POSTAVLJANJE ETIOLOŠKE POSTAVLJANJE ETIOLOŠKE DIJAGNOZE VIRUSNIH DIJAGNOZE VIRUSNIH INFEKCIJA INFEKCIJA Institut za Institut za javno zdravlje javno zdravlje Vojvodine Vojvodine Prof.dr Ivana Hrnjakovi Prof.dr Ivana Hrnjakovi ć ć Cvjetković Cvjetković
POSTAVLJANJE ETIOLOŠKE DIJAGNOZE VIRUSNIH INFEKCIJA. Institut za javno zdravlje Vojvodine Prof.dr Ivana Hrnjakovi ć Cvjetković. 1. DIREKTNO DOKAZIVANJE IZOLACIJOM I IDENTIFIKACIJOM VIRUSA. 1.1 IZOLACIJOM VIRUSA U KULTURI ĆELIJA 1.2 IZOLACIJOM VIRUSA U EMBRIONISANOM KOKOŠIJEM JAJETU - PowerPoint PPT Presentation
Welcome message from author
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Institut za Institut za javno zdravlje Vojvodinejavno zdravlje Vojvodine
Prof.dr Ivana HrnjakoviProf.dr Ivana Hrnjaković Cvjetkovićć Cvjetković
1.1.DIREKTNO DOKAZIVANJE DIREKTNO DOKAZIVANJE IZOLACIJOM I IDENTIFIKACIJOM IZOLACIJOM I IDENTIFIKACIJOM VIRUSAVIRUSA
• 1.1 IZOLACIJOM VIRUSA 1.1 IZOLACIJOM VIRUSA U U KULTURI ĆELIJAKULTURI ĆELIJA
• 1.2 IZOLACIJOM VIRUSA U 1.2 IZOLACIJOM VIRUSA U EMBRIONISANOM KOKOŠIJEM EMBRIONISANOM KOKOŠIJEM JAJETUJAJETU
• 1.3 IZOLACIJOM VIRUSA U 1.3 IZOLACIJOM VIRUSA U LABORATORIJSKIM ŽIVOTINJAMALABORATORIJSKIM ŽIVOTINJAMA
2.DIREKTNO DOKAZIVANJE VIRUSA 2.DIREKTNO DOKAZIVANJE VIRUSA U BOLESNIČKOM MATERIJALU BEZ U BOLESNIČKOM MATERIJALU BEZ PRETHODNOG UMNOŽAVANJAPRETHODNOG UMNOŽAVANJA• 2.1 2.1 METODE ZA DOKAZIVANJE VIRUSA METODE ZA DOKAZIVANJE VIRUSA
ELEKTRONSKA I IMUNOELEKTRONSKA ELEKTRONSKA I IMUNOELEKTRONSKA MIKROSKOPIJAMIKROSKOPIJA
• 2.2 2.2 TEHNIKE ZA DIREKTNO DOKAZIVANJE TEHNIKE ZA DIREKTNO DOKAZIVANJE VIRUSNIH ANTIGENA U UZORCIMA VIRUSNIH ANTIGENA U UZORCIMA BOLESNIČKOG MATERIJALABOLESNIČKOG MATERIJALA TESTOVI FLUORESCENTNE MIKROSKOPIJE TESTOVI FLUORESCENTNE MIKROSKOPIJE (direktni, indirektni i antikomplementarni) (direktni, indirektni i antikomplementarni) ENZIMSKE IMUNOMETODE (direktna ENZIMSKE IMUNOMETODE (direktna sendvič elisa metoda, inhibiciona i sendvič elisa metoda, inhibiciona i kompetitivna) RADIOIMUNE METODEkompetitivna) RADIOIMUNE METODE
2.DIREKTNO DOKAZIVANJE VIRUSA 2.DIREKTNO DOKAZIVANJE VIRUSA U BOLESNIČKOM MATERIJALU BEZ U BOLESNIČKOM MATERIJALU BEZ PRETHODNOG UMNOŽAVANJAPRETHODNOG UMNOŽAVANJA
• 2.3 2.3 METODE ZA BRZU I SPECIFIČNU METODE ZA BRZU I SPECIFIČNU IDENTIFIKACIJU SASTOJAKA VIRUSA U IDENTIFIKACIJU SASTOJAKA VIRUSA U BOLESNIČKOM MATERIJALUBOLESNIČKOM MATERIJALU Lančana reakcija polimerizacije Lančana reakcija polimerizacije nuklenskih kiselina (PCR) nuklenskih kiselina (PCR)
virusa ,virusnih virusa ,virusnih antigena ili virusne antigena ili virusne nukleinske kiselinenukleinske kiseline
• 5.dokazivanje 5.dokazivanje antivirusnih antitela antivirusnih antitela klase IgM iklase IgM i
• 6.dokazivanje 6.dokazivanje antivirusnih antitela antivirusnih antitela klase IgGklase IgG
IZOLACIJA VIRUSA NA IZOLACIJA VIRUSA NA KULTURI ĆELIJAKULTURI ĆELIJA
ZNACI ZNACI RAZMNO RAZMNOŽŽAVANJA AVANJA VIRUSA U VIRUSA U ĆĆELIJAMA KULTUREELIJAMA KULTURE
• U RANOJ FAU RANOJ FAZI RAZMNOŽAVANJA ZI RAZMNOŽAVANJA MOGU SE DOKAZATI I VIRUSNI MOGU SE DOKAZATI I VIRUSNI ANTIGENI ANTIGENI
ZNACI ZNACI RAZMNO RAZMNOŽŽAVANJA AVANJA VIRUSA U VIRUSA U ĆĆELIJAMA KULTUREELIJAMA KULTURE
• CITOPATOGENI EFEKATCITOPATOGENI EFEKAT (cpe) SVE (cpe) SVE MORFOLOŠKE PROMENE KOJE VIRUS IZAZIVA MORFOLOŠKE PROMENE KOJE VIRUS IZAZIVA RAZMNOŽAVAJUĆI SE U KULTURI ĆELIJA RAZMNOŽAVAJUĆI SE U KULTURI ĆELIJA PROMENE JEDRA, PROMENE JEDRA, GRANULACIJE U CITOPLAZMI, GRANULACIJE U CITOPLAZMI, ZAOKRUGLJIVANJE ĆELIJE, SPAJANJE ĆELIJA I ZAOKRUGLJIVANJE ĆELIJE, SPAJANJE ĆELIJA I STVARANJE SINCICIJUMASTVARANJE SINCICIJUMA
• ĆELIJE KULTURE PROPADAJU ZBOG ĆELIJE KULTURE PROPADAJU ZBOG CITOCIDNOG EFEKTA VIRUSA TAKO NASTAJU CITOCIDNOG EFEKTA VIRUSA TAKO NASTAJU DEFEKTI PROZORI U KULTURI ĆELIJADEFEKTI PROZORI U KULTURI ĆELIJA
CITOPATOGENI EFEKATCITOPATOGENI EFEKAT
• CMV u CMV u fibroblastnim fibroblastnim ćelija ,sporo raste, ćelija ,sporo raste, fokusi su mali i fokusi su mali i diskretni. diskretni. “sovinog “sovinog oka” su oka” su karakteristikarakteristične čne inkluzije u jedru inkluzije u jedru inficiranih ćelijainficiranih ćelija
CITOPATOGENI EFEKATCITOPATOGENI EFEKAT
• VZV VZV nukleusi nukleusi inficiranih ćelija su inficiranih ćelija su uvećani i pokazuju uvećani i pokazuju eozinofilne eozinofilne intranuklearne intranuklearne inkluzije.Zaokruživaninkluzije.Zaokruživanje ćelija i izraziti je ćelija i izraziti afinitet za eozin u afinitet za eozin u kasnoj fazi infekcijekasnoj fazi infekcije
ZNACI ZNACI RAZMNO RAZMNOŽŽAVANJA AVANJA VIRUSA U VIRUSA U ĆĆELIJAMA KULTUREELIJAMA KULTURE
• ZBOG RAZMNOŽAVANJA VIRUSA U ZBOG RAZMNOŽAVANJA VIRUSA U ĆELIJAMA USPORAVA METABOLIZAM ĆELIJAMA USPORAVA METABOLIZAM ĆELIJE I ĆELIJE I SMANJENA JE POJAVA SMANJENA JE POJAVA KISELE REAKCIJEKISELE REAKCIJE ŠTO JE DOKAZ DA ŠTO JE DOKAZ DA SE VIRUS RAZMNOŽAVA U ĆELIJI SE VIRUS RAZMNOŽAVA U ĆELIJI IAKO NE DAJE VIDLJIV CPEIAKO NE DAJE VIDLJIV CPE
• POJAVA V IRUSNE HEMAGLUTINACIJE POJAVA V IRUSNE HEMAGLUTINACIJE I HEMADSORBCIJEI HEMADSORBCIJE
ZNACI ZNACI RAZMNO RAZMNOŽŽAVANJA AVANJA VIRUSA U VIRUSA U ĆĆELIJAMA KULTUREELIJAMA KULTURE
• PRISUSTVO VIRUSA KOJI NE DAJE PRISUSTVO VIRUSA KOJI NE DAJE VIDLJIV CPE MOŽE SE DOKAZATI I VIDLJIV CPE MOŽE SE DOKAZATI I INTERFERENCIJOMINTERFERENCIJOM VIRUS RUBELEVIRUS RUBELE NA VERO KULTURI NE DAJE NA VERO KULTURI NE DAJE CPE I NJEGOVO SE UMNOŽAVANJE MOŽE CPE I NJEGOVO SE UMNOŽAVANJE MOŽE DOKAZATI INTERFERENCIJOM SA ECHO DOKAZATI INTERFERENCIJOM SA ECHO VIRUSOM 11 . Ukoliko se virus rubele VIRUSOM 11 . Ukoliko se virus rubele razmnožava na vero ćelijama inokulisan razmnožava na vero ćelijama inokulisan echo 11 neće moći da se umnoži i da cpe echo 11 neće moći da se umnoži i da cpe zbog interferencije sa virusom rubelezbog interferencije sa virusom rubele
ZNACI ZNACI RAZMNO RAZMNOŽŽAVANJA AVANJA VIRUSA U VIRUSA U ĆĆELIJAMA KULTUREELIJAMA KULTURE
• U RANOJ FAU RANOJ FAZI RAZMNOŽAVANJA ZI RAZMNOŽAVANJA MOGU SE DOKAZATI I VIRUSNI MOGU SE DOKAZATI I VIRUSNI ANTIGENI ANTIGENI
ELEKTRONSKA ELEKTRONSKA MIKROSKOPIJAMIKROSKOPIJA
• RANA I BRZA RANA I BRZA DIJAGNOSTIKADIJAGNOSTIKA
• VIRUS SE VIDI BEZ VIRUS SE VIDI BEZ PRETHODNOG PRETHODNOG UMNOŽAVANJAUMNOŽAVANJA
• NIJE MOGUĆA NIJE MOGUĆA IDENTIFIKACIJA VIRUSAIDENTIFIKACIJA VIRUSA
• SKUPA OPREMA I SKUPA OPREMA I OBUČEN KADAROBUČEN KADAR
• ZA VIRUSE KOJI SE NE ZA VIRUSE KOJI SE NE MOGU UMNOŽAVATI U MOGU UMNOŽAVATI U LABORATORIJILABORATORIJI
ELEKTRONSKA ELEKTRONSKA MIKROSKOPIJAMIKROSKOPIJA• UMESTO SVETLOSNIH ZRAKA SNOP UMESTO SVETLOSNIH ZRAKA SNOP
ELEKTRONA KOJI SE PROSTIRU U ELEKTRONA KOJI SE PROSTIRU U VAKUMUVAKUMU
• UMESTO OPTIČKIH SOČIVA UMESTO OPTIČKIH SOČIVA ELEKTROMAGNETNA POLJAELEKTROMAGNETNA POLJA
• SLIKA SE EMITUJE NA EKRAN ILI SE SLIKA SE EMITUJE NA EKRAN ILI SE FOTOGRAFIŠEFOTOGRAFIŠE
• UVEĆANJE JE 100 000 PUTAUVEĆANJE JE 100 000 PUTA
ELEKTRONSKA ELEKTRONSKA MIKROSKOPIJAMIKROSKOPIJA• PREPARATI SE PRAVE KAO ULTRATANKI PREPARATI SE PRAVE KAO ULTRATANKI
REZOVI TANJI OD 100nmREZOVI TANJI OD 100nm
• U CILJU POVEĆANJA KONTRASTA U U CILJU POVEĆANJA KONTRASTA U PREPARATU PREPARAT SE PRSKA POD PREPARATU PREPARAT SE PRSKA POD MALIM UGLOM SUSPENZIJOM KOLOIDNOG MALIM UGLOM SUSPENZIJOM KOLOIDNOG ZLATA ČIME SE POSTIŽE PLASTIČAN ZLATA ČIME SE POSTIŽE PLASTIČAN IZGLED VIRUSA KOJI SU SA JEDNE STRANE IZGLED VIRUSA KOJI SU SA JEDNE STRANE OSVETLJENI A SA DRUGE U SENCI OSVETLJENI A SA DRUGE U SENCI POZITIVNO PRIKAZIVANJEPOZITIVNO PRIKAZIVANJE
ELEKTRONSKA ELEKTRONSKA MIKROSKOPIJAMIKROSKOPIJA
• OSIM POZITIVNOG PRIKAZIVANJE OSIM POZITIVNOG PRIKAZIVANJE MOŽE SE VRŠITI I MOŽE SE VRŠITI I NEGATIVNO NEGATIVNO PRIKAZIVANJEPRIKAZIVANJE TRETIRANJEM TRETIRANJEM PREPARATA KALIJUM PREPARATA KALIJUM FOSFOTUNGSTATOM KOJI JE FOSFOTUNGSTATOM KOJI JE NEPROBOJAN ZA SNOP ELEKTRONANEPROBOJAN ZA SNOP ELEKTRONA
• UZORAK SE PRETHODNO MEŠA SA UZORAK SE PRETHODNO MEŠA SA POZNATIM ANTIVIRUSNIM ANTITELIMA POZNATIM ANTIVIRUSNIM ANTITELIMA (OBIČNO MONOKLONSKIM)(OBIČNO MONOKLONSKIM)
• ZATIM SE ELEKTRONSKIM MIKROSKOPOM ZATIM SE ELEKTRONSKIM MIKROSKOPOM TRAŽI IMUNOLOŠKA REAKCIJA IZMEĐU TRAŽI IMUNOLOŠKA REAKCIJA IZMEĐU DODATIH ANTITELA I VIRUSADODATIH ANTITELA I VIRUSA
• NA OVAJ NAČIN SE POSTIŽE DOKAZIVANJE NA OVAJ NAČIN SE POSTIŽE DOKAZIVANJE VIRUSA I NJEGOVA IDENTIFIKACIJA što se VIRUSA I NJEGOVA IDENTIFIKACIJA što se ne postiže elektronskim mikroskopomne postiže elektronskim mikroskopom
i ANTIKOMPLEMENTARNA TEHNIKA i ANTIKOMPLEMENTARNA TEHNIKA kvalitetan uzorak, poliklonalna ili monoklonalna kvalitetan uzorak, poliklonalna ili monoklonalna antitela obeležena fluorofromom i fluorescentni antitela obeležena fluorofromom i fluorescentni mikroskopmikroskop
• ENZIMSKI IMUNOESEJ ELISA poliklonalna ili ENZIMSKI IMUNOESEJ ELISA poliklonalna ili monoklonalna antitela obeležena enzimom i monoklonalna antitela obeležena enzimom i ELISA procesorELISA procesor
• RADIOIMUNOESEJ poliklonalna ili monoklonalna RADIOIMUNOESEJ poliklonalna ili monoklonalna antitela obeležena radioizotopomantitela obeležena radioizotopom
DOKAZIVANJE VIRUSNOG DOKAZIVANJE VIRUSNOG GENOMAGENOMA• HIBRIDIZACIJA NOVA,SPESIFIČNA I HIBRIDIZACIJA NOVA,SPESIFIČNA I
OSETLJIVA METODA ZNAČAJNA ZA OSETLJIVA METODA ZNAČAJNA ZA DOKAZIVANJE VIRUSA KOJI SE NE MOGU DOKAZIVANJE VIRUSA KOJI SE NE MOGU KULTIVISATI KULTIVISATI
• PRINCIP HIBRIDIZACIJEPRINCIP HIBRIDIZACIJE
• VIRUSNA DNK EKSTRAHOVANA IZ VIRUSNA DNK EKSTRAHOVANA IZ BOLESNIČKOG UZORKA DOKAZUJE SE BOLESNIČKOG UZORKA DOKAZUJE SE POMOĆU PROBE POMOĆU PROBE KOMPLEMENTARNOG KRATKOG LANCA KOMPLEMENTARNOG KRATKOG LANCA NUKLEOTIDA OBELEŽENOG RADIOAKTIVNIM NUKLEOTIDA OBELEŽENOG RADIOAKTIVNIM IZOTOPOM ILI ENZIMOMIZOTOPOM ILI ENZIMOM
DOKAZIVANJE VIRUSNOG DOKAZIVANJE VIRUSNOG GENOMAGENOMA• HIBRIDIZACIJA NOVA,SPESIFIČNA I HIBRIDIZACIJA NOVA,SPESIFIČNA I
OSETLJIVA METODA ZNAČAJNA ZA OSETLJIVA METODA ZNAČAJNA ZA DOKAZIVANJE VIRUSA KOJI SE NE MOGU DOKAZIVANJE VIRUSA KOJI SE NE MOGU KULTIVISATI KULTIVISATI
• PRINCIP HIBRIDIZACIJEPRINCIP HIBRIDIZACIJE
• VIRUSNA DNK EKSTRAHOVANA IZ VIRUSNA DNK EKSTRAHOVANA IZ BOLESNIČKOG UZORKA DOKAZUJE SE BOLESNIČKOG UZORKA DOKAZUJE SE POMOĆU PROBE KOMPLEMENTARNOG POMOĆU PROBE KOMPLEMENTARNOG KRATKOG LANCA NUKLEOTIDA OBELEŽENOG KRATKOG LANCA NUKLEOTIDA OBELEŽENOG RADIOAKTIVNIM IZOTOPOM ILI ENZIMOMRADIOAKTIVNIM IZOTOPOM ILI ENZIMOM
BLOT BLOT HIBRIDIZACIJAHIBRIDIZACIJA
• Za dokazivanje virusne DNK koristi se blot Za dokazivanje virusne DNK koristi se blot hibridizacijahibridizacija
• Nakon EKSTRAKCIJE DNK iz uzorka vrši se Nakon EKSTRAKCIJE DNK iz uzorka vrši se DENATURACIJA kuvanjem čime se DENATURACIJA kuvanjem čime se dobijaju fragmenti jednostruke nukleinske dobijaju fragmenti jednostruke nukleinske kiseline dugi nekoliko stotina nukleotida kiseline dugi nekoliko stotina nukleotida koji se vezuju za čvrstu podlogu - koji se vezuju za čvrstu podlogu - nitroceloloznu ili najlonsku membranunitroceloloznu ili najlonsku membranu
U fazi HLAĐENJA vrši se ANELACIJA U fazi HLAĐENJA vrši se ANELACIJA vezivanje jednolančanih nukl. kiselina za vezivanje jednolančanih nukl. kiselina za oboležene probe čime se formiraju hibridi oboležene probe čime se formiraju hibridi
hibridizacija in situhibridizacija in situ
ZA IN SITU HIBRIDIZACIJU intracelularna DNK se fiksira za predmetno staklo u tankim histopatološkim rezovima tkiva
Pozitivan rezultat se očitava u vidu tačke, kruga ili dugmeta
1.DENATURACIJA na temperaturi 94 stepeni C razdvajanje lanaca DNK I dobijanje dva jednostruka lanca
2.ANELACIJA SPARIVANJE specifične genetske probe (sintetski dobijeni jednostruki lanci DNK od 20-30 nukleotida) vezuju se za sebi komplementaran deo originalnog lanca DNK na 40-60
3.EKSTENZIJA PRODUŽAVANJE LANACA DNK dva kratka dvostruka lanca DNK služe kao inicijalna mesta za dejstvo enzima Taq polimeraze uz čiju pomoć se od 3* kraja probe komplementarno vezuju nukleotidi Ova faza se odigrava na 72 stepena C
TRI FAZE U CIKLUSU NAIZMENIČNO SE PONAVLJAJU I BROJ DVOSTRUKIH LANACA SE UDVOSTRUČAVA
• 1.IMUNOTESTENZIMSKI TEST ELISA1.IMUNOTESTENZIMSKI TEST ELISA• 2.IMUNOFLUORESCENTNI TEST2.IMUNOFLUORESCENTNI TEST• 3.RADIOIMUNOESEJ3.RADIOIMUNOESEJ• KARAKTERISTIKEKARAKTERISTIKE• VISOKA OSETLJIVOST I SPECIFIČNOSTVISOKA OSETLJIVOST I SPECIFIČNOST• DOKAZIVANJE KLASA IMUNOGLOBULINADOKAZIVANJE KLASA IMUNOGLOBULINA• ZA DIJAGNOZU JE ČESTO DOVOLJAN JEDAN ZA DIJAGNOZU JE ČESTO DOVOLJAN JEDAN
UZORAK SERUMA TE TESTOVI ZA IgM SPADAJU UZORAK SERUMA TE TESTOVI ZA IgM SPADAJU U TESTOVE ZA BRZU I RANU DIJAGNOSTIKUU TESTOVE ZA BRZU I RANU DIJAGNOSTIKU
INTERPRETACIJA INTERPRETACIJA SEROLOŠKIH REZULTATASEROLOŠKIH REZULTATAIgM i IgG negativniIgM i IgG negativni nema infekcije, nema infekcije,
inkubacija ili inkubacija ili prodromalni prodromalni stadijumstadijum