Potencial de la inhibición biológica de la nitrificación (IBN) en forrajes tropicales. Jonathan Nuñez Potes Universidad Nacional de Colombia Facultad de ciencias agropecuarias Palmira, Colombia 2015
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Potencial de la inhibición biológica de la nitrificación (IBN) en forrajes
tropicales.
Jonathan Nuñez Potes
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de ciencias agropecuarias
Palmira, Colombia
2015
Potencial de la inhibición biológica de la nitrificación (IBN) en forrajes
tropicales
Jonathan Nuñez Potes
Tesis o trabajo de investigación presentada(o) como requisito parcial para optar al título
de:
Magister en ciencias biológicas
Director (a):
Ph.D., Jacobo Arango
Codirector (a):
Ph.D., Juan Carlos Menjivar
Línea de Investigación:
Biotecnología vegetal
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de ciencias agropecuarias
Palmira, Colombia
2015
A Adriana Medina Cipagauta.
Gracias por estar a mi lado, por regalarme un poquito de ti, por brindarme la oportunidad
de disfrutar la vida, por brindarme tu amor, tú guía, tolerancia y apoyo. Gracias por
hacerme una mejor persona y cada día un mejor investigador. Contigo los retos se
convierten en aprendizaje y alegrías que me han permitido disfrutar mucho más de la
investigación. Esto es solo un paso más en el largo camino que estamos recorriendo
juntos… todavía nos espera lo mejor.
Agradecimientos
A Jacobo Arango, maestro y amigo por la oportunidad que me brindó de hacer
investigación, por sus continuas enseñanzas que me han permitido ser mejor persona y
mejor investigador cada día.
Al doctor Idupulapati Rao, por su guía científica y aportes académicos.
Al profesor Juan Carlos Menjivar por su guía durante el proceso de formación.
A los doctores Ngoni Chirinda y Neuza Asakawa por sus valiosos aportes y sugerencias
como revisores.
A Hannes Karwat, Danilo Moreta y Ashly Arevalo por brindarme amablemente su guía
científica y amistad durante todo este proceso.
A Lucia Chaves y María Recio por brindarme su amistad, enriquecer mi aprendizaje y
especialmente por su tolerancia durante las labores de investigación.
A Edwin Palma, Hernán Mina, Marta, Aracely Vidal y Blanca García. Ustedes son el pilar
de todos los resultados presentados en este trabajo.
Resumen y Abstract IX
Resumen
La pérdida de nitrógeno en el suelo por efecto de una alta nitrificación es un serio
problema económico y ambiental. El nitrógeno sale rápidamente del sistema provocando
la perdida de fertilizantes aplicados, emanación de gases de efecto invernadero (óxido
nitroso) y contaminación de cuerpos de agua por lixiviación de nitrato. El pasto tropical
Brachiaria humidicola exuda compuestos orgánicos que inhiben la nitrificación en el
suelo. Esta capacidad es conocida como Inhibición Biológica de la Nitrificación (IBN) y
tiene un gran potencial para ser aplicado en la recuperación de suelos, disminución de la
polución ambiental asociada con la agricultura y mejora del uso eficiente del nitrógeno de
los cultivos. En el presente estudio se estandarizaron dos metodologías para estudiar el
IBN en B.humidicola con aplicabilidad a otros cultivos. Se estimó el potencial IBN de
plantas a través de extractos de raíces usando el bioensayo, se evaluó el efecto de este
potencial en la comunidad de nitrificantes a través de la determinación de tasas de
nitrificación por incubación de suelo, y se validaron los resultados en genotipos
contrastantes para el IBN cuantificando las comunidades nitrificantes del suelo a través
de qPCR, usando el gen amoA como marcador funcional. De esta manera, usando una
población biparental de B.humidicola (CIAT16888 x CIAT26146) se identificó una alta
diversidad genética asociada con el IBN propia de un carácter cuantitativo. Además se
identificaron híbridos promisorios para iniciar programas de mejoramiento genético con
miras a explotar el IBN y se contribuyó al entendimiento de las bases biológicas que
suman evidencias para una mejor comprensión del fenómeno IBN. Por último Se
confirmó que el IBN de B.humidicola es eficiente y podría mitigar el impacto de la
contaminación por nitrógeno sobre el medio ambiente.
Palabras clave: Nitrógeno, Nitrificación, denitrificación, inhibición biológica de la
nitrificación, fenotipificación, qPCR, bioensayo.
.
X Potencial de la inhibición biológica de la nitrificación (IBN) en forrajes tropicales
Abstract
Soil nitrogen (N) loss due to rapid nitrification (oxidation of ammonium to nitrate) is a
serious problem with economic and environmental implications. As a result, a large
proportion of N fertilizers applied to crops are lost to the environment via nitrate leaching
and nitrous oxide emissions. The tropical pasture grass Brachiaria humidicola (Bh)
exudes organic molecules from roots that inhibit the soil nitrification process. This ability,
termed biological nitrification inhibition (BNI), has great potential for restoration of soil
fertility, reduction of nitrogen pollution from agriculture, and improvement of nitrogen use
efficiency. In the present study, two methodologies were standardized to quantify the
intrinsic BNI-potential of plant genotypes. The BNI potential from root extracts was
determined by a bioassay method and the effect of this potential in the soil was
determined by the quantification of nitrification rates through soil incubation. Additionally,
the results were validated by the quantification of nitrifying microorganism through qPCR,
using the amoA gene as a functional marker. The BNI potential was measured in 121
hybrid progeny of a bi-parental population constructed from a cross between Bh
germplasm accessions of CIAT 26146 x CIAT 16888, differing in BNI-potential (medium-
high and high, respectively). The capacity for BNI in mapping population was normally
distributed indicating that the trait is quantitatively inherited. Results from this study
indicated that using three different phenotyping methods it is possible to identify
promising Bh hybrids to assist the on-going Brachiaria breeding efforts. This study also
contributed towards establishing correlations among BNI capacity in roots, soil nitrification
rates and the amount of nitrifying microorganisms present in the soil.
Key words: Brachiaria, bioassay, Nitrogen, Nitrification, Biological Nitrification Inhibition
(BNI), phenotyping, qPCR
Contenido XI
Contenido
Pág.
Resumen ......................................................................................................................... IX
Lista de figuras ............................................................................................................. XIII
Lista de tablas ............................................................................................................. XVI
Lista abreviaturas ....................................................................................................... XVII
Introducción .................................................................................................................... 1
1. Marco teórico ............................................................................................................ 3 1.1 Microorganismos del suelo y nitrificación ......................................................... 3 1.2 Consecuencias de la alta nitrificación .............................................................. 4 1.3 Estrategias para inhibir las altas tasas de nitrificación ..................................... 5 1.4 Inhibición Biológica de la Nitrificación (IBN) ..................................................... 6 1.5 El forraje tropical Brachiaria humidicola y el IBN .............................................. 8 1.6 Métodos para cuantificar el IBN ....................................................................... 9
2. Materiales y métodos ............................................................................................. 11 2.1 Población de estudio ..................................................................................... 11 2.2 Obtención de compuestos IBN de B. humidicola ........................................... 12 2.3 Estandarización del bioensayo ...................................................................... 13 2.4 Estimación de las tasas de nitrificación .......................................................... 15 2.5 Cuantificación de organismos nitrificantes ..................................................... 17 2.6 Análisis estadístico ........................................................................................ 19
3. Resultados y discusión ......................................................................................... 21 3.1 Estimación del potencial IBN en diferentes genotipos de Brachiaria .............. 21
3.1.1 Estandarización del bioensayo ............................................................ 21 3.1.2 Medición del potencial IBN en plantas utilizando el bioensayo ............ 24
3.2 Estimación de las tasas de nitrificación .......................................................... 31 3.2.1 Efecto de plantas sobre las tasas de nitrificación en el suelo rizosférico38
3.3 Efecto del IBN sobre la comunidad microbiana nitrificante del suelo .............. 42 3.3.1 Cuantificación de archaeas y bacterias nitrificantes del suelo ............. 42
3.4 Fenotipificación del IBN usando una población biparental de B. humidicola .. 44
4. Conclusiones y recomendaciones ........................................................................ 55 4.1 Conclusiones ................................................................................................. 55 4.2 Recomendaciones ......................................................................................... 56
XII Potencial de la inhibición biológica de la nitrificación (IBN) en forrajes tropicales
5. Bibliografía ..............................................................................................................57
Contenido XIII
Lista de figuras
Figura 1. Detección del gen luxAB en el genoma de Nitrosomonas. A. Electroforesis en
gel de agarosa de plásmido pHLUX20 y el producto de PCR del gen luxAB Mp: marcador
de peso 100bp, 1-2-3: plásmido pHLUX20. 4: Amplicon de luxAB de 1.4kb B. Mapa del
plásmido pHLUX20 reportado por Iizumi et al., 1997.Las flechas rojas indican la posición
de los cebadores. ........................................................................................................... 21
Figura 2. Efecto de dosis de diferentes concentraciones de Aliltiourea (AT) en la
inhibición de la luminiscencia emitida por la bacteria Nitrosomonas que porta el gen
LuxAB. Cada punto es el promedio de 4 réplicas ........................................................... 22
Figura 3. Efecto de dosis de Dimetilsulfoxido (DMSO, solvente en el que se diluyen los
inhibidores para el bioensayo) sobre la luminiscencia emitida por la bacteria
recombinante Nitrosomonas que porta el gen reportero de luciferasa LuxAB. Cada punto
es el promedio de 4 réplicas medidas en el luminómetro. .............................................. 24
Figura 4. Efecto de exudados de Brachiaria sobre la inhibición de la luz emitida por
Nitrosomonas recombinante, comparado con el efecto del DMSO. Las barras resaltan la
diferencia entre ambos tratamientos, indicando el porcentaje de inhibición específico del
exudado. Cada punto es el promedio de 4 réplicas. ....................................................... 25
Figura 5. Espectrometría de masas de los exudados purificados de B.humidicola. La
presencia de las masas 121, 137, 199, 291, 334 indica la presencia de braquialactona,
según la referencia publicada por Subbarao et al., (2009). ............................................. 26
Figura 6. Comparación entre diferentes fuentes de compuestos IBN (Exudados y
extracto radical) en 17 genotipos de B. humidicola. En asterisco las parejas que
presentaron diferencias significativas según el test LSD (0.05). Desviación estándar de 3
réplicas biológicas. ......................................................................................................... 28
Figura 7. Relación entre el potencial IBN medido con el bioensayo entre compuestos
obtenidos del tejido radical (tejido-ATU por gramo de raíz) y exudados de la raíz
(Exudación ATU por gramo de raíz) para 17 de genotipos de B humidicola. Se resaltan
los parentales con actividad IBN conocida. Cada punto corresponde al promedio de 3
réplicas biológicas. ......................................................................................................... 29
Figura 8.Comparación de diferentes genotipos frente a la actividad IBN detectada por
bioensayo a partir del extracto de raíz, antes y después de ser estimulada por amonio
(NH4CL 1mM). En asterisco grupos de muestras con diferencias significativas según la
prueba LSD (0.05). ........................................................................................................ 30
Figura 9. Producción de nitrato durante diez días usando el método de incubación de
suelo. Los tratamientos evaluados son suelo CIAT desnudo, suelo CIAT desnudo con
XIV Potencial de la inhibición biológica de la nitrificación (IBN) en forrajes tropicales
Nitrosomonas y suelo CIAT desnudo con DCD. Cada punto es el promedio de tres
replicas técnicas. ............................................................................................................ 33
Figura 10. Tasas de nitrificación en un vertisol (suelo CIAT) comparadas entre los
tratamientos de suelo desnudo, suelo con Nitrosomonas y suelo desnudo con DCD. A)
Tasas obtenidas usando todos los valores desde los tiempos de incubación T0 hasta T10
B) Tasas obtenidas de dos rangos de tiempo, de T0 a T6 y T6 a T10. ........................... 34
Figura 11. Producción de nitrato (mg de N-NO3- por Kg de suelo) en un suelo desnudo
oxisol proveniente de los Llanos Colombianos obtenido usando el método de incubación
de suelo durante 10 días. Cada punto es el promedio de 3 réplicas técnicas. ................ 36
Figura 12. Producción de nitrato (mg de N-NO3- por Kg de suelo) en un suelo desnudo
oxisol proveniente de los Llanos Colombianos con incubación prolongada del día 12
hasta el día 20. Los tratamientos evaluados son suelo desnudo sin cobertura vegetal,
suelo desnudo con Nitrosomonas, suelo desnudo con el inhibidor de nitrificación DCD.
Cada punto es el promedio de 3 réplicas técnicas. ......................................................... 36
Figura 13. Tasas de nitrificación (mg de N-NO3- por kg de suelo por día) obtenidas en un
oxisol (suelo Llanos) mediante la incubación de suelo. Desviación estándar de 3 réplicas.
....................................................................................................................................... 38
Figura 14. Producción de N-NO3- (mg por kg de suelo) en suelo desnudo (sin cobertura
vegetal) y suelo con un cultivo de Brachiaria humidicola accesión CIAT16888, usando el
método de incubación de suelo durante 8 días a partir del 4 día de preincubación. A) Foto
de parcelas de campo donde se realizó el muestreo de suelo. B) Producción de N-NO3-
durante 12 días. Cada punto corresponde al promedio de tres replicas técnicas. ........... 39
Figura 15. Aplicación de la metodología de incubación de suelo estandarizada en este
estudio para detectar diferencias en las tasas de nitrificación en suelos con diferentes
cultivos: Stylosanthes guinensis accesión 12278, Oriza sativa, B. humidicola accesión
679 y un suelo desnudo (sin cobertura vegetal). Desviación estándar de 3 réplicas. ...... 41
Figura 16. Amplificación por PCR de genes funcionales amoA de archaea y bacteria en
DNA de suelo y curvas de disociación o de “melting” mostrando amplificaciones
específica para los genes evaluados. A) tamaños de los productos de PCR del gen
amoA de bacterias. 1. Marcador de peso 1kb plus. 2. Amplicon de amoA bacteria. 3.
Control negativo sin DNA. B) Curva de disociación obtenida para el qPCR del amoA
bacteriano. C) tamaños de los productos de PCR del gen amoA de archaeas. 1.
Marcador de peso 1kb plus. 2. Control negativo sin DNA 3. Amplicon del amoA de
archaeas. D) Curva de melting obtenida para el qPCR del amoA de archaeas. .............. 43
Figura 17. Relación entre las variables potencial IBN total obtenido por bioensayo (ATU
total) y tasas de nitrificación (mg de N-NO3- por kg por día) obtenidas por la incubación de
suelo, para los genotipos con actividad IBN conocida. .................................................... 46
Figura 18. Correlación entre potencial IBN obtenido por bioensayo (Total ATU) y tasas
de nitrificación obtenidas por incubación de suelo (mg N-NO3- por kg de suelo por día),
para toda la progenie de la población biparental CIAT16888 x CIAT26146. Marcadas con
colores se encuentra el subgrupo de muestras que se seleccionó para el análisis de la
población nitrificantes. En rojo muestras del extremo de mayor IBN. En azul los
parentales. En amarillo muestras del extremo con menor IBN ........................................ 48
Contenido XV
Figura 19. Tasas de nitrificación obtenidas a partir de la incubación de suelo de los
genotipos control y 4 genotipos de la población biparental, comparando las tasas
obtenidas según Cardozo et al., 2011 (producción inicial menos producción final, sobre el
número de días incubados) y las obtenidas en el presente estudio (pendiente de 5
puntos). .......................................................................................................................... 50
Figura 20. Relación entre todas las variables para genotipos de B humidicola
contrastantes identificados en este estudio. Potencial IBN obtenido por bioensayo (ATU),
tasas de nitrificación obtenidas por incubación de suelo (3mg de N-NO3- por kg de suelo
por día) y estimación poblacional de microrganismos nitrificantes obtenidas por qPCR. 52
Contenido XVI
Lista de tablas
Pág. Tabla 1. Características de los suelos analizados en este estudio.................................. 15
Tabla 2. Efecto de 0.22µM de AT sobre la luminiscencia de los cultivos de Nitrosomonas
recombinante que porta el gen reportero de luciferasa LuxAB, usados en este estudio. . 23
Tabla 3. Potencial IBN observado en algunas accesiones de B. humidicola y Panicum
maximum con la técnica del bioensayo en este estudio comparado con reportes previos.
....................................................................................................................................... 27
Tabla 4. Potencial IBN obtenido de diferentes cantidades de tejido de raíz de Brachiaria,
usando el bioensayo ....................................................................................................... 31
Tabla 5. Comparación de la producción de nitrato usando el método de incubación de
suelo entre los suelos colectados en los Llanos orientales de Colombia y en CIAT para 10
días de incubación. ......................................................................................................... 35
Tabla 6. Cuantificación por qPCR de bacterias y archaeas nitrificantes usando el gen
amoA como marcador, en suelos con IBN contrastantes (suelo desnudo y suelo con
Brachiaria). ..................................................................................................................... 44
Tabla 7. Potencial IBN estimado por bioensayo y tasas de nitrificación obtenidas por
incubación de suelo, de los genotipos control (IBN conocido), crecidos en potes con suelo
de los Llanos en paralelo con la población biparental. 3 réplicas biológicas por
tratamiento. Letras diferentes significa diferencias significativas según el test LSD ........ 46
Tabla 8. Comparación de genotipos de B. humidicola que presentaron tasas de
nitrificación obtenidas por incubación de suelo significativamente superiores al suelo
desnudo. ......................................................................................................................... 51
Tabla 9. Relación entre el potencial IBN obtenido por bioensayo, las tasas de nitrificación
obtenidas por incubación de suelo y la cantidad de microorganismos nitrificantes
obtenidas por qPCR, en genotipos contrastantes para el IBN de la población biparental.
....................................................................................................................................... 52
Contenido XVII
Lista abreviaturas
Abreviatura Término
ATU Unidades de aliltiourea AOA Archaeas amonio oxidantes AOB Bacterias amonio oxidantes amoA Amonio monooxigenasa AT Aliltiourea DCD Dicindiamida IBN Inhibición biológica de la nitrificación NH4
+ Amonio N Nitrógeno NO3 Nitrato NO2 Nitrito N2O Óxido nitroso RLU Unidades de luz relativas qPCR Reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real
Introducción
La nitrificación es la oxidación del amonio (NH4+) a nitrito (NO2
- ) y subsecuentemente a
nitrato (NO3-), constituyendo una ruta metabólica fundamental para el ciclo biogeoquímico
global del nitrógeno (N). Este proceso está mediado por archaeas y bacterias nitrificantes
del suelo (Zhang et al 2012). El uso intensivo de fertilizantes nitrogenados ha influenciado
la actividad de los microrganismos nitrificantes en suelos con uso agronómico, llevando a
que se produzcan altas tasas de nitrificación que incrementan la cantidad de NO3- en este
sistema (Subbarao et al 2012, Ambus 1998). El NO3- es susceptible de lixiviación y
también es sustrato para la denitrificación, resultando en la perdida de aproximadamente
el 70% del fertilizante nitrogenado aplicado al suelo (Subbarao et al 2013, Glass 2003).
La salida de N del suelo en forma de NO3- por lixiviación contamina cuerpos de agua (Cui
et al 2011) y uno de los productos de la denitrificación, el óxido nitroso (N2O), es un gas
con efecto invernadero 300 veces más alto que el dióxido de carbono (Ambus 1998,
Canfield et al 2010, Subbarao et al 2013). Se estima que cerca de 912 kg de NO3- ha/año
se lixivian a aguas subterráneas (Adriano et al 1972), y para el año 2010 se estimó la
emisión de cerca de 4 teragramos de N2O-N por año, siendo la agricultura una de las
principales fuentes de emisión de N2O en el planeta (Reay et al 2012, Khalil et al 2002).
El uso de inhibidores sintéticos de la nitrificación ha puesto en evidencia que regular este
proceso puede favorecer la retención de nitrógeno en el suelo, disminuir la emisión de
óxido nitroso e incrementar la productividad de los cultivos (Cui et al 2011, Liu et al
2013). Se han identificado ciertas especies de plantas que exudan al suelo compuestos
que inhiben la nitrificación (Gopalakrishnan et al 2009, Sylvester-Bradley et al 1988,
Subbarao et al 2009a, Subbarao et al 2007). Esta propiedad vegetal se ha denominado
inhibición biológica de la nitrificación (IBN) y se ha establecido como una característica
con un gran potencial para favorecer la agricultura, por lo que ha comenzado estudiarse
en detalle en los últimos años (Subbarao et al 2013).
El IBN es un tipo de interacción planta-microorganismo que es afectado por múltiples
factores presentes en el suelo y en la planta. En este sentido, investigadores han logrado
acondicionar un sistema in vivo que permite aislar el efecto de los exudados radicales
2 Introducción
sobre un microorganismo nitrificante (bioensayo), favoreciendo el análisis de esta
característica y permitiendo la estimación del potencial IBN de una planta (Subbarao et al
2006). Por otro lado, el estudio directo del efecto de los compuestos IBN liberados al
suelo sobre los microorganismos nitrificantes, se ha favorecido gracias al establecimiento
de microcosmos (incubación de suelo) que permiten el seguimiento de los productos de
la nitrificación en el tiempo para establecer tasas de nitrificación y detectar la actividad
IBN de una planta (Iponmoroti et al 2008, Subbarao et al 2009, Pariasca et al 2010, Zakir
et al 2012). El forraje tropical Brachiaria humidicola es la especie con mayor potencial
IBN identificado hasta el momento (Subbarao et al 2007). Esta especie exuda al suelo un
coctel de moléculas de las cuales un compuesto orgánico denominado braquialactona
contribuye al 60% de la inhibición de la nitrificación (Subbarao et al 2009). Pruebas de
concepto usando pocos genotipos de Brachiaria, han sido útiles para identificar los
factores que estimulan el IBN, siendo el pH y el NH4+ los principales agentes reguladores
de las moléculas inhibidoras que se exudan al suelo (Subbarao et al 2006b, Subbarao et
al 2009). El conocimiento que se ha generado da soporte a que el IBN es un rasgo
vegetal con un gran potencial para ser aplicado en la recuperación de suelos,
disminución de gases con efecto invernadero y mejora en el uso eficiente del nitrógeno
de los cultivos (Subbarao et al 2012, Subbarao et al 2013).
Es necesario estudiar el IBN desde un enfoque poblacional para definir sus bases
genéticas y por ende explotar la diversidad genética para maximizar su aplicación en la
agricultura. Para ello es importante afinar las metodologías para reducir la variabilidad y
así mismo conseguir aislar los efectos que permitan estudiar en términos cuantitativos la
interacción planta-microorganismos propia del IBN, en un contexto poblacional. En el
presente estudio se validó en CIAT tres metodologías para la caracterización del IBN de
B.humidicola: el bioensayo, la incubación de suelo y la cuantificación de microorganismos
nitrificantes. Se demostró la utilidad de estas herramientas para fenotipificar el IBN en
plantas de campo y en materas. Como población de estudio se usó una población
biparental de B.humidicola (CIAT26146 x CIAT16888) que permitió identificar una alta
diversidad genética asociada con este carácter, propia de una característica cuantitativa.
Se logró identificar genotipos promisorios para iniciar programas de mejoramiento. El
potencial IBN estimado se relacionó con las tasas de nitrificación y la dinámica
poblacional de microorganismos nitrificantes, contribuyendo a las bases biológicas que
suman evidencias para una mejor comprensión del IBN en Brachiaria humidicola
1. Marco teórico
1.1 Microorganismos del suelo y nitrificación
La nitrificación es la oxidación de amonio (NH4+) a nitrito (NO2
- ) y subsecuentemente a
nitrato (NO3-), constituyendo una ruta metabólica fundamental para el ciclo
biogeoquímico global del nitrógeno (N) (Reay et al 2012). La nitrificación es un proceso
mediado por microorganismos del suelo. Se han identificado comunidades de bacterias
oxidantes de amonio (AOB por sus siglas en ingles) y en la última década se identificaron
archaeas oxidantes de amonio (AOA) que también aportan significativamente a las tasas
de nitrificación (Pester et al 2012, Zheng et al 2012, Leininger et al 2006). La tendencia
observada indica que la diversidad de microorganismos varía entre los diferentes tipos de
suelo, incrementándose la proporción de AOA vs AOB a medida que la acidez del suelo
se incrementa, (Yao et al 2011, Zheng et al 2012, Pereira et al 2012) encontrándose
actividad nitrificante en la mayoría de suelos que tengan disponibilidad de oxígeno, ya
que la oxidación de amonio es una reacción que requiere de este elemento.
El catabolismo del amonio a través de la nitrificación se da en dos pasos. El amonio es
inicialmente oxidado a hidroxilamina por acción de la enzima amonio-monooxigenasa
(amoA), enzima que contiene cobre y hace parte de una proteína de membrana (Basu et
al 2003). La hidroxilamina es después oxidada a nitrito por acción de la enzima
hidroxilamina oxidoreductasa (Hao). Esta oxidación libera cuatro electrones, dos de los
cuales son devueltos a la enzima amoA para mantener la oxidación del amoniaco. Los
dos electrones restantes quedan disponibles para suplir las necesidades reductoras de la
célula, el cual es la única fuente de energía de estos microorganismos litoautotróficos
(Bock et al 1991).
La presencia de amoA en todos los organismos nitrificantes sugiere que este es el
principal mecanismo de oxidación del amonio en el suelo (Abell et al 2012, Rotthauwe et
al 1997). El alto nivel de conservación de amoA entre los diferentes linajes de nitrificantes
demuestra la importancia evolutiva de esta enzima la cual le ha permitido a este grupo
4 Potencial de la inhibición biológica de la nitrificación (IBN) en forrajes tropicales
de microorganismos establecerse en este nicho ecológico como los principales
transformadores de nitrógeno (Pester et al 2012)
1.2 Consecuencias de la alta nitrificación
En los agroecosistemas donde la presión por la productividad de los cultivos demanda un
uso intensivo de fertilizantes, las tasas de nitrificación se han incrementado (Liu et al
2013, Subbarao et al 2009, Subbarao et al 2012). La comunidad microbiana que habita
estos ecosistemas se adapta a la alta oferta de nutrientes, adoptando mecanismos que
hace más eficiente la transformación del exceso de N (Liu et al 2013). Bajo esta
condición se da una rápida conversión de amonio (proveniente de fertilizantes o
mineralización de materia orgánica) a NO3- (Cui et al 2011), el cual es un componente
temporal en la solución del suelo ya que su carga negativa no le permite ser retenido y se
pierde rápidamente por lixiviación, contaminando cuerpos de agua, o es denitrificado
(reducido) produciendo óxido nitroso, un gas con efecto invernadero (Reay et al 2012).
Alrededor del 70% de los fertilizantes nitrogenados aplicados en ecosistemas
intervenidos se pierde a través de la nitrificación y procesos asociados (Raun y Johnson
1999; Glass 2003, Subbarao et al 2012).
La conversión rápida de NH4+ a NO3
- en el suelo limita la efectividad de la mayor parte del
N aplicado en forma de fertilizante. Alrededor del 90% de los fertilizantes nitrogenados se
aplican al suelo en forma de NH4+, el cual es en su mayoría es nitrificado dentro de cuatro
semanas después de la aplicación (Sahrawat 1980). Aparte de la volatilización del
amoniaco (Grant et al 1996), la nitrificación se asocia con la mayoría de las principales
vías de pérdidas de N, la denitrificación y la perdida de NO3- por lixiviación (Barker y Mills
1980). Desde el punto de vista agrícola, mantener el N en la forma de NH4+ tiene la
ventaja de extender el tiempo que el N se mantiene en la rizosfera, permitiendo a la
planta más tiempo para que pueda absorberlo (Slangen et al 1984, Subbarao et al 2013).
Las dos principales rutas de pérdidas de N durante y después del proceso de la
nitrificación son emisiones gaseosas como dinitrógeno (N2), óxidos de N (N2O, NO),
además de la lixiviación de NO3- (Canfield et al 2010).
El NO3- se mueve fácilmente a través del suelo por difusión y con el flujo de la masa del
agua (Vitousek et al 2002; Herrmann et al 2005). De este modo, existe un potencial para
que una porción significativa del fertilizante nitrogenado aplicado y N mineralizado
Marco teórico 5
naturalmente se lixivie, se infiltre o se lave de la zona radicular (Gulliam et al 1985). Las
pérdidas de N asociadas con la nitrificación pueden ser abundantes y así tener serias
consecuencias ambientales y económicas para la sociedad (Smith et al 1997). Un
ejemplo de ello es que la agricultura produce el 80% del óxido nitroso a nivel mundial.
Este es un gas de efecto invernadero 300 veces más fuerte que el dióxido de carbono, y
que además afecta la capa de ozono (Hickman et al 2014). Se estima que el consumo de
fertilizantes nitrogenados se duplicará (i.e., 200 Tg N / año) antes del 2025 para
satisfacer la creciente demanda de alimentos (Reay et al 2012, Vitousek et al 1997). Se
espera que este incremento en el uso del N también incremente tanto la nitrificación y
denitrificación del N (Smith et al 1997).
En algunos casos la nitrificación puede conllevar a la retención de N, especialmente en
suelos alcalinos donde existen pérdidas altas de N a partir de la volatilización del
amoníaco. En condiciones de pH alcalino, es posible que la nitrificación facilite la
retención del N al convertir rápidamente el amonio en NO3- , el cual no es susceptible a
pérdidas por volatilización (Sahrawat 1980). La nitrificación sucedida por la
desnitrificación también es importante en el manejo y reciclamiento de desechos
orgánicos incluyendo desechos nitrogenados generados a partir de excretas animales y
humanas, y aguas servidas derivadas de procesos industriales. El amoníaco es la forma
predominante de N en estos desechos, y la nitrificación es el proceso inicial para la
remoción del N antes de ser liberados en el ambiente (Kowalchuk y Stephen, 2001).
1.3 Estrategias para inhibir las altas tasas de nitrificación
La aplicación de inhibidores de la nitrificación en la agricultura es uno de los enfoques
más prometedores para incrementar el uso del N, reduciendo la emisión de óxido nitroso
al ambiente (Liu et al 2013). Una tecnología que controla la lixiviación de nitratos y la
emisión de óxido nitroso es el uso de inhibidores sintéticos de la nitrificación como la
diciandiamiada (DCD) y nitrapirina. Estos compuestos actúan por inhibición de la enzima
amonio-monooxogenasa responsable del primer paso del proceso de la nitrificación, que
comprende la oxidación de amonio a hidroxilamina (Guo et al 2013). Estos compuestos
no son tóxicos, no volátiles, y solubles en agua. El DCD Se degrada hasta dióxido de
carbono, amonio y agua, sin dejar ningún resido a largo plazo. Sin embargo su
efectividad depende de la temperatura, la lluvia y otras condiciones ambientales (Vogeler
6 Potencial de la inhibición biológica de la nitrificación (IBN) en forrajes tropicales
et al 2011). Diferentes formulaciones de DCD han sido desarrolladas y su eficacia ha sido
investigada bajo diferentes rangos de condiciones ambientales y tipos de suelo (Liu et al
2013). Varias moléculas sintéticas capaces de inhibir la hidrolisis de la Urea o la
nitrificación en suelos han sido evaluadas. Entre ellas se encuentran la Nitrapirina, AM (2-
amino-4cloro-6 metilo piriminida), clorato de sodio, azida de sodio y cloruro de benzeno.
Mucho de estos productos se han restringido solo al estado experimental debido a su alto
costo, disponibilidad limitada, afectación de microorganismos benéficos y sobre todo la
poca extensión de esta tecnología a los agricultores (Upadhyay et al 2011).
Otros enfoques agroecológicos evidencian que con el uso de abonos verdes, la rotación
de cultivos y labranza reducida, se puede llegar a alcanzar productividad altas en los
cultivos sin el uso de fertilizantes químicos, que son la base de los problemas asociadas
con el desbalance de nitrógeno en el sistema (Kassie et al 2009). Sin embargo, estos
resultados son dependientes del cultivo y ambientes específicos ya que bajo otras
condiciones, el uso de fertilizantes químicos puede llegar a superar con creces la
productividad que se alcanza con estrategias agroecológicas (Kassie et al 2009).
Existen varias estrategias de manejo de las aplicaciones de fertilizantes nitrogenados que
toman en consideración la época del año (estaciones climáticas) y la tasa de aplicación.
Estas estrategias incluyen aplicaciones en verano vs aplicaciones en otoño, aplicaciones
basales vs. Aplicaciones divididas, fertilización por bandeo vs. Fertilización al boleo,
aplicaciones superficiales vs. Aplicaciones incorporadas, aplicaciones localizadas y
foliares. Las aplicaciones foliares de urea se han usado para limitar la disponibilidad de
NH4+-N para los microbios nitrificantes del suelo. Otras estrategias se han desarrollado
para sincronizar la aplicación de fertilizante con la demanda de N del cultivo y así facilitar
la asimilación rápida del N y reducir el tiempo de residencia del NO3- en el suelo. De este
modo, se limita la desnitrificación y/o la pérdida del N por infiltración (Newbould 1989;
Dinnes et al 2002). Muchas de estas estrategias agronómicas tienen limitaciones ya que
acarrean costos adicionales de mano de obra y otros tipos de dificultades prácticas
(Dinnes et al 2002).
1.4 Inhibición Biológica de la Nitrificación (IBN)
Las plantas tienen la facultad de modificar el ambiente en el cual se desarrollan. Pueden
exudar glucosa, aminoácidos, ácidos orgánicos y células muertas que constituyen la
Marco teórico 7
principal fuente de carbono en el ecosistema del suelo (Jackson et al 2008), esta
dinámica es evidencia de que en el espacio de la rizósfera ocurren interacciones
ecológicas complejas.
Las raíces exudan diversos compuestos de bajo peso molecular correspondiente al 30-40
% del carbono fijado fotosintéticamente (Fiehn 2002). Estos exudados inciden sobre las
complejas interacciones químicas, físicas y biológicas experimentadas por las plantas
terrestres con los microorganismos del suelo. Alrededor de la última década, se han
comprendido numerosos pasos en esas interacciones complejas (Dayan et al., 2010) y
se le ha dado la importancia en la comunidad científica al estudio de los exudados
radiculares y su papel en esas interacciones.
En términos de las relaciones ecológicas entre los diferentes organismos que usan el
nitrógeno disponible en el suelo como nutriente, se han identificado mecanismos en las
plantas que les pueden conferir ventajas en la competencia. Diversos cultivos liberan al
suelo compuestos que inhiben la nitrificación (Sylvester-Bradley et al 1980, Pariaska et al
2010, Subbarao et al 2009). Los metabolitos que son liberados al suelo y que inhiben la
nitrificación son compuestos orgánicos con características hidrofóbicas e hidrofílicas
(Subbarao et al 2009. Dayan et al 2010. Subbarao et al 2012). Estos compuestos
bloquean las enzimas AMO y HAO propias de los organismos nitrificantes y no de los
otros microorganismos presentes en el suelo (Gopalakrishnan et al 2009), es decir, es
un “ataque” dirigido para disminuir las tasas de nitrificación en el suelo, característica que
se ha denominado inhibición biológica de la nitrificación (IBN) (Subbarao et al 2006).
Algunos forrajes tropicales y ciertos cultivos han mostrado un amplio rango de actividad
IBN en su sistema radical. El forraje tropical Brachiaria humidicola que está adaptado a
suelos bajos en Nitrógeno en las sabanas de sur América, presenta el IBN más alto
identificado hasta el momento. En contraste, Panicum maximum que está adaptado a
ambientes ricos en Nitrógeno, presenta el IBN más bajo dentro de los forrajes tropicales
(Subbarao et al 2013). Entre los cereales que se han evaluado, solo el sorgo y el arroz
presentan actividad IBN (Pariaska et al 2010, Zakir et al 2012). Otros cereales como el
maíz, trigo, y la cebada no presentaron actividad IBN en los primeros screening
(Subbarao et al 2007b). La mayoría de legumbres que se han analizado muestran una
estimulación de la nitrificación, sin presentar capacidad IBN en sus raíces (Subbarao et al
2007b). La inhibición de la nitrificación parece ser un mecanismo adaptativo para
conservar y usar el N eficientemente en sistemas naturales donde el N es el nutriente
más limitante que determina la productividad del ecosistema
8 Potencial de la inhibición biológica de la nitrificación (IBN) en forrajes tropicales
1.5 El forraje tropical Brachiaria humidicola y el IBN
Una de las especies que produce compuestos con una alta actividad IBN es la planta
forrajera Brachiara humidicola. Esta especie ha sido útil como modelo de estudio de este
fenómeno y ha permitido identificar algunos de los factores que regulan la liberación al
suelo de compuestos IBN. Hasta ahora se sabe que el pH y el amonio estimulan la
exudación de estos compuestos (Subbarao et al 2006b), sin embargo el conocimiento de
este fenómeno aun es limitado. Zhu et al (2012) plantean que la liberación de moléculas
IBN a la solución del suelo tiene implicaciones energéticas considerables para la planta.
La relación entre la toma de amonio, la bomba de ATPasa de la membrana plasmática y
la acidificación del medio rizosférico influyen en la liberación de IBN. Seguramente
plantas con alta actividad IBN han destinado parte de los fotosintatos para la síntesis de
estos compuestos, sin embargo la relación entre producción de biomasa y actividad IBN
aún no se ha establecido.
Los compuestos con actividad IBN de Brachiaria corresponde a ácidos grasos
insaturados y ácido linoleico en la parte aérea (Subbarao et al 2008). En sus raíces
presenta el mayor inhibidor de la nitrificación que produce esta especie, un diterpeno
cíclico que se ha denominado braquialactona (Subbarao et al 2009). Este compuesto
presenta un esqueleto de diciclopentano, con un anillo Y-lactona. La braquialactona se
ha considerado como uno de los inhibidores más potentes comparado con nitrapirina y
DCD, dos de los inhibidores sintéticos más usados en la agricultura (Subbarao et al
2013). La Braquialactona inhibe a los nitrificantes bloqueando las funciones enzimáticas
de AMO y HAO. Entre el 60 y el 90% de la actividad inhibitoria que Brachiaria libera al
suelo es braquialactona. Su liberación es estimulada por la presencia de amonio en la
rizósfera (Subbarao et al 2013).
Se estima que el potencial IBN liberado de una hectárea de Brachiaria puede llegar a
liberar al suelo compuestos IBN equivalentes a agregar de 6.2 a 18kg de nitrapirina por
hectárea por año, que se sabe tiene una influencia significativa en la población de
nitrificantes y por ende en las tasas de nitrificación (Subbarao et al 2013). En un cultivo
de 3 años de B. humidicola la emisión de óxido nitroso se suprimió más del 90%
(Subbarao et al 2009). Otras pasturas como P. maximum establecidas por 3 años,
presentaron un nivel intermedio de inhibición de las tasas de oxidación de amonio. Una
correlación negativa se observó entre la capacidad IBN de las raíces y la emisión de
óxido nitroso (Subbarao et al 2009).
Marco teórico 9
1.6 Métodos para cuantificar el IBN
La inhibición de la nitrificación puede ser estimada a partir de la comparación de las tasas
de nitrificación entre suelos donde hayan crecido diferentes especies de plantas.
Básicamente se realiza la cuantificación de nitratos/nitritos usando los protocolos
estándar de colorimetría para estimar su incremento conforme avanza el tiempo (Hanson
et al 2002). De esta manera, se logró estimar bajas tasas de nitrificación en suelos donde
crecía Brachiaria a diferencia de suelos con soya y suelo sin ningún cultivo (Subbarao et
al 2009). La tasa de nitrificación también ha permitido registrar el incremento en las tasas
de nitrificación asociadas con las practicas agronómicas de ciertos cultivares (Hanson et
al 2002). Sin embargo, no ha sido utilizada para el estudio de segregación de caracteres
ya que es una medida indirecta que puede estar sujeta a variaciones por efecto de
muestreo.
Por otro lado se ha implementado el seguimiento de la producción de óxido nitroso para
estimar el efecto IBN de un cultivo (Subbarao et al 2009). Este método se basa en el uso
de una cámara estática (Holland et al 1999) a partir de las cuales se colectan muestras
de aire a diferentes intervalos de tiempo usando jeringas descartables. Las muestras son
analizadas posteriormente para determinar los niveles de N2O a través de un
cromatógrafo de gases equipado con un detector de captura de electrones.
Como complemento al seguimiento de los productos metabólicos de la nitrificación se ha
usado la cuantificación de poblaciones nitrificantes a través de PCR en tiempo real,
usando el gen amoA como marcador (Subbarao et al 2009). Diversos estudios han
demostrado la utilidad de esta técnica para analizar la dinámica poblacional de los
microorganismos en el suelo (Rotthauwe et al 1997). El gen amoA está presente en
todos los microorganismos nitrificantes descritos hasta el momento. Un experimento
basado en la aplicación de la PCR en Tiempo-Real se desarrolló para amplificar y
cuantificar el gen amonia-monooxigenasa (amoA) y así estimar el tamaño de la población
de AOB en respuesta a la presencia de amonio en el suelo. Este estudio fue el primero
en desarrollar y aplicar la PCR en Tiempo-Real para cuantificar los genes amoA en el
suelo y comparar su dinámica en respuesta a las concentraciones de amonio y nitrito
(Okano et al 2004).
El método más usado para la caracterización de la actividad IBN en los diferentes
especies reportadas es el bioensayo (Pariaska et al 2010, Subbarao et al 2009). Esta
estrategia fue propuesta para evaluar el efecto de inhibidores sintéticos de la nitrificación
10 Potencial de la inhibición biológica de la nitrificación (IBN) en forrajes tropicales
en plantas de tratamiento de aguas residuales (Lizumi et al 1996) y posteriormente fue
modificado por Subbarao et al (2006) para evaluar el efecto de los exudados de
Brachiaria en la actividad en un microorganismo nitrificante. Desde entonces, el
bioensayo se ha establecido como la herramienta para medir el potencial IBN de los
cultivos. Esta herramienta consiste en el uso de una cepa de Nitrosomas europaea que
ha sido transformada con el gen pluxAB. Este gen codifica para una enzima Luciferasa
bacteriana que en presencia de un sustrato (Decil-aldehido) se presenta una reacción de
quimioluminiscencia, brindando a Nitrosomonas la capacidad de emitir luz. Esta emisión
de luz puede ser cuantificada y expresada en términos de porcentaje de inhibición, ya
que la luz disminuye si la bacteria es inhibida (Lizumi et al 1996). La correlación entre
inhibición de la luz e inhibición de la producción de nitrato es altamente significativa
(Subbarao et al 2006), lo que ha definido este bioensayo como la principal herramienta
para cuantificar y comparar el potencial IBN entre genotipos.
El bioensayo ha permitido analizar la genética del IBN en cultivos importantes como el
sorgo (Subbarao et al 2007) y el arroz (Pariaska et al 2010). En el Sorgo se identificó que
los genotipos silvestres presentan una mayor actividad IBN cuando se compararon con
líneas cultivadas. Usando líneas con introgresiones derivadas de la hibridación entre
genotipos silvestres y líneas cultivadas, mostraron que los genes que confieren alta
actividad IBN están localizados en el cromosoma Lr#n y pueden ser introducidos y
expresados en el background genético de las líneas cultivadas (Subbarao et al 2013),
demostrando que es posible encaminar programas de mejoramiento dirigidos a
incrementar la actividad IBN en cultivos importantes
2. Materiales y métodos
Existen varias normas para la citación bibliográfica. Algunas áreas del conocimiento El
presente estudio se realizó durante los años 2013 y 2014 en el Centro Internacional de
Agricultura Tropical, localizado en Palmira, Valle del Cauca- Colombia, coordenadas: 3°
30′ 17.47″ N, 76 21′ 24.31″ W a 965 msnm con una temperatura promedio de 26 °C.
2.1 Población de estudio
La población de estudio es una población segregante de Brachiaria humidicola generada
a partir del cruce de dos parentales con alto (CIAT16888) y bajo IBN (CIAT26146)
(Subbarao et al 2009). Esta población está compuesta por 134 individuos cada uno con 3
réplicas biológicas organizadas en un diseño completamente al azar. La población se
cultivó en un suelo tipo Oxisol de los Llanos de Colombia, con 4 kg de suelo por matera;
4 plantas por matera (Unidad experimental) por 520 días en condiciones de invernadero.
Se aplicó nitrógeno en la forma de sulfato de amonio líquido ((NH4)2SO4) (sigma aldrich)
a razón de 38.5 mg de NH4+-N por kg de suelo (equivalente a 100 kg de NH4
+-N por ha)
cada mes y 15 días antes de la colecta de muestras. Se incluyeron 5 controles con
potencial IBN conocido (Subbarao et al 2007a): El material comercial de referencia B.
humidicola CIAT 679, B. humidicola CIAT25159, Brachiaria híbrido cv. Mulato, Panicum
maximum cv. Común, y suelo sin cobertura vegetal (suelo desnudo).
La estandarización y validación del Bioensayo se realizó con una sub-muestra de la
población de estudio de 20 genotipos crecidos en solución hidropónica a partir de
estolones durante 90 días. La solución nutritiva está compuesta por (mg/L) KH2PO4
38.31, K2SO4 31.02, CaCl2-2H2O 10.5, MgSO4-7H2O 36.93, Fe-EDTA 15.1, H3BO3 0.57,
CuSO4-5H2O 0.078,MnSO4, 6H2O 0.35, Na2MoO4-2H2O 0.126 y ZnSO4-7H2O 0.220. Se
realizó el cambio de la solución cada cinco días y se ajustó el pH a 5.5 según la
referencia de este estudio (Subbarao et al., 2006).
12 Potencial de la inhibición biológica de la nitrificación (IBN) en forrajes tropicales
La estandarización del método de incubación de suelo se realizó con suelo colectado en
el campo experimental de CIAT que ha sido utilizado para realizar pruebas de concepto
del IBN (Subbarao et al., 2009), con los tratamientos suelo desnudo y suelo donde se
estableció un cultivo de B. humidicola CIAT16888 desde hace 10 años. Las muestras de
suelo se colectaron con barreno a una profundidad de 10 cm atravesando las raíces
(suelo rizosférico). Se tomaron 6 barrenadas por tratamiento, se secó el suelo a
temperatura ambiente durante dos días. Posteriormente se homogenizó usando un tamiz
de 2mm de diámetro y se usó para estimar las tasas de nitrificación a partir del método
de incubación de suelo. Se incluyeron suelos provenientes de otros cultivos como Oriza
sativa y Stylosanthes guianensis accesión 12287 para validar la metodología, siguiendo
el protocolo de muestreo mencionado anteriormente.
2.2 Obtención de compuestos IBN de B. humidicola
Se evaluó dos fuentes de compuestos IBN. Uno es la purificación de compuestos IBN
exudados por la planta, a través del método de captura de exudados en una solución de
cloruro de amonio (NH4Cl2) y cloruro de calcio (CaCl2) (Subbarao et al., 2006). El otro
método es la extracción a partir del tejido radical en metanol que han permitido
caracterizar el IBN de otras especies (Tesfamariam et al., 2014). Los compuestos IBN
exudados se obtuvieron a partir de la purificación de los exudados radicales en una
solución de colecta de 100mM de NH4CL (Sigma aldrich) y 200µm de CaCL2 (Sigma
aldrich) con aireación continua. Al momento de la colecta, los 20 genotipos del cultivo
hidropónico se lavaron con agua destilada y se pusieron en 500mL de solución de
colecta durante 24 horas. Pasado este tiempo, la solución de colecta se distribuyó en 10
compotas con 50 mL cada una, se congeló y se llevó a liofilizar durante 4 días (Edwards
freeze dryer Super Modalgo). Una vez seca la muestra, se resuspendió cada compota en
20mL de metanol absoluto (Merck) se unieron y se llevó a rotoevaporación (rotavapor
buchi 461) a 40 °C durante 20 minutos. Posteriormente la muestra se resuspendió en
100µl de dimetilsulfoxido (DMSO) (Sigma) para su lectura de potencial de inhibición con
el bioensayo. Las raíces se secaron en horno a 60 °C durante 48 horas para registrar el
peso seco de cada unidad experimental. Los compuestos IBN de tejido (extracto de raíz)
se obtuvieron a partir de una extracción con metanol absoluto del tejido radical. Las
raíces se llevaron a molienda fina en tubos falcón de 15mL usando balines de 1mm de
Materiales y métodos 13
diámetro y agitación usando un agitador de pintura (Harbil paint mixer) durante tres
minutos. Posteriormente se tomó 0.25 gr de tejido radical molido y se agregó 1.5mL de
metanol absoluto. Se agitó la muestra en vortex (Fisher vortex genie 2) a máxima
revoluciones durante 5 minutos y se dejó durante 15 minutos a temperatura ambiente. El
extracto se filtró usando jeringas de 3mL y filtros ajustables de 0.22mm (Millipore). El
extracto limpio en metanol se recuperó en un tubo eppendorf de 2 ml y se secó por vacío
en speed-vac (Eppendorf concentrator 5301) durante 4 horas a 30°C. Los extractos
secos se resuspendieron en 100µl de DMSO de acuerdo con la metodología de
referencia (Subbarao et al., 2007). La extracción se validó usando diferentes cantidades
de tejido (en gramos: 0.1, 0.25, 0.5, 1) para verificar si se obtenía el mismo potencial IBN
de cada una de las muestras.
Para verificar la presencia de braquialactona, una de las moléculas responsables del
60% de la inhibición de la nitrificación (Subbarao et al., 2009), se envió para análisis por
espectrometría de masas la muestra de exudados de B. humidicola CIAT16888 al
laboratorio de cromatografía y espectrometría de masas CROM-MASS de la Universidad
Industrial de Santander UIS. El cromatograma obtenido se comparó con el reportado por
Subbarao et al., (2009) para identificar los picos específicos de braquialactona y
confirmar su presencia en las muestras analizadas.
2.3 Estandarización del bioensayo
El Bioensayo es una herramienta para cuantificar el potencial IBN de una especie vegetal
(Subbarao et al., 2006). La importancia de esta técnica radica en la posibilidad de
cuantificar a través de un modelo in vitro la inhibición sobre la enzima amoA de
Nitrosomonas, un componente clave en la nitrificación que está presente en todos los
microorganismos autotróficos que usan el amonio como fuente de energía (Rotthauwe et
al., 1997). La veracidad experimental del bioensayo se basa en la estabilidad de la
respuesta de Nitrosomonas cuando está en contacto con los inhibidores de nitrificación,
lo que se traduce en reproducibilidad del experimento. Dado que se está utilizando un
organismo vivo, se deben ajustar todas las condiciones para obtener variaciones
mínimas en la respuesta, que permitan comparaciones validas experimentalmente a
través de diferentes estudios.
14 Potencial de la inhibición biológica de la nitrificación (IBN) en forrajes tropicales
La cepa de Nitrosomonas que se utilizó en este estudio fue donada por el instituto
JIRCAS de Japón, aislada y modificada según Lizumi et al., (1996). Se reactivó la cepa
recombinante cultivándola en 600mL de medio P repartidos en 3 erlenmeyers de 500mL
(200mL por erlenmeyer) con 100µl de Kanamicina 50mg/ml (Promega) por cada 200mL
de medio P. Las bacterias se incubaron en oscuridad cubriendo el erlenmeyer con bolsas
negras, a 50 rpm y 28 °C en un agitador con incubadora (Excella E24 incubator) durante
7 días. El medio P está compuesto por (concentración final) KH2PO4 5.14Mm, Na2HPO4
95.1mM, (NH4)2SO4 18.91mM, NaHCO3 5.95mM, CaCl2-2H2O 0.034mM, MgSO4-7H2O
0.041mM, Fe (III) EDTA 0.0027mM, ajustando el pH a 7.8 con HCL 1N, y posteriormente
se esterilizó por autoclave. Después del cultivo, las bacterias tenían una densidad óptica
(OD) medida por espectrofotometría (Thermo scientific nanodrop 1000) de 0.6, valor que
se mantuvo a través de todos los cultivos usados en este estudio.
Para confirmar la estabilidad del transgen que confiere a Nitrosomonas la propiedad de
emitir luz, se aisló el plásmido y se realizó una PCR con los cebadores específicos para
el gen de la luciferasa bacterial (luxAB) reportados por Iizumi et al., (1997). El plásmido
se aisló partir de cultivos de 7 días de crecimiento. Se centrifugó el cultivo a 4000 rpm y
se extrajo el plásmido usando el kit Wizard®plus sv minipreps DNA purification system
(promega) siguiendo el protocolo del fabricante. De acuerdo con las condiciones de PCR
publicadas por Iizumi et al., (2006), a partir de 5ng de plásmido se realizó la PCR con los
primers sentido 5’-CGGGATCCAACAAATAAGGAAATGTTATG-3’ y antisentido 5’-
CCAGATCTTCCATATAAATGCCTCTATTAG-3’ y después se visualizó el producto en un
gel de agarosa al 1% tenido con sybr-safe (promega).
Una vez se confirmó la estabilidad del transgen en el genoma complementario de
Nitrosomonas, se realizó el bioensayo de luminiscencia siguiendo la metodología
propuesta por Subbarao et al., (2006). El mix se realizó con 2µl de exudado o extracto de
raíz, 198 µl de agua destilada y 250µl de bacteria, llevando a incubación en oscuridad
durante 30 minutos a 25°C y 700 rpm en un agitador (Thermomixer eppendorf 3420),
para después realizar la lectura de 100µL del mix con 4 repeticiones por cada exudado o
extracto de raíz evaluado. La luminiscencia se cuantificó con un luminómetro glomax
20/20 (promega) a partir de la inyección de 25µL de decanal al 1%(Merck) que actúa
como sustrato de la Luciferasa y posterior lectura de un tiempo de integración de 10
segundos. Cada unidad de luz relativa (RLU) dado por el luminómetro, se transformó a
porcentaje de inhibición usando los valores de RLU del control (solo DMSO) de
referencia que corresponde al 100% de luminiscencia. El porcentaje de inhibición de los
Materiales y métodos 15
exudados o extractos de raíces se transformó a unidades estándar del inhibidor sintético
aliltiourea (AT) (Sigma), donde una (1) unidad corresponde al 80% de inhibición de la luz
emitida por Nitrosomonas. La curva de efecto de dosis de AT se realizó aplicando en la
incubación las concentraciones finales de 0, 0.02, 0.12, 0.22 y 0.3 µM. La curva de
DMSO se construyó usando 0, 1, 2, 3, 4 y 5 µl. Se consideró bacterias estables para el
bioensayo, las Nitrosomonas que presentaron la inhibición cercana al 80% por efecto de
0.22 µM de AT y la inhibición del 20% por 2µl de DMSO.
2.4 Estimación de las tasas de nitrificación
La dinámica de las diferentes formas de nitrógeno en el suelo está regulada por la
actividad microbiana que los usa como sustrato para su metabolismo (Canfield et al.,
2010). Cuantificar el sustrato (amonio) y el producto metabólico de la nitrificación
(nitrato) en una escala temporal, permite establecer la actividad de los microorganismos
nitrificantes en suelo. Esta actividad expresada como tasa de producción de nitrato en el
tiempo comparada entre diferentes plantas, permite diferenciar genotipos con alto o bajo
IBN, asumiendo que una tasa de nitrificación baja es debida a la inhibición mediada por
los compuestos IBN exudados al suelo. La incubación de suelo rizosférico ha permitido
relacionar los compuestos IBN exudados con tasas de nitrificación reducidas para Sorgo
(Subbarao et al., 2012), pastos tropicales en condiciones de campo (Subbarao et al.,
2009) y Brachiaria en condiciones controladas (Arango et al., 2014). En este estudio se
usó la incubación de suelo aplicada para un suelo de tipo Oxisol (suelo Llanos) con pH
ácido y rico en aluminio proveniente de los Llanos Colombianos. La estandarización y
validación de esta técnica se realizó utilizando un suelo vertisol (suelo CIAT). Las
características de los suelos usados en este estudio están reportados en la tabla 1.
Tabla 1. Características de los suelos analizados en este estudio
Suelo Tipo de
suelo
pH
(Un)
MO
(g/kg)
Al
(cmol/kg)
CIC
(cmol/kg)
Llanos Oxisol 4.3 41.08 3.15 3.82
CIAT Vertisol 7.5 13.20 ND 19.07
16 Potencial de la inhibición biológica de la nitrificación (IBN) en forrajes tropicales
Se siguió la metodología de incubación de suelo propuesta por Ipinmoroti et al., (2008). A
partir de 5 gramos de suelo colectado seco y homogenizado (ver materiales y métodos:
4.1 población de estudio) puestos en frascos ámbar, se agregó 0.8mL de una solución de
(NH4)2SO4 27mM (sustrato para la nitrificación) manteniendo la capacidad de campo al
60%. Los frascos ámbar se taparon y abrieron dos huecos para permitir el intercambio
gaseoso, conformando las unidades experimentales. Se incubó durante 8 y 10 días a
25°C y humedad relativa del 50% (Incubadora isotemp Fisher scientific). Cada dos días
se hizo la extracción de nitrato (NO3-) en 50 ml de KCL 1M (Merck) (extracto KCL). Se
agitó en agitador horizontal a 175 rpm durante 30 minutos a temperatura ambiente y
posteriormente se filtró con papel Whatman No 5. Por cada tiempo de muestreo se
dispuso de 3 réplicas técnicas.
Para cada tipo de suelo evaluado se incluyó como control positivo la aplicación de un
microorganismo nitrificante al suelo desnudo. Se usó la Nitrosomonas recombinante del
bioensayo con RLUs mayores a 30000 aplicadas en la solución de incubación para
asegurar la distribución homogénea en la muestra. Como control negativo se incluyó
diciandiamida (DCD) (Merck) un inhibidor sintético de la nitrificación. Se agregó 12.7mg
de DCD en 100mL de la solución de incubación, para ser aplicado a los suelos desnudos
evaluados.
La cuantificación del nitrato se realizó de acuerdo al siguiente protocolo:
1. Se transfirió 0.5 ml de la muestra (extracto KCL) a un tubo de ensayo.
2. Se adicionó 0.25 mL de Buffer TRI (Merck).
3. Se secó la muestra en horno a 80-90 ºC durante 24 horas.
4. Una vez fría las muestra, se adicionó 0.5 ml de ácido sulfúrico concentrado (Merk). Se
dejó en reposo 5 minutos.
5. Se agregó 2.5 ml de agua destilada
6. Se agregó 2.5 ml de NaOH (Merck) al 40% y se dejó enfriar
7. Se agitó la solución (vortex a baja velocidad). La intensidad del color amarillo depende
de la concentración del nitrato.
8. Se transfirió 350µl de cada muestra a cada pozo del plato para la lectura mediante
espectrofotometría (placa multi-pozos, biorad).
9. Se cuantificó el Nitrato a través de espectrometría visible a 410 nm en un
espectrofotómetro Sinergy HT (BioTek co), usando la curva estándar de soluciones con
concentraciones de nitrato conocidas, correspondientes a 0.5,1, 2, 4, 6, 8, 10, 15, 20, 30
mg/L de nitrato de potasio (Sigma) que pasaron por el mismo proceso.
Materiales y métodos 17
Las tasas de nitrificación se obtuvieron como la pendiente de la recta (slope) de la
producción de nitrato cada dos días en el rango de tiempo evaluado.
2.5 Cuantificación de organismos nitrificantes
Para el análisis molecular se extrajo DNA de suelo de cada tratamiento usando el kit
FastDNA® SPIN Kit For Soil (MP Biomedicals) con modificaciones que incluyen el uso de
tiocianato de guanidina (Merck) para remover los ácidos húmicos, de acuerdo con el
siguiente protocolo:
1. Se añadió 300 mg de suelo a la Matrix de lisis E. Manteniendo los tubos en hielo.
2. Se agregó 978 µl de Búfer de fosfato de sodio y 122 µl de buffer MT. Se mezclaron los
tubos durante 5 minutos con vortex fuerte.
3. Se centrifugó a 16.200 x g durante 10 minutos
4. Se transfirió el sobrenadante a un tubo eppendorf de 2 ml. Se agregó 250 µl del
reactivo PPS y se mezcló por inversión 10 veces.
5. Se centrifugó a 16.200 x g durante 10 minutos
6. El sobrenadante se transfirió a un tubo eppendorf de 2 ml. Se agregó 1 ml de Binding
Matrix Suspension. Mezclando por inversión diez veces.
7. Se centrifugó los tubos a 16.200 x g durante 2 minutos y se eliminó el sobrenadante
8. Se lavó el precipitado con 1mL de tiocianato de guanidina 5.5M (64.98gr en 100mL de
agua destilada)
9. Se centrifugó los tubos a 16.200 x g por 10 minutos se eliminó el sobrenadante y se
realizó tres lavados más con tiocianato de guanidina 5.5M siguiendo el mismo
procedimiento.
10. Se resuspendió el precipitado en 1 ml de tiocianato de guanidina 5.5M y se transfirió
600 µl a un SPINTM Filter, para después centrifugar a 16.200 x g durante 1 minuto,
eliminar el remanente y agregar el resto de muestra para centrifugar de nuevo a 16.200 x
g durante 1 minuto
15. Se añadió 500 µl de búfer SEW al SPINTM Filter y resuspendiendo suavemente el
precipitado y se centrifugo a 16.200 x g durante 1 min.
16. Una vez se secó el SPINTM Filter se agregó 50 µl de agua ultrapura y se colocó el
SPIN filter en un tubo eppendorf de 1.5mL
18 Potencial de la inhibición biológica de la nitrificación (IBN) en forrajes tropicales
19. Se centrifugó a 16.200 x g durante 1 min para transferir el ADN al tubo eppendorf
El DNA extraído se cuantificó con el método de fluorescencia usando el picogreen
(Molecular Probes) y el equipo GENios (TECAN) y después visualizado en un gel de
agarosa al 1% teñido sybr-safe para determinar su calidad.
La cuantificación de los genes de las AOB y AOA se hizo a través de PCR en tiempo real
(Realplex eppendorf) usando las combinaciones de primers amoA-1F/amoA-2R para
bacterias nitrificantes (Rotthauwe et al., 1997) y amoA19F /amoA643R para archaeas
nitrificantes (Leininger et al., 2006). La combinación amoA-1F / amoA-2R amplifica un
fragmento de 493pb del gen amoA de bacterias nitrificantes autotróficas pertenecientes a
la subclase β de las proteobacterias. Estos primers fueron diseñados con base en
alineamientos de secuencias del gen amoA disponibles en base de datos públicas
(Rotthauwe et al., 1997). Para amplificar y cuantificar el gen amoA de archaeas se usó la
combinación de primers amoA19F diseñado para análisis filogenéticos (Leininger et al.,
2006), que genera un fragmento de 649pb.
Se siguió el protocolo reportado por Subbarao et al., (2009) y Moreta (2010) donde se
estandarizó el uso de los marcadores amoA para evaluar estas variables como
indicadores de IBN. Los genes en estudio se cuantificaron con el fluorocromo Brilliant
SYBR Green qPCR Master Mix (Stratagene). Este fluorocromo emite fluorescencia a
medida que los productos de PCR se acumulan dentro del tubo de reacción. Las
reacciones de PCR en Tiempo-Real se corrieron independientemente por triplicado en un
volumen final de 20 μl con 5 ng de DNA de suelo, 0.5 μM de cada primer y 10 μl del
Brilliant SYBR Green QPCR Master Mix. El control negativo o No Template Control (NTC)
consistió de agua en vez de DNA. Las condiciones de amplificación de los genes de
interés fueron las siguientes: 1) 95°C – 5 min; 2) 95°C – 1.5 min; 3) 55°C – 1.5 min; 4)
72°C 1.5min; 5) Lectura de la placa; 8) Ir al paso 2 por 40 veces más; 9) Curva de melting
desde 65°C hasta 95°C, leer cada 0.2°C, mantener 1 sec; Fin. La especificidad de los
productos de PCR se confirmó a través del análisis de la curva de melting (curva de
disociación) y visualización en geles de agarosa. La curva estándar de referencia en este
estudio fue la misma obtenida por Moreta (2010).
Para esta prueba se seleccionó el suelo desnudo y suelo con B. humidicola CIAT16888
(actividad IBN alta) del campo experimental para validar las condiciones de
cuantificación. Como prueba se incluyó un grupo de 6 muestras de la población
Materiales y métodos 19
biparental que representan los extremos y niveles medios de los potenciales IBN
identificados en este estudio.
2.6 Análisis estadístico
Se aplicó el análisis de varianza (andeva) y el test LSD de mínimas diferencias
significativas con un alfa de 0.05% como la prueba de comparación de medias entre
tratamientos.
3. Resultados y discusión
3.1 Estimación del potencial IBN en diferentes genotipos de Brachiaria
3.1.1 Estandarización del bioensayo
Se confirmó la inserción estable del gen LuxAB en el genoma complementario de
Nitrosomonas ya que el producto de PCR mantiene el tamaño esperado de acuerdo con
Iizumi et al., 1998 (Figura 1).
Figura 1. Detección del gen luxAB en el genoma de Nitrosomonas. A. Electroforesis en
gel de agarosa de plásmido pHLUX20 y el producto de PCR del gen luxAB Mp: marcador
de peso 100bp, 1-2-3: plásmido pHLUX20. 4: Amplicon de luxAB de 1.4kb B. Mapa del
plásmido pHLUX20 reportado por Iizumi et al., 1997.Las flechas rojas indican la posición
de los cebadores.
El cultivo de Nitrosomonas presentó luminiscencia superior a 3x104 unidades relativas de
luz (RLU). La estabilidad de la luminiscencia permitió desarrollar la curva de respuesta a
la inhibición promovida por la Aliltiourea (AT), un inhibidor sintético de la nitrificación. La
AT actúa como inhibidor de la enzima amonio-monooxigenasa lo que permite su
aplicación para evaluar la respuesta de Nitrosomonas frente a inhibidores de su actividad
metabólica (Iizumi et al.,, 1996, Subbarao et al., 2006). Se asume que una disminución
en el metabolismo principal (oxidación de amonio) afecta directamente la luminiscencia
(Iizumi et al., 1996), por lo tanto el efecto inhibidor de una molécula se puede cuantificar
a partir de la inhibición de la luminiscencia (a mayor inhibición de la nitrificación menor
1.5 kb 1.0 kb
Mp 1 2 3 4
A B
22 Potencial de la inhibición biológica de la nitrificación (IBN) en forrajes tropicales
emisión de luz). De esta manera se construyó la curva del efecto de dosis de AT (Figura
2); donde se observa que a medida que se aumenta la dosis de AT en el bioensayo, la
emisión de luz registrada por el luminómetro disminuye y por ende se da un aumento del
porcentaje de inhibición. En este estudio la inhibición de 0.22 µM AT muestra el mismo
comportamiento reportado en la literatura (Zakir et al., 2010, Subbarao et al., 2012,
Pariaska et al., 2010, Subbarao et al., 2006, Subbarao et al., 2007), donde la inhibición
de la luminiscencia se va incrementando con la concentración de AT, siendo 83% la
inhibición de 0.22 µM. De acuerdo con Subbarao et al., (2006), 0.22 µM de AT debe
inhibir cerca del 80% de la luminiscencia en el bioensayo para considerar una bacteria
estable y un bioensayo confiable que permita la comparación adecuada entre diferentes
experimentos. Este parámetro permite la transformación del porcentaje de inhibición a
unidades de AT (ATU) donde un (1) ATU corresponde a una inhibición cercana al 80% de
la luminiscencia. Esta inhibición es directamente proporcional a la disminución en la
producción de nitrito, uno de los subproductos de la nitrificación (Subbarao et al., 2006)
soportando la tesis en la cual una inhibición de luminiscencia es evidencia directa de la
inhibición de la ruta metabólica de la nitrificación en el bioensayo, usando la
Nitrosomonas recombinante.
Figura 2. Efecto de dosis de diferentes concentraciones de Aliltiourea (AT) en la
inhibición de la luminiscencia emitida por la bacteria Nitrosomonas que porta el gen
LuxAB. Cada punto es el promedio de 4 réplicas
.
El 80% de inhibición generada por 0.22 µM de AT en el bioensayo también representa un
parámetro de estabilidad de la cepa de Nitrosomonas. Cultivos bacterianos que cumplen
con esta condición presentan respuestas estables frente al Dimetilsulfoxido (DMSO,
solvente en el que se diluyen los inhibidores para el bioensayo), los exudados y los
extractos de raíz. El porcentaje de inhibición generado por 0.22µM de AT se evaluó en
todos los lotes de cultivos bacterianos usados en este estudio (Tabla 2). Se observó
respuesta diferencial en cultivos bacterianos que tienen más de 6 días en suspensión
donde la inhibición por AT es mayor al 80%. A su vez, estas bacterias presentan
R² = 0.9661
0
20
40
60
80
100
0 0,02 0,12 0,22 0,3
Inh
ibic
ion
de
la lu
min
esce
nci
a (%
)
Concentracion de AT (µM)
Resultados y discusión 23
porcentajes de inhibición más elevados para los exudados y extractos de raíz. El tiempo
en el cual se observó la mayor estabilidad del cultivo desde la resuspensión en medio P,
es de aproximadamente 5 días.
Tabla 2. Efecto de 0.22µM de AT sobre la luminiscencia de los cultivos de Nitrosomonas
recombinante que porta el gen reportero de luciferasa LuxAB, usados en este estudio.
Cultivos
bacterianos
Inhibición de 0.22µM
de AT (%)
Lote 1 82.8± 1.1
Lote 2 84.2± 2.1
Lote 3 86.5± 1.2
Lote 4 83.6± 0.9
Lote 5 84.5± 0.4
El DMSO es un componente importante del bioensayo. Subbarao et al., (2006) lo incluye
como solvente para diluir los exudados radicales, porque presenta el menor efecto sobre
la luminiscencia de Nitrosomonas. En este estudio el DMSO inhibió entre el 15-20% de la
luminiscencia durante las primeras horas de resuspensión. La mayor inhibición efectuada
por DMSO se alcanzó al aplicar 6 µl donde se estabilizó la respuesta de Nitrosomonas en
aproximadamente 70% de inhibición (Figura 3). Para este estudio se usaron 2 µl de
DMSO como patrón de lectura, ya que en todas las mediciones este volumen presentó
una inhibición estable sin ser afectado por la concentración de la bacteria, es decir,
independiente de la cantidad de bacteria (RLUs altos) estas siempre fueron inhibidas
entre el 10 y el 15% por 2µl de DMSO.
A través de la evaluación del efecto de DMSO y AT, se establecieron los parámetros de
estabilidad para considerar un cultivo bacteriano óptimo para ser aplicado en la
determinación del potencial IBN de Brachiaria.
24 Potencial de la inhibición biológica de la nitrificación (IBN) en forrajes tropicales
Figura 3. Efecto de dosis de Dimetilsulfoxido (DMSO, solvente en el que se diluyen los
inhibidores para el bioensayo) sobre la luminiscencia emitida por la bacteria
recombinante Nitrosomonas que porta el gen reportero de luciferasa LuxAB. Cada punto
es el promedio de 4 réplicas medidas en el luminómetro.
3.1.2 Medición del potencial IBN en plantas utilizando el bioensayo
La estimación del potencial IBN se realizó con plantas crecidas en experimentos
controlados (hidropónico y materas en invernadero) y plantas de campo, de tal manera
que se cubriera todos los escenarios posibles para llegar a una fenotipificación precisa.
Se evaluaron dos fuentes de compuestos IBN. El primero son los exudados de raíz que
contienen inhibidores de la nitrificación, colectados a través del método de colecta de
exudados en una solución de NH4Cl2 (Subbarao et al., 2006). El segundo tipo de
compuestos consisten en los extractos metanolicos de compuestos IBN contenidos en la
raíz que han permitido caracterizar el IBN de otras especies (Tesfamariam et al., 2014).
La respuesta de Nitrosomonas frente a los compuestos exudados de Brachiaria se
evaluó a través de una curva de efecto de dosis (Figura 4). Se observó que los exudados
inhiben un máximo del 90% sin llegar a la inhibición total de la luz emitida. Este resultado
es congruente con los diferentes reportes que indican que los exudados de las plantas
con actividad IBN no detienen completamente la nitrificación sino que la inhiben
parcialmente (Subbarao et al., 2009, Ipinmoroti et al., 2008).
La curva de efecto de dosis indica que la inhibición es mediada por moléculas presentes
en los extractos evaluados y no por los solventes orgánicos. Subbarao et al., (2006)
sugieren realizar la prueba de efecto de dosis cada vez que se va a caracterizar la
R² = 0,9607
0
10
20
30
40
50
60
1 2 3 4 5
Inh
ibic
ion
de
lum
inis
cen
cia
(%)
Volumen (µl)
Resultados y discusión 25
actividad IBN de una especie nueva, como una manera de verificar que la inhibición es
debido a moléculas producidas por la planta.
Figura 4. Efecto de exudados de Brachiaria sobre la inhibición de la luz emitida por
Nitrosomonas recombinante, comparado con el efecto del DMSO. Las barras resaltan la
diferencia entre ambos tratamientos, indicando el porcentaje de inhibición específico del
exudado. Cada punto es el promedio de 4 réplicas.
Los extractos de compuestos IBN que presentan inhibiciones menores al 40% tienen
mayor variabilidad entre las réplicas biológicas que los extractos de plantas con alta
actividad IBN (mayores a una inhibición del 40%). En estudios previos (Pariaska et al.,
2010) se ha observado la misma variabilidad en la respuesta de Nitrosomonas cuando se
evalúan extractos con niveles bajos de IBN, sugiriendo que la sensibilidad del bioensayo
disminuye con este tipo de muestras.
A través de la espectrofotometría de masas se confirmó la presencia de braquialactona
(Figura 5), el único compuesto IBN caracterizado hasta la fecha responsable de cerca del
60% de la actividad inhibitoria de la totalidad de los compuestos colectados como
exudados radicales (Subbarao et al., 2009). El cromatograma obtenido presenta los
perfiles reportados por Subbarao et al., (2009), lo que confirma que la actividad IBN
reportada en este estudio es debida a las moléculas caracterizadas como responsables
de la mayoría del IBN de B. humidicola.
R² = 0,9885
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
1 2 3 4 5
Inh
ibic
ion
de
lum
inis
cen
cia
(%)
Volumen (µl)
Exudados
DMSO
26 Potencial de la inhibición biológica de la nitrificación (IBN) en forrajes tropicales
Figura 5. Espectrometría de masas de los exudados purificados de B.humidicola. La
presencia de las masas 121, 137, 199, 291, 334 indica la presencia de braquialactona,
según la referencia publicada por Subbarao et al., (2009).
Se evaluó la exudación de compuestos IBN en genotipos con actividad conocida con 3
meses de crecimiento en el cultivo hidropónico (Tabla 3). Los ATU por gramo de raíz
mantienen la tendencia con respecto a los reportados en otros estudios (Subbarao et al.,
2009, Subbarao et al., 2007). De mayor a menor actividad se encuentran los genotipos
de Brachiaria humidicola CIAT26159, CIAT16888 y CIAT26146. La menor actividad fue
observada para la especie P.maximum.
En contraste con otros reportes (Tabla 3), se observan diferencias en los órdenes de
magnitud para los valores de IBN específico (ATU por gramo de raíz) que puede ser
explicado por diferencias en los protocolos de purificación que han cambiado desde su
primera publicación hace 4 años, en conjunto con la mayor sensibilidad del luminómetro
moderno utilizado en este trabajo. Evidencia de esto, es que muchos de los IBN
específicos reportados para diferentes especies en la referencia del presente estudio
(Subbarao et al., 2007) han sido re-evaluados. Tal es el caso del Arroz, que fue reportado
como una especie sin IBN en el 2007 y un estudio posterior (Pariaska et al., 2010)
muestra genotipos de Arroz con actividad IBN. Por otro lado, se sabe que puede haber
diferencias en el orden de magnitud del potencial IBN entre muestras colectadas a
diferentes tiempos del mismo genotipo si se usa el bioensayo como indicador (Subbarao
et al., 2009). Evaluar los genotipos en el mismo tiempo y bajo las mismas condiciones se
convierte en la principal vía de comparación del potencial IBN de una especie dada. A
pesar de las diferencias en el orden de magnitud con otras publicaciones, los resultados
obtenidos mantienen la misma tendencia en la categorización de alto, bajo y medio IBN
de los genotipos evaluados.
Resultados y discusión 27
Tabla 3. Potencial IBN observado en algunas accesiones de B. humidicola y Panicum
maximum con la técnica del bioensayo en este estudio comparado con reportes previos.
Genotipo Peso seco
de raíz (gr)
ATU por gramo de
raíz (IBN
especifico)
ATU por gramo de
raíz (Subbarao et al.,
2007, 2009)
CIAT26146 0.34±0.08 42.02±18.96 bajo/medio*
CIAT16888 0.31±0.05 109.49±12.54 53.8
P.maximum 6.51±1.60 8.98±2.14 0.7
CIAT26159 0.19±0.03 165.91±10.56 46.3
* Genotipo publicado como bajo/medio IBN sin un valor asignado.
Una de las desventajas de evaluar el potencial IBN a través de los exudados radicales es
que el mantenimiento de un sistema hidropónico es costoso y su manejo hace poco
eficiente el desarrollo de métodos rápidos y confiables para evaluar el IBN de las plantas,
además de ser un sistema artificial donde la interacción planta-suelo está ausente.
Cuantificar el potencial IBN a partir de extractos de raíz supone una ventaja que permite
la aplicación de esta metodología a plantas de campo.
Dado que los exudados han sido la fuente principal de potenciales IBN reportados, se
comparó los exudados con los extractos de raíz para confirmar que estos tratamientos
representan el mismo potencial IBN de un genotipo. Consecuentemente, se evaluó un
subgrupo de muestras provenientes de una generación F1 de la población biparental,
crecidas en un sistema hidropónico de acuerdo a las condiciones establecidas para el
estudio del potencial IBN en otras especies (Pariaska et al., 2010, Subbarao et al., 2007,
Subbarao et al., 2012b). Este grupo de muestras contiene dos genotipos con potencial
IBN conocido (parentales) y 15 genotipos de la progenie con IBN desconocido (Figura 6).
28 Potencial de la inhibición biológica de la nitrificación (IBN) en forrajes tropicales
Figura 6. Comparación entre diferentes fuentes de compuestos IBN (Exudados y
extracto radical) en 17 genotipos de B. humidicola. En asterisco las parejas que
presentaron diferencias significativas según el test LSD (0.05). Desviación estándar de 3
réplicas biológicas.
Según el análisis de varianza hay diferencias entre el IBN exudado y el IBN de los
extractos de tejido. Se observó que el potencial IBN del tejido es mayor al obtenido por
exudado, relación que ha sido reportada en otros estudios (Subbarao et al., 2012b). Sin
embargo, no hay diferencias significativas para 7 genotipos entre las dos fuentes de
compuesto IBN. Esta coincidencia entre los ATU obtenidos de ambas fuentes se observó
para la mayoría de genotipos con niveles exudados por encima de 25 ATU, lo que
significa que a partir de este valor la exudación y los extractos de raíz aportan
información similar acerca del potencial IBN de un genotipo.
Sin embargo se observaron diferencias significativas en los genotipos que presentan bajo
IBN (por debajo de 25 ATU). Esto puede ser debido a una baja eficiencia en la
purificación de compuestos IBN a partir de los exudados en conjunto con la falta de
sensibilidad del bioensayo al momento de detectar una baja actividad (Pariaska et al.,
2010). A pesar de esta diferencia entre el exudado y el extracto de raíz hay una alta
correlación entre las dos variables (Figura 7). Es decir, según el coeficiente de
correlación (R2= 0.9) genotipos con potencial altos, medio y bajo se mantienen con la
misma tendencia, independiente de que se use la medición con extractos IBN
provenientes de exudados y extractos de la raíz. Esto indica que posiblemente la mayoría
de las moléculas inhibitorias de la nitrificación que son sintetizadas en la raíz de
Brachiaria, son exudadas al medio.
**
**** ** ** **
**
**
0
20
40
60
80
100
120
140
160A
TU p
or
gram
o d
e ra
iz IBN obtenido de exudado
IBN obtenido de extracto de raiz
Resultados y discusión 29
Figura 7. Relación entre el potencial IBN medido con el bioensayo entre compuestos
obtenidos del tejido radical (tejido-ATU por gramo de raíz) y exudados de la raíz
(Exudación ATU por gramo de raíz) para 17 de genotipos de B humidicola. Se resaltan
los parentales con actividad IBN conocida. Cada punto corresponde al promedio de 3
réplicas biológicas.
Sabiendo que el extracto de raíz representa el potencial IBN de una planta, se usó para
determinar si la actividad IBN obtenida por este método responde al amonio, el principal
estimulo que promueve la exudación de compuestos IBN (Subbarao et al., 2007). Para
ello se usó plantas de campo con actividad IBN confirmada por Subbarao et al., 2009
(Figura 8), sustrayendo las plantas del suelo y comparando los extractos de raíz, con y
sin el estímulo de cloruro de amonio 1mM (NH4CL). Se obtuvo diferencias significativas
entre el potencial IBN para CIAT16888 y CIAT679 cuando fueron estimulados con
amonio y no se observaron diferencias significativas para P.maximum y Mulato, bajo este
mismo tratamiento (Figura 8). Los resultados indican que especies con IBN bajo
(P.maximum y Mulato), responden menos al amonio que los dos genotipos de Brachiaria
con IBN alto (CIAT 16888 y CIAT679), los cuales presentan diferencias significativas en
la actividad IBN antes y después de ser tratados con NH4CL. Especialmente el genotipo
CIAT16888 fue el que más potencial IBN produjo después del tratamiento con amonio,
incrementando 0.7 veces más su actividad. Estas evidencias dan soporte a que la
extracción de tejido es un buen indicador del potencial IBN de una especie, evitando la
dificultad que supone el montaje y desarrollo de un experimento en un sistema
hidropónico. La diferencia en la respuesta al amonio entre genotipos de Brachiaria, es
evidencia de que factores genéticos pueden estar relacionados con la síntesis de
compuestos IBN en relación con el amonio presente en el medio. El genotipo CIAT16888
se ha caracterizado por su alta actividad IBN, posiblemente su alta respuesta frente al
amonio con respecto a los otros genotipos evaluados, puede ser la razón que explique
esta característica.
Bh26146
Bh16888
0
20
40
60
80
100
120
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Tejid
o-
ATU
po
r gr
amo
de
raiz
Exudacion- ATU por gramo de raiz
30 Potencial de la inhibición biológica de la nitrificación (IBN) en forrajes tropicales
De este resultado también se observó que las plantas de campo presentan mayores
órdenes de magnitud del potencial IBN (Figura 8) comparado con los ATU obtenidos de
solución hidropónica (ver Figura 6). Aunque se mantiene la tendencia respecto a niveles
IBN observados entre ambos experimentos, las proporciones entre genotipos altos y
bajos se reducen. La vigorosidad, edad de las plantas y la diferencia en los sustratos de
crecimiento (suelo campo vs hidropónico) pueden explicar estas diferencias. Respecto a
los resultados reportados por Subbarao et al., (2009), se obtuvieron las mismas
tendencias en la actividad IBN entre genotipos siendo los genotipos de B.humidicola
CIAT 16888 y CIAT679 más altos que P.maximum y Mulato.
Figura 8. Comparación de diferentes genotipos frente a la actividad IBN detectada por
bioensayo a partir del extracto de raíz, antes y después de ser estimulada por amonio
(NH4CL 1mM). En asterisco grupos de muestras con diferencias significativas según la
prueba LSD (0.05).
La reproducibilidad del potencial IBN obtenido por extractos de raíz, se validó a partir de
la extracción de diferentes cantidades de tejido radical de un mismo genotipo (Tabla 4).
Según el coeficiente de determinación obtenido (R2 = 0.99), mayor cantidad de tejido
empleado para la extracción corresponde a una mayor inhibición expresada en ATU.
Cuando esta variación se normaliza por gramo de raíz para calcular el potencial IBN por
unidad de tejido, se obtuvo un promedio de 169.12 ATUs por gramo de las 4
extracciones. Esto indica que el potencial IBN obtenido del tejido radical es reproducible
a través de diferentes eventos de extracción, independiente de la cantidad de tejido que
****
0
100
200
300
400
500
600
700
P.maximum Mulato CIAT679 CIAT16888
ATU
po
r gr
amo
de
raiz
IBN obtenido de extracto de tejido
IBN obtenido de extracto de tejido, despuesde estimulacion con amonio por 24 horas
Resultados y discusión 31
se utilice, siendo 100mg de raíz suficiente para determinar el potencial IBN contenido en
la raíz de Brachiaria.
Tabla 4. Potencial IBN obtenido de diferentes cantidades de tejido de raíz de Brachiaria,
usando el bioensayo
Cantidad de
tejido (mg) ATU total ATU por gramo de raíz
100 17.22 ±0.35 171.23±27.74
250 50.56±4.39 184.52±17.84
500 87.44±7.31 151.73±18.13
1000 191.37±17.83 169.03±49.43
R2 = 0.99 Promedio = 169.12
Los resultados indican que los extractos de raíz representan la actividad IBN que exuda
la planta a la solución del suelo. A su vez, el potencial IBN obtenido de este tipo de
muestra presenta niveles de variación bajos con respecto a los exudados que presentan
un mayor grado de variación. Por lo tanto en este estudio se estandarizo una herramienta
que permite estudiar la dinámica del IBN de una manera rápida y eficiente, en contraste
con los protocolos basados en exudados para el estudio del IBN en Brachiaria reportados
en la literatura.
Es importante determinar la relación entre el potencial IBN y la inhibición de la
nitrificación en el suelo, que permita sumar evidencias a la comprensión de este carácter
y por ende se realice una fenotipificación más completa. En este estudio se incluyeron
otras evidencias para estudiar el impacto del IBN sobre la comunidad de microrganismos
nitrificantes, que permitan establecer la relación entre potencial contenido en un
determinado genotipo y el efecto de este potencial en el suelo.
3.2 Estimación de las tasas de nitrificación
En este estudio se usó la incubación de suelo aplicada para un suelo de tipo Oxisol
(suelo Llanos) con pH ácidos y ricos en aluminio proveniente de los Llanos Colombianos.
La estandarización de esta técnica se realizó utilizando un suelo vertisol (suelo CIAT),
que tiene pH cercano a la neutralidad (ver materiales y métodos, Tabla 1)
32 Potencial de la inhibición biológica de la nitrificación (IBN) en forrajes tropicales
La estandarización se hizo considerando el suelo desnudo (sin ningún tipo de planta)
como la matriz óptima para evidenciar la actividad de los nitrificantes a través de la
cuantificación de sus productos metabólicos, que pueden ser estimulada o inhibida por
las plantas. Estudios han mostrado que el suelo desnudo presenta tasas de nitrificación
más elevadas que suelos donde hubo plantas con actividad IBN (Subbarao et al., 2009,
Iponmoroti et al., 2008).
Se estableció como controles para la estandarización, el suelo desnudo y suelo desnudo
suplementado con Nitrosomonas, con el objetivo de relacionar la producción de nitrato
con la actividad amonio-oxidante mediada por un microorganismo nitrificante exógeno. La
cepa de Nitrosomonas que se adicionó al suelo desnudo, es la misma que fue descrita
anteriormente y que tiene la capacidad de emitir luz, con RLUs de 35586 ± 3856, y una
densidad óptica de 0.6 .Estas características (especialmente el RLU) muestra a un
microorganismo activo metabólicamente. Como control negativo se usó suelo desnudo
con diciandiamida (DCD) al 10%.
Las muestras se incubaron de acuerdo con la metodología (Ver materiales y métodos) y
se cuantificó la producción de nitrato durante diez días. Los resultados presentados en la
figura 9, muestran que la mayor producción de nitrato en los tratamientos se dio en el
final de periodo de incubación (10 días), que presentó 66.807 ±10.2 mg de N-NO3- por kg
de suelo para el suelo desnudo con el suplemento de Nitrosomonas y 45.63 ± 5.23 para
el suelo desnudo sin la adición de Nitrosomonas. El promedio del coeficiente de
determinación R2 del experimento fue de 0.94 mostrando que a mayor tiempo de
incubación, mayor producción de nitrato. El suelo con Nitrosomonas produjo
significativamente 0.6 veces más nitrato que el suelo desnudo debido a una mayor
abundancia de microrganismos nitrificantes sobre la producción de nitrato.
El DCD es un inhibidor sintético de la nitrificación que se utilizó como control negativo en
el experimento, donde la enzima amoA esta inhibida por este agente y por lo tanto la
nitrificación es limitada (Liu et al., 2014). En este experimento de incubación de suelo con
condiciones controladas, el efecto del DCD sobre el nitrato producido es claro, ya que
mantiene el nitrato en su estado basal, sin incrementarse en el tiempo (Figura 9). El DCD
es usado como un inhibidor que se aplica al suelo para reducir las tasas de nitrificación y
disminuir su efecto negativo sobre la productividad de un cultivo (Guo et al., 2013). Actúa
inhibiendo la enzima amoA (Liu et al., 2014, Zacherl et al., 2009) sin afectar el paso
subsiguiente que involucra la reducción de hidroxilamida hasta nitrito (Subbarao et al.,
2009). Otros estudios han mostrado el efecto del DCD sobre el nitrato producido en la
incubación de suelo (Zheng et al., 2012) y en condiciones de campo (Guo et al., 2013),
donde se reporta una inhibición de más del 99% de la actividad de nitrificantes, similar a
lo obtenido en este estudio.
El tiempo de incubación evaluado en este experimento fue de diez días. Este rango de
evaluación fue determinado considerando la aplicación de la metodología en un alto
número de muestras (high throuhput screening) que permita evaluaciones rápidas y
efectivas para conocer sin ambigüedad el efecto del potencial IBN de diferentes (cientos)
Resultados y discusión 33
genotipos en el suelo donde crecen. Otros estudios han usado diferentes tiempos de
incubación para evaluar la dinámica de la nitrificación, que van desde 56 días (Iponmoroti
et al., 2008), 30 días (Zhang et al., 2012), siete días (Cardoso et al., 2011) y 15 días
(Ghoneim et al., 2014), con resultados similares a los obtenidos en este estudio. La
incubación de suelo rizosférico a diez días, junto con el seguimiento de la producción de
nitrato y la estabilidad de amonio en el tiempo pueden ser buenos indicadores de la
actividad IBN en cultivos.
Figura 9. Producción de nitrato durante diez días usando el método de incubación de
suelo. Los tratamientos evaluados son suelo CIAT desnudo, suelo CIAT desnudo con
Nitrosomonas y suelo CIAT desnudo con DCD. Cada punto es el promedio de tres
replicas técnicas.
La tasa de producción de nitrato se estimó como la pendiente del modelo lineal que
explica el incremento del nitrato en el tiempo (Figura 10). Considerando todos los tiempos
de incubación, el suelo con Nitrosomonas produce 6.06 ±1 mg de N-NO3-por kilogramo
de suelo por día, a diferencia del suelo desnudo que produce 4.04±0.5 (Figura 10A).
Según este indicador, el efecto de agregar un microrganismo nitrificante exógeno
incrementa significativamente 0,6 veces más la producción de nitrato por día. La
pendiente obtenida en el tratamiento con DCD es negativa (-0.237) indicando que en
lugar de producción, hubo reducción de nitrato en el tiempo, en una tasa de salida de
0.237 mg de N-NO3- por día. Ya que el DCD no afecta la dinámica de otros
microorganismos diferentes a los nitrificantes (Liu et al., 2014, Zacherl et al., 2009) la
salida de nitrato del sistema puede ser debida a la actividad de microorganismos que
66,807
45,63195
3,5204
0
10
20
30
40
50
60
70
80
T0 T2 T4 T6 T8 T10
mg
de
N-N
O3
-p
or
Kg
de
su
elo
Tiempo de incubacion en dias
Suelo desnudo + Nitrosomonas
Suelo desnudo
Suelo desnudo + DCD
34 Potencial de la inhibición biológica de la nitrificación (IBN) en forrajes tropicales
estarían fijando el nitrógeno disponible en su biomasa, o por microorganismos
denitrificantes que actúan sobre las formas de nitrógeno que son sustrato para la
producción de otros metabolitos como el óxido nitroso o N2 (Canfield et al., 2010)
Figura 10. Tasas de nitrificación en un vertisol (suelo CIAT) comparadas entre los
tratamientos de suelo desnudo, suelo con Nitrosomonas y suelo desnudo con DCD. A)
Tasas obtenidas usando todos los valores desde los tiempos de incubación T0 hasta T10
B) Tasas obtenidas de dos rangos de tiempo, de T0 a T6 y T6 a T10.
Durante el tiempo de incubación se observaron dos tendencias con pendientes diferentes
que posiblemente reflejan dinámicas metabólicas diferentes (ver Figura 9). Una que va
desde el día 0 hasta el día 6 (T0-T6) y otra que va desde el día 6 hasta el 10 (T6-T10). La
comparación de las tasas para cada uno de estas sub-incubaciones (Figura 10B)
muestra una producción de nitrato por día estadísticamente diferente entre los dos
grupos, siendo la producción de nitrato más alta de 10.89 ±3.4 para el T6-T10 del suelo
con Nitrosomonas. Estas tendencias diferentes en la producción de nitrato pueden ser
explicadas por el estado de latencia de los microorganismo nitrificantes, que requieren de
un tiempo con las condiciones ideales (humedad y temperatura) para restablecer su
metabolismo a las condiciones dadas por el micro-cosmos al que son sometidas (e.g
elevado contenido de amonio, física del suelo alterada por efecto de homogenización,
desecación del suelo durante dos días). Este resultado indica que se obtiene un mejor
reflejo de la actividad metabólica de los microorganismos nitrificantes si se aplica un
periodo de pre-incubación con el objetivo de romper el estado quiescente en el que
A B
Resultados y discusión 35
algunos microrganismos nitrificantes se pueden encontrar. El hecho de que se pueda
monitorear eficientemente y con baja variabilidad la nitrificación con la incubación de
suelo y que en los controles con adición de Nitrosomonas y DCD se observen los
resultados esperados de aumento y disminución de la tasas de nitrificación
respectivamente, indica que esta metodología es una herramienta que se puede utilizar
para estudiar la actividad IBN entre los suelos donde crecen diferentes genotipos.
Se evaluó la dinámica de la nitrificación en un oxisol procedente de los Llanos
Colombianos (Ver tabla 1) bajo las mismas condiciones mencionadas anteriormente (ver
materiales y métodos). Por su extensión, esta zona geográfica tiene potencial para el
desarrollo agronómico del país, donde el IBN representa una tecnología que puede
promover el desarrollo agronómico ecoeficiente (Rao et al., 2014). La tasa de nitrificación
de este oxisol es menor que el suelo CIAT (Figura 11, Tabla 5). La producción de N-NO3-
alcanzó su máximo en 7.56 mg de N-NO3- por kg de suelo en contraste con los 45.63 mg
observados en la incubación a los diez días con suelo colectado en el CIAT. El contenido
de nitrato al momento de iniciar la incubación es similar entre ambos tipos de suelos
(Tabla 5) sin embargo, el nitrato final producido entre los suelos es significativamente
diferente, siendo 6 veces más alto en el suelo CIAT.
Los datos presentados en la tabla 5 y la figura 11 permiten concluir que los tipos de suelo
evaluados tienen diferentes dinámicas relacionados con la actividad de microorganismos
nitrificantes. Para el intervalo de tiempo evaluado, la tasas de nitrificación (pendiente) del
suelo de los Llanos corresponde a 0.27 mg de N-NO3- por kg por día, siendo
significativamente más baja que la tasa de producción en el suelo CIAT que presento
4.04 mg de N-NO3- por kg por día.
Tabla 5. Comparación de la producción de nitrato usando el método de incubación de
suelo entre los suelos colectados en los Llanos orientales de Colombia y en CIAT para 10
días de incubación.
Suelo desnudo
mg NO-3 por Kg de suelo
inicial
mg N-NO3- por
Kg de suelo Final**
R2**
mg de N-NO3
- por Kg de suelo por
día**
Vertisol CIAT 15.29 ±1.41 175.51 ±13.33 0.94 ±0.03 4.04 ±0.25
Oxisol Llanos 15.73 ±1.73 29.10 ±5.61 0.61 ±0.18 0.27 ±0.08
** Diferencias significativas entre los tratamientos según test LSD (0.05).
36 Potencial de la inhibición biológica de la nitrificación (IBN) en forrajes tropicales
Figura 11. Producción de nitrato (mg de N-NO3- por Kg de suelo) en un suelo desnudo
oxisol proveniente de los Llanos Colombianos obtenido usando el método de incubación
de suelo durante 10 días. Cada punto es el promedio de 3 réplicas técnicas.
Figura 12. Producción de nitrato (mg de N-NO3- por Kg de suelo) en un suelo desnudo
oxisol proveniente de los Llanos Colombianos con incubación prolongada del día 12
hasta el día 20. Los tratamientos evaluados son suelo desnudo sin cobertura vegetal,
suelo desnudo con Nitrosomonas, suelo desnudo con el inhibidor de nitrificación DCD.
Cada punto es el promedio de 3 réplicas técnicas.
Ante la poca producción de N-NO3- y el bajo R2 observado en la incubación con suelo de
los Llanos ( Figura 11, Tabla 5), se decidió extender el tiempo partir del décimo día de
3
4
5
6
7
8
9
T0 T2 T4 T6 T8 T10
mg
de
N-N
O3
-p
or
Kg
de
sue
lo
Tiempo de incubacion en dias
Suelo desnudo llanos
76,6077
59,0538
87,6928
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100
T12 T14 T16 T18 T20
mg
de
N-N
O3
-p
or
Kg
de
suel
o
Suelo desnudo
Suelo desnudo + DCD
Suelo desnudo + Nitrosomonas
Resultados y discusión 37
incubación con los mismos tratamientos evaluados en el suelo CIAT (adición de
Nitrosomonas como control positivo y adición de DCD como control negativo) (Figura 12).
Este resultado muestra que en suelo desnudo de los Llanos, la producción de nitrato
puede llegar a ser hasta 65 mg de N-NO3- por kg de suelo al día doce; sugiriendo la
necesidad de extender el tiempo de incubación de suelo cuando se utiliza suelo con
estas características para poder observar una nitrificación más activa. Como se puede
observar en la figura 12, el tratamiento que contiene DCD tiene un N-NO3- base de 60.33
mg y final de 59.63 mg, por lo que evidentemente la nitrificación fue inhibida al 100%.
Este hecho sugiere que el contenido de N-NO3- basal en estas muestras está cercano a
los 60mg por kg de suelo, siendo este nitrato el producto de los nitrificantes naturales
presentes en el suelo antes del muestreo, cuya actividad fue bloqueada por acción del
DCD al iniciar la incubación del suelo de manera controlada en el laboratorio. Durante el
periodo de preincubación de once días el N-NO3- se incrementó en 3 mg para el suelo
desnudo y 9 mg para el suelo desnudo con la adición de Nitrosomonas, lo cual está
relacionado con las tasas de nitrificación observadas para 10 días en este mismo suelo
(Ver Figura 11). Las tasas de nitrificación por día observadas para los tratamientos
evaluados (Figura 13) muestran que no hay diferencias significativas entre la tasa de
producción de nitrato en el suelo desnudo (2.87±0.26) y el suelo donde el cultivo de
Nitrosomonas fue adicionado (2.31±0.83). Por otro lado, ambos tratamientos (suelo
desnudo y suelo desnudo con adición de Nitrosomonas) son significativamente diferentes
del suelo con adición de DCD que presentó una tasa de tan solo 0.36±0.38 mg de N-NO3-
por kg de suelo, por día. El efecto de aplicar una cantidad adicional de microrganismos
nitrificantes no se observó en el suelo Llanos en contraste con lo observado en la
incubación del suelo CIAT (figura 9, figura 10), posiblemente se deba a la falta de
condiciones óptimas de pH y composición del suelo para que la cepa de Nitrosomonas
pueda crecer (Esta cepa viene de ser cultivada en un medio liquido con pH 7.8, ver
materiales y métodos).
38 Potencial de la inhibición biológica de la nitrificación (IBN) en forrajes tropicales
Figura 13. Tasas de nitrificación (mg de N-NO3- por kg de suelo por día) obtenidas en un
oxisol (suelo Llanos) mediante la incubación de suelo. Desviación estándar de 3 réplicas.
Las bajas tasas de nitrificación en suelos ácidos se han discutido ampliamente en la
literatura. Factores como el pH del suelo tienen un efecto considerable sobre la actividad
microbiana y por ende en los procesos biogeoquímicos (Nicol et al., 2008, Kresovic et
al., 2010, Cuhel et al., 2010). El pH afecta las formas químicas, la concentración y
disponibilidad de ciertos sustratos, que inciden sobre el crecimiento celular y la actividad
de microorganismos (Nicol et al., 2008). Otras características propias del suelo de los
Llanos es la presencia de aluminio (ver tabla 1). Esta condición en particular también
puede afectar la producción de nitrato ya que se ha observado que la concentración alta
de metales afecta negativamente las tasas de nitrificación (Langdon et al., 2014), Por lo
tanto los parámetros fisicoquímicos del suelo de los Llanos puede explicar la diferencia
en las tasas de nitrificación observada entre los suelos analizados.
3.2.1 Efecto de plantas sobre las tasas de nitrificación en el suelo rizosférico
La comparación entre las tasas de nitrificación de plantas con IBN conocido, permitió
optimizar la metodología de incubación para categorizar plantas con nulo, bajo y alto IBN.
Se usó la incubación de suelo para comparar las tasas entre el suelo desnudo y suelo
donde se estableció B. humidicola CIAT16888 durante aproximadamente 10 años (Figura
14). Esta parcela experimental ha sido útil para evaluar pruebas de concepto de IBN
(Subbarao et al., 2009). Según los resultados, el incremento en la producción de N-NO3-
observado a partir del cuarto día de pre-incubación (Figura 14 B) muestra una producción
de nitrato 14 veces más alta en el suelo desnudo con respecto al suelo donde está
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
Suelo desnudo Suelo desnudo + DCD Suelo desnudo +Nitrosomonas
mg
de
N-N
O3-
po
r K
g d
e su
elo
po
r d
ia
Resultados y discusión 39
sembrado B. humidicola CIAT16888. Este resultado permite concluir dos cosas: La
primera es que aplicar el tiempo de pre-incubación es una manera eficiente de muestrear
la actividad metabólica de los nitrificantes presentes en el suelo al hacer las mediciones
en el tiempo donde los microrganismos están más activos. La reproducibilidad entre los
diferentes experimentos (Figura 10 y figura 14B) para los tiempos en que se pueden
comparar los suelos desnudos (T4, T6 y T8), muestran resultados similares, llegando a
un pico de 112 mg de N-NO3- por kg de suelo cuando se lleva hasta el día doce de
incubación, con la respectiva tasa de nitrificación de aproximadamente 10 mg de N-NO3-
por kilogramo de suelo por día para los dos experimentos. La segunda conclusión de
este experimento es que la inhibición de la nitrificación mediada por B. humidicola es
evidente y medible a través del método de incubación de suelo. En este tratamiento,
aunque la producción de N-NO3- se mantiene en el tiempo según el coeficiente de
determinación (R2 = 0.93 ±0.04), la producción es significativamente menor que el suelo
CIAT desnudo, llegando a una tasa de producción de 0.46 ± 0.082 mg de N-NO3- por
kilogramo de suelo por día en comparación con los 10.6 mg de N-NO3- por kilogramo de
suelo por día que produce el suelo desnudo (Figura 14). Este resultado es congruente
con los reportes, que muestran a la inhibición de la nitrificación mediada por la accesión
de B. humidicola CIAT16888 como la más alta dentro de diferentes genotipos de
Brachiaria analizados (Subbarao et al., 2007, Subbarao et al., 2009).
Figura 14. Producción de N-NO3- (mg por kg de suelo) en suelo desnudo (sin cobertura
vegetal) y suelo con un cultivo de Brachiaria humidicola accesión CIAT16888, usando el
método de incubación de suelo durante 8 días a partir del 4 día de preincubación. A) Foto
de parcelas de campo donde se realizó el muestreo de suelo. B) Producción de N-NO3-
durante 12 días. Cada punto corresponde al promedio de tres replicas técnicas.
A B
Suelo desnudo
CIAT16888
40 Potencial de la inhibición biológica de la nitrificación (IBN) en forrajes tropicales
De los resultados también se puede observar que a diferencia de la inhibición mediada
por el inhibidor sintético DCD, la inhibición por B. humidicola no detiene la actividad de
los microorganismos nitrificantes. En comparación con el suelo desnudo, la accesión
CIAT16888 de B humidicola inhibe el 96% de la nitrificación el suelo con una reducción
en la producción final de nitrato del 92%. Esto es una ventaja para sistemas donde se
utilizan genotipos con altos niveles de IBN, considerando un escenario donde es continua
la disponibilidad en el suelo de nitrato y amonio en el tiempo disponibles para la
asimilación por las plantas, sin la rápida salida de nitrógeno del sistema (Subbarao et al.,
2012).
El uso de la tierra con sistemas agronómicos de manera prolongada, incluyendo
aplicaciones de altas dosis de fertilizantes nitrogenados, puede llegar a incrementar las
tasas de nitrificación en el suelo (Subbarao et al., 2012). Siguiendo este orden de ideas,
se hizo la comparación de la nitrificación a través de la incubación de dos suelos
colectados en dos tipos de cultivos: uno con uso prolongado de B. humidicola CIAT679 y
el otro con cultivo de largo tiempo de Oriza sativa, ambos sistemas localizados en los
Llanos orientales de Colombia (figura 15 B). Los resultados indican que en el suelo
Llanos, el continuo cultivo de arroz ha llevado a tener tasas de nitrificación superiores al
suelo desnudo, mientras que el continuo cultivo de Brachiaria mantiene baja las tasas de
nitrificación (Figura 15 B). En este y otros estudios se ha demostrado consistentemente
que el suelo desnudo al no tener plantas que usen el nitrógeno disponible, presenta una
mayor producción de nitrato en el tiempo (mayor tasa de nitrificación). Si un cultivo
estimula las tasas de nitrificación puede significar un rápido flujo de nitrógeno a través de
esta ruta metabólica, que se traduce en pérdidas de fertilizantes (Subbarao et al., 2012).
En este sentido, un cultivo intensivo de Brachiaria mantiene la baja nitrificación en el
suelo (Figura 14, Figura 15B).
Actualmente se está evaluando si la condición de nitrificación reducida (por efecto IBN)
se mantiene en el suelo después de remover las plantas de Brachiaria y así verificar si se
presenta un efecto residual que incida positivamente sobre el uso eficiente del nitrógeno
de un cultivo sucesivo a Brachiaria. Este concepto busca una aplicación práctica de IBN
en rotación pastos-cultivos y está siendo probada en sistemas de rotación con maíz,
cultivo que han mostrado elevadas tasas de nitrificación (Karwat et al., datos no
publicados). Usando el método de incubación de suelo estandarizado en este estudio, se
confirmó que otras especies forrajeras (especialmente leguminosas) como Stylosanthes
guinensis pueden llegar a estimular la nitrificación (Sylvester-Bradley et al., 1988) (Figura
15A), reforzando la idea de que el IBN no es una característica presente en todos los
grupos taxonómicos de plantas y que se encuentra especialmente acentuada en la
especie Brachiaria humidicola y otras especies del genero Brachiaria. En este sentido,
existe evidencia de que los exudados de algunas plantas estimulan la nitrificación; un
ejemplo de ello es Eperua falcata, un árbol que exuda compuestos que estimulan la
nitrificación y que además inhiben el grupo de microorganismos denitrificantes que usan
el nitrato como fuente de energía (Michalet et al., 2013).
Resultados y discusión 41
De acuerdo con la evidencia, Michalet y colaboradores proponen la hipótesis de que la
inhibición de la denitrificación es una estrategia adaptativa de la especie que promueve la
formación y estabilidad del nitrato ya que E. falcata prefiere nitrato en lugar que amonio.
Aplicando esta hipótesis a Brachiaria humidicola, se ha observado que este forraje no
tiene preferencias por alguna de las dos formas asimilables de nitrógeno (amonio y
nitrato) ya que puede usar eficientemente las dos para su metabolismo, siendo uno de
los atributos de este pasto que explica su capacidad invasora y rápido crecimiento (Rao
1999).
Figura 15. Aplicación de la metodología de incubación de suelo estandarizada en este
estudio para detectar diferencias en las tasas de nitrificación en suelos con diferentes
cultivos: Stylosanthes guinensis accesión 12278, Oriza sativa, B. humidicola accesión
679 y un suelo desnudo (sin cobertura vegetal). Desviación estándar de 3 réplicas.
Bajo el escenario del IBN que supone una mayor disponibilidad de amonio en lugar de
nitrato, estudios con plantas crecidas en solución nutritiva (condiciones controladas)
muestran que B.humidicola incrementa su producción en niveles altos de amonio, donde
otras especies de Brachiaria (con bajo IBN) presentan inhibición en su crecimiento (Rao
1999). Sin embargo, para conocer en detalle si se trata de una respuesta adaptiva de
Brachiaria en términos de la competencia con los microorganismos nitrificantes por el
nitrógeno, se requiere de estudios que aborden estas hipótesis de investigación.
Las evidencias mostradas en este estudio indican que la metodología de incubación de
suelo es un buen indicador del efecto inhibitorio de la nitrificación (IBN) que pueda causar
un genotipo dado al suelo donde crece. La sensibilidad de la prueba en la discriminación
A B
42 Potencial de la inhibición biológica de la nitrificación (IBN) en forrajes tropicales
de plantas respecto su potencial IBN y su consecuencia en la nitrificación del suelo
donde crecen, se discute más adelante en la fenotipificación de la población biparental de
B. humidicola (sección 5.4)
3.3 Efecto del IBN sobre la comunidad microbiana nitrificante del suelo
3.3.1 Cuantificación de archaeas y bacterias nitrificantes del suelo
Estudios previos han mostrado que la disminución en las tasas de nitrificación están
asociados con disminución en poblaciones de microorganismos nitrificantes (Subbarao et
al., 2009, Zhang et al., 2012). Bajo el efecto IBN se afectan específicamente nitrificantes
y no otros microorganismos asociados al suelo (Gopalakrishnan et al., 2009). En el
presente estudio se estimó a través de la cuantificación del gen amonio monoxigenasa
(amoA), la cantidad de microorganismos nitrificantes presentes en los suelos evaluados y
donde crecían diferentes genotipos con diferentes potenciales IBN. Esto con el objetivo
de correlacionar las variables evaluadas (potencial IBN por bioensayo y tasas de
nitrificación por incubación de suelo) para validar los resultados obtenidos en muestras
contrastantes. Se aplicó esta metodología a los tratamientos suelo desnudo y suelo
donde se estableció Brachiaria humidicola CIAT16888, de donde se obtuvo los
potenciales IBN por bioensayo (ver figura 8) y tasas de nitrificación por incubación de
suelo (ver figura 14).
Resultados y discusión 43
Figura 16. Amplificación por PCR de genes funcionales amoA de archaea y bacteria en
DNA de suelo y curvas de disociación o de “melting” mostrando amplificaciones
específica para los genes evaluados. A) tamaños de los productos de PCR del gen
amoA de bacterias. 1. Marcador de peso 1kb plus. 2. Amplicon de amoA bacteria. 3.
Control negativo sin DNA. B) Curva de disociación obtenida para el qPCR del amoA
bacteriano. C) tamaños de los productos de PCR del gen amoA de archaeas. 1.
Marcador de peso 1kb plus. 2. Control negativo sin DNA 3. Amplicon del amoA de
archaeas. D) Curva de melting obtenida para el qPCR del amoA de archaeas.
La extracción de ADN de suelo y posterior amplificación por PCR permitió obtener
amplicones con tamaños esperados de los genes amoA de archaea (649pb) y bacteria
(493pb) (Figura 16 A y C). Las curvas de disociación (melting curves) muestran la
especificidad de la reacción al visualizarse un solo pico indicando la amplificación de un
único producto (Figura 16 B y D). Las condiciones de PCR y las curvas estándar son las
mismas que se usó en estudios previos (Subbarao et al., 2009, Moreta 2010) y se
encuentran listadas en la sección materiales y métodos. Los resultados de la
cuantificación de nitrificantes son consistentes con la literatura y con los descritos
anteriormente en este estudio al comparar suelo desnudo con la accesión B. humidicola
CIAT16888 (Tabla 6).
Los resultados muestran poblaciones diferenciales de bacterias y archaeas nitrificantes
similar a lo reportado por Subbarao et al., (2009). El suelo desnudo presenta una mayor
población de nitrificantes con respecto al suelo colectado en la parcela donde crece
44 Potencial de la inhibición biológica de la nitrificación (IBN) en forrajes tropicales
B.humidicola, siendo mayor la diferencia en la cantidad de archaeas entre ambos
tratamientos.
Tabla 6. Cuantificación por qPCR de bacterias y archaeas nitrificantes usando el gen
amoA como marcador, en suelos con IBN contrastantes (suelo desnudo y suelo con
Brachiaria).
3.4 Fenotipificación del IBN usando una población biparental de B. humidicola
En este capítulo se presentan los resultados de la evaluación de la característica IBN en
134 híbridos que componen una población biparental IBN de mapeo. Esta fenotipificación
usando las metodologías estandarizadas en los capítulos 5.1.1 y 5.2.1 Se estimó el
potencial IBN contenido en las raíces de los híbridos de B. humidicola a través del
bioensayo al igual que las tasas de nitrificación obtenidas por incubación de suelo y se
cuantificaron los microrganismos nitrificantes del suelo (aplicado solo para muestras
contrastantes), finalmente se estableció la relación entre los datos obtenidos con estas
metodologías.
La población está compuesta por 134 híbridos correspondientes a una generación F1 del
cruce de dos genotipos contrastantes para el IBN (CIAT16888 con alto IBN y modo de
reproducción apomictica y CIAT26146 con bajo/medio IBN con modo de reproducción
sexual). Aunque el parental CIAT16888 presenta una alto nivel de IBN confirmado en
este estudio (ver Tabla 2, figura 6, figura 14) el parental CIAT26146 no pertenece al
grupo donde se encuentran los híbridos con bajo IBN, estando categorizado dentro de un
rango medio/bajo IBN (Tabla 2). Sin embargo, dado las limitaciones impuestas por la
estrategia reproductiva que presenta esta especie (apomixis), el genotipo CIAT26146
permite cruces sexuales que facilitan el estudio de la genética de diferentes rangos en
esta especie (CIAT 2006).
La población se estableció con estolones y fue crecida durante 18 meses en suelo de los
Llanos con fertilización y riego controlado en condiciones de invernadero (ver materiales
y método). A los 12 meses de haber establecido las unidades experimentales se realizó
Genotipo
amoA bacteria
copias/g de
suelo
amoA archaea
copias/g de
suelo
CIAT16888 3.94E+04 2.46E+03
suelo desnudo 6.26E+06 6.35E+05
Total 6.30E+06 6.38E+05
Resultados y discusión 45
colecta de suelo para estimar las tasas de nitrificación y se realizó un muestro destructivo
donde se colectaron las raíces de los diferentes híbridos para estimar el potencial IBN 6
meses después usando el bioensayo. Los resultados obtenidos muestran que los
genotipos usados como controles con IBN conocido, se comportaron de la manera
esperada de acuerdo a lo reportado en la literatura (Tabla 7).
Respecto al potencial IBN medido por bioensayo, a nivel de IBN especifico, P.maximum y
Brachiaria hibrido Mulato (BHM) no presentaron diferencias significativas con los
genotipos de B. humidicola CIAT16888 y CIAT26159. La única diferencia significativa fue
para CIAT26146 catalogado como bajo/medio IBN (Tabla7). De acuerdo con la literatura,
en la variable IBN específico debieron diferenciarse P.maximum y BHM de los genotipos
de B. humidicola. Posiblemente esto se deba a la sensibilidad del test de comparación de
medias que se ve afectada por la alta varianza proveniente de las muestras P.maximum
y CIAT679 que mostraron las variaciones fenotípicas más altas entre las réplicas
biológicas en este set de datos según las desviación estándar (Tabla 7).
Aunque no existen diferencias significativas a nivel del potencial IBN específico entre los
genotipos mencionados, el IBN total que se obtiene al incluir la variable biomasa total de
raíz, si presenta diferencias entre los genotipos de acuerdo a lo reportado en la literatura.
En este sentido, BHM está dentro de la categoría de bajo/medio ya que no presenta
diferencias significativas con CIAT26146. Los grupos de alto IBN quedan definidos por
CIAT16888 y CIAT26159 y el nivel medio por P.maximum y CIAT679, categorización que
está en concordancia con resultados obtenidos en otros estudios (Subbarao et al., 2009,
Subbarao et al., 2007). El IBN total representa todas las unidades ATU que produce cada
unidad experimental y que teóricamente están siendo liberadas al suelo. Esto significa
que genotipos con un IBN específicos bajo pueden llegar a presentar altos niveles de IBN
en condiciones de campo, ya que desarrollan a cabalidad su biomasa radical la cual se
encuentra limitada físicamente por las materas en este estudio
46 Potencial de la inhibición biológica de la nitrificación (IBN) en forrajes tropicales
Tabla 7. Potencial IBN estimado por bioensayo y tasas de nitrificación obtenidas por
incubación de suelo, de los genotipos control (IBN conocido), crecidos en potes con suelo
de los Llanos en paralelo con la población biparental. 3 réplicas biológicas por
tratamiento. Letras diferentes significa diferencias significativas según el test LSD
Genotipo
IBN especifico
(ATU por
gramo de raíz)
LSD ATU total por
genotipo LSD
Tasa de
nitrificación
(mg N-NO3-/
Kg/día)
LSD
CIAT 26146 55.51±6.11 a 2576.39±781.48 a 2.09±0.53 a
CIAT 16888 115.42±1.06 b 13124.04±662.8 b 0.91±0.40 b
P. maximum 83.83±54.69 b 7619.58±3007.7 c 0.89±0.27 b
Mulato 92.97±2.25 b 3206.86±944.31 a 2.18±0.62 a
CIAT 26159 79.92±5.15 b 10575.57±698.5 b 0.92±0.44 b
CIAT679 114.97±23.9 b 5104.34±3274.3 ac 0.64±0.05 b
Suelo des. - - - - 2.87±0.26 a
Figura 17. Relación entre las variables potencial IBN total obtenido por bioensayo (ATU
total) y tasas de nitrificación (mg de N-NO3- por kg por día) obtenidas por la incubación de
suelo, para los genotipos con actividad IBN conocida.
CIAT26146
CIAT26159P.maximum
Mulato
CIAT16888CIAT679
Suelo desnudo
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000
mg
de
N-N
O3-
po
r kg
po
r d
ia
ATU total
Resultados y discusión 47
La relación entre el potencial de IBN total de cada genotipo y las tasas de nitrificación se
muestra en la figura 17. Las variables analizadas permiten agrupar a genotipos con bajo
IBN (no presentan diferencias significativas con el suelo desnudo) a BHM y CIAT26146.
Genotipos con alto IBN CIAT16888 y CIAT26159 y como nivel medio se encuentra
CIAT679 y P.maximum con diferencias en ATU total respecto a los altos, pero con tasas
de nitrificación iguales estadísticamente. Según los resultados, potenciales IBN de una
planta mayores a 5000 ATU inhiben significativamente la producción de nitrato en el
suelo.
Este estudio representa el primer esfuerzo que se realiza para la cuantificación masiva
de diferentes variables IBN de un número elevado de genotipos segregantes a partir de
plantas crecidas en materas. El tiempo de muestreo del suelo se consideró
empíricamente, asumiendo que a los 12 meses las plantas ya habían desarrollado raíces
y que por lo tanto fenómeno IBN seria medible en el suelo. Los resultados obtenidos en
este estudio constituyen la base de la relación entre las variables IBN evaluadas a los 12
meses de desarrollo de B.humidicola. Para efecto de análisis de los resultados se debe
tener en cuenta que las tasas de producción de nitrato obtenidas en este estudio
corresponden a muestreos de suelo que pueden tener acumulación de inhibidores a
través del tiempo (el muestreo se realizó un año después de establecido el experimento).
Es necesario implementar una metodología que permita la cuantificación de la actividad
IBN del suelo en una escala temporal, para identificar si entre los genotipos existen
diferencias en la tasa de acumulación de moléculas IBN en la rizósfera. Ante una
situación hipotética de que el muestreo hubiera sido dos años después, posiblemente las
tasas de nitrificación de CIAT26146 y Mulato igualen a las observadas en los genotipos
con alto IBN, así como también existe la posibilidad de que un muestreo más temprano
permita ver grandes diferencias entre los genotipos, que se ajuste al potencial IBN
observado. Existe evidencia de que las tasas de nitrificación son diferentes durante el
desarrollo del sorgo, (Ghoneim et al., 2014) donde la producción de nitrato en la
incubación de suelo presentó variaciones durante muestreos realizados a diferentes
tiempos de desarrollo del cultivo.
Con respecto a los resultados de toda la población biparental, el potencial IBN específico
estuvo entre 49.6 y 473.2 ATU por mg de raíz, mostrando una alta variación fenotípica
entre genotipos segregantes, propia de un carácter cuantitativo (Mackay et al., 2009).
Esta variabilidad también fue obtenida para las tasas de producción de nitrato, abarcando
valores que van desde 0.1 hasta 5.6 mg de N-NO3- por kg de suelo por día.
La segregación observada para el IBN específico posiblemente representa un fenotipo
dado por múltiples moléculas IBN presentes en los extractos de raíz. De estos, la
braquialactona explica entre el 60 y el 90% del porcentaje de inhibición observado en el
bioensayo según datos presentados por Subbarao et al., (2009). Hasta la fecha, no se
conocen las diferencias de la producción de esta molécula entre diferentes genotipos de
B.humidicola y tampoco se conoce la composición completa de los extractos con
actividad IBN. El sorgo por ejemplo, cuenta con un grupo de al menos 3 moléculas con
actividad IBN confirmadas a través del bioensayo (Zakir et al., 2008). Esto significa que la
48 Potencial de la inhibición biológica de la nitrificación (IBN) en forrajes tropicales
segregación observada comprende todas las variaciones e interacciones de los factores
genéticos asociados con todos los posibles compuestos IBN. Actualmente se está
realizando la correlación de los fenotipos IBN con marcadores genéticos polimórficos
entre los dos parentales contrastantes, para identificar regiones genéticas asociadas con
estas características. Para ello se está usando las tasas de nitrificación y el potencial IBN
identificado en este estudio.
El hecho de tener genotipos segregantes que superan los límites de los parentales,
indican que hay una diversidad genética asociada con el IBN que se puede explotar a
través del mejoramiento genético (Mackay et al., 2009).
Las tendencias observadas entre las tasas de nitrificación y el potencial IBN se presentan
en la figura 18. Los genotipos con alto IBN están agrupados al extremo derecho de la
gráfica junto con las menores tasas de nitrificación obtenidas y al extremo izquierdo de la
gráfica se observa la relación inversa que comprende genotipos con bajo potencial IBN
que resultan en altas tasas de nitrificación.
Figura 18. Correlación entre potencial IBN obtenido por bioensayo (Total ATU) y tasas
de nitrificación obtenidas por incubación de suelo (mg N-NO3- por kg de suelo por día),
para toda la progenie de la población biparental CIAT16888 x CIAT26146. Marcadas con
colores se encuentra el subgrupo de muestras que se seleccionó para el análisis de la
población nitrificantes. En rojo muestras del extremo de mayor IBN. En azul los
parentales. En amarillo muestras del extremo con menor IBN
Sin embargo los extremos también cuentan con genotipos que no corresponden entre el
potencial IBN y las tasas de nitrificación esperadas (alto IBN con altas tasas de
nitrificación, Bajo IBN con bajas tasas de nitrificación). Esta inconsistencia puede deberse
a dos razones principales: La primera razón considera al bioensayo como una
herramienta que solo estima la producción IBN intrínseca de la planta y no su efecto
sobre los microorganismos nitrificantes en la matriz del suelo. El microorganismo modelo
usado (Nitrosomonas recombinante) y el sistema in vitro (bioensayo) empleado son
R² = 0,1441
-1,0
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
0 5000 10000 15000 20000 25000 30000 35000 40000
mg
N-N
O3
-p
or
kg d
e su
elo
po
r d
ia
Total ATU
Resultados y discusión 49
buenos indicadores de la inhibición de amoA de todos los microorganismos nitrificantes
en el suelo. Esto ha sido demostrado por la relación inversamente proporcional respecto
a las ATU aplicadas al suelo y la inhibición de la nitrificación (Mas ATU en el suelo
generan menores tasas de nitrificación) (Gopalakrishnan et al., 2009, Subbarao et al.,
2006). Sin embargo Subbarao et al., (2012b) indica que no todas las moléculas que
presentan actividad IBN a través del bioensayo, también manifiestan una inhibición de la
nitrificación en el suelo. Tal es el caso de la molécula sakuratenina, un compuesto
orgánico que hace parte del mix de compuestos IBN que es exudado por el sorgo
demostrando que en el suelo ocurren interacciones que afectan el potencial IBN y que no
son registradas a través del bioensayo. Para identificar si este caso aplica para los
genotipos de B.humidicola que no concuerdan entre actividad IBN y tasas de nitrificación,
es necesario caracterizar la diversidad de moléculas presentes en el extracto de raíz y
así llegar a establecer potenciales IBN más precisos. Fue a través del estudio de
compuestos IBN específicos que se llegó a la caracterización precisa de los factores
genéticos asociados con el IBN en sorgo, específicamente para el caso de la sorgoleona
(Subbarao et al., 2009b); La segunda razón tiene en cuenta las tasas de nitrificación y la
metodología empleada. Se sabe que la nitrificación es muy sensible a factores como la
temperatura y la humedad (Sullivan et al., 2012). Estos factores deben ser muy bien
controlados para no afectar la inhibición de la nitrificación promovida por Brachiaria
(Iponmoroti et al., 2008). Experimentos con un bajo número de muestras permiten
controlar el error experimental más eficientemente que en un experimento con un
elevado número de muestras. En este estudio se evaluó un total de 141 muestras, cada
una con 5 tiempos de incubación y tres replicas por cada tiempo. Aunque los controles
presentaron comportamientos esperados (ver Figura 17) las medidas de dispersión de
las réplicas fueron mayores con respecto a los experimentos donde se evaluó un menor
número de muestras (ver Figuras 9 y 13). En este sentido, para reducir el número de
tiempos de incubación, se propone evaluar las tasas de nitrificación de acuerdo con
Cardozo et al., (2010), que solo considera la producción de nitrato en el tiempo inicial y
final de las incubaciones, para después dividir el valor sobre el número total de días y así
estimar el potencial de nitrificación. Aunque esta propuesta tiene la desventaja que no
permite observar la dinámica de la producción de nitrato a través del tiempo, se obtienen
tasas de nitrificación similares a las obtenidas cuando se usa la pendiente de 5 tiempos
de incubación (Figura 19), lo cual fue observado para todas las tasas de nitrificación
obtenidas en este estudio. La metodología presentada por Cardozo y colaboradores
reduce el número de muestras, lo cual debe disminuir el error experimental teniendo los
mismos resultados finales y permitiría analizar mayor número de muestras al mismo
tiempo. De esta manera se reduce los tiempos entre muestreo y montaje del experimento
de incubación de suelo, disminuyendo las fuentes de variación que pueden afectar las
tasas de nitrificación. Sin embargo, para evaluar el potencial IBN de una especie nueva,
se sugiere primero establecer que la inhibición es estable a través del tiempo de
incubación ya que en otras especies se observó que la dinámica de producción de nitrato
puede variar en los tiempos de incubación, lo cual se discute como un efecto IBN
temporal (Goneheim et al., 2014).
50 Potencial de la inhibición biológica de la nitrificación (IBN) en forrajes tropicales
Figura 19. Tasas de nitrificación obtenidas a partir de la incubación de suelo de los
genotipos control y 4 genotipos de la población biparental, comparando las tasas
obtenidas según Cardozo et al., 2011 (producción inicial menos producción final, sobre el
número de días incubados) y las obtenidas en el presente estudio (pendiente de 5
puntos).
Del set de datos obtenido de la biparental, también se observó que algunos genotipos
presentan tasas de nitrificación significativamente superiores al suelo desnudo (Tabla 8).
Este grupo de muestras, corresponden a genotipos que presentan IBN específico dentro
de los rangos medios y alto, pero tienen la particularidad de presentar las menores
biomasas de raíz observadas, lo que se traduce en un IBN total reducido. Dos de estos
genotipos (Bh136 y Bh36) presentan potenciales IBN altos en este grupo de muestras. A
pesar de contar con IBN total mayores a 20000 ATU parece haber una estimulación en la
nitrificación. Dado que no se observan otros genotipos con estas características, se
descarta cualquier evidencia genética asociada con este patrón.
Con todo el set de datos de la población biparental, no se encontró correlación (R2=
0.1441) entre el potencial IBN total y las tasas de nitrificación (Figura 18). Sin embargo
en los extremos del rango IBN se encuentran grupos consistentes entre las diferentes
metodologías. El 94% de los genotipos presenta menor tasa de nitrificación que el suelo
desnudo, demostrando que esta población biparental la mayoría manifiesta actividad IBN,
como se espera en la especie B. humidicola. Como se discutió anteriormente, los datos
sugieren que el tiempo de muestreo del suelo puede presentar ATU acumulado y esto no
permite observar claramente la relación entre potencial IBN y tasas de nitrificación para
todas las muestras.
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
mg
de
N-N
O3-
po
r kg
de
suel
o p
o d
ia pendiente de 5 puntos (presente estudio)
Cardozo et al 2011
Resultados y discusión 51
Tabla 8. Comparación de genotipos de B. humidicola que presentaron tasas de
nitrificación obtenidas por incubación de suelo significativamente superiores al suelo
desnudo.
Genotipo
ATU por
gramo de
raíz
Peso de
raíz (mg) IBN total
mg de N-NO3-
por kg suelo
por día
Bh107 221.91 2.12 470.46 5.76
Bh136 308.06 104.33 32139.83 4.55
Bh52 169.91 17.68 3004.65 4.49
Bh36 250.87 90.68 22748.95 4.29
Bh25 163.68 16.33 2672.95 4.24
suelo desnudo - - - 2.87
Se tomó un set de muestras contrastantes en el IBN, incluyendo los dos parentales
(Figura 18) para cuantificar la población de archaeas y bacterias nitrificantes presentes
en el suelo donde crecieron estos genotipos (Tabla 9). Se encontraron diferencias
significativas entre las archaeas de los grupos con alto y bajo IBN, siendo el genotipo
Bh010 el que mayor cantidad de archaeas presenta, categorizado como una de las
muestras con más bajo ATU y más altas tasas de nitrificación de todo el set de datos
evaluado. La cantidad de bacterias nitrificantes se mantuvo estable entre las muestras, a
diferencia del genotipo bH022 que presentó diferencias significativas respecto a las
demás. Este genotipo presenta el mayor potencial IBN y las menores tasas de
nitrificación. Respecto a estos resultados, en suelos ácidos se ha reportado que las
archaeas juegan el rol principal en la nitrificación con respecto a las bacterias (Zheng et
al., 2012) llegando a superar hasta 200 veces más en número a las bacterias (Leininger
et al., 2006). Particularmente, cuando el número de archaeas se reduce se reducen las
tasas de nitrificación en suelos ácidos, mientras que la reducción de bacterias no se
correlaciona con esta variable (Zheng et al., 2012). Las proporciones entre archaea y
bacteria se reducen en el grupo con alto IBN (Tabla 9. genotipos Bh022, Bh014,
CIAT16888). El grupo de bajo IBN presenta un mayor número de archaeas (Bh010,
Bh013, Bh005, CIAT26146), llegando a identificarse 33.1 veces más archaeas que
bacterias en el genotipo Bh010 categorizado como el genotipo con más bajo IBN y altas
tasas de nitrificación de este grupo de muestras (Tabla 9, Figura 20), resultados que son
consistentes con la literatura (Zheng et al., 2012).
52 Potencial de la inhibición biológica de la nitrificación (IBN) en forrajes tropicales
Tabla 9. Relación entre el potencial IBN obtenido por bioensayo, las tasas de nitrificación
obtenidas por incubación de suelo y la cantidad de microorganismos nitrificantes
obtenidas por qPCR, en genotipos contrastantes para el IBN de la población biparental.
Categoría
IBN Genotipo
AOA/gr
de suelo
AOB /gr
de suelo
proporción
AOA/AOB
Tasa de
producción
de nitrato
(mg N-NO3-
por Kg/día)
ATU
total
Alto Bh022 8.00E+04 7.15E+04 1.12 0.4 27918.33
Alto Bh014 1.15E+05 1.93E+05 0.60 0.78 18804.34
Alto Bh16888 7.74E+04 6.27E+05 0.12 0.91 13124.04
Bajo/medio Bh26146 1.37E+06 1.79E+05 7.65 2.09 2576.39
Bajo Bh005 8.47E+05 2.37E+05 3.57 1.51 2251.77
Bajo Bh013 5.24E+06 2.27E+05 23.08 2.23 1658.42
Bajo Bh010 1.86E+07 5.62E+05 33.10 3.00 1215.99
Los resultados de la dinámica de las poblaciones de archaea y bacteria con respecto al
nivel IBN se muestran en la figura 20 donde se observa que conforme el potencial IBN se
va incrementando se va observando una tendencia en la reducción de archaeas, a
excepción del genotipo con mayor nivel de IBN donde el número de bacterias es similar
al número de archaeas (siendo la muestra con el menor número de microrganismos
nitrificantes totales).
Figura 20. Relación entre todas las variables para genotipos de B humidicola
contrastantes identificados en este estudio. Potencial IBN obtenido por bioensayo (ATU),
tasas de nitrificación obtenidas por incubación de suelo (3mg de N-NO3- por kg de suelo
por día) y estimación poblacional de microrganismos nitrificantes obtenidas por qPCR.
Resultados y discusión 53
De acuerdo con los resultados el IBN es una característica eficiente para reducir la
nitrificación en el suelo. Para el caso de Brachiaria en un suelo de tipo oxisol, entre más
potencial IBN tenga la planta se observa un mayor efecto en la población de archaeas
nitrificantes de la rizosfera que impacta significativamente las tasas de nitrificación, pero
se mantiene la población de bacterias nitrificantes. Conforme la actividad IBN se
incrementa más, comienzan a reducir también la población de bacterias nitrificantes
(caso del genotipo Bh22). Esta observación debe corroborarse usando un número más
amplio de muestras que representen los extremos y el nivel medio del IBN, para
confirmar los resultados obtenidos este estudio. El subgrupo de muestras analizadas está
en concordancia con la literatura, para la dinámica de la nitrificación en suelos ácidos.
Además las evidencias sugieren que el IBN tiene el mismo efecto que los inhibidores
sintéticos sobre las poblaciones de microorganismos nitrificantes que lleva a la reducción
significativa de las tasas de nitrificación.
Los resultados de este estudio aportan a la base del conocimiento biológico que soporta
el beneficio de la rotación de cultivos en un contexto agroecológico y pone de manifiesto
el tremendo potencial genético de Brachiaria para ser explotado a través del
mejoramiento convencional en la consecución de una agricultura menos agresiva con el
medio ambiente y con un mejor uso eficiente de los fertilizantes, sin la intervención de
moléculas sintéticas.
4. Conclusiones y recomendaciones
4.1 Conclusiones
Los resultados de este estudio indica que usando tres métodos de fenotipificación
diferente es posible identificar híbridos de B humidicola promisorios para asistir el
actual programa de mejoramiento. Este hecho podría sentar las bases para
desarrollar estudios de genómica funcional que permitan identificar los genes
responsables de la característica IBN en cultivos de importancia agrícola, además
de desarrollar estrategias de mitigación del impacto negativo de agricultura sobre
el medio ambiente y el mejoramiento del uso eficiente del N por parte de los
cultivos.
La caracterización del potencial IBN a partir de extractos de raíz de B.humidicola
representa el IBN que se obtiene por exudación. Esto significa que se puede
aplicar esta metodología masivamente usando pequeñas cantidades de raíz, para
caracterizar eficientemente el potencial IBN de un genotipo de esta especie. Este
estudio es pionero en la adecuación de esta metodología para el estudio del IBN
en B.humidicola aplicado a una población biparental.
El tejido radical de B.humidicola incrementa su potencial IBN (ATU por gramo de
tejido) cuando se pone en contacto con amonio. El genotipo CIAT16888 presentó
una mayor respuesta al amonio que el genotipo CIAT679, lo cual es evidencia de
que existen diferencias en la regulación de la síntesis de compuestos IBN entre
genotipos.
Se identificaron genotipos segregantes de B.humidicola que superan los límites
de los parentales, indicando una alta diversidad genética asociada con el IBN
propia de un carácter cuantitativo. Esta información se está usando para la
identificación de QTLs asociados con el IBN.
56 Potencial de la inhibición biológica de la nitrificación (IBN) en forrajes tropicales
4.2 Recomendaciones
Se sugiere evaluar los mismos genotipos en un suelo con condiciones físico-
químicas diferentes para determinar si las interacciones planta-microorganismos
observadas se mantienen.
Se debe incluir la cuantificación de amonio en los experimentos de la incubación
de suelo. Esto permitiría estimar las tasas de mineralización y el porcentaje de
nitrato que se produce a través de la nitrificación. Con esta evidencia se puede
tener una mejor perspectiva de la dinámica de formación de nitrato obtenido en
este estudio
Se debe implementar una metodología que permita la cuantificación de las
moléculas con actividad IBN presentes en el suelo en una escala temporal, para
identificar si entre los genotipos existen diferencias en la tasa de acumulación de
moléculas IBN en la rizósfera y su relación con la fenología de B. humidicola
Se debe aplicar metodologías que permitan la cuantificación específica de la
braquialactona en cada uno de los genotipos caracterizados en este estudio. De
esta manera se puede caracterizar la genética y QTLs de la molécula responsable
del mayor porcentaje de IBN producido por B. humidicola.
Para validar la dinámica observada de microorganismos nitrificantes en relación
con el potencial IBN se sugiere incrementar el número de muestras
representativas de los diferentes rangos de IBN obtenidos en este estudio.
Se sugiere evaluar subgrupos de muestras de la población biparental que
representen niveles altos, bajos y medios de IBN, para realizar la caracterización
a nivel de campo.
Se sugiere usar dos genotipos contrastantes que representen los extremos del
potencial IBN identificado y hacer estudios de genómica funcional (RNAseq) para
identificar genes candidatos relacionados con esta característica
5. Bibliografía
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