PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS CARRERA DE MICRO BIOLOGÍA INDUSTRIAL CARACTERIZACIÓN CINÉTICA Y ENZIMÁTICA DE Thermoanaerobacter italicus CEPA USBA 18 AISLADA DE UN MANANTIAL TERMOMINERAL EN PAIPA, BOYACÁ JAVIER ANTONIO GÓMEZ GÓMEZ TRABAJO DE GRADO Presentado como requisito parcial Para optar al título de MICROBIÓLOGO INDUSTRIAL Bogotá, D. C. Julio de 2008
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PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD …javeriana.edu.co/biblos/tesis/ciencias/tesis128.pdf · Ruta de Embden-Meyerhof-Parmas 35 Figura 7. Hidrólisis enzimática de almidón
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PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE MICRO BIOLOGÍA INDUSTRIAL
CARACTERIZACIÓN CINÉTICA Y ENZIMÁTICA DE
Thermoanaerobacter italicus CEPA USBA 18 AISLADA DE UN
MANANTIAL TERMOMINERAL EN PAIPA, BOYACÁ
JAVIER ANTONIO GÓMEZ GÓMEZ
TRABAJO DE GRADO Presentado como requisito parcial
Para optar al título de
MICROBIÓLOGO INDUSTRIAL
Bogotá, D. C. Julio de 2008
NOTA DE ADVERTENCIA
"La Universidad no se hace responsable
por los conceptos emitidos por sus
alumnos en sus trabajos de tesis. Solo
velará por que no se publique nada
contrario al dogma y a la moral católica y
por que las tesis no contengan ataques
personales contra persona alguna, antes
bien se vea en ellas el anhelo de buscar
la verdad y la justicia".
Artículo 23 de la Resolución No13 de
julio de 1946.
CARACTERIZACIÓN CINÉTICA Y ENZIMÁTICA DE
Thermoanaerobacter italicus CEPA USBA 18 AISLADA DE UN
MANANTIAL TERMOMINERAL EN PAIPA, BOYACÁ
JAVIER ANTONIO GÓMEZ GÓMEZ
APROBADO
SANDRA BAENA G. Ph. D BALKYS QUEVEDO M. Sc Bióloga Ing. Química Directora Codirectora AURA MARINA PEDROZA Ph. D CATALINA GIRALDO M. Sc Bacterióloga Ing. Proc esos Jurado 1 Jurado 2
CARACTERIZACIÓN CINÉTICA Y ENZIMÁTICA DE
Thermoanaerobacter italicus CEPA USBA 18 AISLADA DE UN
MANANTIAL TERMOMINERAL EN PAIPA, BOYACÁ
JAVIER ANTONIO GÓMEZ GÓMEZ
APROBADO INGRID SCHULER Ph. D JANETH ARIAS P M. Sc Bióloga Bacterióloga Decana Académica Directora de Carrera
Saber que no se sabe
es una noble intuición.
Pretender saber y no saber
es una enfermedad.
Y el que reconoce la enfermedad
como tal no la sufre.
A Dios y A Mis Abuelitos.
AGRADECIMIENTOS
A la Unidad de Saneamiento y Biotecnología Ambienta (USBA) de la
Universidad Javeriana que permitió el desarrollo de este proyecto.
A la Doctora Sandra Baena por su confianza, apoyo, paciencia y
conocimientos aportados para el desarrollo de esta investigación.
A la Ingeniera Balkys Quevedo por las oportunidades que me ha dado en
la vida, por su paciencia, confianza y conocimientos.
A mi Madre y Padre por que siempre me han apoyado y me han
enseñado a ser responsable y una persona con principios e integral. A mi
familia por su amor.
A mis compañeros de USBA Carolina Díaz, Carolina Rubiano, Gina
2.3. MICROORGANISMOS TERMÓFILOS 13 2.3.1. Taxonomía de los microorganismos termófilos 15 2.3.2. Mecanismos de supervivencia a altas temperaturas 17 2.3. Género Thermoanaerobacter 28 2.3.1. Thermoanaerobacter italicus 31 2.3.1.1. Hábitat de Thermoanaerobacter italicus en Colombia 32 2.3.1.1.1. Manantial termomineral PP-10 (pozo Hotel Lanceros) 32 2.3.2. Metabolismo del género Thermoanaerobacter 33
2.3.2.1. Ruta de Embden-Meyerhof-Parmas 33 2.3.2.2. Ruta de las pentosas fosfato 35 2.3.2.3. Enzimas amilolíticas 36 2.3.2.4. Enzimas xilanolíticas 39
2.3.2.5. Enzimas pectinolíticas 41 3. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN 44 4. OBJETIVOS 46 4.1. OBJETIVO GENERAL 46
4.2. OBJETIVOS ESPECIFICOS 46 5. MATERIALES Y METODOS 47 5.1. Microorganismo 47 5.2. Medio de cultivo y condiciones de cultivo 48
5.2.1. Medio de cultivo mínimo de crecimiento 48
Pagina
5.3. Determinación de condiciones óptimas de crecimiento 49 5.3.1. Temperatura óptima de crecimiento 49 5.3.2. Concentración de NaCl óptima de crecimiento 50 5.3.3. pH óptimo de crecimiento 50
5.4. Determinación de actividades enzimáticas 50 5.4.1. Determinación de actividad amilolítica 51 5.4.1.1. Determinación de temperatura óptima de actividad amilolítica 52 5.4.2. Determinación de actividad pectinolítica 52 5.4.3. Determinación de actividad xilanolítica 52
5.5. Evaluación de crecimiento en diferentes sustratos 53 5.5.1. Seguimiento al consumo de sustrato 53 5.5.2. Determinación de metabolitos producidos por HPLC 54 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 55
6.1. Morfología Thermoanaerobacter italicus cepa USBA 18 55 6.2. Determinación de condiciones óptimas de crecimiento 56 6.2.1. Temperatura óptima de crecimiento 57 6.2.2. Concentración de NaCl óptima de crecimiento 58
6.2.3. pH óptimo de crecimiento 59 6.3. Determinación de Actividades enzimáticas 60 6.3.1. Actividad amilolítica 61 6.3.1.1. Temperatura óptima de actividad amilolítica 63 6.3.2. Actividad pectinolítica 64 6.3.3. Actividad xilanolítica 64 6.4. Crecimiento en diferentes sustratos 65 6.4.1. Determinación de metabolitos producidos por HPLC 68 7. CONCLUSIONES 74 8. RECOMENDACIONES 76 9. BIBLIOGRAFIA 77 10. ANEXOS 88 ANEXO 1. CURVA DE CALIBRACIÓN PARA DETERMINACIÓN DE PESO SECO BACTERIANO 88 ANEXO 2. DETERMINACION DE ACTIVIDAD AMILOLITICA 92 ANEXO 3. DETERMINACION DE ACTIVIDAD PECTINOLITICA 97 ANEXO 4. DETERMINACION DE ACTIVIDAD XILANOLITICA 102
INDICE DE FIGURAS
Figura 1. Terrazas de Mammoth, manantial termal. Parque Nacional de Yellowstone, Wyoming, EUA 6
Figura 2. Géiser el Viejo Fiel, Parque Nacional de Yellowstone, Wyoming, EUA 8
Figura 3. Fumarola del cráter del volcan Mutnovskaja. Republica Checa 9
Figura 4. Clasificación de los microorganismos basada en los rangos óptimos de temperatura 14
Figura 5. Lípidos de Archaea y en bacterias 27
Figura 6. Ruta de Embden-Meyerhof-Parmas 35
Figura 7. Hidrólisis enzimática de almidón hasta glucosa y accionar de las enzimas Amilolíticas 37
Figura 8. Estructura del xilano 40
Figura 9. Microfotográfica de contraste de fase de Thermoanaerobacter italicus USBA 18 55
Figura 10. Cinética de crecimiento de Thermoanaerobacter italicus cepa USBA 18 en condiciones óptimas de crecimiento 56
Figura 11. Determinación de la temperatura óptima de crecimiento para Thermoanaerobacter italicus cepa USBA 18 58
Figura 12. Determinación de la concentración de NaCl óptima de crecimiento para Thermoanaerobacter italicus cepa USBA 18 59
Figura 13. Determinación del pH óptimo de crecimiento para Thermoanaerobacter italicus cepa USBA 18 60
Figura 14. Actividad amilolítica de Thermoanaerobacter italicus cepa USBA 18 a diferentes temperaturas 63
Figura 15. Actividades enzimáticas producidas por Thermoanaerobacter italicus cepa USBA 18 65
Figura 16. Consumo de sustrato con respecto al tiempo por parte de Thermoanaerobacter italicus cepa USBA 18 68
INDICE DE TABLAS
Tabla 1. Parámetros físicos y químicos de los fluidos hidrotermales, agua de mar y agua dulce 7
Tabla 2. Algunos productos biotecnológicos y aplicaciones de los extremófilos 12
Tabla 3. Algunos ejemplos de Bacterias termófilas 15
Tabla 4. Géneros del Orden Clostridiales 19
Tabla 5. Principales características del MTM Pozo Hotel Lanceros 47
Tabla 6. Productos metabólicos producidos por Thermoanaerobacter italicus cepa USBA 18 con diferentes fuentes de carbono a las 120 h de fermentación 69
Tabla 7. Productos metabólicos producidos por Thermoanaerobacter italicus USBA 18 con diferentes concentraciones de extracto de levadura y peptona a las 120 h de fermentación 70
Tabla 8. Productos metabólicos producidos por Thermoanaerobacter italicus cepa USBA 18 con KNO3 como fuente inorgánica de nitrógeno y solución de vitaminas de Balch a las 120 h de fermentación 71
Tabla 9. Principales Características de algunas especies del género Thermoanaerobacter 73
1
1. INTRODUCCIÓN
El estudio, identificación y caracterización de microorganismos aislados de
ambientes extremos hace parte del entendimiento de la diversidad
microbiana de este tipo de ambientes, con el fin de determinar las
características particulares que permiten a los organismos sobrevivir en
condiciones extremas y comprender el papel desempeñado por los
microorganismos en sus hábitats naturales. Los microorganismos
extremófilos se caracterizan por habitar en ambientes en los cuales las
condiciones físicas son críticas con respecto a las condiciones “normales”
(temperaturas altas o muy bajas, valores de pH extremadamente ácidos ó
básicos, ausencia de oxígeno, salinidad, presión, entre otras), sin embargo,
estos microorganismos tienen la capacidad de sobrevivir y reproducirse bajo
estas condiciones.
Dentro del grupo de los organismos extremófilos se encuentran los
termófilos, los cuales están adaptados para crecer óptimamente a
temperaturas altas (60°C a 110°C). Estos microorgan ismos han sido aislados
a partir de fuentes termales marinas y terrestres, áreas volcánicas, fumarolas
negras, sistemas hidrotermales marinos, reservorios de petróleo, entre otros
hábitats naturales, pero también se han aislado a partir de ambientes
antropogénicos como el compost, materia orgánica en descomposición y
aguas residuales de procesos industriales.
Las investigaciones sobre este tipo de microorganismos, así como de todos
los extremófilos ha generado grandes expectativas y ha tomado gran
importancia desde hace dos décadas, debido a que pueden ser utilizados en
aplicaciones biotecnológicas, ya que sus enzimas y su actividad metabólica
en general se desarrollan a altas temperaturas y por ende son estables a
estas. Desafortunadamente, en la actualidad, solo una pequeña parte de la
2
diversidad microbiana de ambientes extremófilos ha sido estudiada a nivel
mundial, de ahí que sea un campo atractivo para el desarrollo de nuevas
investigaciones.
Investigaciones desarrolladas en la Unidad de Saneamiento y Biotecnología
Ambiental (USBA) demostraron la presencia de poblaciones microbianas
termofilicas en manantiales termominerales (MTM) en la región de Paipa,
Boyacá, con la identificación de microorganismos sulfato reductores,
tiosulfato reductores, reductores de hierro férrico, reductores de nitrato y
principalmente microorganismos fermentativos. Se han identificado nuevas
especies de bacterias sulfato-reductoras termófilas pertenecientes al género
Desulfomicrobium y se ha propuesto una nueva especie llamada
Desulfomicrobium thermophilum. Del mismo modo se encontró una marcada
dominancia de organismos del filum Firmicutes y especialmente de miembros
del genero Thermoanaerobacter identificados por medio de análisis
fenotípicos y moleculares del gen 16S rRNA. A partir de estos estudios se
seleccionó la cepa Thermoanaerobacter italicus cepa USBA 18 aislada del
manantial termomineral P4 - pozo Hotel Lanceros en Paipa, Boyacá.
El conocer más a fondo estos microorganismos puede llevar al desarrollo de
moléculas y metabolitos de aplicación industrial y biotecnológica, partiendo
de la premisa que si el microorganismo productor resiste condiciones
extremas, las moléculas y metabolitos que produce tendrán esta misma
capacidad. Es por esto que se tiene un amplio interés científico con respecto
a estos microorganismos y sus posibles usos en una extensa variedad de
industrias.
En este trabajo, se realizó la caracterización cinética y enzimática de la cepa
Thermoanaerobacter italicus USBA 18 (98% de similitud con
Thermoanaerobacter italicus), teniendo en cuenta condiciones de
3
temperatura, pH y concentración de NaCl. A su vez, se realizó un análisis
enzimático en diferentes sustratos y la identificación de los metabolitos
producidos.
4
2. MARCO TEÓRICO
2.1. AMBIENTES EXTREMOS
Todo tipo de vida en la Tierra, así como la distribución de los organismos
está claramente influenciada por una gran variedad de factores abióticos, de
allí que la distribución de sus integrantes esté relacionada con la capacidad
que tengan estos para adaptarse, soportar y permanecer estable dentro de
su ambiente, bajo unas condiciones determinadas.
Los microorganismos, así como cualquier organismo tienen que ser estables
bajo las condiciones de su entorno para llevar a cabo su reproducción y
asegurar su supervivencia. Es por esto que la limitación de nutrientes y la
tolerancia ambiental regulan o excluyen la existencia de microorganismos en
diferentes ambientes (Atlas y Bartha, 2002).
Un ambiente extremo es definido como lo opuesto a un ambiente normal, es
decir que posee condiciones significativamente diferentes a aquellas
denominadas “normales” para uno o varios de los parámetros que
caracterizan el medio. Un ambiente normal, generalmente tiene una
temperatura entre 4 y 40 °C, pH entre 5 y 8.5, sali nidad oscilante entre la
salinidad del agua dulce (< 100 mg/l) y aquella del agua de mar (~ 35000
mg/L), presión cercana a la atmosférica (1 Atm) y una composición
atmosférica similar a la atmósfera terrestre (N2 78.03%, O2 20.99%, Ar 0.94%
y 0.04% de otros gases).
Existen muchos ambientes alrededor del mundo que son considerados como
extremos. Se encuentran en áreas geotermales con altas temperaturas,
regiones polares con temperaturas alrededor del punto de congelación del
5
agua, profundidades de los océanos con presiones muy altas y manantiales
ácidos ó alcalinos con pH bajos o altos respectivamente (Vorgias y
Antranikian, 2004).
Considerando las limitaciones con respecto a los requerimientos
ambientales, los microorganismos extremófilos son capaces de explotar
diversos hábitats en la tierra y en el mar (Burgess et al., 2007). Por esta
razón es que este tipo de organismos pueden ser encontrados en diferentes
ambientes que suministren las condiciones mínimas para su supervivencia y
reproducción.
Según Burgess et al (2007) los ambientes de temperaturas altas pueden ser
agrupados en diferentes clases.
2.1.1. Ambientes terrestres no antropogénicos
Dentro de este grupo de ambientes se encuentran los manantiales calientes
(manantiales termominerales) géiseres, solfataras y depósitos de lodos, los
cuales están distribuidos en las regiones que presentan actividad volcánica
alrededor del mundo, donde se incluye Islandia, el oeste de Norteamérica,
Nueva Zelanda, Japón, la región este de Rusia y demás zonas que hacen
parte del anillo de fuego del Pacífico. El Parque Nacional de Yellowstone al
norte de EUA presenta la mayor concentración de actividad geotérmica en la
Tierra y es el lugar donde se han desarrollado gran parte de los estudios de
biodiversidad de ambientes termófilos. En Colombia se han desarrollado
varios estudios para caracterizar geoquímicamente algunos sistemas
geotérmicos en Paipa (Boyacá) (Alfaro, 2002) y estudiar la diversidad
microbiana de estos ambientes termominerales relacionados con actividad
volcánica (Baena y Roldan, 2005).
6
2.1.1.1. Manantiales termales.
El agua que emerge con una temperatura por encima de la temperatura del
cuerpo humano (36.7°C) es definida como manantial t ermal. Los manantiales
termales (figura 1) son manifestaciones superficiales de un gran sistema
hidrotermal y son de gran importancia a nivel de la energía geotermal y en la
exploración mineral. Contienen depósitos de oro, plata, cobre y otros
elementos pueden ser originados en estos ambientes (Burgess et al., 2007).
Los sistemas geotermales están presentes en muchos lugares de la Tierra y
no necesariamente están relacionados con la actividad volcánica. Esta agua
caliente usualmente muestra altas concentraciones de muchos elementos y
pueden ser altamente supersaturadas con respecto a una variedad de
minerales (Tabla 1) (Fernández-Turial et al., 2005).
Figura 1. Terrazas de Mammoth, manantial termal. Parque Nacional de
4.2. Estas diluciones se preparan en tubos eppendorf y se leen en el
espectrofotómetro a 580 nm, utilizando Solución salina 0.85% como
blanco de la prueba. Normalmente los valores mas concentrados
(diluciones 5/10 a 9/10) no ofrecen buenos resultados ya que a estas
concentraciones se pierde la linealidad en la grafica y por eso se hace un
segundo conjunto de diluciones mas finas.
Tabla 2. Diluciones de la suspensión de trabajo (ST) más finas.
Dilución 1/25 1/20 3/20 5/20
ST (µl) 40 50 150 250
Solución
Salina (µl) 960 950 850 750
Vf (µl) 1000 1000 1000 1000
4.3. Una vez se tengan suficientes puntos se traza la curva Diluciones vs
DO580 mn. Se calcula la ecuación y el valor importante aquí es la
pendiente
4.4. Cuando se haya establecido el peso seco de las bacterias en las
capsulas, se calcula el peso seco de bacterias/ml de SM. Una vez
calculado el peso seco para la ST, se calcula para cada dilución el peso
seco correspondiente. Se convierten las diluciones en concentración: µg
de bacterias peso seco/ml.
91
4.5. Se grafica peso seco (µg/ml) vs DO580 y de la ecuación de la recta se
calcula la pendiente.
92
ANEXO 2. DETERMINACIÓN DE ACTIVIDAD AMILOLÍTICA
1. Preparación del buffer fosfato 0.1 M
Preparar cada fosfato por separado de la siguiente forma: pesar 14.2g de
Na2HPO4 y disolver en 200 ml de agua destilada; pesar 12 g de NaH2PO4
y dilsolver en 200 ml de agua destilada, posteriormente mezclar, ajustar
pH= 7.0 +/- 2.0 y enrasar a 1000 ml con agua destilada en balón
volumétrico.
2. Preparación de almidón al 1 % p/v en buffer fosf ato 0.1M
Pesar 1g de almidón hidrosoluble y disolver lentamente en 50 ml de buffer
fosfato 0.1M (solución tampón), calentar la solución en horno microondas
por un minuto, ajustar pH = 7.0 +/- 2.0 y enrasar a 100 ml con buffer
fosfato 0.1M en balón volumétrico.
3. Reacción enzimática con almidón al 1 % p/v en bu ffer fosfato 0.1 M
3.1. Centrifugar la muestra (5000 rpm, 4°C, 10 min) , separar el extracto
crudo y depositar en un tubo eppendorf limpio.
3.2. Realizar el protocolo descrito en la tabla 1.
3.3. A partir del sobrenadante obtenido tomar 0,25 ml y transferir a los
tubos de ensayo que contienen 0,25 ml de DNS (Miller, 1959). Continuar
con el protocolo que se describe en la Tabla 2.
3.4. Los resultados de esta prueba deben ser reportados en Unidades
Amilolíticas (UA/l), definida como la cantidad de enzima que libera una
µmol de azucares reductores de glucosa por minuto, bajo las condiciones
de la prueba. Debe tener en cuenta que antes que cualquier cosa debe
realizar una curva patrón con de glucosa.
93
Tabla 1. Reacción enzimática con almidón al 1 % p/v en buffer fosfato
0.1 M
Reactivo Réplica 1 Réplica 2 Réplica 3
Almidón al 1 % (p/v) en Buffer
fosfato 0.1 M 1 ml 1 ml 1 ml
Extracto crudo 1 ml 1 ml 1 ml
Incubar las muestras por 30 minutos mínimo a la temperatura que desea
evaluar. Frenar la reacción depositando los tubos en hielo por cinco
minutos.
Centrifugar (5000 rpm, 4°C, 15 min) para separar el almidón no
hidrolizado en la reacción.
Tabla 2. Cuantificación de actividad amilolítica.
Reactivo Blanco Répica 1 Réplica 2 Réplica 3
Sobrenadante de la
técnica enzimática (ml) - 0.25 0.25 0.25
Agua (ml) 0.25 - - -
Reactivo DNS (ml) 0.25 0.25 0.25 0.25
Llevar a ebullición por 5 minutos y frenar reacción colocando los tubos en
hielo
Agua (ml) 2.5 2.5 2.5 2.5
Protejer los tubos de la luz y realice las lecturas en espectrofotómetro a
540 nm. Ajustando el cero de absorbancia con el blanco de la prueba
4. Elaboración de una curva de calibración de gluco sa
4.1. Preparación de una solución stock de glucosa 2 g/l
Pesar 2 g de glucosa anhidra en balanza analítica. Disolver en 500 ml de
agua destilada utilizando un balón volumétrico de 1000 ml. Homogenizar y
94
completar hasta 1000 mL con agua destilada. Rotular con la fecha de
preparación y la persona responsable.
4.2. Preparación de las soluciones de concentración conocida 0.5 –
2.0 g/l
Emplear la primera ley de la volumetría. Utilizar la fórmula 1.
Fórmula 1.
Preparar 6 soluciones con un volumen final de 2 ml, como lo muestra la
tabla 3.
4.3. Determinación de glucosa por DNS
A partir de cada una de las soluciones de concentración conocidas
deposite 0.25 ml en cada uno de los tubos de ensayo y siga el protocolo
descrito en la tabla 4. En lo posible procesar las muestras por triplicado.
Tabla 3. Preparación de las soluciones de glucosa.
Concentración (g/L)
Volumen de la solución
stock de glucosa 2 g/l
(ml)
Volumen de agua
destilada (ml)
0,5 0,5 1,5
0,7 0,7 1,3
1,0 1,0 1,0
1,5 1,5 0,5
1,7 1,7 0,3
2,0 2,0 0,0
Ci X Vi = Cf X Vf
95
4.4. Resultados
4.4.1. Realizar las determinaciones de absorbancia a una longitud de
onda (λ) de 540 nm en el espectrofotómetro, ajustando el cero de
absorbancia con el blanco de la prueba.
4.4.2. Registrar los resultados obtenidos en la tabla 5.
4.4.3 Haciendo uso de la calculadora o de sistemas operativos como
Excel haga la regresión lineal de los datos de absorbancia en función de
la concentración y determine la ecuación de la línea recta así como su
respectivo coeficiente de determinación (R2). Recuerde que valores
menores a 0.9 en el R2 no son permitidos para curvas patrones o de
calibración y por ende debe revisar el reactivo o la manipulación de sus
diluciones.
Tabla 4. Metodología para la elaboración de la curva patrón de glucosa.
Concentración (g/L) Reactivo Blanco
0,5 0,7 1,0 1,5 1,7 2,0
Glucosa (ml) - 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25
Agua (ml) 0,25 - - - - - -
DNS (ml) 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25
Calentar los tubos de ensayo por 5 minutos y posteriormente detenga la
reacción por la inmersión de los tubos en hielo durante 5 minutos.
Agua
destilada (m) 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5
Realizar las determinaciones de absorbancia a una longitud de onda (λ)
de 540 nm en el espectrofotómetro, ajustando el cero de absorbancia con
el blanco de la prueba.
96
Tabla 5. Resultados de la curva patrón de glucosa.
Absorbancia a 540 nm. Concentración (g/L)
R1 R2 R3
0,5
0,7
1,0
1,5
1,7
2,0
97
ANEXO 3. DETERMINACIÓN DE ACTIVIDAD PECTINOLÍTICA
1. Preparación del buffer fosfato 0.1 M
Preparar cada fosfato por separado de la siguiente forma: pesar 14.2g de
Na2HPO4 y disolver en 200 ml de agua destilada; pesar 12 g de NaH2PO4
y dilsolver en 200 ml de agua destilada, posteriormente mezclar, ajustar
pH= 7.0 +/- 2.0 y enrasar a 1000 ml con agua destilada en balón
volumétrico.
2. Preparación de pectina al 1 % p/v en buffer fosf ato 0.1M
Pesar 1g de pectina y disolver lentamente en 50 ml de buffer fosfato 0.1M
(solución tampón), calentar la solución en horno microondas por un
minuto, ajustar pH = 7.0 +/- 2.0 y enrasar a 100 ml con buffer fosfato 0.1M
en balón volumétrico.
3. Reacción enzimática con pectina al 1 % p/v en bu ffer fosfato 0.1 M
3.1. Centrifugar la muestra (5000 rpm, 4°C, 10 min) , separar el extracto
crudo y depositar en un tubo eppendorf limpio.
3.2. Realizar el protocolo descrito en la tabla 1.
Tabla 1. Reacción enzimática con pectina al 1 % p/v en buffer fosfato
0.1 M
Reactivo Réplica 1 Réplica 2 Réplica 3
Pecina al 1 % (p/v) en Buffer
fosfato 0.1 M 1 ml 1 ml 1 ml
Extracto crudo 1 ml 1 ml 1 ml
Incubar las muestras por 30 minutos mínimo a la temperatura que desea
evaluar. Frenar la reacción depositando los tubos en hielo por cinco
minutos.
Centrifugar (5000 rpm, 4°C, 15 min) para separar la pectina no
hidrolizada en la reacción.
98
3.3. A partir del sobrenadante obtenido tomar 0,25 ml y transferir a los
tubos de ensayo que contienen 0,25 ml de DNS (Miller, 1959). Continuar
con el protocolo que se describe en la Tabla 2.
3.4. Los resultados de esta prueba deben ser reportados en Unidades
Pectinolíticas (UP/l), definida como la cantidad de enzima que libera una
µmol de azucares reductores equivalentes a ácido D-galacturónico por
minuto, bajo las condiciones de la prueba. Debe tener en cuenta que
antes que cualquier cosa debe realizar una curva patrón con ácido D-
galacturónico.
Tabla 2. Cuantificación de actividad pectinolítica.
Reactivo Blanco Répica 1 Réplica 2 Réplica 3
Sobrenadante de la
técnica enzimática (ml) - 0.25 0.25 0.25
Agua (ml) 0.25 - - -
Reactivo DNS (ml) 0.25 0.25 0.25 0.25
Llevar a ebullición por 5 minutos y frenar reacción colocando los tubos en
hielo
Agua (ml) 2.5 2.5 2.5 2.5
Protejer los tubos de la luz y realice las lecturas en espectrofotómetro a
540 nm. Ajustando el cero de absorbancia con el blanco de la prueba
4. Elaboración de una curva de calibración de ácido D-galacturónico
4.1. Preparación de una solución stock de ácido D-g alacturónico 2 g/l
Pesar 2 g de ácido D-galacturónico en balanza analítica. Disolver en 500
ml de agua destilada utilizando un balón volumétrico de 1000 ml.
Homogenizar y completar hasta 1000 mL con agua destilada. Rotular con
la fecha de preparación y la persona responsable.
99
4.2. Preparación de las soluciones de concentración conocida 0.5 –
2.0 g/l
Emplear la primera ley de la volumetría. Utilizar la fórmula 1.
Formula 1.
Preparar 6 soluciones con un volumen final de 2 ml, como lo muestra la
tabla 3.
4.3. Determinación de ácido D-galacturónico por DNS
A partir de cada una de las soluciones de concentración conocidas
deposite 0.25 ml en cada uno de los tubos de ensayo y siga el protocolo
descrito en la tabla 4. En lo posible procesar las muestras por triplicado.
Tabla 3. Preparación de las soluciones de ácido D-galacturónico.
Concentración (g/L)
Volumen de la solución
stock de ácido D-
galacturónico 2 g/l (ml)
Volumen de agua
destilada (ml)
0,5 0,5 1,5
0,7 0,7 1,3
1,0 1,0 1,0
1,5 1,5 0,5
1,7 1,7 0,3
2,0 2,0 0,0
Ci X Vi = Cf X Vf
100
4.4. Resultados
4.4.1. Realizar las determinaciones de absorbancia a una longitud de
onda (λ) de 540 nm en el espectrofotómetro, ajustando el cero de
absorbancia con el blanco de la prueba.
4.4.2. Registrar los resultados obtenidos en la tabla 5.
4.4.3 Haciendo uso de la calculadora o de sistemas operativos como
Excel haga la regresión lineal de los datos de absorbancia en función de
la concentración y determine la ecuación de la línea recta así como su
respectivo coeficiente de determinación (R2). Recuerde que valores
menores a 0.9 en el R2 no son permitidos para curvas patrones o de
calibración y por ende debe revisar el reactivo o la manipulación de sus
diluciones.
Tabla 4. Metodología para la elaboración de la curva patrón de ácido D-
galacturónico.
Concentración (g/L) Reactivo Blanco
0,5 0,7 1,0 1,5 1,7 2,0
ácido D-
galacturónico
(ml)
- 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25
Agua (ml) 0,25 - - - - - -
DNS (ml) 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25
Calentar los tubos de ensayo por 5 minutos y posteriormente detenga la
reacción por la inmersión de los tubos en hielo durante 5 minutos.
Agua
destilada (ml) 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5
Realizar las determinaciones de absorbancia a una longitud de onda (λ)
de 540 nm en el espectrofotómetro, ajustando el cero de absorbancia con
el blanco de la prueba.
101
Tabla 5. Resultados de la curva patrón de ácido D-galacturónico.
Absorbancia a 540 nm. Concentración (g/L)
R1 R2 R3
0,5
0,7
1,0
1,5
1,7
2,0
102
ANEXO 4. DETERMINACIÓN DE ACTIVIDAD XILANOLÍTICA
1. Preparación del buffer fosfato 0.1 M
Preparar cada fosfato por separado de la siguiente forma: pesar 14.2g de
Na2HPO4 y disolver en 200 ml de agua destilada; pesar 12 g de NaH2PO4
y dilsolver en 200 ml de agua destilada, posteriormente mezclar, ajustar
pH= 7.0 +/- 2.0 y enrasar a 1000 ml con agua destilada en balón
volumétrico.
2. Preparación de xilano al 1 % p/v en buffer fosfa to 0.1M
Pesar 0.5g de xilano de abedul y 0.5g de xilano de avena de escanda y
disolver lentamente en 50 ml de buffer fosfato 0.1M (solución tampón),
calentar la solución en horno microondas por un minuto, ajustar pH = 7.0
+/- 2.0 y enrasar a 100 ml con buffer fosfato 0.1M en balón volumétrico.
3. Reacción enzimática con xilano al 1 % p/v en buf fer fosfato 0.1 M
3.1. Centrifugar la muestra (5000 rpm, 4°C, 10 min) , separar el extracto
crudo y depositar en un tubo eppendorf limpio.
3.2. Realizar el protocolo descrito en la tabla 1.
3.3. A partir del sobrenadante obtenido tomar 0,25 ml y transferir a los
tubos de ensayo que contienen 0,25 ml de DNS (Miller, 1959). Continuar
con el protocolo que se describe en la Tabla 2.
3.4. Los resultados de esta prueba deben ser reportados en Unidades
Xilanolíticas (UX/l), definida como la cantidad de enzima requerida para
producir una µmol de azucares reductores equivalentes a xilosa por
minuto, bajo las condiciones de la prueba. Debe tener en cuenta que
antes que cualquier cosa debe realizar una curva patrón con xilosa.
103
Tabla 1. Reacción enzimática con xilano al 1 % p/v en buffer fosfato
0.1 M.
Reactivo Réplica 1 Réplica 2 Réplica 3
xilano al 1 % (p/v) en Buffer
fosfato 0.1 M 1 ml 1 ml 1 ml
Extracto crudo 1 ml 1 ml 1 ml
Incubar las muestras por 30 minutos mínimo a la temperatura que desea
evaluar. Frenar la reacción depositando los tubos en hielo por cinco
minutos.
Centrifugar (5000 rpm, 4°C, 15 min) para separar el xilano no
hidrolizada en la reacción.
Tabla 2. Cuantificación de actividad xilanolítica.
Reactivo Blanco Répica 1 Réplica 2 Réplica 3
Sobrenadante de la
técnica enzimática (ml) - 0.25 0.25 0.25
Agua (ml) 0.25 - - -
Reactivo DNS (ml) 0.25 0.25 0.25 0.25
Llevar a ebullición por 5 minutos y frenar reacción colocando los tubos en
hielo
Agua (ml) 2.5 2.5 2.5 2.5
Protejer los tubos de la luz y realice las lecturas en espectrofotómetro a
540 nm. Ajustando el cero de absorbancia con el blanco de la prueba
4. Elaboración de una curva de calibración de xilos a
4.1. Preparación de una solución stock de xilosa 2 g/l
104
Pesar 2 g de xilosa en balanza analítica. Disolver en 500 ml de agua
destilada utilizando un balón volumétrico de 1000 ml. Homogenizar y
completar hasta 1000 mL con agua destilada. Rotular con la fecha de
preparación y la persona responsable.
4.2. Preparación de las soluciones de concentración conocida 0.5 –
2.0 g/l
Emplear la primera ley de la volumetría. Utilizar la fórmula 1.
Fórmula 1.
Preparar 6 soluciones con un volumen final de 2 ml, como lo muestra la
tabla 3.
4.3. Determinación de xilosa por DNS
A partir de cada una de las soluciones de concentración conocidas
deposite 0.25 ml en cada uno de los tubos de ensayo y siga el protocolo
descrito en la tabla 4. En lo posible procesar las muestras por triplicado.
Ci X Vi = Cf X Vf
105
Tabla 3. Preparación de las soluciones de xilosa.
Concentración (g/L) Volumen de la solución
stock de xilosa (ml)
Volumen de agua
destilada (ml)
0,5 0,5 1,5
0,7 0,7 1,3
1,0 1,0 1,0
1,5 1,5 0,5
1,7 1,7 0,3
2,0 2,0 0,0
4.4. Resultados
4.4.1. Realizar las determinaciones de absorbancia a una longitud de
onda (λ) de 540 nm en el espectrofotómetro, ajustando el cero de
absorbancia con el blanco de la prueba.
4.4.2. Registrar los resultados obtenidos en la tabla 5.
4.4.3 Haciendo uso de la calculadora o de sistemas operativos como
Excel haga la regresión lineal de los datos de absorbancia en función de
la concentración y determine la ecuación de la línea recta así como su
respectivo coeficiente de determinación (R2). Recuerde que valores
menores a 0.9 en el R2 no son permitidos para curvas patrones o de
calibración y por ende debe revisar el reactivo o la manipulación de sus
diluciones.
T
106
abla 4. Metodología para la elaboración de la curva patrón de xilosa.
Concentración (g/L) Reactivo Blanco
0,5 0,7 1,0 1,5 1,7 2,0
xilosa - 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25
Agua (ml) 0,25 - - - - - -
DNS (ml) 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25
Calentar los tubos de ensayo por 5 minutos y posteriormente detenga la
reacción por la inmersión de los tubos en hielo durante 5 minutos.
Agua
destilada (ml) 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5
Realizar las determinaciones de absorbancia a una longitud de onda (λ)
de 540 nm en el espectrofotómetro, ajustando el cero de absorbancia con
el blanco de la prueba.
Tabla 5. Resultados de la curva patrón de xilosa.
Absorbancia a 540 nm. Concentración (g/L)
R1 R2 R3
0,5
0,7
1,0
1,5
1,7
2,0
107
CARACTERIZACIÓN CINÉTICA Y ENZIMÁTICA DE Thermoanaerobacter italicus CEPA USBA 18 AISLADA DE UN MANANTIAL TERMOMINERAL E N PAIPA,
BOYACÁ Javier Gómez, Sandra Baena, Balkys Quevedo.
RESUMEN
Se caracterizó cinética y enzimáticamente la cepa Thermoanaerobacter italicus USBA 18, bacilo termófilo anaerobio aislado de un manantial termomineral (5º45’30.69’’N; 73º6’50.61’’W) de Paipa (Boyacá), para determinar las condiciones óptimas de crecimiento, sustratos degradados y metabolitos producidos y cuantificar la actividad enzimática amilolítica, peptinolítica y xilanolítica de este organismo. La temperatura óptima de crecimiento fluctuó entre 65 y 70ºC, usando glucosa (20 mM) como fuente de carbono. El pH óptimo de crecimiento fue alrededor de 7.2 y 1% de NaCl se determinó como la concentración adecuada para el crecimiento Tiene una actividad amilolítica, pectinolítica y xilanolítica considerable y aplicable a nivel industrial. Thermoanaerobacter italicus cepa USBA 18 tiene la capacidad de fermentar azúcares como glucosa, galactosa y xilosa, sin embargo la arabinosa no es utilizada como fuente de energía. A su vez, la cepa USBA 18 también es capaz de degradar polímeros complejos como almidón, pectina y xilano. A partir del metabolismo genera como principal producto final de su fermentación acido láctico. Palabras claves: Anaerobio, manantial termomineral, termófiloThermoanaerobacter italicus. INTRODUCCIÓN El estudio, identificación y caracterización de microorganismos aislados de ambientes extremos hace parte del entendimiento de la diversidad microbiana de este tipo de ambientes, con el fin de determinar las características particulares que permiten a los organismos sobrevivir en condiciones extremas y comprender el papel desempeñado por los microorganismos en sus hábitats naturales. Los microorganismos extremófilos se caracterizan por habitar en ambientes en los cuales las condiciones físicas son críticas con respecto a las condiciones “normales” (temperaturas altas o muy bajas, valores de pH extremadamente ácidos ó básicos, ausencia de oxígeno, salinidad, presión, entre otras), sin embargo, estos microorganismos tienen la capacidad de sobrevivir y reproducirse bajo estas condiciones. Investigaciones desarrolladas en la Unidad de Saneamiento y Biotecnología Ambiental (USBA) demostraron la presencia de poblaciones microbianas termofilicas en manantiales termominerales (MTM) en la región de Paipa, Boyacá, con la identificación de microorganismos sulfato reductores, tiosulfato reductores, reductores de hierro
férrico, reductores de nitrato y principalmente microorganismos fermentativos. Se han identificado nuevas especies de bacterias sulfato-reductoras termófilas pertenecientes al género Desulfomicrobium y se ha propuesto una nueva especie llamada Desulfomicrobium thermophilum. Del mismo modo se encontró una marcada dominancia de organismos del filum Firmicutes y especialmente de miembros del genero Thermoanaerobacter identificados por medio de análisis fenotípicos y moleculares del gen 16S rRNA. A partir de estos estudios se seleccionó la cepa Thermoanaerobacter italicus cepa USBA 18 aislada del manantial termomineral P4 - pozo Hotel Lanceros en Paipa, Boyacá. METODOLOGÍA Microoganismo. Thermoanaerobacter italicus cepa USBA 18, se encuentra en la colección de microorganismos del Departamento de Biología de la Pontificia Universidad Javeriana bajo el número PUJ-M-BIO-USBA-18 (P4-4). Esta cepa fue aislada de un manantial termomineral (MTM) localizado en Paipa en el departamento de Boyacá (5º 45' 30,69” N, 73º 6' 50,61” W; 2500 msnm) (PP-10 Pozo Hotel Lanceros) (Alfaro, 2002; Posada et al., 2004). Por análisis fenotípicos y genotípicos se conoce que
108
la cepa USBA 18 pertenece al género Thermoanaerobacter, y con base en el análisis de la secuencia del 16S rDNA se observa una similitud del 98% y 97% con Thermoanaerobacter italicus y Thermoanaerobacter mathranii, respectivamente. Medio de cultivo y condiciones de cultivo. Las técnicas de Hungate (Hungate, 1969) se usaron para llevar a cabo este estudio. El medio básico contenía (l-1): 1.0 g de NH4Cl; 0.3 g de K2HPO4; 0.3 g de KH2PO4; 23.0 g de NaCl; 0.1 g de CaCl2; 0.1 g de KCl; 0.5 g de c; 0.5 g de extracto de levadura; 10.0 ml de solución de oligonutrientes de Balch (Balch et al., 1979); 1.0 ml de resazurina 0.1%. El pH del medio se ajustó a 7.0 ± 0.1 con NaOH 0.1N. El medio se llevó a ebullición hasta obtener una atmósfera libre de O2 y se enfrió a temperatura ambiente. Alícuotas (4.3 ml) de medio se distribuyeron dentro de tubos Hungate bajo condiciones libres de O2 por la adición de N2 gaseoso. Posteriormente la fase gaseosa se sustituyó con N2/CO2 (80:20) (Baena et al., 1999). El medio se esterilizó a 15 psi durante 20 minutos. Una vez autoclavados los tubos Hungate que contenían el Medio Básico (MB) se adicionaron 0.05 ml de Na2S al 2% (v/v) para asegurar las condiciones de anaerobiosis y 0.05 ml de NaHCO3 al 10% (v/v) para mantener el pH del medio. Las fuentes de carbono fueron adicionadas a cada tubo a partir de soluciones stock estériles y preparadas bajo condiciones de anaerobiosis (Rubiano, 2006). Posteriormente, el medio fue inoculado con 10% (v/v) del preinóculo de bacteria y llevado a incubación. Medio de cultivo mínimo de crecimiento. Se evaluaron diferentes concentraciones de extracto de levadura (0.25, 0.5, 1.0, 2.0 g/l) y peptona (0.25, 0.5, 1.0 g/l) como fuente de nitrógeno orgánico en el medio básico (MB) de cultivo. A su vez se cambió la fuente inorgánica de nitrógeno (NH4Cl) por KNO3 1.0 g/l y se evaluó una serie con la adición de vitaminas de Balch sin extracto de levadura (Balch et al., 1979). Thermoanaerobacter italicus USBA 18 fue subcultivada dos veces sucesivas
por triplicado bajo las mismas condiciones experimentales y se tomaron muestras de los tiempos 0 y 120 h de fermentación. Las muestras fueron procesadas y analizadas por Cromatografía Líquida de Alta Eficiencia (HPLC). Determinación de condiciones óptimas de crecimiento. Thermoanaerobacter italicus cepa USBA 18 fue subcultivada dos veces sucesivas bajo las mismas condiciones experimentales y por triplicado en tubos Hungate y se realizó un seguimiento del microorganismo por densidad óptica (DO) a 580nm y verificación microscópica del crecimiento de este en el medio líquido utilizando el microscopio de contraste de fase (Nikon: Eclipse 50i). Los valores obtenidos de absorbancia a 580 nm fueron transformados a concentración (µg de biomasa seca/ml) por medio de la curva patrón de peso seco. Los parámetros evaluados para determinar las condiciones óptimas de crecimiento fueron: temperatura, pH y concentración NaCl. Determinación de actividades enzimáticas. La determinación de actividades enzimáticas se realizó a partir de curvas de crecimiento con las diferentes fuentes de carbono (almidón 2%; pectina 2% y xilano 8g/L (xilano de abedul 4.0 g/L; xilano de avena de escanda 4.0 g/L) a las condiciones óptimas determinadas previamente y se obtuvieron extractos crudos por centrifugación de las horas de muestreo, los cuales fueron enfrentados a una solución de la fuente de carbono al 1% p/v en buffer fosfato 0.1M. La mezcla fue incubada durante 30 minutos a 65ºC, posteriormente clarificada por centrifugación y los azucares reductores fueron determinados por la técnica del ácido 3,5-dinitrosalicilico (DNS) (Miller., 1959). Una unidad de actividad se definió como la cantidad de enzima requerida para producir una µmol de azúcar reductor por minuto (Kozianowski et al., 1997; Chauhan et al., 2006). Evaluación de crecimiento en diferentes sustratos y determinación de metabolitos producidos por HPLC. Se evaluó el crecimiento de
109
Thermoanaerobacter italicus cepa USBA 18 en diferentes sustratos. Los sustratos utilizados como fuente de carbono fueron: almidón y pectina a una concentración del 2% p/v; arabinosa, galactosa y glucosa a una concentración de 20 mM y xilano 8 g/L. Se realizó seguimiento al sustrato consumido mediante la cuantificación de azucares reductores por DNS a las diferentes horas de muestreo y se determinaron los metabolitos producidos en la fermentación de las diferentes fuentes de carbono por cromatografía liquida de alta eficiencia (HPLC) en fase reversa utilizando un cromatógrafo Shimadzu Prominence LC-20AT, equipado con un automuestreador (Shimadzu SIL-20), una columna Restek Ultra Aqueous C18 (5 µm x 150 x 4.6 mm) y un detector de arreglo de diodos (Shimadzu SPP-M20A) con H2PO4 0.05% pH 2.5 como fase móvil. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Morfología Thermoanaerobacter italicus cepa USBA 18. Thermoanaerobacter italicus cepa USBA 18 es un bacilo delgado móvil, se dispone solo, en parejas o cadenas de hasta 5 células. El tamaño de la célula es de 3 a 6 µm de largo x 0.3 a 0.45 µm de ancho. Después de 12 horas de incubación las células se agrupan en cadenas alcanzando una longitud de 25 µm aproximadamente. Este bacilo termófilo anaerobio presenta reacción positiva a la coloración de Gram y forma esporas esféricas terminales (figura 1). Morfológicamente, la cepa USBA 18 es similar a Thermoanaerobacter italicus, aunque difieren en su reacción frente a la coloración de Gram, ya que la cepa USBA 18 es Gram positiva y Thermoanaerobacter italicus Gram negativa (Kozianowski et al., 1997). Las dos cepas forman esporas circulares terminales y las células se disponen solas, en pares o en cadenas (Tabla 4). El tamaño celular entre T. italicus y la cepa USBA 18 es diferente ya que T. italicus mide 2 a 6 µm de largo x 0.4 a 0.75 µm de ancho. Determinación de condiciones óptimas de crecimiento. Se determinaron las condiciones óptimas
de crecimiento de Thermoanaerobacter italicus cepa USBA 18, teniendo en cuenta temperatura de crecimiento, pH y concentración de NaCl del medio de cultivo. La temperatura óptima de crecimiento para esta cepa se presentó entre 65°C y 70°C, a pH de 7,2 y 1% (p/v) de NaCl en el medio de cultivo. En estas condiciones de cultivo, la bacteria presentó una velocidad específica de crecimiento (µx) de 0.3045 h-1, con un tiempo de duplicación (td) de 2.276 h.
Figura 1. Microfotográfica de contraste de fase de Thermoanaerobacter italicus USBA 18 tomada a las 24 horas de cultivo en medio básico suplementado con glucosa 20 mM. Es importante aclarar que las condiciones óptimas encontradas para la cepa USBA 18 están influenciadas por las características físicas y químicas encontradas en el lugar de su aislamiento (Pozo hotel Lanceros), que presenta una temperatura promedio de 64°C, un pH de 7.2 y una concentración de NaCl de 41 g/l (4.1% p/v) (Alfaro, 2002; Pachon y Posada, 2003). Únicamente, existe una diferencia marcada en la concentración de NaCl encontrada en el lugar de su aislamiento y la reportada como óptima para la cepa USBA 18 en este trabajo. La bibliografía reporta para Thermoanaerobacter italicus usando glucosa como fuente de carbono a 70°C un tiempo de duplicación (td) de 2.1 h con una velocidad específica de crecimiento (µx) de 0.33 h-1 (Kozianowski et al., 1997). La cepa USBA 18 y Thermoanaerobacter italicus se diferencian en su tiempo de duplicación con glucosa como fuente de carbono en 0.16 h. Determinación de Actividades enzimáticas. Se evaluaron las
110
actividades amilolítica, xilanolítica y pectinolítica (65°C x 30 min), enfrentando el extracto enzimático (obtenido por centrifugación) a una solución stock buffer fosfato de la fuente de carbono y se cuantificaron los azúcares reductores producidos en la reacción por DNS. Se determinó que Thermoanaerobacter italicus cepa USBA 18 presenta actividad amilolítica (410 UA/l), pectinolítica (265 UP/l) y xilanolítica (216 UX/l) cuantitativa (figura 2). La capacidad de degradar estos polímeros de origen vegetal se debe posiblemente a la exposición del microorganismo en su ambiente natural a carbohidratos derivados de algas termófilas y derivados de biomasa bacteriana ó por polisacáridos estructurales vegetales que ocasionalmente caen en estos ambientes por desplazamiento físico (Jain y Zeikus, 1992). Lo cual se ha evidenciado durante los muestreos, ya que el manantial termomineral PP-10 “Pozo Hotel Lanceros” se encuentra resguardado de visitantes y la entrada de materia orgánica exógena es muy baja, ocasionalmente se encuentran en el pozo hojas ó ramas provenientes de la vegetación cercana. La existencia de organismos en este yacimiento es evidente, continuamente se observa la presencia de algas y lodo en la zona circundante al punto de emanación (Pachon y Posada, 2003). Teniendo en cuenta que Thermoanaerobacter italicus cepa USBA 18 presenta actividad amilolítica, pectinolítica y xilanolítica cuantitativa, se debe profundizar sobre su actividad y sus enzimas con el fin de determinar utilidades a nivel biotecnológico e industrial debido a que estos tres polímeros de origen vegetal son altamente empleados en la industrial, para la producción de alcoholes, monómeros (azúcares), ácidos orgánicos y una infinidad de productos y finalidades. Crecimiento en diferentes sustratos y determinación de metabolitos producidos por HPLC. Se realizó seguimiento al sustrato consumido
mediante la cuantificación de azúcares reductores por DNS en diferentes tiempos de crecimiento y se determinaron los metabolitos producidos en la fermentación de las diferentes fuentes de carbono por cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC) en fase reversa. Thermoanaerobacter italicus cepa USBA 18 tiene la capacidad de fermentar azúcares como glucosa, galactosa y xilosa, sin embargo, la arabinosa no es utilizada como fuente de energía (característica no compartida con Thermoanaerobacter italicus la cual sí presenta crecimiento y degradación de esta pentosa), observando así diferencias a nivel fenotípico con la cepa aislada por Kozianowski y col (1997) (Tabla 4). A su vez, la cepa USBA 18 también es capaz de degradar polímeros complejos como almidón, pectina y xilano (figura 3).
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130
Tiempo (h)
Uni
dade
s de
Act
ivid
ad/l
UA/l
UP/l
UX/l
Figura 2. Actividades enzimáticas producidas por Thermoanaerobacter italicus cepa USBA 18. Reacción enzimática a 65°C x 30 min. Es importante resaltar que la figura 3 muestra el consumo de sustrato. En los casos de consumo de almidón y xilano, lo que se observa es un aumento con respecto al tiempo, esto se debe a que al degradarse el polímero aumenta la cantidad de azúcares reductores, mostrando de forma indirecta el consumo de sustrato. La cepa USBA 18 exhibe un metabolismo fermentativo, teniendo mayor afinidad por las hexosas como la glucosa y la galactosa y en una proporción menor por las pentosas como la xilosa; la pentosa arabinosa no es degradada. La degradación de las hexosas y los polímeros de glucosa posiblemente (almidón y pectina) la realiza utilizando la vía clásica de Embden Meyerhof Parmas (EMP) utilizando la fructosa-6-fosfato o la glucosa-6-fosfato como precursores
111
metabólicos (Schönheit, 2008) hasta llegar a formar dos moléculas de piruvato (ácido pirúvico) que puede ser convertido en diferentes productos entre los cuales se incluyen alcohol etilico (etanol), ácido acético, ácido láctico, ácido succínico, ácido butírico, alcohol bulitico, alcohol isopropilico, ácido propiónico, ácido fórmico y otros componentes (McArthur, 2006). Las pentosas (polímero de xilano) son degradadas por medio de la ruta de las pentosas fosfato, teniendo la molécula de cinco carbonos fosforilada como precursora de la vía, y generando de este modo dos opciones metabólicas para la degradación y la subsiguiente formación de los productos metabólicos; la pentosa fosfato puede ser hidrolizada hasta una triosa fosfato y convertirse en piruvato, o la pentosa puede entrar en la parte regenerativa de la vía, en la cual las pentosas fosfato se convierten en hexosas fosfatos y pasan a ser degradadas en la glicólisis (EMP) (Koolman y Roehm, 2005). La capacidad de degradación de polímeros complejos de origen vegetal que presenta Thermoanaerobacter italicus cepa USBA 18, hacen de este microorganismo atractivo para procesos industriales, ya que exhibe los complejos enzimáticos necesarios para la hidrólisis de moléculas complejas hasta glucosa con la formación principalmente de acido láctico y de sustratos más complejos como el almidón, la pectina y el xilano también con una producción mayor de ácido láctico.
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
5.5
0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52
Tiempo (h)
Sus
trato
(g/L
) Galactosa
Arabinosa
Glucosa
Almidon
Xilano
Figura 3. Consumo de sustrato con respecto al tiempo por parte de Thermoanaerobacter italicus cepa USBA 18. Los productos finales de la fermentación de Thermoanaerobacter italicus fueron
analizados por cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC), los resultados obtenidos se muestran en las tabla 1,2 y 3. Es importante resaltar que el metabolito producido en mayor concentración fue ácido láctico (19.7 mM) utilizando glucosa como fuente de carbono, aunque se generaron otro tipo de productos en el bioproceso como ácido acético (12.8 mM) con almidón como sustrato y ácido fórmico, málico, succínico, propiónico y etanol pero en menores concentraciones (tabla 1). Con respecto a las variaciones realizadas al medio de cultivo, se determinó que la concentración adecuada de extracto de levadura para la producción de ácido láctico se encuentra en el rango comprendido entre 0.5 g/l y 1.0 g/l obteniéndose valores de 19.7 mM y 19.5 mM respectivamente. Si la fuente de nitrógeno orgánico (extracto de levadura) es sustituida por peptona se obtiene que la concentración apropiada para la producción de ácido láctico es de 0.5 g/l proporcionando 20.2 mM de este ácido orgánico y pequeñas trazas de ácido acético (2.1 mM) (tabla 2). El cambio de la fuente de nitrógeno inorgánica (NH4Cl por KNO3) influye notablemente en la producción de los metabolitos evaluados ya que con la adición de KNO3 se produce en menor proporción ácido láctico (7.6 mM) y ácido acético (4.8 mM) con respecto a los valores obtenidos a partir de la fermentación de la glucosa o del almidón. La adición de la solución de vitaminas de Balch por extracto de levadura no suple por completo los requerimientos celulares a nivel de fuente de nitrógeno debido a que se produce en menor proporción los metabolitos analizados (0.3 mM de ácido málico, 10.3 mM de ácido láctico, 6.1 mM de ácido acético, 1.1 mM de acido succínico y 0.8 mM de ácido propiónico) (tabla 3). Lo anterior lleva a concluir que Thermoanaerobacter italicus cepa USBA 18 necesita de una fuente orgánica de nitrógeno para la producción de los ácidos orgánicos analizados, en especial para la producción de ácido láctico, indistintamente si se trata de extracto de levadura o peptona.
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Tabla 1. Productos metabólicos producidos por Thermoanaerobacter italicus cepa USBA 18 con diferentes fuentes de carbono a las 120 h de fermentación (65ºC; pH 7.2).
YE, extracto de levadura. Se uso como control de la prueba (MB + YE (0.5 g/l)) y a los valores obtenidos se le restó el control. Thermoanaerobacter italicus produce como metabolitos finales de la fermentación de glucosa, etanol (26.6 mM), lactato (12.4 mM), acetato (2.2 mM), succinato (0.3mM), H2 y CO2 (Kozianowski et al., 1997). A diferencia de T. italicus, la cepa USBA 18 no genera etanol como producto final del metabolismo de la glucosa y produce en mayor proporción lactato y acetato y en menores proporciones ácido fórmico, ácido málico y ácido propiónico (tabla 4). Se observó producción de etanol en muy bajas concentraciones utilizando como fuentes de carbono pectina (0.5 mM de etanol) y almidón (0.2 mM de etanol), generando de esta forma diferencias notables a nivel metabólico y cinético entre Thermoanaerobacter italicus y la cepa USBA 18. Desde el punto de vista biotecnológico es importante resaltar la producción de los metabolitos generados por Thermoanaerobacter italicus cepa USBA 18, ya que se observó que el producto final de la fermentación que se presentó en mayor concentración fue ácido láctico y ácido acético y la relevancia que se le puede dar a estos productos a nivel industrial. Se ha determinado por bibliografía que Bacillus thermoamylovorans produce 22.2 mM de ácido láctico a partir de glucosa 30 mM a las 72 h de fermentación a 50°C (Combet-Blanc et al., 1995) y que este microorganismo tiene un elevado potencial biotecnológico para la producción de ácido láctico a partir de azúcares y sustratos de origen vegetal (Combet-Blanc et al., 1999).
El acido láctico ha sido usado durante mucho tiempo en la industria del cuero como acidulante; es usado en la terminación de textiles y de la lana; también es usado para aplicaciones menores como en la producción de resinas, impresión litográfica y textil, en adhesivos y en la formulación de detergentes (5 a 10% del consumo total de ácido láctico); además, tiene numerosas aplicaciones farmacéuticas y cosméticas ya que muchas de las formulaciones contienen este ácido orgánico, lactato de sodio y de calcio y acil lactatos. El lactato de calcio es usado para tratar las deficiencias de este mineral, los lactatos son adicionados a muchos productos cosméticos como humectantes, emulsificantes y estabilizantes, a su vez estos han sido promovidos como productos para el cuidado de la piel (mejoran la textura y apariencia de la piel) y el etil lactato es el ingrediente activo en las preparaciones anti acné (Rogers et al., 2006). Del mismo modo, existen aplicaciones importantes a nivel médico para los polilactátidos preparados a partir de dímeros láctidos. Estos polímeros son usados para procedimientos que requieren sutura quirúrgica, placas de hueso, entre otras que generan interés ya que son biocompatibles y biodegradables. El acido láctico también, es usado como una alternativa ecológica para la producción de bioplasticos generando una alternativa amigable con el medio ambiente y se presenta como uno de los productos biotecnológicos más importantes y con mayor potencial (Romaní et al., 2008).
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Tabla 2. Productos metabólicos producidos por Thermoanaerobacter italicus USBA 18 con diferentes concentraciones de extracto de levadura y peptona a las 120 h de fermentación (65ºC; pH 7.2).
MB, medio básico; Glu, glucosa; YE, extracto de levadura; PEP, peptona. Se uso como control de la prueba (MB + Glu (20mM) – fuente orgánica de nitrógeno) y a los valores obtenidos se le restó el control. Tabla 8. Productos metabólicos producidos por Thermoanaerobacter italicus cepa USBA 18 con KNO3 como fuente inorgánica de nitrógeno y solución de vitaminas de Balch a las 120 h de fermentación (65ºC; pH 7.2).
MB+Glu(20mM)-YE+KNO3 0,0 0,0 0,0 2,7 0,0 0,0 0,0 MB, medio basico; Glu, glucosa; YE, extracto de levadura; Vit, solucion de vitaminas de Balch. Se uso como control de la prueba (MB + Glu (20mM) y a los valores obtenidos se le restó el control. CONCLUSIONES Se realizó la caracterización cinética y enzimática de Thermoanaerobacter italicus cepa USBA 18, determinándose que la cepa USBA 18 presenta diferencias a nivel fenotípico con Thermoanaerobacter italicus (Kozianowski et al., 1997). Dentro de las diferencias más importantes encontradas en el marco de este estudio, se resalta la no producción de etanol como producto final de la fermentación por parte de Thermoanaerobacter italicus cepa USBA 18, la formación de ácido láctico como el producto predominante de su metabolismo y la no utilización de arabinosa como fuente de carbono. Todo lo anterior indica que posiblemente la cepa USBA 18 sea una nueva subespecie del género Thermoanaerobacter a su vez, se determinó que la cepa utilizada para realizar el estudio es termófila; ya que crece adecuadamente a temperaturas superiores a 50°C y que no es hipertermófila debido a que a
temperaturas mayores de 75°C su crecimiento se ve afectado. También se concluye que para su crecimiento óptimo es necesario tener un pH del medio cercano a la neutralidad y que su crecimiento no se ve inhibido por la presencia de NaCl, porque presenta crecimiento tanto en ausencia como en presencia de NaCl. . Se concluyó que Thermoanaerobacter italicus cepa USBA 18 necesita de una fuente orgánica de nitrógeno para la producción de metabolitos finales, en especial para la producción de ácido láctico, indistintamente si se trata de extracto de levadura o peptona. El cambio de la fuente de nitrógeno inorgánico (NH4Cl por KNO3) influye notablemente en la producción de los metabolitos finales de su fermentación. La adición de solución de vitaminas de Balch por extracto de levadura no suple por completo los requerimientos celulares para la producción de los metabolitos evaluados en este trabajo. Thermoanaerobacter italicus cepa USBA 18 presenta actividad amilolítica
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Tabla 4. Principales Características de algunas especies del género Thermoanaerobacter.
Características
Thermoanaerobacter italicus (Kozianowski et al., 1997)
Thermoanaerobacter mathranii (Larsen et al., 1997)
Thermoanaerobacter brockii (Zeikus et al., 1979)
Thermoanaerobacter ethanolicus (Wiegel y Ljungdahl, 1981)
Butirato - - - - - - n.r.: No reportado n.d: No determinado
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(409.9 UA/l), pectinolíca (264.9 UP/l) y xilanolítica (215.9 UX/l) cuantitativa. Las tres actividades presentadas por este microorganismo son significativas y se cree que podrían ser potencialmente utilizadas a nivel biotecnológico y en una gran variedad de industrias. Se debe resaltar que la actividad que se presentó en mayor proporción fue la amilolítica ademas, Se estableció Thermoanaerobacter italicus cepa USBA 18 tiene un metabolismo fermentativo y que puede utilizar algunas hexosas y pentosas como fuente energética, del mismo modo se determinó que la bacteria analizada tiene la capacidad de hidrolizar polímeros complejos hasta compuestos más simples de gran valor comercial y biotecnológico, como el ácido láctico, que actualmente genera mucho interés debido a que puede ser convertido en polímeros biodegradables. BIBLIOGRAFÍA Alfaro, C. 2002. Geoquímica del sistema geotérmico de Paipa. Ingeominas. Bogota D.C. Baena, S., Fardeau, M. L., Ollivier, B., Labat, M., Thomas, P., García, J. L., Patel, K. C. 1999. Aminomonas paucivorans gen. Nov., sp. Nov., a mesophilic, anaerobic, amino-acid-utilizing bacterium. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 49: 975 – 982. Balch, W., Fox , G., Magrum, R., Wolfe, R. 1979. Methanogens: Re-evaluation of a unique biological group. Microbiol Rev. 43: 260 – 296. Chauhan, S., Choudhury, B., Singh, S., Ghosh, P. 2006. Application of Xylanase enzyme of Bacillus coagulans as a prebleaching agent on non-woody pulps. Process Biochemistry. 41: 226-231. Combet-Blanc, Y., Dieng, M. C., Kergoat, P. Y. 1999. Effect of organic complex compounds on Bacillus thermoamylovorans growth and glucose fermentation. Applied and environmental microbiology. 65: 4582–4585. Combet-Blanc, Y., Kalamba, K. K., Kergoat, P. Y. 1995. Effect of pH on
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