i POTENSI DAN IMOBILISASI ENZIM LIPASE DARI DEDAK PADI ( Oryza Sativa L.) SERTA APLIKASINYA DALAM MENGKATALISIS REAKSI TRANS-ESTERIFIKASI DAN AMIDASI MENGGUNAKAN SUBSTRAT MINYAK KELAPA MURNI THE POTENTIAL AND IMOBILIZATION OF ENZYME LIPASE OF RICE BRAN (Oryza Sativa L.) AND ITS APPLICATION IN CATALYZING REACTION TRANS-ESTERIFICATION AND AMIDATION USING VIRGIN COCONUT OIL HENDRA JULTRISNO RUSMAN P1100213009 PROGRAM PASCASARJANA UNIVERSITAS HASANUDDIN MAKASSAR 2017
213
Embed
POTENSI DAN IMOBILISASI ENZIM LIPASE DARI DEDAK PADI ...
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
i
POTENSI DAN IMOBILISASI ENZIM LIPASE DARI DEDAK PADI (Oryza
Sativa L.) SERTA APLIKASINYA DALAM MENGKATALISIS REAKSI
TRANS-ESTERIFIKASI DAN AMIDASI MENGGUNAKAN SUBSTRAT
MINYAK KELAPA MURNI
THE POTENTIAL AND IMOBILIZATION OF ENZYME LIPASE OF RICE BRAN (Oryza Sativa L.) AND ITS APPLICATION IN CATALYZING
REACTION TRANS-ESTERIFICATION AND AMIDATION USING VIRGIN COCONUT OIL
HENDRA JULTRISNO RUSMAN
P1100213009
PROGRAM PASCASARJANA
UNIVERSITAS HASANUDDIN
MAKASSAR
2017
ii
POTENSI DAN IMOBILISASI ENZIM LIPASE DARI DEDAK PADI (Oryza
Sativa L.) SERTA APLIKASINYA DALAM MENGKATALISIS REAKSI
TRANS-ESTERIFIKASI DAN AMIDASI MENGGUNAKAN SUBSTRAT
MINYAK KELAPA MURNI
Tesis
Sebagai Salah Satu Syarat Untuk Memperoleh Gelar Magister
Program Studi
Ilmu Kimia
Disusun dan diajukan oleh
HENDRA JULTRISNO RUSMAN
Kepada
PROGRAM PASCASARJANA
UNIVERSITAS HASANUDDIN
MAKASSAR
2017
iii
iv
v
PRAKATA
Puji syukur penulis panjatkan ke hadirat Tuhan Yang Maha Esa atas
hikmat, kebijaksanaan, dan kesempatan kepada penulis dalam menjalankan
program studi Magister Ilmu Kimia mulai dari awal perkuliahan hingga akhir
penulisan tesis ini.
Tesis ini merupakan laporan hasil penelitian dengan judul Potensi dan
Imobilisasi Enzim Lipase Dari Dedak Padi (Oryza Sativa L.) Serta
Aplikasinya Dalam Mengkatalisis Reaksi Trans-esterifikasi dan Amidasi
Menggunakan Substrat Minyak Kelapa Murni; dan disusun sebagai salah
satu syarat untuk memperoleh gelar akademik Magister Sains pada program
studi Ilmu Kimia, Program Pascasarjana Universitas Hasanuddin Makassar.
Dalam proses penyusunan tesis ini, penulis menghadapi berbagai
kendala; namun berkat bantuan, bimbingan, dan kerjasama dari semua
pihak, tesis ini dapat diselesaikan. Oleh karena itu, penulis mengucapkan
terima kasih yang setulus-tulusnya dan memberikan penghargaan yang
setinggi-tingginya kepada ibu Dr. Hj. Seniwati Dali, M.Si, bapak Dr. Firdaus,
MS, dan bapak Prof. Dr. H. Abd. Rauf Patong (Almarhum) selaku komisi
penasehat atas kesabaran dan kesediaanya untuk memberikan waktu,
tenaga, dan fikiran di dalam membimbing dan mengarahkan penulis mulai
dari perencanaan penelitian, pelaksanaan penelitian dan penyelesaian tesis.
vi
Penulis tidak lupa mengucapkan terima kasih yang sedalam-dalamnya dan
memberi penghormatan yang setinggi-tingginya kepada kedua orang tua
yang penulis cintai dan banggakan Ayah Rusman Balante, S.Pd. SD
(Almarhum), Ibu Yefrina Babutung yang telah melahirkan, membesarkan,
mendidik dan mendoakan penulis. Penulis berterima kasih kepada kakak
Odin Balani, S.Pd, adik Hendrianto Rusman, dan yang tercinta Yunila
Putri Carolina Sidani, serta seluruh keluarga yang selalu memberikan
motivasi, pengertian, serta kasih sayang baik dalam suka maupun duka.
Ucapan terima kasih dan penghargaan yang sama diberikan kepada:
1. Ibu Prof. Dr. Dwia Aries Tina Pulubuhu, M.A; Rektor Universitas
Hasanuddin Makassar.
2. Bapak Prof. Dr. Syamsyul Bachri, SH, MS; Direktur Program
Pascasarjana Universitas Hasanuddin Makassar.
3. Bapak Dr. Eng. Amiruddin, S.Si, M.Si; Dekan Fakultas Matematika dan
Ilmu Pengetahuan Alam (FMIPA) Universitas Hasanuddin Makassar.
4. Ibu Dr. Hj. Indah Raya, M.Si dan Bapak Dr. Muhammad Zakir, M.Si;
Ketua dan Sekretaris Jurusan Kimia Untiversitas Hasanuddin; serta
seluruh dosen dan staff administrasi Jurusan Kimia Universitas
Hasanuddin Makassar.
5. Ibu Dr. Hj. Hasnah Natsir, M.Si, Ibu Andi Asviana, dan bapak Idris
Khaerun; Ketua dan Staff administrasi Program Studi S2 Fakultas
vii
Matematika dan Ilmu pengetahuan Alam Universitas Hasanuddin
Makassar.
6. Ibu Dr. Paulina Taba, M.Phill dan ibu Dr. Hj. Seniwati Dali, M.Si;
Penasehat akademik penulis selama menjadi mahasiswa Program
Pascasarjana Universitas Hasanuddin Makassar.
7. Bapak Prof. Dr. H. Hanapi Usman, MS (Almarhum), bapak Dr. H.
Syarifuddin Liong, M.Si, Ibu Dr. Hj. Hasnah Natsir, M.Si, dan Bapak Dr.
Maming, M.Si; Tim penilai seminar usul penelitian, seminar hasil
penelitian, dan ujian tesis.
8. Bapak Dr. H. Abd. Karim, M.Si, Ibu Mahdalia, S.Si, bapak Prof. Dr. H.
Ahyar Ahmad, bapak Abdur Rahman Arif, S.Si, M.Si, ibu Dr. Hj.
Rugaiyah Arfah, M.Si, Ilham Haidir, S.Si, Maretrin, S.Si, Bapak Prof. Dr.
Ir. Asmuddin Natsir, M.Sc, Ibu Trias Devianti, Bapak Sugeng, S.Tp, Ibu
Indriani Ismail, Isti Nurillah, Fatahu, Mirnawati, dan Putri Sopiahrini.
viii
Penulis menyadari sepenuhnya bahwa di dalam penyusunan tesis ini
masih banyak terdapat kekurangan. Oleh karena itu, penulis mengharapkan
kritik dan saran yang bersifat membangun demi sempurnanya penelitian dan
penulisan karya ilmiah yang akan datang. Besar harapan pula agar tesis ini
bermanfaat dan dapat dikembangkan di bidang sains dan teknologi
khususnya di bidang ilmu kimia. Akhir kata, penulis tidak dapat membalas
kebaikan semua pihak yang telah membantu penulis dalam proses
penyelesaian laporan hasil penelitian ini, dan hanya dapat mendoakan
semoga Tuhan Yang Maha Kuasa selalu menyertai dan memberkati kita
semua, Amin.
Makassar, 04 Desember 2017 Penulis Hendra Jultrisno Rusman
ix
ABSTRAK
HENDRA JULTRISNO RUSMAN. Potensi Dan Imobilisasi Enzim Lipase dari Dedak Padi (Oryza Sativa L.) Serta Aplikasinya Dalam Mengkatalisis Reaksi Trans-esterifikasi dan Amidasi Menggunakan Substrat Minyak Kelapa Murni (dibimbing oleh Seniwati dan Firdaus)
Penelitian ini bertujuan: (1) mengisolasi, memurnikan, dan menentukan aktivitas spesifik enzim lipase pada beberapa tingkat kemurnian; (2) mengkarakterisasi enzim lipase yang telah dimurnikan; (3) mengimobilisasi, menentukan aktivitas optimal enzim imobil terhadap pengaruh perubahan suhu dan pH; (4) menguji kestabilan enzim imobil terhadap perubahan lingkungan dan penggunaan secara berulang; dan (5) menguji kemampuan enzim lipase imobil di dalam mengkatalisis reaksi trans-esterifikasi dan amidasi menggunakan substrat minyak kelapa murni.
Tahapan penelitian meliputi ekstraksi, fraksinasi menggunakan amonium sulfat, dialisis menggunakan membran selofan, kromotografi kolom menggunakan matriks Q-sepharosa Fast Flow, kromotografi kolom menggunakan matriks sephadeks G-75; karakterisasi enzim lipase; uji pengaruh ion logam sebagai kovaktor; imobilisasi menggunakan karbon aktif; uji aktivitas enzim imobil pada variasi suhu dan pH; uji efektivitas enzim imobil terhadap pengaruh lingkungan dan penggunaan secara berulang; serta uji kemampuan enzim imobil di dalam mengkatalisis reaksi trans-esterifikasi dan amidasi menggunakan substrat minyak kelapa murni. Hasil katalisis diidentifikasi menggunakan instrumen FTIR dan GC-MS.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa enzim lipase dedak padi (Oryza sativa L.) dapat dimurnikan sampai pada tingkat kemurnian sebesar 23,58 kali dari ekstrak kasar dengan aktivitas spesifik sebesar 0,283 U/mg protein; mempunyai karakteristik mengkatalisis secara optimal pada konsentrasi enzim 40%, suhu 450C, waktu reaksi 15 menit, konsentrasi substrat 40%, dan pH 6,5; serta aktivitasnya meningkat sebesar 154% oleh kovaktor ion logam Co2+. Enzim lipase imobil mengkatalisis secara optimal pada suhu 50oC dan pH 6,5; mempunyai kestabilan terhadap perubahan lingkungan pada waktu pemaparan 15-105 menit dengan aktivitas relatif sebesar 47,5%; serta dapat digunakan sebanyak 6 kali. Berdasarkan hasil identifikasi produk reaksi trans-esterifikasi, enzim lipase dedak padi (Oryza Sativa L.) diklasifikasikan sebagai enzim spesifik mengkatalisis asam lemak rantai panjang (C18-20), spesifik mengkatalisis triasilgliserol dan di dalam pengujiannya menggunakan substrat minyak kelapa murni, enzim lipase tidak dapat mengkatalisis reaksi amidasi. Kata Kunci: Lipase dedak padi (Oryza Sativa L.), minyak kelapa murni, isolasi, pemurnian, karakterisasi, imobilisasi, trans-esterifikasi, dan amidasi.
x
ABSTRACT
HENDRA JULTRISNO RUSMAN. The Potential and Imobilization of Enzyme Lipase of Rice Bran (Oryza Sativa L.) and its Application in Catalyzing Reaction Trans-esterification and Amidation Using Virgin Coconut Oil Substrate (Supervised by Seniwati and Firdaus)
The research aimed: (1) to isolate, purify and determine the specific activity of the enzyme lipase in several purification levels; (2) to characterize the lipase enzyme which had been purified; (3) to immobilize and determine the immobile enzyme optimal activity on the effect of the temperatures and pH changes; (4) to examine the immobile enzyme stability on the environment change and repeated uses; and (5) to examine the immobile lipase enzyme ability in catalyzing the reaction of the trans-esterification and amidation using the Virgin Coconut Oil substrate.
The research stages included extraction, fracsination using ammonium sulphate, dialysis using the cellophane membrane, chromotography columns using Q-sepharosa Fast Flow matrix, column chromotography using sephadecs G-75 matrix; lipase enzym characterization, the test of ion metal effect as the cofactors, imobilization using the active carbon, immobile enzyme activity test on temperature and pH variations, the immobile enzyme activity test on the environment effect and repeated uses, the immobile enzyme ability test in catalyzing the reaction of trans-esterification and amidation using Virgin Coconut Oil substrate. The catalysis results was identified using FTIR and GC-MS instruments.
The research result indicates that the enzyme lipase from rice bran (Oryza sativa L.) can be refined to the purity level of 23,58 times to rough activities with the specific of 0,283 U/mg proteins; have the characteristic to catalyze optimally on the enzyme concentration 40%, temperature 450C, reaction time 15 minutes, concentration substrate 40%, and pH 6.5; and its activity increased as much as 154% by the ion cofactor of metal Co2+. The immobile lipase enzyme catalyzes optimally on the temperature of 500C and pH 6.5; has the stability on the environment change at the moment of the disclosure time of 15-105 with the relative activity of 47.5%; and can be used as many as 6 times. Based on the production identification result of the trans-esterification the rice bran (Oryza Sativa L.) lipase enzyme is classified as the specific enzymes to catalyze fatty acids the long chain fatty acid (C18-20), to catalyze triacylglycerol spesifically, and the testing uses virgin coconut oil substrate, the lipase can not catalyze catalyze the amidation reaction. Keywords: Lipase from rice bran (Oryza Sativa L.), virgin coconut oil isolation, purification, characterization, imobilization, trans-esterification, and amidation.
xi
DAFTAR ISI
ISI Halaman
HALAMAN DEPAN
HALAMAN PENGESAHAN
PERNYATAAN KEASLIAN TESIS
PRAKATA
ABSRAK
ABSTRACT
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
DAFTAR GAMBAR
DAFTAR LAMPIRAN
DAFTAR ARTI, LAMBANG DAN SINGKATAN
i
iii
iv
v
ix
x
xi
xvi
xvii
xx
xxii
BAB I PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
B. Rumusan Masalah
C. Tujuan Penelitian
D. Manfaat Penelitian
1
1
5
6
6
BAB II TINJAUAN PUSTAKA
A. Taksonomi Tanaman Padi
B. Tinjauan Tentang Enzim
1. Mekanisme Kerja Enzim
2. Spesifitas Enzim
3. Faktor-Faktor Yang Mempengaruhi Kerja Enzim
C. Tinjauan Tentang Enzim Lipase
D. Enzim Lipase Dedak Padi
E. Isolasi dan Pemurnian Enzim
1. Ekstraksi
2. Fraksinasi Dengan Amonium Sulfat
7
7
8
9
10
12
14
21
22
22
23
xii
3. Dialisis
4. Kromatografi Kolom Penukar Ion
5. Kromatografi Kolom Filtrasi Gel
F. Imobilisasi Enzim
G. Tinjauan Tentang Minyak Kelapa Murni
H. Kerangka Pikir
I. Hipotesis
24
25
26
27
28
29
32
BAB III METODE PENELITIAN
A. Waktu dan Tempat Penelitian
B. Alat dan Bahan Penelitian
1. Alat
2. Bahan
C. Prosedur Penelitian
1. Isolasi dan Pemurnian Enzim Lipase
a. Ekstraksi Enzim Lipase
b. Fraksinasi Dengan Amonium Sulfat
c. Dialisis Dengan Membran Selofan
d. Kromatografi Kolom Penukar Ion
e. Kromatografi Kolom Filtrasi Gel
2. Karakterisasi Enzim Lipase
a. Penentuan Konentrasi Enzim Maksimum
b. Penentuan Suhu Optimum
c. Penentuan Waktu Reaksi Optimum Enzim
d. Penentuan pH Optimum
e. Penentuan Konsentrasi Substrat Maksimum
f. Uji Pengaruh Ion Logam Sebagai Kovaktor
g. Penentuan Konstanta Kinetika KM dan Vmaks
33
33
33
33
34
35
35
35
35
36
37
37
38
38
38
38
38
38
39
39
xiii
3. Imobilisasi Enzim Lipase
a. Penentuan Waktu Imobilisasi
b. Penentuan Kondisi Optimum Enzim Imobil
1. Penentuan Suhu Optimum
2. Penentuan pH Optimum
c. Penentuan Kestabilan Enzim Imobil
1. Penentuan Kestabilan Termal Enzim Imobil
2. Penentuan Kestabilan Enzim Imobil Terhadap
Penggunaan Berulang
4. Penentuan Kadar Protein Enzim
a. Pembuatan Kurva Standar BSA
b. Pengukuran Kadar Protein Enzim
5. Penentuan Aktivitas Lipase
a. Pembuatan Kurva Standar Asam Oleat
b. Uji Aktivitas Enzim Lipase Bebas
c. Uji Aktivitas Enzim Lipase Imobil
6. Uji Kemampuan Katalitik Enzim Lipase Terhadap
Reaksi Trans-esterifikasi dan Amidasi Menggunakan
Substrat Minyak Kelapa Murni
a. Reaksi Trans-esterifikasi
b. Reaksi Amidasi
39
39
40
40
40
40
40
41
41
41
42
42
42
43
44
45
45
45
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Isolasi dan Pemurnian Enzim Lipase
1. Ekstraksi Enzim Lipase dari Dedak Padi
2. Fraksinasi Dengan Amonium Sulfat
3. Dialisis Dengan Membran Selofan
4. Kromatografi Kolom Penukar Ion
46
46
46
49
50
52
xiv
5. Kromatografi Kolom Filtrasi Gel
B. Karakterisasi Enzim Lipase
1. Penentuan Konsentrasi Enzim Maksimum
2. Penentuan Suhu Optimum
3. Penentuan Waktu Reaksi Optimum
4. Penentuan pH Optimum
5. Penentuan Konsentrasi Substrat Maksimum
6. Uji Pengaruh Ion Logam Sebagai Kofaktor
7. Penentuan Konstanta Kinetika KM dan Vmaks
C. Imobilisasi Enzim Lipase
1. Penentuan Waktu Imobilisasi
2. Penentuan Suhu Optimum Enzim Imobil
3. Penentuan pH Optimum Enzim Imobil
4. Penentuan Kestabilan Enzim Imobil Terhadap
Lingkungan
5. Penentuan Kestabilan Enzim Imobil Terhadap
Peggunaan Berulang
D. Uji Kemampuan Katalitik Enzim Lipase Terhadap Reaksi
Trans-esterifikasi dan Amidasi
1. Identifikasi Gugus Fungsi Menggunakan Instrumen
Fourier Transform Infrared (FTIR)
2. Identifikasi Senyawa Hasil Katalisis Menggunakan
Instrumen Gas Chromatography-Mass
Spectrofotometer (GC-MS)
53
56
56
57
58
60
61
62
64
65
66
67
68
69
70
71
72
74
BAB V PENUTUP
A. Kesimpulan
B. Saran
89
89
90
xv
DAFTAR PUSTAKA
LAMPIRAN
91
97
xvi
DAFTAR TABEL
Nomor Halaman
1. Aplikasi beberapa enzim lipase yang telah
dimanfaatkan sebagai biokatalis di dalam
memodifikasi minyak baik di dalam industri pangan
maupun non-pangan
20
2. Komposisi asam lemak minyak kelapa murni 29
3. Tingkat kemurnian enzim lipase dari dedak padi (Oryza
Sativa L.) pada ekstrak kasar, fraksinasi, dialisis,
kromatografi kolom penukar ion, dan kromatografi
kolom filtrasi gel.
55
4. Hasil analisis spektrum MS hasil katalisis enzim lipase
terhadap substrat minyak kelapa murni
75
xvii
DAFTAR GAMBAR
Nomor Halaman
1. Tanaman padi 8 2. Bagian-bagian enzim 9
3. Diagram energi reaksi tanpa enzim dan reaksi dengan enzim
10
4. Hipotesis kerja enzim 12 5. Struktur enzim lipase 15 6. Reaksi kespesifikan enzim lipase terhadap posisi
gliserida dan asam lemak
18 7. Jenis-jenis reaksi yang dapat dikatalisis oleh enzim
lipase
19 8. Prinsip pemurnian protein dengan metode fraksinasi
menggunakan amonium sulfat
24 9. Prinsip pemurnian protein dengan metode
menggunakan membran selofan
25 10. Prinsip pemurnian enzim dengan metode kromatografi
kolom penukar ion
26
11. Prinsip pemurnian protein dengan metode kromatografi kolom filtrasi gel
27
12. Imobilisasi enzim secara adsorbsi menggunakan karbon aktif sebagai material pendukung
28
13. Bagan kerangka pikir 31
14. Prinsip reaksi penentuan aktivitas lipase dengan menggunakan metode Kwon dan Rhee
47
15. Prinsip reaksi penentuan kadar protein menggunakan metode Lowry 48
16. Data hasil fraksinasi enzim lipase dedak padi (Oryza Sativa L.) dengan menggunakan ammonium sulfat
50
17. Kromatogram hasil pemurnian enzim lipase dari dedak padi (Oryza Sativa L.) menggunakan matriks Q-Sepharosa FF, laju alir elusi 0,7 mL/menit pada suhu kamar
53 18. Kromatogram hasil pemurnian enzim lipase dari dedak
padi (Oryza Sativa L.) menggunakan matriks Sephadex G-75, laju alir elusi 0,7 mL/menit pada suhu kamar
54 19. Pengaruh konsentrasi enzim terhadap aktivitas enzim
lipase pada volume substrat 0,75 mL, waktu reaksi 30 menit, suhu 30oC, dan pH 7,5
56 20. Pengaruh suhu terhadap aktivitas enzim lipase pada
xviii
konsentrasivolume substrat 0,75 mL, waktu reaksi 30 menit, [Enzim] 40%, dan pH 7,5
57
21. Pengaruh waktu terhadap aktivitas enzim lipase pada volume substrat 0,75 mL, waktu reaksi 30 menit, [Enzim] 40%, suhu 45oC pada enzim hasil dialisis, dan suhu 50oC pada enzim kasar, serta pH 7,5
59 22. Pengaruh pH terhadap aktivitas enzim lipase pada
volume substrat 0,75 mL; waktu reaksi 15 menit; [Enzim] 40%; dan suhu 450C pada enzim hasil dialisis, dan suhu 500C pada enzim kasar
60 23. Pengaruh konsentrasi substrat terhadap aktivitas
enzim lipase pada waktu reaksi 15 menit, [Enzim] 40%, suhu 450C pada enzim hasil dialisis, dan suhu 500C pada enzim kasar, serta pH 6,5
61 24. Pengaruh ion logam terhadap aktivitas enzim lipase
pada waktu reaksi 15 menit, [Enzim] 40%, [Substrat] 40%, suhu 450C pada enzim hasil dialisis, dan suhu 500C pada enzim kasar, serta pH 6,5
sephadex G-75 3. Data hasil pemisahan enzim menggunakan
matriks sephadex G-75
109 109
110
111
6. Penentuan aktivitas spesifik dan tingkat kemurnian enzim
112
7. Karakterisasi enzim lipase hasil dialisis 1. Skema karakterisasi enzim lipase hasil dialisis 2. Data hasil karakterisasi enzim lipase hasil dialisis
113 113 114
8. Imobilisasi enzim lipase 1. Skema kerja imobilisasi dan uji kestabilan enzim
imobil 2. Data hasil imobilisasi enzim
117
117 118
9. Penentuan kadar protein enzim dengan metode lowry (1951) 1. Skema kerja pembuatan kurva standar BSA 2. Skema kerja penentuan kadar protein sampel enzim
120 120 120
xxi
3. Data hasil penentuan panjang gelombang maksimum
4. Data hasil penentuan kurva standar BSA
121 122
10. Penentuan kurva standar BSA spektrofotometer UV-Vis (λ= 280 nm)
123
11. Penentuan aktivitas enzim lipase dengan metode Kwon dan Rhee (1986) 1. Skema kerja pembuatan reagen Cu(II) asetat 5%
pH 6 2. Skema kerja pembuatan kurva standar asam oleat 3. Skema kerja penentuan aktivitas enzim lipase
bebas 4. Skema kerja penentuan aktivitas enzim lipase
imobil 5. Data hasil penentuan panjang gelombang
maksimum 6. Data hasil penentuan kurva standar asam oleat
124
124 124
125
126
127 128
12. Pembuatan buffer 129 13. Uji kemampuan katalitik enzim lipase terhadap reaksi
trans-esterifikasi dan amidasi menggunakan substrat minyak kelapa murni 1. Skema kerja reaksi trans-esterifikasi 2. Skema kerja reaksi amidasi 3. Data hasil analisis menggunakan instrumen FTIR 4. Data hasil analisis menggunakan instrumen GC-MS
130 130 131 132 134
14. Dokumentasi penelitian 189
xxii
DAFTAR ARTI LAMBANG DAN SINGKATAN
LAMBANG/SINGKATAN ARTI/KETERANGAN A
Absorbansi (serapan)
BM Berat molekul E Enzim EC Code of enzyme EI Kompleks Enzim-Inhibitor ES Kompleks Enzim-Substrat fp Faktor pengenceran I Inhibitor kDa Kilo Dalton, satuan massa protein λ Lambda (panjang gelombang) M Molaritas nm nano meter P Produk p.a Pro analyzing pH R
Power of Hydrogen (Tingkat keasaman)
Gugus alkil rpm Rotation per minutes (Kecepatan putar
per menit) S Substrat T Suhu t Waktu U Unit v/v Volume per Volume [ ] Konsentrasi
1
BAB I
PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
Dewasa ini, penggunaan enzim di bidang bioteknologi semakin
berkembang pesat yang disebabkan karena meningkatnya kesadaran
manusia terhadap masalah lingkungan dan kesehatan. Oleh karena itu,
banyak industri pangan dan non-pangan yang telah menggunakan enzim
sebagai biokatalis. Reaksi senyawa-senyawa yang dikatalisis oleh enzim
tidak menghasilkan zat yang beracun dan dapat didegradasi oleh mikroba
yang ada di lingkungan. Salah satu jenis enzim yang mempunyai peran
penting dan banyak digunakan sebagai biokatalisator di bidang industri
adalah enzim lipase (Yuneta dan Saputra, 2010). Banyaknya penemuan
baru dalam hal pemanfaatan enzim lipase sebagai biokatalisator untuk
memodifikasi minyak dan lemak menyebabkan permintaan enzim lipase di
bidang industri setiap tahunnya semakin meningkat. Hal tersebut
mendorong para peneliti untuk melakukan kajian mengenai sumber-
sumber enzim lipase (Amalia dkk., 2013).
Enzim lipase yang telah dimanfaatkan di berbagai bidang industri
pada umumnya merupakan enzim lipase mikrobial seperti Aliciclobacillus
amidasi, dan aminolisis. Reaksi-reaksi tersebut dapat dilihat pada
Gambar 7.
19
Gambar 7. Jenis-jenis reaksi yang dapat dikatalisis oleh enzim lipase
(Barros dkk, 2009)
Beberapa enzim lipase spesifik dan nonspesifik yang telah
dimanfaatkan sebagai biokatalis untuk berbagai jenis reaksi di dalam
memodifikasi minyak dan lemak untuk menghasilkan produk yang
bermanfaat baik di dalam skala industri pangan dan nonpangan dapat
dilihat pada Tabel 1.
20
Tabel 1. Aplikasi beberapa enzim lipase yang telah dimanfaatkan sebagai biokatalis di dalam memodifikasi minyak baik di dalam industri pangan maupun non-pangan
No. Peneliti Jenis dan Sumber Enzim Lipase Aplikasi
1. Pudji Hastuti dan Tyas Utami, 2003
Lipase spesifik 1,3-triasilgliserol dari Rhizomucor Meihei dan Candida Antartica
Interesterifikasi enzimatik palm stearin dan minyak ikan lemuru untuk menghasilkan lemak margarin
2. Dani Wibowo, 2009 Lipase spesifik 1,3-triasilgliserol dari Mucor Meihei
Produksi dilaurin sebagai agen pengemulsi melalui antara asam laurat dan gliserol
3. Kurnia, 2010 Lipase spesifik 1,3-triasilgliserol dari Aspergillus Niger
Produksi monoasilgliserol dari minyak kelapa
4. Seniwati, 2010 Lipase spesifik 2-triasilgliserol dari Aspergillus Oryzae
Produksi diasilgliserol dari minyak kelapa
5. Sapta Raharja, Prayoga Suryadarma, dan Teni Oktavia, 2011
Lipase spesifik 1,3-triasilgliserol dari Aspergillus Niger
Produksi asam lemak omega-3 dari minyak ikan.
6. Suharyanto, Tri-Panji, dan Urip Perwitasari, 2011
Lipase spesifik 1,3-triasilgliserol dari Rhizopus Oryzae Tp-2
Produksi diasilgliserol dari crude palm oil
7. Noor Khadimah, Bambang Dwi Argo, dan Bambang Susilo, 2014
Lipase non-spesifik dari Candida Rugosa
Produksi biodiesel dari minyak nyamplung
8. Mazaahir Kidwai, Roona Poddar, dan Poonam Motshra, 2009
Lipase non-spesifik dari Rihzomucor Meihei dan Candida Antartica
Sintesis biosurfaktan etanolamida dari beberapa asam lemak
9. Hendra Jultrisno Rusman, Abd. Rahman Razak, dan Nurhaeni, 2013
Lipase non-spesifik dari getah pepaya (Carica Papaya Latex)
Sintesis biosurfaktan Palmitin Etanolamida
10. Zuhrina Masyithah, 2010 Lipase non-spesifik dari Rihzomucor Meihei dan Candida Antartica
Sintesis biosurfaktan dietanolamida dan N-metilglukamina
21
D. Enzim Lipase Dedak Padi
Enzim lipase banyak terdapat pada biji-bijian yang mengandung
minyak seperti dedak padi (Amalia dkk., 2013). Putrawan dan
Sowerawidjaja (2007) mengemukakan bahwa dedak padi memiliki
kandungan minyak < 25% dan dapat diekstraksi dengan menggunakan
berbagai pelarut. Akan tetapi, produksi minyak dedak padi hanya dapat
bertahan beberapa bulan karena kualitas dedak padi yang tidak baik. Hal
ini disebabkan karena adanya enzim lipase di dalam dedak padi yang
mengakibatkan peningkatan asam lemak bebas sebesar 20 % dalam
waktu beberapa hari. Terjadinya peningkatan asam lemak bebas akan
menurunkan perolehan minyak dan menimbulkan bau tengik pada minyak
dedak. Dharsono dan Oktari (2010) juga mengemukakan bahwa
kandungan asam lemak bebas sebesar 4% - 8% dapat diperoleh dalam
waktu sesingkat mungkin. Hal ini disebabkan oleh adanya enzim lipase
yang sangat aktif setelah proses penggilingan sehingga kandungan asam
lemak bebas pada dedak padi menjadi lebih tinggi dan minyak dedak sulit
untuk dimurnikan.
Putrawan dan Soerawidjaja (2007) mengemukakan bahwa
berbagai metode telah dilakukan untuk mendeaktifasi enzim lipase yang
terdapat di dalam dedak padi, diantaranya adalah penggunaan gas SO2,
penggunaan larutan HCl, metode pendinginan, metode pemanasan
basah, dan metode pemanasan kering. Akan tetapi, metode-metode
tersebut dipandang kurang efisien dan ekonomis. Putrawan dan
22
Soerawidjaja (2007) dalam penelitiannya menyimpulkan bahwa lipase
dapat deaktivasi dengan metode pemanasan basah menggunakan
pemasak ekstrusif yang dioperasikan pada kelembaban 15%-20% dan
suhu 110-130oC. Selama tiga bulan penyimpanan pada kondisi tersebut,
kadar asam lemak bebas diperoleh sebesar 8%-13% dari kadar asam
lemak bebas mula-mula yakni 5%-6%.
Enzim lipase dedak padi telah diekstraksi dan dimanfaatkan dalam
bentuk ekstrak kasar oleh Arvian dkk. (2009) sebagai biokatalis di dalam
mensintesis biodiesel dari minyak biji karet dengan menggunakan n-
heksana sebagai pelarut. Hasil penelitian menunjukkan bahwa semakin
lama waktu yang digunakan, semakin banyak biodiesel yang dihasilkan
pada berbagai perbandingan. Suhu optimum reaksi trans-esterifikasi ini
adalah 51oC dengan hasil konversi sebesar 72,6%.
E. Isolasi dan Pemurnian Enzim
1. Ekstraksi
Ekstraksi merupakan suatu proses pemisahan zat berdasarkan
kelarutan, dilakukan secara lisis menggunakan blender sebagai alat
pengekstraksi dan buffer sebagai pelarut. Ekstraksi enzim dilakukan pada
suhu rendah dan pH yang sesuai dengan jenis enzim yang akan diisolasi
dengan tujuan untuk mempertahankan struktur dan fungsi biologisnya. Hal
ini disebabkan karena enzim merupakan kelompok biomakromolekul yang
sangat heterogen dan tidak stabil jika berada di luar sel. Setelah dilakukan
23
proses ekstraksi, dilakukan proses disentrifugasi menggunakan kecepatan
dan waktu tertentu (Satwika, 2010).
Sentrifugasi merupakan pemisahan berdasarkan perbedaan
kecepatan sedimentasi partikel molekul yang disebabkan oleh adanya
gaya sentrifugal. Cara ini digunakan untuk memisahkan endapan yang
sukar disaring dengan saringan biasa. Pada saat dimulainya proses
sentrifugasi, semua partikel yang semula terdistribusi secara merata di
dalam larutan akan secara perlahan bergerak menuju pusat medan
sentrifugal. Bila partikel memiliki kerapatan yang lebih besar dari partikel
pelarut maka partikel tersebut akan lebih cepat bergerak meninggalkan
larutan untuk menuju pusat medan sentrifugal, sedangkan partikel yang
memiliki kerapatan lebih kecil dari pelarut akan tetap berada di dalam
pelarutnya. Kondisi kesetimbangan tercapai apabila partikel yang memiliki
nilai kerapatan yang lebih besar dari pelarutnya telah berada di pusat
medan sentrifugal dan kondisi ini menyebabkan terjadinya pengendapan
(Seniwati, 2010).
2. Fraksinasi Dengan Amonium Sulfat
Fraksinasi menggunakan amonium sulfat dilakukan berdasarkan
perbedaan kelarutan protein pada konsentrasi amonium sulfat tertentu
yang dipengaruhi oleh interaksi ionik antara, protein, amonium sulfat, dan
air. Konsentrasi garam amonium sulfat akan berpengaruh terhadap
sumbangan kation dan anion garam dalam larutan. Hal ini menyebabkan
24
kecenderungan gugus-gugus rantai samping dalam protein terdisosiasi
untuk mengion (efek salting-in). Apabila kekuatan ionik meningkat lebih
lanjut maka kelarutan protein akan semakin berkurang; dan pada
kekuatan ionik yang tinggi, ion akan menarik molekul air di permukaan
molekul protein sehingga terjadi pengendapan (salting-out) (Satwika,
2010). Prinsip pemisahan protein berdasarkan perbedaan kelarutan
dengan menggunakan amonium sulfat dapat dilihat pada Gambar 8.
Gambar 8. Prinsip pemurnian enzim dengan metode fraksinasi menggunakan amonium sulfat
(Satwika, 2010)
3. Dialisis
Dialisis merupakan proses pemisahan protein dari zat terlarut yang
berbobot molekul kecil seperti glukosa dan ammonium sulfat melalui
proses difusi menggunakan membran semipermeabel (kantong selofan).
Proses dialisis dipengaruhi oleh perbedaan konsentrasi zat terlarut dalam
kedua sisi yang dipisahkan membran. Pada saat kondisi kesetimbangan
tercapai, proses difusi zat terlarut pada membran akan menjadi
setimbang. Penggantian molekul garam dengan air atau buffer dengan
Kelarutan
sel
Kelarutan
Penambahan (NH4)2SO4 Pengendapan
protein
Tingkat kejenuhan (NH4)2SO4
25
kekuatan ion rendah menyebabkan konsentrasi molekul zat terlarut dalam
protein menjadi berkurang (Satwika, 2010). Prinsip pemisahan protein
berdasarkan ukuran molekul menggunakan metode dialisis dapat dilihat
pada Gambar 9.
Gambar 9. Prinsip pemurnian enzim dengan metode menggunakan membran selofan
(Satwika, 2010)
4. Kromatografi Kolom Penukar Ion
Metode pemisahan protein menggunakan kolom penukar ion
didasari oleh interaksi ionik antara molekul protein dengan molekul yang
ada di dalam kolom penukar ion. Dengan demikian, molekul protein akan
dipisahkan berdasarkan muatan ionnya. Sebagai contoh, jika suatu protein
memiliki muatan positif pada pH 7 maka protein yang bermuatan positif
akan terikat pada matriks kolom yang mengandung muatan negatif,
sedangkan protein yang bermuatan negatif tidak terikat. Protein dielusi
dengan garam-buffer sebagai eluen. Sebagai contoh, kalium klorida 0,05
M pH 7, ion K+ yang digunakan sebagai eluen akan mensubstitusi gugus
Kantong
selofan
Larutan
buffer
Larutan
protein
Magnet
stirrer
26
protein bermuatan positif yang masih terikat pada matriks kolom, sehingga
protein yang memiliki banyak muatan negatif akan terelusi lebih dahulu.
Selain faktor muatan, afinitas terhadap matriks pendukung kolom dapat
mempengaruhi proses pemisahan protein pada kolom penukar ion
(Seniwati, 2010). Pemisahan protein melalui proses kromatografi kolom
penukar ion dapat dilihat pada Gambar 10.
Gambar 10. Prinsip pemurnian enzim dengan metode kromatografi kolom
penukar ion (Steve, 2008)
5. Kromatografi Kolom Filtrasi Gel
Prinsip kromatografi kolom filtrasi gel adalah partisi berdasarkan
ukuran molekul pada kolom yang mengandung butiran sangat kecil
berpori dan terbuat dari gel polimer berhidrat tinggi. Pada tahapan ini,
molekul-molekul protein dengan berbagai ukuran akan dielusikan lewat
Protein yang bermuatan negatif
mudah dipindahkan
Penambahan larutan KCl
Protein yang bermuatan positif dipindahkan
dengan kekuatan ionik tinggi
27
kolom sehingga molekul-molekul yang lebih kecil dari ukuran pori gel akan
masuk ke dalam partikel-partikel gel sebagai fasa stasioner, sedangkan
molekul-molekul yang lebih besar dari pori gel akan ditolak oleh partikel
gel dan masuk kedalam fasa mobil diantara partikel gel (Seniwati, 2010).
Prinsip kromatografi kolom filtrasi gel dapat dilihat pada Gambar 11.
Gambar 11. Prinsip pemurnian protein dengan metode kromatografi kolom
filtrasi gel
(Stryer, 1995)
F. Imobilisasi Enzim
Imobilisasi enzim didefinisikan sebagai lokalisasi enzim dalam
suatu ruang pada matriks dengan tetap mempertahankan aktivitas
katalitiknya. Pada umumnya, imobilisasi dilakukan dengan membuat
ikatan yang kuat antara asam amino penyusun enzim dengan matriks
pengimobil sehingga tercapai struktur yang stabil, dan menyebabkan
enzim imobil tidak larut dalam air. Dengan demikian, enzim menjadi lebih
stabil terhadap pengaruh lingkungan, mudah dipisahkan dari produk,
menghasilkan produk dengan tingkat kemurnian yang tinggi, dan dapat
Matriks polimer
Molekul besar yang tidak dapat masuk
ke pori
Molekul kecil yang dapat masuk ke pori
28
digunakan secara berulang. Penggunaan enzim imobil sebagai biokatalis
adalah sangat efisien, efektif, dan ekonomis (Hasna, 2012).
Imobilisasi enzim secara adsorpsi merupakan salah satu metode
yang sederhana dan murah. Enzim lipase yang teradsorpsi ditentukan
oleh jumlah enzim yang terikat pada senyawa pengimobil. Metode
adsorpsi menunjukkan hasil yang baik untuk enzim lipase karena tidak
memungkinkan terjadinya perubahan konformasi struktur enzim dan tidak
menunjukkan penurunan yang signifikan tehadap aktivitas biokatalis
enzim. Imobilisasi dengan metode adsorbsi fisik menggunakan karbon
aktif sebagai salah satu jenis material pendukung (Carrier) dapat dilihat
pada Gambar 12.
Gambar 12. Imobilisasi enzim secara adsorbsi menggunakan karbon aktif sebagai material pendukung
(Riadi, 2017; Wolfinbarger, 2017)
G. Tinjauan Tentang Minyak Kelapa Murni
Minyak kelapa murni merupakan minyak dengan kadar asam lemak
bebas yang rendah yaitu 0,0002% (Prakosa, 2009). Minyak kelapa murni
umumnya dikonversi menjadi gliserol dan metil ester asam lemak
29
menggunakan enzim lipase non-spesifik. Metil ester asam lemak rantai
pendek dan rantai sedang seperti metil kaproat, metil kaprilat, metil kaprat,
dan metil laurat memiliki kegunaan sebagai antimikroba; metil ester asam
lemak rantai panjang memiliki kegunaan sebagai biodiesel; dan gliserol
murni memiliki nilai ekonomi 40 kali lebih tinggi dari minyak kelapa murni
(Mappiratu dan Ijirana, 2010). Selain itu, minyak kelapa murni dapat
dikatalisis oleh enzim lipase spesifik 1,3-triasilgliserol dan spesifik 2-
triasilgliserol menjadi monolaurin dan dilaurin yang digunakan sebagai
pengemulsi makanan dan kosmetik serta dalam pembuatan sabun alami
karena berfungsi sebagai antivirus, antibakteri, dan antiprotozoa (Dwiyuni,
2006). Komposesi asam lemak dapat dilihat pada Tabel 2.
Tabel 2. Komposisi asam lemak Minyak Kelapa Murni (Edahwati, 2011)
Asam Lemak Rumus Kimia Jumlah (%)
Asam lemak jenuh
Asam kaproat C5H11COOH 0,4-0,6
Asam kaprilat C7H17COOH 5,0-10,0
Asam kaprat C9H19COOH 4,5-8,0
Asam laurat C11H23COOH 43,0-53,0
Asam miristat C13H27COOH 16,0-21,0
Asam palmitat C15H31COOH 7,5-10,0
Asam stearat C17H35COOH 2,0-4,0
Asam lemak tak jenuh
Asam oleat C17H33COOH 5,0-10,0
Asam linoleat C17H31COOH 1,0-2,5
H. Kerangka Pikir
Enzim lipase dedak padi merupakan enzim lipase yang potensial
untuk dikembangkan dalam skala komersial namun belum termanfaatkan
secara maksimal. Agar dapat dimanfaatkan secara maksimal maka perlu
30
pula ditingkatkan aktivitas menjadi maksimum. Upaya yang dilakukan
untuk memperoleh enzim dengan aktivitas maksimum adalah melakukan
isolasi dan pemurnian yang meliputi; (1) pemisahan enzim dari sel melalui
proses ekstraksi, (2) pemisahan enzim berdasarkan interaksi ionik dengan
garam amonium sulfat dan air melalui proses fraksinasi, (3) pemisahan
enzim dari molekul kecil melalui proses dialisis menggunakan membran
selofan, (4) pemisahan enzim berdasarkan muatan ionnya melalui proses
kromotografi kolom penukar ion, dan (5) pemisahan enzim berdasarkan
ukuran molekul melalui proses kromotografi kolom filtrasi gel. Enzim isolat
selanjutnya dikarakterisasi dengan melibatkan variabel penentuan
konsentrasi enzim maksimum, suhu optimum, waktu optimum reaksi, pH
optimum, konsentrasi substrat maksimum, uji pengaruh ion logam sebagai
kofaktor dan penentuan konstanta kinetika KM dan vmaks.
Pada dasarnya enzim lipase yang telah dimurnikan dan
dikarakterisasi masih merupakan enzim yang terlarut dan tidak stabil
sehingga tidak dapat digunakan secara berulang-ulang. Dengan demikian,
enzim tidak efektif, efisien, dan ekonomis untuk digunakan sebagai
biokatalisator. Untuk mengatasi kekurangan tersebut, dilakukan imobilisasi
enzim secara adsorpsi menggunakan karbon aktif sebagai material
pendukung, dilanjutkan dengan penentuan kembali suhu dan pH
optimumnya serta kestabilan enzim imobil terhadap pengaruh lingkungan
dan penggunaan secara berulang.
31
Uji potensi katalitik enzim lipase yang telah diperoleh dilakukan
melalui penerapan enzim tersebut di dalam mengkatalisis reaksi trans-
esterifikasi menggunakan substrat minyak kelapa murni dan metanol
sebagai ko-substrat untuk menghasilkan metil ester asam lemak;
dilanjutkan dengan reaksi amidasi menggunakan metil ester asam lemak
sebagai substrat dan etanolamina sebagai ko-substrat untuk
menghasilkan surfaktan etanolamida. Analisis produk untuk mengetahui
kemampuan enzim lipase di dalam mengkatalisis reaksi trans-esterifikasi
dan amidasi dilakukan menggunakan instrumen FTIR dan GC-MS.
Gambar 13. Bagan kerangka pikir
Lipase murni: aktivitas enzim belum maksimum,
tidak stabil terhadap pengaruh lingkungan, dan tidak
amonium sulfat dilakukan secara perlahan sambil diaduk dengan magnet
36
stirrer pada kecepatan rendah hingga amonium sulfat melarut dengan
sempurna, kemudian didiamkan selama 24 jam pada suhu 40C, dan
selanjutnya dilakukan setrifugasi selama 30 menit pada suhu 40C dengan
kecepatan 10000 rpm. Endapan yang diperoleh dari masing-masing fraksi
dilarutkan dengan buffer fosfat pH 6,5 kemudian dilakukan penentuan
kadar protein dengan metode Lowry dan penentuan aktivitas lipase
dengan metode Kwon dan Rhee. Enzim fraksi tertinggi (fraksi 60%)
didialisis dengan menggunakan membran selofan.
c. Dialisis Dengan Membran Selofan
Enzim fraksi tertinggi (fraksi 60%) dimasukkan ke dalam membran
selofan kemudian diletakkan pada gelas kimia yang berisi buffer fosfat pH
6,5 dalam keadaan dingin; selanjutnya dilakukan proses pengadukan
dengan magnet stirrer pada kecepatan rendah. Setelah itu, dilakukan
pengamatan dengan menambahkan BaCl2 0,01 M pada larutan buffer.
Penggantian buffer selama proses dialisis dilakukan setiap 3 jam dan
proses dialisis dihentikan pada saat tidak terjadi pembentukkan endapan
putih (BaSO4). Setelah proses dialisis dihentikan, dilakukan penentuan
kadar protein menggunakan metode Lowry dan penentuan aktivitas lipase
menggunakan metode Kwon dan Rhee; kemudian dilanjutkan pada
proses pemisahan enzim dengan kromatorgafi kolom penukar ion.
37
d. Kromatografi kolom penukar ion
Enzim hasil dialisis 10 mL dimasukkan ke dalam kolom yang berisi
matriks Q-Sepharosa Fast Flow yang telah diaktivasi menggunakan buffer
tris-HCl pH 6,5; kemudian dielusi dengan menggunakan buffer tris-HCl pH
6,5. Sampel ditampung sebanyak 3 mL pada setiap tabung dengan
menentukan laju alir (menit/3mL) pada masing-masing sampel, kemudian
ditentukan kadar protein menggunakan spektrofotometer UV-Vis (λ = 280
nm) dan aktivitas lipase menggunakan metode Kwon dan Rhee; kemudian
dilanjutkan pada proses pemisahan enzim dengan kromatografi kolom
filtrasi gel.
e. Kromatografi kolom filtrasi gel
Enzim hasil kromatografi kolom penukar ion 0,5 mL dimasukkan ke
dalam kolom yang berisi matriks sephadex G-75 yang telah diaktivasi
menggunakan buffer fosfat pH 6,5; kemudian dielusi dengan
menggunakan buffer fosfat pH 6,5. Sampel ditampung sebanyak 3 mL
pada setiap tabung dengan menentukan laju alir (menit/3mL) pada
masing-masing sampel. Masing-masing fraksi ditentukan kadar protein
menggunakan spektrofotometer UV-Vis (λ = 280 nm) dan aktivitas lipase
menggunakan metode Kwon dan Rhee.
38
2. Karakterisasi enzim Lipase
a. Penentuan konsentrasi enzim maksimum
Penentuan suhu optimum enzim lipase dilakukan dengan menguji
aktivitas enzim lipase menggunakan metode Kwon dan Rhee pada
konsentrasi enzim yang bervariasi yaitu 10, 20, 30, 40, dan 50%.
b. Penentuan suhu optimum
Penentuan suhu optimum enzim lipase dilakukan dengan menguji
aktivitas enzim lipase menggunakan metode Kwon dan Rhee pada suhu
yang bervariasi yaitu 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, dan 700C.
c. Penentuan waktu reaksi optimum enzim
Penentuan waktu reaksi optimum enzim lipase dilakukan dengan
menguji aktivitas enzim lipase menggunakan metode Kwon dan Rhee
pada waktu yang bervariasi yaitu 5, 10, 15, 20, 25, dan 30 menit.
d. Penentuan pH optimum enzim
Penentuan pH optimum enzim lipase dilakukan dengan menguji
aktivitas enzim lipase menggunakan metode Kwon dan Rhee pada pH
yang bervariasi yaitu 5,5; 6,0; 6,5; 7,0; 7,5; dan 8,0.
e. Penentuan konsentrasi substrat maksimum
Penentuan konsentrasi substrat maksimum dilakukan dengan
menguji aktivitas enzim lipase menggunakan metode Kwon dan Rhee
pada konsentrasi subsrat yang bervariasi yaitu 10, 20, 30, 40, dan 50%.
39
f. Uji Pengaruh Ion Logam Sebagai Kofaktor
Larutan enzim 0,7 mL ditambahkan dengan 0,175 mL buffer pH
6,5; ion logam Fe2+, Ca2+, Ba2+, Mg2+,dan Co2+ 0,157 mL; dan substrat
minyak zaitun 0,70 mL. Kontrol yang digunakan adalah 0,70 mL akuades,
0,70 mL minyak zaitun, dan 0,35 mL buffer pH 6,5. Campuran sampel dan
kontrol masing-masing diinkubasi dengan kecepatan 120 rpm pada suhu
450C selama 15 menit, kemudian ditambahkan 0,5 mL HCl 6 N dan 3,25
mL n-heksana. Selanjutnya dilakukan penentuan aktivitas lipase
menggunakan metode Kwon dan Rhee dan ditentukan aktivitas relatif
enzim.
g. Penentuan kinetika KM dan vmaks
Parameter kinetika reaksi reaksi enzimatis adalah kecepatan
maksimum reaksi (vmaks) dan konstanta Michaelis-Menten (KM) dengan
menggunakan persamaan Michaelis-Menten atau persamaan Lineweaver
Burk. Persamaan Michaelis-Menten diperoleh dengan membuat kurva
hubungan antara konsentrasi substrat ([S]) dengan kecepatan (v);
sedangkan persamaan Lineweaver Burk diperoleh dari percobaan
penentuan konsentrasi substrat maksimum enzim lipase dari dedak padi
(Oryza Sativa L.).
3. Imobilisasi Enzim Lipase
a. Penentuan waktu imobilisasi
Enzim lipase murni 15 mL ditambahkan dengan 15 mL buffer fosfat
pH 6,5 dan 5 gram karbon aktif kemudian dishaker pada selang waktu 0,
40
5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, dan 40 menit dengan kecepatan 150 rpm pada
suhu kamar. Selanjutnya disentrifugasi selama 5 menit dengan kecepatan
1000 rpm. Jumlah enzim lipase yang tidak terimobilisasi pada supernatan
ditentukan dengan menggunakan metode Lowry pada panjang gelombang
640 nm. Enzim imobil dikeringkan dalam oven pada suhu 350C selama 12
jam.
b. Penentuan Kondisi Optimum Enzim Imobil
1. Penentuan suhu Optimum
Penentuan suhu optimum dilakukan dengan menguji aktivitas
enzim lipase yang telah diimobilisasi menggunakan metode Kwon dan
Rhee pada suhu yang bervariasi yaitu 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, dan
700C.
2. Penentuan pH Optimum
Penentuan pH optimum dilakukan dengan menguji aktivitas enzim
lipase menggunakan metode Kwon dan Rhee pada pH yang bervariasi
yaitu: 5,5; 6,0; 6,5; 7,0; 7,5; dan 8,0.
c. Penentuan Kestabilan Enzim Imobil
1. Penentuan kestabilan enzim imobil terhadap pengaruh lingkungan
Uji stabilitas termal enzim imobil dilakukan dengan menguji aktivitas
enzim lipase menggunakan metode Kwon dan Rhee pada waktu
pemaparan yang bervariasi yaitu 15, 45, 75, dan 105 menit.
41
2. Penentuan kestabilan enzim imobil terhadap penggunaan berulang
Uji stabilitas enzim imobil terhadap penggunaan berulang adalah
sebagai berikut: enzim imobil sebanyak 1 g ditambahkan 5 mL buffer
fosfat pH 6,5 dan 5 mL substrat minyak zaitun. Campuran tersebut
diinkubasi pada waktu 15 menit pada suhu 500C dengan kecepatan 250
rpm, kemudian campuran disentrifugasi pada kecepatan 1000 rpm selama
5 menit. Produk yang dihasilkan diuji aktivitas enzimnya dengan
menggunakan metode Kwon dan Rhee pada panjang gelombang 615 nm,
sedangkan enzim imobil dicuci dengan 20 mL buffer fosfat pH 6,5;
disaring, dan dikeringkan di dalam oven pada suhu 400C selama 120
menit; selanjutnya, enzim imobil yang telah kering digunakan untuk
penentuan aktivitas enzim lipase berikutnya.
4. Penentuan Kadar Protein Enzim
Penentuan kadar protein enzim dilakukan dengan menggunakan
metode Lowry yang dimodifikasi sebagai berikut :
a. Pembuatan kurva standar Bovine Serum Albumin (BSA)
Larutan induk BSA dengan konsentrasi 1 mg/mL diambil masing-
masing sebanyak 0,04; 0,08; 0,12; 0,16; 0,20; dan 0,24 mL dan
diencerkan dengan aquades hingga volume total mencapai 2 mL
sedangkan aquades 2 mL digunakan sebagai blanko. Dari perlakuan
tersebut dihasilkan larutan standar BSA dengan konsentrasi masing-
masing 0,02; 0,04; 0,06; 0,08; 0,10; dan 0,12 mg/mL. Larutan standar dan
42
blanko ditambahkan dengan reagen Lowry B sebanyak 2,75 mL kemudian
dikocok dengan kuat lalu didiamkan selama 15 menit pada suhu kamar.
Setelah itu, ditambahkan reagen lowry A sebanyak 0,25 mL dan dikocok
dengan kuat lalu didiamkan selama 30 menit; selanjutnya dilakukan
penentuan nilai absorbansi pada larutan standar menggunakan
spektrofotometer 20 D+ pada panjang gelombang 640 nm.
b. Pengukuran kadar protein enzim
Larutan enzim 0,1 mL diencerkan dengan aquades hingga volume
total mencapai 2 mL sedangkan aquades 2 mL digunakan sebagai blanko.
Sampel dan blanko ditambahkan dengan reagen Lowry B sebanyak 2,75
mL kemudian dikocok dengan kuat lalu didiamkan selama 15 menit pada
suhu kamar. Setelah itu, ditambahkan reagen lowry A sebanyak 0,25 mL
dan dikocok dengan kuat lalu didiamkan selama 30 menit; selanjutnya
dilakukan penentuan nilai absorbansi sampel dengan menggunakan
spektrofotometer 20 D+ pada panjang gelombang 640 nm.
5. Penentuan Aktivitas Lipase
Penentuan aktivitas lipase dilakukan dengan menggunakan metode
Kwon dan Rhee yang dimodifikasi sebagai berikut:
a. Penentuan kurva standar asam oleat
Larutan induk asam oleat 30 mg/mL di ambil masing-masing 0,125;
0,250; 0,375; 0,500; 0,625; dan 0,750 mL dan diencerkan dengan n-
heksana hingga volume total mencapai 3,75 mL sedangkan pelarut n-
heksana 3,75 mL digunakan sebagai blanko. Dari perlakuan tersebut
43
dihasilkan larutan standar asam oleat dengan konsentrasi masing-masing
1, 2, 3, 4, 5, dan 6 mg/mL. Larutan standar dan blanko ditambahkan
dengan 0,5 ml reagen tembaga (II) asetat 5 % pH 6 lalu dikocok dengan
kuat selama 1 menit. Masing-masing larutan diambil kembali sebanyak
3,20 mL kemudian dilakukan penentuan nilai absorbansi dengan
menggunakan spektrofotometer 20 D+ pada panjang gelombang 615 nm.
b. Uji aktivitas enzim lipase bebas
Enzim bebas sebanyak 0,70 mL ditambahkan 0,35 mL buffer fosfat
pH 6,5 dan substrat minyak zaitun sebanyak 0,70 mL. Campuran tersebut
diinkubasi pada suhu 450C dengan kecepatan 120 rpm selama 15 menit.
Setelah proses inkubasi, ditambahkan 0,5 mL HCl 6 N dan 3,25 mL n-
heksana, dikocok dengan kuat, lalu didiamkan selama 15 menit. Setelah
terbentuk dua fase, fase minyak diambil sebanyak 2,50 mL dan
ditambahkan n-heksana sebanyak 1,25 mL. Perlakuan ini menggunakan
kontrol yaitu akuades 0,70 mL yang ditambahkan 0,35 mL buffer fosfat pH
6,5 dan substrat minyak zaitun sebanyak 0,70 mL. Selain itu, digunakan
blanko pelarut n-heksana sebanyak 3,75 mL. Sampel, kontrol, dan blanko
ditambahkan 0,5 mL reagen tembaga (II) asetat 5% pH 6 lalu dikocok
dengan kuat. Fase minyak diambil sebanyak 3,20 mL kemudian dilakukan
penentuan nilai absorbansi dengan menggunakan spekrofotometer 20 D+
pada panjang gelombang 615 nm.
44
c. Uji aktivitas enzim lipase imobil
Enzim imobil sebanyak 1 g ditambahkan 5 mL buffer fosfat pH 6,5
dan substrat minyak zaitun sebanyak 5 mL. Campuran tersebut diinkubasi
selama 15 menit dengan kecepatan 250 rpm, selanjutnya campuran
tersebut disentrufugasi dengan kecepatan 1000 rpm selama 5 menit untuk
memisahkan antara produk dengan enzim imobil. Pada perlakuan ini,
produk hasil katalitik merupakan cairan dan terdapat di dalam fase minyak
sedangkan enzim imobil merupakan padatan. Setelah dilakukan
sentrifugasi, cairan yang diperoleh dari reaksi didiamkan selama 15 menit
hingga terbentuk membentuk fase dengan sempurna. Setelah terbentuk
dua fase, fase minyak diambil sebanyak 2,50 mL dan ditambahkan n-
heksana sebanyak 1,25 mL. Perlakuan ini menggunakan kontrol yaitu
akuades 0,70 mL yang ditambahkan 0,35 mL buffer fosfat pH 6,5 dan
substrat minyak zaitun sebanyak 0,70 mL. Selain itu, digunakan blanko
pelarut n-heksana sebanyak 3,75 mL. Sampel, kontrol, dan blanko
ditambahkan 0,5 mL reagen tembaga (II) asetat 5% pH 6 lalu dikocok
dengan kuat. Fase minyak diambil sebanyak 3,20 mL kemudian dilakukan
penentuan nilai absorbansi dengan menggunakan spekrofotometer 20 D+
pada panjang gelombang 615 nm.
45
5. Uji Kemampuan Katalitik Enzim Lipase Terhadap Reaksi Trans-esterifikasi dan Amidasi
a. Reaksi Trans-Esterifikasi
Minyak kelapa murni sebanyak 15 gram ditambahkan dengan 7,5
mL metanol dan 7,5 gram enzim imobil kemudian diinkubasi selama 6 jam
pada suhu 500C. Selanjutnya dilakukan ekstraksi produk menggunakan 25
mL kloroform, didinginkan, dan disaring. Pelarut kloroform dievaporasi
pada suhu 650C. Produk yang diperoleh dilarutkan kembali di dalam 50
mL n-heksana kemudian dicuci dengan 25 mL aquades sebanyak 2 kali,
dikeringkan dengan Na2SO4 anhidrat, dan pelarut n-heksana dievaporasi
pada suhu 550C. Produk yang diperoleh dianalisis menggunakan
instrumen FTIR dan GC-MS.
b. Reaksi Amidasi
Produk metil ester asam lemak sebanyak 10 gram ditambahkan
dengan 10 mL etanolamina dan 5 gram enzim imobil kemudian diinkubasi
pada suhu 500C selama 6 jam. Produk diekstraksi dengan 25 mL
kloroform, didinginkan, dan disaring. Pelarut kloroform dievaporasi pada
suhu 650C, dan produk dilarutkan kembali di dalam 50 mL n-heksana
panas, didinginkan, dan dicuci dengan 25 mL aquades sebanyak 4 kali
kemudian dikeringkan dengan Na2SO4 anhidrat. Setelah itu, dilakukan
evaporasi pelarut pada suhu 550C. Produk yang diperoleh dianalisis
dengan instrumen FTIR dan GC-MS.
46
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Isolasi dan Pemurnian Enzim Lipase
1. Ekstraksi Enzim Lipase Dari Dedak Padi
Proses ekstraksi enzim lipase dari dedak padi (Oryza sativa L.)
dilakukan melalui beberapa tahap yaitu (1) ekstraksi minyak dedak dengan
metode maserasi menggunakan pelarut n-heksana p.a (1:3, b/v). Proses ini
bertujuan untuk menghentikan aktivitas enzim lipase di dalam dedak padi yang
biasa berlangsung akibat adanya minyak dedak substrat, dan memudahkan
pemisahan dedak padi dari pengotor (Dharsono dan Oktari, 2010); (2)
pemisahan dedak padi bebas minyak dari pengotor seperti sekam dan menir
menggunakan ayakan 60 mesh (Cahyanine dkk., 2008); (3) pemisahan enzim
dari dedak padi secara lisis menggunakan blender dan larutan fisiologis NaCl
0,9% pH 7 steril (Hendra, 2013); (4) pengendapan selama ± 1 malam untuk
memisahkan larutan enzim dari dedak padi; dan (5) sentrifugasi untuk
memisahkan supernatan dari partikel halus yang tersisa pada proses
dekantasi. Penentuan adanya enzim lipase yang terkandung di dalam dedak
padi dilakukan dengan cara menguji aktivitas lipase menggunakan metode
Kwon dan Rhee. Adanya aktivitas lipase ditandai dengan perubahan warna
pada produk menjadi hijau atau biru setelah ditambahkan asam asetat 5% pH
47
6 sedangkan aktivitas lipase ditentukan berdasarkan nilai absorbansi pada
produk hasil hidrolisis. Prinsip reaksi pada penentuan aktivitas lipase
menggunakan metode Kwon dan Rhee dapat dilihat pada Gambar 14.
Gambar 14. Prinsip reaksi penentuan aktivitas enzim lipase menggunakan metode Kwon dan Rhee
(Yuneta dan Saputra, 2010)
Enzim ekstrak kasar yang diperoleh ditentukan kadar proteinnya
menggunakan metode Lowry. Adanya protein di dalam sampel ditandai
dengan terbentuknya warna biru setelah penambahan reagen Lowry B dan
Lowry A sedangkan kadar protein ditentukan berdasarkan nilai absorbansi
sampel enzim. Prinsip reaksi penentuan kadar protein menggunakan metode
Lowry dapat dilihat pada Gambar 15.
48
Gambar 15. Prinsip reaksi penentuan kadar protein enzim menggunakan metode Lowry
(Seniwati, 2010)
Berdasarkan data penelitian, kadar protein pada supernatan adalah
sebesar 3,195 mg/mL dan aktivitas enzim lipase adalah sebesar 0,340 U/mL
pada kondisi reaksi yakni konsentrasi substrat 40%, konsentrasi enzim 40%,
suhu 500C, waktu reaksi 15 menit, dan pH 6,5. Dengan demikian, supernatan
merupakan enzim lipase ekstrak kasar (crude enzim lipase). Enzim lipase
49
ekstrak kasar dimurnikan lebih lanjut dengan metode Fraksinasi menggunakan
amonium sulfat.
2. Fraksinasi Menggunakan Amonium Sulfat
Fraksinasi dengan ammonium sulfat dilakukan berdasarkan interaksi
ionik antara molekul protein dengan molekul air dan garam ammonium sulfat,
serta banyaknya gugus yang bermuatan pada molekul protein seperti R–NH3+
dan R–COO-. Garam ammonium sulfat digunakan karena memiliki kelebihan
yaitu (1) kekuatan ionik sangat tinggi dan (2) tidak menimbulkan perubahan
konformasi struktur enzim (Su’i dan Suprihana, 2013). Penambahan garam
ammonium sulfat di dalam larutan menyebabkan terjadinya interaksi secara
ionik antara garam ammonium sulfat dengan gugus R–NH3+ dan R–COO- pada
molekul protein sehingga protein melarut dengan sempurna di dalam larutan
garam (salting-in) dan menimbulkan gaya tolak-menolak antar-molekul protein
dengan muatan yang sama. Penambahan garam ammonium sulfat secara
terus-menerus menyebabkan interaksi ionik antara molekul protein dengan
molekul air menjadi semakin melemah. Dengan demikian, protein secara
perlahan terpisah dan mengendap (salting out). Pemurnian menggunakan
metode fraksinasi dilakukan pada konsentrasi 10-100%; dilanjutkan dengan
proses penentuan kadar protein dan aktivitas lipase. Hasil fraksinasi enzim
menggunakan amonium sulfat dapat dilihat pada Gambar 16 dan rincian data
dapat dilihat pada Lampiran 2.1.
50
Gambar 16. Data hasil fraksinasi enzim lipase dedak padi (Oryza Sativa L.) dengan menggunakan amonium sulfat
Berdasarkan data penelitian, enzim lipase yang dominan terdapat pada
konsentrasi amonium sulfat 60% (fraksi 40-60) sebanyak 10 mL dengan kadar
protein enzim sebesar 7,993 mg/mL dan aktivitas lipase sebesar 0,125 U/mL
pada kondisi optimum enzim kasar. Fraksinasi lebih lanjut enzim lipase ekstrak
kasar menghasilkan 68 mL larutan enzim dengan kadar protein enzim sebesar
1,193 mg/mL. Larutan enzim ini selayaknya dimurnikan dengan metode dialisis
menggunakan membran selofan. Uji aktifitas enzim lipase pada fraksinasi
tahap kedua dilakukan setelah diperoleh kondisi optimal reaksi enzim lipase
hasil dialisis.
3. Dialisis Menggunakan Membran Selofan
Enzim fraksi amonium sulfat 60% didialisis menggunakan membran
selofan yang merupakan membran semipermeabel. Dialisis didasari oleh
proses difusi antara ion-ion Na+, H+, HPO4- dan PO4
2- yang terkandung di
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
9.38.7
6.67.7
6.4
12.5
8.7 8.2 8.7 8.5
3.195 3.1011.926 1.807
6.09
7.94 7.9937.383
8.575
5.85
Aktivitas Lipase (µU/mL) Kadar Protein (mg/mL)
Fraksi (NH4)2SO
4 (0-100 %)
51
dalam buffer fosfat dengan molekul kecil yang terdapat dalam larutan enzim
lipase seperti sisa garam amonium sulfat, glukosa, dan mineral. Pada proses
dialisis, molekul kecil yang terikat pada enzim lipase akan keluar secara
perlahan melewati membran dan melarut di dalam buffer (Telussa, 2013).
Penggantian buffer setiap 3 jam dilakukan agar molekul yang telah terlepas
dari protein tidak berikatan kembali dengan molekul protein sehingga jumlah
molekul kecil yang terdapat di dalam larutan enzim lipase semakin berkurang.
Pada waktu total 24 jam, proses dialisis telah mencapai kondisi kesetimbangan
dimana seluruh molekul kecil yang terdapat di dalam larutan enzim lipase telah
tergantikan oleh ion-ion yang ada di dalam larutan buffer. Selanjutnya
dilakukan kembali karakterisasi enzim lipase dan penentuan kadar protein.
Berdasarkan data penelitian, diperoleh kadar protein sebesar 0,908
mg/mL dan aktivitas lipase sebesar 0,050 U/mL pada kondisi optimal reaksi
yaitu konsentrasi substrat 40%, konsentrasi enzim 40%, suhu 450C, waktu
reaksi 15 menit, dan pH 6,5 sedangkan enzim lipase hasil dialisis yang
ditambahkan dengan buffer fosfat pH 6,5 pada perbandingan 1:1 (v/v)
mempunyai kadar protein sebesar 0,274 mg/mL dan aktivitas lipase sebesar
0,077 U/mL pada kondisi reaksi yang sama. Enzim hasil dialisis dimurnikan
dengan metode kromatografi kolom penukar ion menggunakan matriks Q-
Sepharosa Fast Flow (FF).
4. Kromatografi kolom penukar ion
52
Kromatografi kolom penukar ion merupakan metode pemisahan protein
enzim berdasarkan muatan ionnya. Matriks Q-sepharosa Fast Flow
merupakan senyawa polietilen-agarosa yang memiliki gugus fungsional R-
O(CH2CHOHCH2)2N+(CH3)3 (Amersham Biosciences, 1996). Oleh karena itu,
diperlukan eluen yang mengandung ion negatif seperti buffer tris-HCl pH 6,5
untuk mengaktivasi matriks tersebut dengan tetap mempertahankan kondisi
optimal enzim (Sigma-Aldich, 2012). Aktivasi matriks dilakukan agar matriks
menjadi R-O(CH2CHOHCH2)2N+(CH3)3Cl- sehingga dapat terjadi pertukaran
ion Cl- dengan protein bermuatan negatif. Pada saat proses elusi, protein
bermuatan positif akan lebih dahulu keluar dari matriks akibat adanya gaya
tolak-menolak antara muatan positif molekul protein dengan matriks,
sedangkan protein bermuatan negatif akan berinteraksi secara ionik dan
secara perlahan keluar dari matriks (Noor dkk., 2005). Aktivitas enzim lipase
ditentukan berdasarkan kondisi optimum enzim hasil dialisis, sedangkan
penentuan kadar protein dilakukan menggunakan sperktrofotometer UV-Vis
pada λ = 280 nm. Kromatogram hasil pemurnian enzim lipase dapat dilihat
pada Gambar 17 dan rincian data dapat dilihat pada Lampiran 4.3.
53
Gambar 17. Kromatogram hasil pemurnian enzim lipase dari dedak padi (Oryza Sativa L.) menggunakan matriks Q-Sepharosa FF, laju alir elusi 0,7 mL/menit pada suhu ruang.
Berdasarkan data penelitian, pemisahan menggunakan matriks Q-
sepharosa FF menghasilkan 8 fraksi dengan aktivitas enzim lipase masing-
fraksi 33 = 0,109 U/mL, dan fraksi 34 = 0,109 U/mL. Akan tetapi, enzim lipase
dengan aktivitas tertinggi terdapat pada fraksi 27 dengan aktivitas lipase
sebesar 0,111 U/mL dan kadar protein sebesar 1,088 mg/mL. Enzim lipase
fraksi 27 dimurnikan lebih lanjut menggunakan kromatografi kolom filtrasi gel.
5. Kromatografi kolom filtrasi Gel
Kromatografi kolom filtrasi gel menggunakan matriks sephadex G-75
merupakan pemisahan protein berdasarkan ukuran molekulnya. Matriks
sephadex G-75 dibentuk dari ikatan silang senyawa dextran dan membentuk
struktur tiga dimensi. Hal ini menyebabkan terbentuknya pori-pori di dalam gel
Fraksi Q-Sepharosa Fast Flow/3mL
Ak
tivit
as
Lip
ase
(U
/mL
)
Kad
ar
Pro
tein
(m
g/m
L)
54
(Sigma-aldrich, 2017). Pada metode ini dilakukan aktivasi matriks
menggunakan eluen buffer fosfat 0,1 M pH 6,5 dengan tujuan untuk
memperlebar pori-pori gel sebagai akibat dari adanya ikatan hidogen antara
eluen dengan matriks (Vakhlu dan Kour, 2006; Mladenoska, 2014). Pada saat
proses elusi, protein berukuran molekul besar tidak dapat masuk ke dalam
pori-pori gel sehingga akan lebih dulu keluar dari kolom; sedangkan protein
berukuran molekul kecil akan masuk ke dalam pori-pori gel dan secara
perlahan keluar dari matriks. Aktivitas enzim lipase ditentukan berdasarkan
kondisi optimum enzim hasil dialisis, sedangkan penentuan kadar protein
dilakukan menggunakan sperktrofotometer UV-Vis (λ = 280 nm). Hasil
kromatogram pemurnian enzim lipase dapat dilihat pada Gambar 18 dan
rincian data dapat dilihat pada Lampiran 5.3.
Gambar 18. Kromatogram hasil pemurnian enzim lipase dari dedak padi (Oryza Sativa L.) menggunakan matriks Sephadex G-75, laju alir elusi 0,7 mL/menit pada suhu ruang.
Keterangan: Kemurnian enzim lipase dibandingkan ekstrak kasar (X) = Kali lipat
56
Berdasarkan data yang diperoleh, maka disimpulkan bahwa enzim
lipase telah diisolasi dari dedak padi dapat dimurnikan hingga tingkat
kemurnian 23,58 kali lebih murni jika dibandingkan dengan enzim ekstrak
kasar dan mempunyai aktivitas spesifik sebesar 0,283 U/mg Protein.
B. Karakterisasi Enzim Lipase
1. Penentuan konsentrasi enzim maksimum
Penentuan konsentrasi enzim dilakukan untuk mengetahui persentase
maksimum enzim yang dapat bereaksi dengan substrat minyak zaitun. Di
dalam penelitian ini, konsentrasi substrat dibuat tetap, sedangkan konsentrasi
enzim dibuat pada rentang 10-50% (v/v). Hasil penelitian dapat dilihat pada
Gambar 19 dan rincian data dapat dilihat di dalam Lampiran 1.2a dan 7.2a.
Gambar 19. Pengaruh konsentrasi enzim terhadap aktivitas enzim lipase pada volume substrat 0,75 mL, waktu reaksi 30 menit, suhu 30oC, dan pH 7,5.
Berdasarkan hasil penelitian maka diketahui bahwa aktivitas lipase
meningkat pada konsentrasi enzim 10-30% akibat meningkatnya kecepatan
Ak
tivit
as
Rel
ati
f (%
)
Konsentrasi enzim (%)
57
reaksi dan mencapai aktivitas maksimum pada konsentrasi 40% dengan
aktivitas lipase masing-masing sebesar 0,049 U/mL pada enzim kasar dan
0,016 U/mL pada enzim hasil dialisis. Pada konsentrasi 40%, seluruh molekul
substrat yang terkandung di dalam minyak zaitun telah bereaksi dengan enzim
sehingga penambahan konsentrasi enzim menjadi 50% tidak dapat lagi
meningkatkan aktivitas enzim lipase (Murni dkk., 2011).
2. Penentuan suhu optimum
Penentuan suhu optimum enzim dilakukan untuk mengetahui suhu
optimal enzim dalam bekerja sebagai biokatalis. Di dalam penelitian ini, suhu
divariasikan pada rentang 30-70oC. Hasil penelitian dapat dilihat pada Gambar
20 dan rincian data dapat dilihat di dalam Lampiran 1.2b dan 7.2b.
Gambar 20. Pengaruh suhu terhadap aktivitas enzim pada volume substrat 0,75 mL, waktu reaksi 30 menit, [Enzim] 40%, dan pH 7,5
Berdasarkan hasil penelitian maka diketahui bahwa peningkatan suhu
mengakibatkan aktivitas lipase sampai pada suhu optimum. Hal ini disebabkan
Ak
tivit
as
Rel
ati
f (%
)
Suhu (0C)
58
adanya peningkatan energi kinetika yang memudahkan proses tumbukan
antara enzim dengan substrat, dan pemutusan ikatan fisik pada bagian enzim
tertentu sehingga terjadi perubahan konformasi struktur yang mengakibatkan
berkurangnya efek sterik pada sisi aktif enzim. Dengan demikian, substrat akan
mudah untuk masuk dan berikatan dengan sisi aktif enzim. Jika melewati suhu
optimum, enzim secara perlahan mengalami denaturasi yang diawali dengan
pembentukkan parsial struktur sekunder, tersier, dan kuartener molekul enzim
sebagai akibat dari pemutusan ikatan fisik maupun kimia pada molekul enzim.
Hal ini ditandai dengan menurunnya aktivitas lipase (Shariff dkk., 2011). Enzim
lipase hasil dialisis bekerja secara optimal pada suhu 45oC dengan aktivitas
lipase sebesar 0,019 U/mL, sedangkan enzim lipase kasar bekerja secara
optimal pada suhu 50oC dengan aktivitas lipase sebesar 0,069 U/mL.
Perbedaan ini disebabkan oleh adanya senyawa nonprotein yang terlepas dari
molekul enzim setelah proses dialisis sehingga terjadi perubahan ikatan fisik
yang dapat mempengaruhi kestabilan konfirmasi enzim.
3. Penentuan waktu reaksi optimum
Penentuan waktu optimum reaksi enzim lipase merujuk pada kerja
maksimum enzim lipase dalam selang waktu tertentu (Lestari, 2012). Dengan
menentukan waktu optimum reaksi, aktivitas enzim lipase dapat ditentukan
secara tepat. Di dalam penelitian ini, waktu reaksi divariasikan pada selang
59
waktu 5-30 menit. Hasil penelitian dapat dilihat pada Gambar 21 dan rincian
data dapat dilihat pada Lampiran 1.2c dan 7.2c.
Gambar 21. Pengaruh waktu terhadap aktivitas enzim lipase pada volume substrat 0,75 mL, [Enzim] 40%, suhu 45oC pada enzim hasil dialisis, dan suhu 50oC pada enzim kasar, serta pH 7,5
Berdasarkan hasil penelitian maka diketahui bahwa aktivitas lipase
meningkat secara perlahan dalam selang waktu waktu 5-10 menit, dan
mencapai titik optimal pada waktu reaksi 15 menit dengan aktivitas lipase
masing-masing 0,133 U/mL pada enzim kasar dan 0,035 U/mL pada enzim
hasil dialisis. Peningkatan aktivitas lipase secara perlahan menunjukkan enzim
lipase membutuhkan waktu tertentu untuk membentuk emulsi, mengikat
substrat, dan mengkatalisis substrat (Shi, 2010). Pada selang waktu 20-30
menit terjadi penurunan aktivitas lipase secara perlahan. Hal ini disebabkan
oleh kondisi lingkungan yang menjadi semakin asam atau semakin basa akibat
proses reaksi sehingga terjadi pembentukan atau pemutusan ikatan fisik atau
ionik pada gugus-gugus fungsi asam amino tertentu yang dapat
mempengaruhi kestabilan konfirmasi struktur enzim (Park dan Cho, 2012).
40
50
60
70
80
90
100
5 10 15 20 25 30
Enzim kasar Enzim Hasil Dialisis
Waktu reaksi (menit)
Ak
tivit
as
Rel
ati
f (%
)
60
4. Penentuan pH optimum
Penentuan pH optimum dilakukan untuk mengetahui pH optimal enzim
sebagai biokatalis. Di dalam penelitian ini, buffer yang digunakan adalah buffer
fosfat dan pH divariasikan pada rentang 5,5-8,0. Hasil penelitian dapat dilihat
pada Gambar 22 dan rincian data dapat dilihat di dalam Lampiran 1.2d dan
7.2d.
Gambar 22. Pengaruh pH terhadap aktivitas enzim lipase pada volume substrat 0,75 mL, waktu reaksi 15 menit, [Enzim] 40%, serta suhu 45oC pada enzim hasil dialisis, dan suhu 50oC pada enzim kasar
Berdasarkan hasil penelitian maka diketahui bahwa enzim lipase
bekerja secara optimal pada pH 6,5 dengan aktivitas lipase sebesar 0,045
U/mL pada enzim hasil dialisis dan 0,162 U/mL pada enzim kasar. Hal ini
menunjukkan bahwa perubahan pH berpengaruh pada perubahan konformasi
struktur enzim di dalam larutan akibat pembentukkan atau pemutusan interaksi
ionik terutama pada bagian enzim yang mengandung ion R–NH3+ dan R –COO-
(Kajanavas dkk., 2010).
pH Larutan Buffer
Ak
tivit
as
Rel
ati
f (%
)
61
5. Penentuan konsentrasi substrat maksimum
Penentuan konsentrasi substrat maksimum dilakukan dengan tujuan
untuk mengetahui persentase maksimum substrat yang dapat bereaksi
dengan enzim. Di dalam penelitian ini, konsentrasi enzim dibuat tetap,
sedangkan konsentrasi substrat divariasikan pada rentang 10-50% (v/v). Hasil
penelitian dapat dilihat pada Gambar 23 dan rincian data dapat dilihat di dalam
Lampiran 1.2e dan 7.2e.
Gambar 23. Pengaruh konsentrasi substrat terhadap aktivitas enzim lipase pada waktu reaksi 15 menit, [Enzim] 40%, suhu 45oC pada enzim hasil dialisis, dan suhu 50oC pada enzim kasar, serta pH 6,5
Berdasarkan hasil penelitian maka diketahui bahwa aktivitas lipase
meningkat secara perlahan pada konsentrasi substrat 10-30%, dan mencapai
titik maksimum pada konsentrasi substrat 40% dengan aktivitas masing-
masing sebesar 0,050 U/mL pada enzim hasil dialisis dan 0,172 U/mL pada
enzim kasar. Peningkatan aktivitas lipase disebabkan oleh terjadinya
peningkatan kecepatan reaksi enzim. Akan tetapi pada titik maksimum, semua
Konsentrasi Substrat (%)
Ak
tivit
as
Rel
ati
f (%
)
62
sisi aktif enzim telah berikatan dengan substrat dan membentuk kompleks
enzim-substrat sehingga penambahan konsentrasi substrat menjadi 50% tidak
dapat meningkatkan aktivitas lipase lagi (Crooks dkk., 1995).
6. Uji pengaruh ion logam sebagai kofaktor
Uji pengaruh ion logam sebagai kofaktor dilakukan dengan tujuan untuk
mengetahui jenis-jenis ion logam yang dapat digunakan untuk meningkatkan
aktivitas lipase. Ion logam akan mengikat residu asam amino pada sisi regulasi
enzim dan menyebabkan terjadinya perubahan konformasi struktur.
Perubahan ini dapat menurunkan atau meningkatkan jumlah molekul substrat
yang dapat berikatan dengan sisi aktif enzim untuk membentuk kompleks
enzim-substrat (Sekhar, 2012). Ion logam dapat dikatakan sebagai kofaktor
apabila di dalam pengujiannya, aktivitas enzim lipase meningkat dari aktivitas
lipase tanpa penambahan ion logam (nilai aktivitas relatif >100%). Ion logam
pula dapat dikatakan sebagai inhibitor apabila di dalam pengujiannya, aktivitas
lipase mengalami penurunan dari aktivitas lipase tanpa penambahan ion logam
(nilai aktivitas relatif <100%). Di dalam penelitian ini, divariasikan beberapa ion
logam bivalen yaitu Fe2+, Ba2+, Ca2+, Mg2+, Co2+ dengan konsentrasi 10 mM,
dan enzim tanpa penambahan ion logam sebagai kontrol. Hasil penelitian
dapat dilihat pada tabel Gambar 24 dan rincian data dapat dilihat di dalam
Lampiran 1.2f dan 7.2f.
63
Gambar 24. Pengaruh ion logam terhadap aktivitas enzim lipase pada waktu reaksi 15 menit, [Enzim] 40%, [Substrat] 40%, suhu 45oC pada enzim hasil dialisis, dan suhu 50oC pada enzim kasar, serta pH 6,5
Berdasarkan hasil penelitian maka diketahui bahwa ion logam Co2+
merupakan kofaktor enzim lipase hasil dialisis dengan meningkatkan aktivitas
lipase sebesar 54%; sedangkan ion logam Fe2+, Ba2+, Ca2+, dan Mg2+
merupakan inhibitor dengan menurunkan aktifitas lipase masing-masing
sebesar 42%, 26%, 30%, dan 26%. Pada enzim kasar, ion logam Ca2+ dan
Co2+ merupakan kofaktor dengan meningkatkan aktivitas lipase masing-
masing sebesar 22,09% dan 29,65%; sedangkan ion logam Fe2+, Ba2+, dan
Mg2+ merupakan inhibitor dengan menurunkan aktivitas lipase masing-masing-
masing sebesar 40,12%, 19,77%, dan 43,02%.
7. Penentuan konstanta kinetika KM dan vmaks
Penentuan konstranta kinetika KM dan vmaks dilakukan untuk
menentukan kinerja optimal enzim lipase sebagai biokatalis berdasarkan
100
59.88
80.23
122.09
56.98
129.65
100
5874 70 74
154A
kti
vit
as
Rel
ati
f (%
)
Ion Logam 10 mM
64
pengaruh konsentrasi substrat minyak zaitun terhadap aktivitas enzim lipase
menggunakan persamaan Michaelis-Menten 1/v =KM/vmaks(1/[S]) +1/vmaks
dimana KM dan vmaks merupakan konstanta. Persamaan Michaelis-Menten ini
dikembangkan ke dalam metode persamaan garis lurus (regresi) y = ax+b;
dimana y = 1/V, x = 1/[S], a = 1/vmaks, dan b = KM/vmaks. Metode ini dikenal
dengan metode Lineweaver-Burk. Penentuan konstanta kinetika KM dan vmaks
enzim lipase melalui metode Lineweaver-Burk dapat dilihat pada Gambar 25
dan rincian data dapat dilihat pada Lampiran 7.2g.
Gambar 25. Kurva Lineweaver-Burk reaksi katalitik enzim lipase dari dedak padi (Oryza Sativa L.)
Berdasarkan metode Lineweaver-Burk maka diperoleh nilai KM 40,86%
(v/v). Nilai KM merupakan konstanta yang menyatakan besarnya konsentrasi
substrat pada saat kecepatan reaksi mencapai setengah kali kecepatan
maksimum (KM = ½ vmaks). Hal ini menunjukkan bahwa pada konsentrasi
substrat minyak zaitun yang diperlukan untuk mencapai ½ vmaks adalah 40,86%
Senyawa yang terdapat pada peak 9 teridentifikasi sebagai metil ester
9-oktadekenoat. Adanya senyawa ini ditandai dengan munculnya peak m/z=
74 yang merupakan hasil fragmentasi melalui mekanisme McLafferty dengan
melepaskan senyawa C16H30 dan peak m/z= 264 yang merupakan hasil
pelepasan senyawa CH3OH. Spektrum massa dan mekanisme pola
fragmentasi dapat dilihat pada Gambar 33.
76
Gambar 33. Spektrum massa dan mekanisme pola fragmentasi metil ester 9-oktadekenoat
Senyawa yang terdapat pada peak 10 teridentifikasi sebagai metil ester
oktadekanoat. Adanya senyawa ini ditandai dengan munculnya peak m/z=74
yang merupakan hasil fragmentasi melalui mekanisme McLafferty dengan
melepaskan senyawa C16H32 dan peak m/z= 255 yang merupakan hasil
pelepasan senyawa C3H7. Spektrum massa dan mekanisme pola fragmentasi
dapat dilihat pada Gambar 34.
77
Gambar 34. Spektrum massa dan mekanisme pola fragmentasi metil ester oktadekanoat
Senyawa yang terdapat pada peak 12 teridentifikasi sebagai asam 9-
oktadekenoat. Adanya senyawa ini ditandai dengan munculnya peak m/z= 60
yang merupakan hasil fragmentasi melalui mekanisme McLafferty dengan
melepaskan senyawa C16H30 dan peak m/z= 264 yang merupakan hasil
pelepasan senyawa H2O. Spektrum massa dan mekanisme pola fragmentasi
dapat dilihat pada Gambar 35.
78
Gambar 35. Spektrum massa dan mekanisme pola fragmentasi asam 9-oktadekenoat
Senyawa yang terdapat pada peak 13 teridentifikasi sebagai asam
oktadekanoat. Adanya senyawa ini ditandai dengan munculnya peak m/z= 60
yang merupakan hasil fragmentasi melalui mekanisme McLafferty dengan
melepaskan senyawa C16H32 dan peak m/z= 241 yang merupakan hasil
79
pelepasan senyawa C3H7. Spektrum massa dan mekanisme pola fragmentasi
dapat dilihat pada Gambar 36.
Gambar 36. Spektrum massa dan mekanisme pola fragmentasi asam oktadakenoat
Senyawa yang terdapat pada peak 15 teridentifikasi sebagai metil ester
dokosanoat. Adanya senyawa ini ditandai dengan munculnya peak m/z= 74
yang merupakan hasil fragmentasi melalui mekanisme McLafferty dengan
melepaskan C18H36 dan m/z= 283 yang merupakan hasil pelepasan senyawa
C3H7. Spektrum massa dan mekanisme pola fragmentasi dapat dilihat pada
Gambar 37.
80
Gambar 37. Spektrum massa dan mekanisme pola fragmentasi metil ester dokosanoat
Berdasarkan data tersebut, dapat diketahui bahwa munculnya asam
lemak di dalam sampel ditandai dengan munculnya peak m/z=60 dan metil
ester ditandai dengan munculnya peak m/z=74 dimana masing-masing peak
merupakan hasil fragmentasi melalui mekanisme McLafferty; sedangkan
perbedaan antara satu asam lemak dengan asam lemak lainnya ditandai
dengan munculnya peak dengan nilai deret ion m/z yang menunjukkan hasil
pelepasan senyawa H2O, CH3OH, dan C3H7.
Senyawa yang terdapat pada peak 17 teridentifikasi sebagai 3-
hidroksipropil ester, 1-9-oktadekenoat. Adanya senyawa ini ditandai dengan
81
munculnya peak m/z= 118 yang merupakan mekanisme fragmentasi
McLafferty dengan melepaskan senyawa C6H30, m/z= 75 yang merupakan
hasil pelepasan senyawa C18H33O, dan m/z= 264 yang merupakan hasil
pelepasan senyawa C3H8O2. Spektrum massa dan mekanisme pola
fragmentasi dapat dilihat pada Gambar 38.
Gambar 38. Spektrum massa dan mekanisme pola fragmentasi 3-hidroksipropil ester 1-9-oktadekenoat
Senyawa yang terdapat pada peak 19 teridentifikasi sebagai 2-
hidroksipropil ester, 1-dodekanoat, 3-heksaanoat. Adanya senyawa ini ditandai
82
dengan munculnya peak m/z= 173 yang merupakan hasil pelepasan senyawa
C12H24O2 yang dilanjutkan dengan fragmentasi hingga mencapai m/z= 99 yang
merupakan hasil pelepasan senyawa C3H6O2 dan m/z=183 yang merupakan
hasil pelepasan senyawa C8H15O4. Spektrum massa dan mekanisme pola
fragmentasi dapat dilihat pada Gambar 39.
Gambar 39. Spektrum massa dan mekanisme pola fragmentasi 2-hidroksipropil ester 1-dodekanoat, 3-heksanoat
Senyawa yang terdapat pada peak 20 teridentifikasi sebagai tetril ester
dokosanoat. Adanya senyawa ini ditandai dengan munculnya peak m/z= 116
yang merupakan mekanisme fragmentasi McLafferty dengan melepaskan
senyawa C18H36 dan m/z= 295 yang merupakan hasil pelepasan senyawa
C4H9O. Spektrum massa dan mekanisme pola fragmentasi dapat dilihat pada
Gambar 40.
83
Gambar 40. Spektrum massa dan mekanisme pola fragmentasi tetril ester dokosanoat
Senyawa yang terdapat pada peak 21 teridentifikasi sebagai 1-
hidroksipropil ester, 2-dodekanoat, 3-oktanoat. Adanya senyawa ini ditandai
dengan munculnya peak m/z= 201 yang merupakan hasil pelepasan senyawa
C12H22O2, m/z= 183 yang merupakan hasil pelepasan senyawa C11H21O4, dan
m/z= 127 yang merupakan pelepasan senyawa C15H28O4. Spektrum massa
dan mekanisme pola fragmentasi dapat dilihat pada Gambar 41.
84
Gambar 41. Spektrum massa dan mekanisme pola fragmentasi 1-
hidroksipropil ester 2-dodekanoat, 3-oktanoat
Senyawa yang terdapat pada peak 22 teridentifikasi sebagai 2-
hidroksipropil ester, 1-dodekanoat, 3-oktanoat. Adanya senyawa ini ditandai
dengan munculnya peak m/z= 201 yang merupakan hasil pelepasan senyawa
C12H23O2 dilanjutkan dengan pelepasan CH2 hingga memunculkan peak m/z=
187, m/z= 183 yang merupakan hasil pelepasan senyawa C11H21O4, dan m/z=
127 yang merupakan pelepasan senyawa C15H28O4. Spektrum massa dan
mekanisme pola fragmentasi dapat dilihat pada Gambar 42.
85
Gambar 42. Spektrum massa dan mekanisme pola fragmentasi 2-hidroksipropil ester 1-dodekanoat, 3-oktanoat
Berdasarkan data tersebut diketahui bahwa adanya ester asam lemak
ditandai dengan munculnya peak m/z yang menunjukkan mekanisme
fragmentasi McLafferty dan nilai deret ion m/z tertentu sebagai akibat dari
pelepasan senyawa RCO, RO, dan ROH. Berdasarkan data itu pula, adanya
senyawa diasilgliserol ditandai dengan munculnya peak m/z yang
menunjukkan adanya senyawa RCO sebagai cirikhas dari suatu asam lemak.
Posisi 1,3-diasilgliserol ditandai dengan munculnya peak m/z yang
menujukkan adanya pelepasan senyawa RCOO dilanjutkan dengan pelepasan
86
senyawa CH2, sedangkan posisi 1,2-diasilgliserol atau 2,3-diasilgliserol
ditandai dengan pelepasan senyawa RCOO. Dengan demikian, diketahui
bahwa enzim lipase dedak padi (Oryza Sativa L.) memiliki kespesifikan
katalitik; yaitu (1) spesifik mengkatalisis asam lemak rantai panjang (C18-20), (2)
spesifik mengkatalisis reaksi trans-esterifikasi pada substrat triasilgliserol
menjadi diasilgliserol dan metil ester asam lemak, (3) tidak mampu
mengkatalisis reaksi esterifikasi umumnya dan khususnya pada asam lemak
rantai panjang (C18-20), dan (4) tidak mampu mengkatalisis reaksi trans-
esterifikasi pada ester non-gliserol khususnya pada asam lemak rantai panjang
(C18-20). Kespesifikan enzim lipase tersebut dapat dilihat pada Gambar 43.
Gambar 43. Kespesifikan reaksi katalitik enzim lipase dedak padi (Oryza Sativa L.)
87
Mekanisme katalitik enzim lipase dedak padi (Oryza Sativa L.) dalam
mengkatalisis substrat triasilgliserol menjadi diasilgliserol dan metil ester asam
lemak dapat dilihat pada Gambar 44.
Gambar 44. Mekanisme katalitik enzim lipase dedak padi (Oryza Sativa L.) terhadap substrat triasilgliserol menjadi diasilgliserol dan metil ester asam lemak
(Shi, 2010)
88
Sedangkan model proses katalitik enzim lipase terimobilisasi karbon
aktif terhadap reaksi trans-esterifikasi dapat dilihat pada Gambar 45.
Gambar 45. Model katalitik enzim lipase terimobilisasi karbon aktif terhadap substrat minyak kelapa murni untuk menghasilkan metil ester asam lemak dan diasilgliserol
(Riadi, 2017; Wolfinbarger, 2017)
Berdasarkan data hasil analisis menggunakan instrumen FTIR dan GC-
MS maka dapat diketahui bahwa enzim lipase dedak padi (Oryza Sativa L.)
merupakan enzim yang termasuk dalam golongan lipase yang spesifik
terhadap kelompok asam lemak rantai panjang (C18-20) dan spesifik terhadap
kelompok lemak triasilgliserol sehingga enzim hanya mampu mengkatalisis
substrat minyak kelapa murni, enzim lipase ini hanya mampu melakukan reaksi
trans-esterifikasi dan tidak berpotensi untuk mengkatalisis reaksi amidasi.
89
BAB V
PENUTUP
A. Kesimpulan
Berdasarkan hasil penelitian yang telah dilakukan, dapat tarik
beberapa kesimpulan sebagai berikut:
1. Enzim lipase dedak padi (Oryza sativa L.) yang telah diisolasi
mempunyai tingkat kemurnian sebesar 23,58 kali lebih murni dari
ekstrak kasar; dan mempunyai aktivitas spesifik sebesar 0,283 U/mg
protein.
2. Enzim lipase dedak padi (Orysa Sativa L.) yang telah diisolasi dan
dimurnikan mempunyai karakteristik, yaitu dapat mengkatalisis reaksi
hidrolisis secara optimal pada suhu 45oC, waktu reaksi 15 menit, pH
6,5; konsentrasi enzim 40%, dan konsentrasi substrat 40%, serta
mempunyai kovaktor ion logam Co2+ dengan peningkatan aktivitas
sebesar 154%.
3. Enzim lipase dedak padi (Orysa Sativa L.) yang telah diimobilisasi
mengkatalisis secara optimal pada suhu 50oC dan pH 6,5.
4. Enzim imobil mempunyai kestabilan terhadap pengaruh lingkungan
pada waktu pemaparan 15-105 menit dengan aktivitas relatif sebesar
47,5%, serta dapat digunakan sebanyak 6 kali dengan aktivitas relatif
sebesar 52,5%.
90
5. Enzim lipase dedak padi (Orysa Sativa L.) yang telah diisolasi,
dimurnikan, dikarakterisasi, dan diimobilisasi merupakan enzim yang
spesifik mengkatalisis substrat asam lemak rantai panjang (C18-20) dan
spesifik mengkatalisis triasilgliserol menjadi diasilgliserol. Enzim ini
tidak berpotensi untuk mengkatalisis reaksi amidasi.
B. Saran
Berdasarkan hasil penelitian dan untuk pengembangan penelitian ini,
disarankan beberapa hal yaitu:
1. Melakukan penentuan berat molekul dan komposisi asam amino pada
enzim lipase dedak padi (Oryza Sativa L.) yang telah diisolasi dan
dimurnikan.
2. Melakukan pemurnian diasilgliserol yang terbentuk untuk dijadikan
sebagai senyawa emulsifier di dalam industri pangan fungsional dan
industri kosmetik.
3. Mengaplikasikan enzim tersebut di dalam mengkatalisis substrat yang
mengandung asam lemak rantai panjang (C18-20) seperti, minyak zaitun,
dan minyak dedak untuk dijadikan produk yang dapat dimanfaatkan
baik di dalam industri pangan maupun non-pangan.
91
DAFTAR PUSTAKA
Altan A, 2004, Izolation and Molecular Characterization Of Extracellular Lipase and Producing Bacteria From Olive Oil Mills, Disertasi Tidak Diterbitkan, Izimir Institute Of Technologi, Izimir.
Amalia R. Nst; Bulan R; Sebayang F, 2013, Penentuan pH dan Suhu Optimum Untuk Aktivitas Ekstrak Kasar Enzim Lipase dari Kecambah Biji Karet (Hevea Braziliensis) Teehadap Hidrolisis PKO (Palm Karmel Oil), Jurnal Saintia Kimia Vol. 1. No. 2. Th 2013.
Amersham Biosciences, Q-Sepharose Fast Flow, Important User Information, S-751 82, Uspalla, Sweden, 1996.
Arvian F; Yulianto M.E; Hari S; Mulikin H; Yuariski O, 2009, Pengembangan Proses Enzimatik Untuk Produksi Biodiesel dari Minyak Biji Karet, Simposium Nasional RAPI VIII 2009, ISSN: 1412-9612.
Barros M; Fleuri L.F; Macedo G.A., Seed Lipases: Sources, Aplications, and Properties-A Review, Brazilian J. Of. Chem. Eng; Vol.27. No. 01. pp 15-29, January-March 2009.
Bintang M; Panji T; Saadah S, 2015, Imobilisasi Lipase Rhizopus oryzae pada Zeolit, CaCO3, Silika Gel, dan Tulang Sapi, Current Biochemistry, Volume 2 (2): 54 – 63, ISSN: 2355-7877.
Budianto A; Hadipermata M; Kailaku S.I, 2007, Potensi Pengembangan Dedak Padi di Indonesia, Laporan Penelitian Tidak Diterbitkan, Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Pascapanen Pertanian, Bogor.
Cahyanine M; Estiasih T; Nisa F.C., 2008, Fraksi Kaya Tokoferol Dari Bekatul Beras (Oryza sativa) Dengan Teknik Kristalisasi Pelarut Suhu Rendah, Jurnal Teknologi Pertanian Vol. 9 No. 3 (Desember 2008) 165 – 172.
Christianasari R; Widi R.K; Halim B.A; Purwanto M. G.M., 2014, Imobilisasi Enzim Lipase Pada Ca-Bentonit Serta Apilkasinya Pada Produksi Asam Lemak Omega-3 Pada Limbah Minyak Ikan, Seminar Nasional Bioteknologi 2014, Biotechnological Approaces to Blue Economy Implementation.
Crooks G. E; Rees G.D; Robinson B.H; Svensson M; Stephenson G.R, 1995, Comparison of Hydrolysis and Esterification Behavior of Humicola lanuginose and Rhizomucor Miehei Lipases in ACT-Stabilized Water-in-Oil Microemulsions:I. Effect of pH and Water Contenton Reaction Kinetics, Biotechnology and
92
Bioengineering, Vol.48, Pp. 78-88 (1995), CCC 0006-3592/95/010078-11.
Dharsono W; Oktari Y.S, 2010, Pembuatan Biodiesel Dari Dedak Padi dan Metanol Dengan Esterifikasi In Situ, Skripsi Tidak Diterbitkan, Universitas Diponegoro, Semarang.
Dwiyuni M, 2006, Kajian Sifat Fisiko-Kimia Ekstraksi Minyak Kelapa Murni (Virgin Coconut Oil, VCO) dengan Metode Pembekuan Krim Santan, Skripsi Tidak Diterbitkan, Institut Pertanian Bogor, Bogor.
Edahwati L., Aplikasi Penggunaan Enzim Papain dan Bromelin Terhadap Perolehan VCO, UPN Press, ISBN: 978-602-8915-26-6, 2011.
Effendi Y, 2008, Kajian Resistensi Beberapa Varietan Padi Gogo (Oriza Sativa L.) Terhadap Cekaman Kekeringan, Tesis Tidak Diterbitkan, Universitas Sebelas Maret, Surakarta.
Green A.A; Hughes W. L, 1995, Protein Solubility on the Basis of Solubility in Aquoeus Solution of Salts and Organic Solvents, Methods Enzymol. 1: 67-90.
Haryadi P., High Grade Specialty Fats dari Sawit, Sky Is the Limit, Jurnal Infosawit Edisi Khusus 2009.
Hasna, 2012, Studi Esterifikasi Asam Lemak Hasil Hidrolisis Minyak Kelapa Dengan Glukosa Menggunakan Lipase Candida Rugosa EC 3.1.1.3 Terimobilisasi Pada Matriks Ca-Alginat, Skripsi Tidak Diterbitkan, Universitas Indonesia, Depok.
Hastuti P dan Utami T., Interesterifikasi Enzimatis Palm Stearin dan Minyak Ikan Lemuru Untuk Membuat Lemak Margarin, Jurnal. Teknol. dan Industri Pangan, Vol XIV, No.1 Th. 2003.
Hendra, Rahman, dan Nurhaeni, Sintesis Biosurfaktan Palmitin Etanolamida Dengan Menggunakan Biokatalis Lipase dari Getah Pepaya (Carica Papaya Latex) Imobil, Ol.J.O.Nat.Sci, Vol 2(1): 55-63, ISSN: 2338-0950, Th. 2013.
Kanjanavas P; Khuchareontaworn S; Khawsak P; Pakpitcharoen A; Pothivejkul K; Santiwatanakul S; Matsui K; Kajiwara T; Chansiri K, 2010, Purification and Characterization of Organic Solvent and Detergent Tolerant Lipase from Thermotolerant Bacillus sp. RN2, Int. J. Mol. Sci. 2010, 11, 3783-3792; doi:10.3390/ijms11103783, ISSN 1422-0067.
Khadimah N; Argo B.D; Susilo B., 2014, Konversi Minyak Nyamplung Menjadi Biodiesel Menggunakan Enzim Lipase Candida Rugosa, Proceeding Seminar Nasional, Teknologi Praktisdalam
93
Upaya Konservasi Air dan Energi, Jurusan Teknik Lingkungan, Universitas Lambung Mangkurat, ISBN 978-602-9092-64-6.
Kidwai M; Poddar R; Mothsra P, 2009, N-acylation Of Ethanolamine Using Lipase: Chemoselective Catalyst, B.J.O. Chem. 2009. 5. No. 10.
Kurnia, 2010, Produksi Enzim Lipase Dari Aspergullus Niger Untuk Menghasilkan Monoasilgliserol, Tesis Tidak Diterbitkan, Universitas Diponegoro, Semarang.
Lestari S.P; Harjono; Supartono, 2012, Sintesis Askorbil-Laurat Melalui Reaksi Esterifikasi dengan Katalis Enzim Lipase, Idn.J. Chem Sci. 1 (2) (2012).
Mappiratu dan Ijirana, Penelitian Pembuatan Metil Ester Asam Lemak Rantai Sedang Dan Rantai Panjang Serta Pemurnian Gliserol dari Minyak Kelapa Murni, Jurnal Penelitian Hasil Hutan Vol. 28 No. 4, Desember 2010: 415-426.
Masyithah Z, 2010, Optimasi Sintesis Surfaktan Alkanolamida Dari Asam Laurat Dengan Dietanolamina dan N-Metilglukosamina Secara Enzimatik, Disertasi Tidak Diterbitkan, Universitas Sumatera Utara, Medan.
Mladenoska I, 2014, Isolation and Purification of Lipases from Geotrichum
Candidum Grown on a Sunflower Oil Waste as a Carbon
Source, Chem. Eng. Transaction, VOL. 42, 2014, ISBN 978-
88-95608-33-4; ISSN 2283-9216.
Murni S.W; Kholis S.D; Tanti D.L; dan Petrissia E.M, 2011, Produksi,
Karakterisasi, dan Isolasi Lipase dari Aspergillus niger,
Pengembangan Teknologi Kimia untuk Pengolahan Sumber
Daya Alam Indonesia, Prosiding Seminar Nasional Teknik
Kimia “Kejuangan”, ISSN 1693 – 4393, Yogyakarta, 22
Using Immobilized Lipase in a Stirred Batch Reactor,
Biotechnol, Bioprocess Eng. 2002, 7: 367-370.
Nath M; Hindumathy J.W, 2012, Izolation, Optimation and Purification Of Lipase From Myroides Odoratimus, I.J.O.L.Res.I.Sci and Tech. Vol.1. Issue 3: Page No. 239-246. Sep-Oct (2012), ISSN (Online): 2278-5299.
Nawani N; Singh R; Kaur J, 2006, Immobilization and stability studies of a lipase from thermophilic Bacillus sp: The effect of process
94
parameters on immobilization of enzyme, E. J. of Biotech ISSN: 0717-3458, Vol.9 No.5, Issue of October 15, 2006.
Noor Raja Zaliha R.A; Rahman; Baharum S.N; Basri M; Salleh A.B, 2005 High-yield purification of an organic solvent-tolerant lipase from Pseudomonas sp. strain S5, Analytical Biochemistry 341 (2005) 267–274, Enzyme and Microbial Technology Research, Universiti Putra Malaysia, 43400 UPM Serdang, Selangor, Malaysia.
Prakosa A.H., 2009, Pembuatan Minyak Kelapa Murni (Virgin Coconut Oil) Menggunakan Fermentasi Ragi Tempe, Skripsi Tidak Diterbitkan, Jurusan Teknik Kimia, Fakultas Teknik, Universitas Sebelas Maret, Surakarta.
Putrawan I.D.G.A; Soerawidjaja T.H, 2007, Stabilisasi Dedak Padi Melalui Pemasakan Ekstrusif, Jurnal Teknik Kimia Indonesia Vol. 6. No. 3. Des. 2007 : 681-688.
Raharja S; Suryadarma P; dan Oktavia T., Hidrolisis Enzimatik Minyak Ikan Untuk Produksi Asam Lemak Omega-3 Menggunakan Lipase dari Aspergillus Niger, Jurnal Teknol. dan Industri Pangan, Vol XXII No.1 Th. 2011.
Riadi M., 2017, Karbon aktif, Kajian Pustaka.com (diakses pada tanggal 7 desember 2017)
Rosenblatt D.H dan Davis G. T, 1973, Laboratory Course in Organic Chemistry, Second Edition, Allyn and Bacon, Inc. Boston.
Sawtika R.A, 2010, Kombinasi Metode Sonikasi, Pemanasan dan Fraksinasi Amonium Sulfat Untuk Ekstraksi Enzim Posfolipase-A2 Dari Acanthaster Planci, Skripsi Tidak Diterbitkan, Universitas Indonesia, Depok.
Sekhar P, 2012, Microbial Lipases: Production of Extracellular Lipase
Enzyme by Alcaglines Viscous (DOGE-1) Strain, I. J. of App.
Biology and Pharmaceutical Tech; www.ijabpt.com, Volume-3,
Shi Q, 2010, Selection and Partial Characterization Of Lipases From Raw Milk Bacterial Isolates For Selective Hydrolisis Of Milk Fat, Tesis Tidak Diterbitkan, University Of Helsinki, Helsinki.
Sigma-Aldrich, Sepharose Ion exchange Media, Product Information, JJJ, GCY, MAM 08/12-1, 2012.
Sigma-Aldrich, Sephadex G-75, GE Healthcare, 17-0050-01, 2017.
ography.png, diakses 28 Mei 2008; Dikutip 20 November 2017).
Stryer, L. 1995. Biochemistry. 4 th ed., W.H. Freeman and Company, New
York. p. 45-47, 911-915.
Suharyanto, Panji-T; Perwitasari U., Optimasi Produksi Diasilgliserol dari Crude Palm Oil Menggunakan Lipase Spesifik 1-3 Gliserida dari Rhizopus Oryzae TP-2, Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan, Menara Perkebunan 2011, 79(1), 23-29.
Su’I M., Suprihana, Lipase Fractionation of Coconut Endosperm by Salting Out Method, AGRITECH, Vol. 33, No. 4, November 2013.
Susilo B., 2012, Studi Optimasi Esterifikasi Asam Lemak Hasil Hidrolisis Minyak Kelapa Dengan Glukosa Menggunakan Lipase Candida Rugosa EC 3.1.1.3 Terimobilisasi Pada Matriks Ca-Alginat, Skripsi Tidak Diterbitkan, Universitas Indonesia, Depok.
Telussa I, 2013, Isolasi Bakteri Penghasil Enzim Lipase Dari Coco Butter Subtitute dan Karakterisasi Lipasenya, Prosiding FMIPA Universitas Pattimura 2013, ISBN: 978-602-97522-0-5.
Vakhlu J; Kour A, 2006, Yeast lipases: enzyme purification, biochemical properties and gene cloning, E.J.O.Bio., ISSN: 0717-3458, Vol.9 No.1, Issue of January 15, 2006.
Wahyuningsih; Pudjiastuti I; Kusumianti H, 2011, Asidolisis Enzimatik Minyak Ikan Tuna (Thunnus Thynnus) Menjadi Produk Asam Lemak Kaya Omega-3 Dengan Pemanfaatan Lipase Getah Pepaya (Carica Papaya Latex), Hasil Penelitian TTG Hibah
Bersaing Melalui SK Dekan No 304/SK/UN7.3.3/IV/2011, DIPA Fakultas Teknik, Universitas Diponegoro, Semarang.
Wibowo D, 2009, Pembuatan Agen Pengemulsi Melalui Reaksi Esterifikasi Enzimatis Gliserol dan Asam Laurat Menggunakan Katalis Lipase Mucor Meihei Yang Diimobilisasi, Skripsi Tidak Diterbitkan, Universitas Indonesia, Depok.
Wolfinbarger L., Jr., Enzyme Regulation in Metabolic Pathways, February 2017, Wiley-Blackwell, ISBN: 978-1-119-15538-6
Yuneta R; Saputra S.R, 2010, Pengaruh Suhu Pada Lipase Dari Bakteri Bacillus Subtilis, Prosiding Kimia FMIPA, Institut Teknologi Sepuluh November, Surabaya.
98
Lampiran 1. Ekstraksi dan karakterisasi enzim Lipase ekstrak kasar
1. Skema kerja ekstraksi dan karakterisasi enzim lipase ekstrak kasar
Ditambahkan n-heksana (1 : 3, b/v)
Dikocok selama 3 menit
Didiamkan selama semalam
Disaring dengan kertas saring
Dikeringkan dalam oven (t = 450C)
Diayak dengan ayakan 60 mesh
100 g Dedak padi
Dihomogenisasi dalam blender dengan NaCl 0,9%
pH 7 (1 : 10, b/v); t = 15 menit
Disaring dengan kain saring
Didiamkan selama semalam
Filtrat
Didiamkan selama semalam
Disentrifugasi, v = 8000 rpm; T = 40C; t = 30 menit
Ditentukan kadar protein
Ditentukan aktivitas lipase
Residu
Pengotor Dedak Padi
Residu Crude Enzim Lipase
Penentuan konsentrasi enzim maksimum
Penentuan suhu optimum
Penentuan waktu optimum reaksi
Penentuan pH optimum
Penentuan konsentrasi substrat maksimum
Uji pengaruh ion logam sebagai kofaktor
Data
99
2. Data hasil karakterisasi enzim lipase ekstrak kasar
a. Penentuan konsentrasi enzim maksimum
[E] (%) A [Oleat] (mg/mL) Aktivitas (U/mL) Aktivitas Relatif (%)
10 0,021 0,203 0,024 48,97
20 0,035 0,361 0,042 85,71
30 0,039 0,406 0,048 97,96
40 0,040 0,417 0,049 100
50 0,040 0,417 0,049 100
Keterangan: pH = 7,5; T = 30 oC; t = 30 menit; VSubstrat = 0,75 mL; v = 120 rpm; fp= 1,5 kali pengenceran.
b. Penentuan suhu optimum
T (oC) A [Oleat] (mg/mL) Aktivitas (U/mL) Aktivitas Relatif (%)
30 0,021 0,203 0,024 34,78
35 0,023 0,226 0,027 39,13
40 0,032 0,327 0,038 55,07
45 0,038 0,395 0,046 66,67
50 0,055 0,586 0,069 100
55 0,046 0,485 0,057 82,61
60 0,038 0,395 0,046 66,67
65 0,032 0,327 0,038 55,07
70 0,019 0,180 0,021 30,43
Keterangan: pH = 7,5; t = 30 menit; [E] = 40 %; VSubstrat = 0,75 mL; v = 120 rpm; dan fp = 1,5
kali pengenceran
c. Penentuan waktu optimum reaksi
t (menit) A [Oleat] (mg/mL) Aktivitas (U/mL) Aktivitas Relatif (%)
5 0,015 0,135 0,095 71,43
10 0,033 0,338 0,119 89,47
15 0,053 0,564 0,133 100
20 0,054 0,575 0,101 75,93
25 0,055 0,586 0,083 62,41
30 0,055 0,586 0,069 51,88
Keterangan: pH = 7,5; T = 45 oC; v = 120 rpm; [E] = 40 %; VSubstrat = 0,75 mL; fp = 1,5 kali
pengenceran
100
d. Penentuan pH optimum
pH A [Oleat] (mg/mL) Aktivitas (U/mL) Aktivitas Relatif (%)
5,5 0,050 0,530 0,125 77,16
6,0 0,058 0,620 0,146 90,12
6,5 0,064 0,688 0,162 100
7,0 0,059 0,632 0,149 91,98
7,5 0,053 0,564 0,133 82,10
8,0 0,048 0,508 0,119 73,46
Keterangan: t = 15 menit; T = 45 oC; v = 120 rpm; [E] = 40 %; VSubstrat = 0,75 mL; fp = 1,5 kali pengenceran
e. Penentuan konsentrasi substrat maksimum [S] (%) A [Oleat] (mg/mL) Aktivitas (U/mL) Aktivitas Relatif (%)
10 0,032 0,327 0,077 44,77
20 0,050 0,530 0,125 72,67
30 0,066 0,711 0,167 97,09
40 0,068 0,733 0,172 100
50 0,068 0,733 0,172 100 Keterangan: t = 15 menit; T= 45 oC; v = 120 rpm; [E] = 40 %; VSubstrat = 0,75 mL; fp = 1,5 kali
pengenceran
f. Uji pengaruh ion logam sebagai kofaktor
Ion Logam
(10 mM) A
[Oleat]
(mg/mL)
Aktivitas
Lipase (U/mL)
Aktivitas
Relatif (%) Keterangan
Kontrol 0,068 0,733 0,172 100 -
Fe2+ 0,042 0,440 0,103 59,88 Inhibitor
Ba2+ 0,055 0,586 0,138 80,23 Inhibitor
Ca2+ 0,082 0,891 0,210 122,09 Kovaktor
Mg2+ 0,040 0,417 0,098 56,98 Inhibitor
Co2+ 0,087 0,947 0,223 129,65 Kovaktor
Keterangan: T = 45 oC; t = 15 menit; [E] = 40 %; [S] = 40%; v = 120 rpm; dan fp= 1,5 kali
pengenceran; Vol. Ion logam 100 mM = 0,175 mL; Vol. buffer fosfat pH 6,5 = 0,175 mL
101
Lampiran 2. Fraksinasi menggunakan amonium sulfat
1. Skema kerja fraksinasi menggunakan amonium sulfat
Supernatan (S3)
Supernatan (S4)
Di (+) (NH4)2SO4 kejenuhan (30 – 50%)
Didiamkan semalam dalam keadaan dingin
Disentrifugasi, t = 30 menit; v = 10000 rpm dan T = 40C
Di (+) (NH4)2SO4 kejenuhan (20 – 40%)
Didiamkan semalam dalam keadaan dingin
Disentrifugasi, t = 30 menit; v = 10000 rpm dan T = 40C
Di (+) (NH4)2SO4 kejenuhan (0 – 10%)
Didiamkan semalam dalam keadaan dingin
Disentrifugasi, t = 30 menit; v = 10000 rpm dan T = 40C
Crude enzim lipase
Supernatan (S1) Fraksi enzim (F1)
Di (+) (NH4)2SO4 kejenuhan (0 – 20%)
Didiamkan semalam dalam keadaan dingin
Disentrifugasi, t = 30 menit; v = 10000 rpm dan T = 40C
Fraksi enzim (F4)
Fraksi enzim (F3)
Supernatan (S2) Fraksi enzim (F2)
Di (+) (NH4)2SO4 kejenuhan (10 – 30%)
Didiamkan semalam dalam keadaan dingin
Disentrifugasi, t = 30 menit; v = 10000 rpm dan T = 40C
102
Supernatan (S10)
Supernatan (S6)
Fraksi enzim (F10)
Di (+) (NH4)2SO4 kejenuhan (50 – 70%)
Didiamkan semalam dalam keadaan dingin
Disentrifugasi, t = 30 menit; v = 10000 rpm dan T = 40C
Supernatan (S7)
Di (+) (NH4)2SO4 kejenuhan (60 – 80%)
Didiamkan semalam dalam keadaan dingin
Disentrifugasi, t = 30 menit; v = 10000 rpm dan T = 40C
Data Enzim Hasil Fraksinasi F1, F2, F3, F4, F5, F6, F7, F8, F9, dan F10
Supernatan (S5) Fraksi enzim (F5)
Di Larutkan dalam buffer fosfat pH 6,5
Diuji aktivitas enzim lipase
Ditentukan kadar protein enzim
Supernatan (S9)
Di (+) (NH4)2SO4 kejenuhan (80 – 100%)
Didiamkan semalam dalam keadaan dingin
Disentrifugasi, t = 30 menit; v = 10000 rpm dan T = 40C
Fraksi enzim (F9)
Supernatan (S8)
Di (+) (NH4)2SO4 kejenuhan (70 – 90%)
Didiamkan semalam dalam keadaan dingin
Disentrifugasi, t = 30 menit; v = 10000 rpm dan T = 40C
Di (+) (NH4)2SO4 kejenuhan (40 – 60%)
Didiamkan semalam dalam keadaan dingin
Disentrifugasi, t = 30 menit; v = 10000 rpm dan T = 40C
Fraksi enzim (F8)
Fraksi enzim (F6)
Fraksi enzim (F7)
103
2. Data hasil fraksinasi menggunakan amonium sulfat
Kontrol - - - 0,003 0,794 - Keterangan : fp = 1,5 Kali Pengenceran; T = 45 OC; t = 15 menit; pH = 6,5; [E] = 40%; [S] =
40%; v = 120 rpm
112
Lampiran 6. Penentuan aktivitas spesifik dan tingkat kemurnian enzim
Tahap
Pemurnian
Enzim Lipase
Vol.
Enzim
(mL)
Kadar
Protein
(mg/mL)
Total
Protein
(mg)
Aktivitas
Lipase
(U/mL)
Total
Unit
(U)
Aktivitas
Spesifik
(U/mg
Protein)
Tingkat
Kemurnian
(X)
Enzim ekstrak
kasar 905 3,195 2891,5 0,037 33,49 0,012 1,00
Hasil fraksinasi
(NH4)2SO4
fraksi 40-60
68 1,193 81,124 0,045 3,06 0,038 3,17
Hasil dialisis 43 0,908 39,044 0,050 2,15 0,055 4,58
Fraksi 27
Hasil kolom
Q-Sepharosa
FF
3 1,088 3,264 0,111 0,333 0,102 8,50
Fraksi 4
Hasil kolom
Sephadex G-75
3 0,113 0,339 0,032 0,096 0,283 23,58
Total protein dan total unit aktivitas enzim lipase dihitung dengan
menggunakan persamaan:
Aktivitas spesifik enzim dihitung dengan menggunakan persamaan:
Tingkat kemurnian enzim dihitung dengan menggunakan persamaan:
Total protein (mg) = Volume enzim (mL) x Kadar Protein (mg/mL)
Total Unit (U) = Volume enzim (mL) x Aktivitas enzim (U/mL)
Aktivitas spesifik (Umg⁄ ) =
Total Unit (U)
Total protein (mg)
Tingkat kemurnian =Aktivitas spesifik enzim murni (U/mg)
Aktivitas spesifik enzim kasar (U/mg)
113
Lampiran 7. Karakterisasi enzim lipase hasil dialisis
1. Skema karakterisasi enzim lipase hasil dialisis
Enzim lipase dari dedak padi
(Oryza Sativa L.)
[Enzim]
Maksimum
Suhu
Optimum
Waktu
Optimum
pH
Optimum
[Substrat]
Maksimum
Pengaruh
ion logam
KM dan v maks
Dikarakterisasi
114
2. Data hasil karakterisasi enzim lipase hasil dialisis
a. Penentuan konsentrasi enzim maksimum
[E] (%) A [Oleat] (mg/mL) Aktivitas (U/mL) Aktivitas Relatif (%)
10 0,010 0,079 0,009 56,25
20 0,012 0,101 0,012 80,00
30 0,014 0,124 0,015 93,75
40 0,015 0,135 0,016 100
50 0,015 0,135 0,016 100
Keterangan: pH = 7,5; T = 30 oC; t = 30 menit; VSubstrat = 0,75 mL; v = 120 rpm; fp= 1,5 kali pengenceran.
b. Penentuan suhu optimum
T (oC) A [Oleat] (mg/mL) Aktivitas (U/mL) Aktivitas Relatif (%)
30 0,012 0,101 0,012 63,16
35 0,014 0,124 0,015 78,95
40 0,015 0,135 0,016 84,21
45 0,017 0,158 0,019 100
50 0,016 0,147 0,017 84,47
55 0,014 0,124 0,015 78,95
60 0,013 0,113 0,013 68,42
65 0,012 0,101 0,012 63,16
70 0,010 0,079 0,009 56,25 Keterangan: pH = 7,5; t = 30 menit; [E] = 40 %; VSubstrat = 0,75 mL; v = 120 rpm; dan fp = 1,5
kali pengenceran
c. Penentuan waktu optimum reaksi t (menit) A [Oleat] (mg/mL) Aktivitas (U/mL) Aktivitas Relatif (%)
5 0,006 0,034 0,024 68,57
10 0,011 0,090 0,032 91,43
15 0,016 0,147 0,035 100
20 0,017 0,158 0,028 80
25 0,017 0,158 0,022 68,86
30 0,017 0,158 0,019 54,29
Keterangan: pH = 7,5; T = 45 oC; v = 120 rpm; [E] = 40 %; VSubstrat = 0,75 mL; fp = 1,5 kali
pengenceran
115
d. Penentuan pH optimum
pH A [Oleat] (mg/mL) Aktivitas (U/mL) Aktivitas Relatif (%)
5,5 0,013 0,113 0,027 68,42
6,0 0,018 0,169 0,040 88,89
6,5 0,020 0,192 0,045 100
7,0 0,019 0,180 0,042 93,33
7,5 0,017 0,158 0,037 82,22
8,0 0,015 0,135 0,032 71,11
Keterangan: t = 15 menit; T= 45 oC; v = 120 rpm; [E] = 40 %; VSubstrat = 0,75 mL; fp = 1,5 kali pengenceran
e. Penentuan konsentrasi substrat maksimum [S] (%) A [Oleat] (mg/mL) Aktivitas (U/mL) Aktivitas Relatif (%)
10 0,010 0,079 0,019 38
20 0,015 0,135 0,032 64
30 0,019 0,180 0,042 84
40 0,022 0,214 0,050 100
50 0,022 0,214 0,050 100
Keterangan: pH = 6,5; T = 45 oC; t = 15 menit; [E] = 40 %; v = 120 rpm; dan fp = 1,5 kali
pengenceran
f. Uji pengaruh ion logam sebagai kofaktor Ion Logam
(10 mM) A
[Oleat]
(mg/mL)
Aktivitas
Lipase (U/mL)
Aktivitas
Relatif (%) Keterangan
Kontrol 0,022 0,214 0,050 100 -
Fe2+ 0,014 0,124 0,029 58 Inhibitor
Ba2+ 0,017 0,158 0,037 74 Inhibitor
Ca2+ 0,016 0,147 0,035 70 Inhibitor
Mg2+ 0,017 0,158 0,037 74 Inhibitor
Co2+ 0,032 0,327 0,077 154 Kofaktor
Keterangan: T = 45 oC; t = 15 menit; [E] = 40 %; [S] = 40%; v = 120 rpm; dan fp = 1,5 kali pengenceran; Vol. Ion logam 100 mM = 0,175 mL; Vol. buffer fosfat pH 6,5 = 0,175 mL
116
g. Penentuan Konstranta kinetika KM dan Vmaks
[S]
(%)
Aktivitas (v)
(µmol/mL/menit) 1/[S] 1/v
10 0,019 0,100 52,63
20 0,036 0,050 31,25
30 0,040 0,033 23,81
40 0,042 0,025 20
50 0,042 0,020 20
Dari persamaan garis yang diperoleh melalui grafik Lineweaver-Burk, diperoleh y = 421,27x + 10,328 Dari persamaan Michaelis-Menten dinyatakan bahwa: 1/V = KM/Vmaks (1/[S]) + 1/Vmaks 1/Vmaks = 10,328 (µmol/mL/menit)-1 Vmaks = 1/10,328 (µmol/mL/menit)-1 = 0,097 µmol/mL/menit Jika KM/Vmaks = 421,27; maka KM = 421,27 x 0,097 = 40,86 % (v/v)