenic bacteria) occurs rapidly once a fish dies. This makes fish that are found dead poor specimens for histopathology. For optimum preservation and diagnostic value, fish must be alive and euthanized just prior to fixation. Fish designated for histopathology should be euthanized according the Euthanizing fish for PCR or Fixation SOP.

Eutanazija – hipotermalni šok

Sentinel Fish Program (ZIRC protokol)