PONTIFICIA UNIVERSIDAD CATOLICA DE CHILE FACULTAD DE AGRONOMIA E INGENIERIA FORESTAL DIRECCION DE INVESTIGACION Y POSTGRADO PROGRAMA DE POSTGRADO EN CIENCIAS DE LA AGRICULTURA MAGISTER EN CIENCIAS ANIMALES EFECTO DEL NIVEL DE PROTEINA SOBRE LA ACTIVIDAD DE LOS TANINOS EN LA DIGESTION RUMINAL DE POLISACARIDOS ESTRUCTURALES Tesis presentada como requisito para optar al grado de Magister en Ciencias Animales por: Jorge Alexander Peña Gutiérrez Comité de Tesis Profesor Guía: Gaston Pichard. Ing. Agr., PhD. Profesores Informantes: Antonio Hargreaves. Ing. Agr., MSc., PhD. Fernando Bas. Ing. Agr. MSc., PhD. Enero 2004 Santiago-Chile
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PONTIFICIA UNIVERSIDAD CATOLICA DE CHILE FACULTAD DE AGRONOMIA E INGENIERIA FORESTAL
DIRECCION DE INVESTIGACION Y POSTGRADO PROGRAMA DE POSTGRADO EN CIENCIAS DE LA AGRICULTURA
MAGISTER EN CIENCIAS ANIMALES
EFECTO DEL NIVEL DE PROTEINA SOBRE LA ACTIVIDAD DE LOS TANINOS EN LA
DIGESTION RUMINAL DE POLISACARIDOS ESTRUCTURALES
Tesis presentada como requisito para optar al grado de
Magister en Ciencias Animales
por:
Jorge Alexander Peña Gutiérrez
Comité de Tesis Profesor Guía: Gaston Pichard. Ing. Agr., PhD.
Profesores Informantes: Antonio Hargreaves. Ing. Agr., MSc., PhD.
Fernando Bas. Ing. Agr. MSc., PhD.
Enero 2004
Santiago-Chile
AGRADECIMIENTOS
Deseo agradecer a todas aquellas personas que de una u otra manera
colaboraron con el desarrollo de este trabajo. Especialmente a Don Gaston Pichard, mi
profesor guía, no sólo por su labor como educador, sino también por aportes, ideas y
valiosos consejos.
A Don Antonio Hargreaves, quien además de profesor, ha sido un amigo y
consejero en todos los momentos de mi carrera. A Don Fernando Bas por todos sus
consejos y apoyo en general brindado durante el transcurso de mis estudios en la
Universidad.
A Eduardo Leiva y Claudio Tapia por su ayuda y voluntad durante los estudios en
el laboratorio; a la secretaria del Departamento María Eugenia Garín por todo su apoyo y
a todo el personal de los laboratorios del Departamento y la Unidad Metabólica,
especialmente Jorge Moraga y Jorge Manzor.
También a todos los profesores y compañeros que me escucharon y ayudaron en
cada momento del magíster, con especial cariño a Claudio Aguilar, Guillermo Barros,
María Elena Covarrubias, Mónica Gandarillas, Gonzalo Gompertz, Marisol González,
Rafael Larraín, Cecilia Rivas y José Luis Riveros.
Agradezco a la Organización de Estados Americanos (OEA) quien me brindó la
oportunidad de ingresar al programa de Magister en Ciencias Animales en esta
Universidad mediante el programa de adiestramiento (PRA). Al Departamento de Ciencias
Animales de la Pontificia Universidad Católica de Chile, por otorgar el financiamiento al
presente trabajo y a la Empresa Concha y Toro por su aporte en la facilitación de material
para el desarrollo del presente.
Finalmente, a mis familiares por su cariño, paciencia y apoyo durante el desarrollo
de mis estudios.
A mis padres Jorge y Leticia;
mis hermanos Lorena Lizzeth, Ada Leticia, Estrella Yamileth y Martín de Jesús,
con todo mi cariño y dedicación.
1
INDICE
RESUMEN . . . . . . . . . 4
ABSTRACT . . . . . . . . . 5
INTRODUCCION . . . . . . . . 6
MATERIALES METODOS . . . . . . . 10
Metodología general . . . . . . . 10
Fuente de taninos . . . . . . . 10
Sustratos . . . . . . . . 11
Uso de polietilenglicol . . . . . . 12
Incubación ruminal . . . . . . . 12
Análisis químicos . . . . . . . 13
Diseño experimental . . . . . . . 14
Interpretación cuantitativa de los datos . . . . 15
RESULTADOS Y DISCUSION . . . . . . 16
Caracterización y composición química del orujo de uva . . 16
Efecto de los taninos sobre la digestibilidad de la pared celular . 16
Relación entre la desaparición de sustrato y producción de gas ruminal. 19
Efecto de los taninos sobre la cinética de fermentación de la pared
celular de los forrajes . . . . . . 20
Efecto de la fuente de nitrógeno sobre la acción de los taninos . 26
Inhibición de los taninos a través del uso de polietilenglicol . 28
CONCLUSIONES . . . . . . . . 30
BIBLIOGRAFIA . . . . .. . . 31
2
INDICE DE CUADROS
Cuadro 1. Composición química del orujo de uva y su extracto . . . 11
Cuadro 2. Composición de las fuentes de nitrógeno . . . . 12
Cuadro 3. Impacto del nivel de taninos sobre la cinética de producción de gas
ruminal in vitro en una dieta basal de harina de soya, con un contenido medio
de N. Sustrato Lolium perenne L. y Medicago sativa L. . . . . 24
Cuadro 4. Efecto de la adición de nitrógeno amoniacal a una dieta basal de soya
sobre los parámetros de fermentación ruminal in vitro con un contenido medio de
taninos . . . . . . . . . . 26
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INDICE DE FIGURAS
Figura 1. Impacto de los taninos sobre la digestibilidad ruminal in vitro
de la pared celular en un medio bajo en contenido de nitrógeno . . . 18
Figura 2. Efecto de la adición de nitrógeno amoniacal sobre la digestibilidad
ruminal in vitro de la pared celular en una dieta con un contenido basal de
nitrógeno proteico y alto contenido de taninos . . . . . 18
Figura 3. Correlación entre la producción de gas y digestibilidad ruminal de los
sustratos en dietas en presencia de taninos, a diversos contenidos de nitrógeno
a 48 horas de incubación . . . . . . . . 19
Figura 4. Efecto del nivel de taninos sobre la producción acumulada de gas ruminal
in vitro en un sustrato rico en pared celular y bajo en nitrógeno. Sustrato (a) Lolium
perenne L. y (b) Medicago sativa L. . . . . . . . 21
Figura 5. Impacto del nivel de taninos sobre la tasa de producción de gas ruminal
in vitro en una dieta con contenido medio de nitrógeno. Sustrato Lolium perenne L. 22
Figura 6. Impacto de los taninos sobre la dinámica de producción de gas ruminal
in vitro en una dieta basal de harina de soya. Sustrato Medicago sativa L.. . 23
Figura 7. Efecto de la fuente nitrogenada (NP y NNP) sobre la actividad de los
taninos en la fermentación ruminal in vitro. Sustrato Medicago sativa L y Niveles
de taninos . . . . . . . . . . 27
Figura 8. Efecto de la fuente nitrogenada sobre la fermentación ruminal In vitro.
Sustrato Medicago sativa L. y Nivel alto taninos. . . . . . 27
Figura 9. Efecto de la fuente nitrogenada (NP y NNP) sobre producción de gas
en la fermentación ruminal in vitro. Sustrato Lolium perenne L. y Niveles de taninos. 28
Figura 10. Efecto del PEG sobre la fermentación ruminal in vitro de la pared celular
en presencia de una alta concentración de taninos. Sustrato Lolium perenne L. . 29
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RESUMEN
Peña G., J. 2003. Efecto del nivel de proteína sobre la actividad de los taninos en
la digestión ruminal de polisacáridos estructurales. Tesis, Magister en Ciencias
Animales, Facultad de Agronomía e Ingeniería Forestal, Pontificia Universidad Católica
de Chile. Santiago, Chile. 36 pp.
Los taninos presentes en las plantas tienen tanto efectos positivos como negativos
sobre la digestibilidad de los forrajes, los cuales dependen de la cantidad y actividad
biológica de los taninos. Por otro lado, el contenido de proteína de los forrajes es un
factor crítico en el desarrollo y productividad del animal, que asociado a la presencia
de taninos lo vuelve aún más crítico. El objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto de
la proteína sobre la actividad de los taninos en la digestión ruminal de los polisacáridos
estructurales. Para tal fin, se utilizó taninos provenientes del orujo de uva (Vitis
vinifera) y pared celular purificada de ballica (Lolium perenne L.) y de alfalfa (Medicago
sativa L.), además de otras fuentes energéticas; como fuente de nitrógeno se utilizó
harina de soya y sulfato de amonio. Se estudiaron cuatro niveles de taninos y
adiciones de nitrógeno no proteico sobre una dieta basal de harina de soya. Los
análisis reportan un contenido de taninos de 5.11 g/kg MS (1.24 g CE/L) en el orujo de
uva. Se observó un efecto de los taninos sobre la digestibilidad ruminal de la pared, sin
embargo, la intensidad de este efecto está estrechamente relacionado con la
concentración de taninos y con el contenido de proteína de la dieta. Se observó que en
dietas con bajo contenido de proteína, al aumentar los niveles de taninos la
digestibilidad de la pared celular se redujo de 59 a 25% y de 55 a 13% en ballica y
alfalfa respectivamente. Esta menor digestión de los polisacáridos estructurales
sugiere que los taninos además de complejar el sustrato proteico de la dieta, tienen un
efecto inhibidor sobre la actividad de las polisacaridasas, ya sea por acción sobre los
polisacáridos o por la inhibición de las enzimas microbianas. Por otro lado, al elevar el
contenido de nitrógeno en la dieta se observó un leve aumento en la digestibilidad de
la pared celular en un 5 y 2.5% para ballica y alfalfa respectivamente. Ambos
escenarios tienen un impacto directo sobre la tasa, tiempo LAG y volumen de gas
producido. Al observar el efecto del PEG sobre la inhibición de la actividad de los
taninos, se obtuvo un incremento acumulado de 40% en la producción de gas in vitro a
diferentes tiempos de medición. La adecuación del contenido proteico de la dieta,
permitirá reducir los efectos negativos de los taninos sobre la digestibilidad y complejo
enzimático microbiano.
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ABSTRACT
Peña G., J. 2003. Effect of protein level in the diet on activity of tannins during
ruminal breakdown of structural polysaccharides. Tesis, Magister en Ciencias
Animales, Facultad de Agronomía e Ingeniería Forestal, Pontificia Universidad Católica de
Chile. Santiago, Chile. 36 pp.
Tannins content in plants have both positive and negative effects on forage digestibility,
depending upon amount and biological activity of tannins. On the other hand, protein
content of forages is a critical factor affecting animal development and performance which
becomes worse in the presence of tannins. The purpose this work was to evaluate the
effect of protein upon tannins activity on ruminal digestion of structural polysaccharides.
Tannins were obtained from grape marc (Vitis vinifera). Purified cell wall was obtained
from ray grass (Lolium perenne L.) and lucerne (Medicago sativa L.), and other energy
sources; soy bean meal and ammonium sulphate were used as nitrogen source. Four
levels of tannins and additions of non protein nitrogen were studied on a basal diet of soy
bean meal. Diet with Grape marc containing 5.11 g/kg DM (1.24 g CE/L) of tannins
showed an effect on ruminal digestibility of the wall cell was observed in a diet with
tannins, however, the intensity of this effect is closely related with tannin concentration and
protein content in the diet. It was observed that in diets with low protein content,
degradability of wall cell decrease from 59 to 25% and of 55 to 13% in ray grass and
lucerne respectively, when level of tannins increased. The latter suggests that tannins
complexed with the protein substrate of the diet; they have an inhibitor effect on the
polysaccharidases activity, either because of the effect on polysaccharides or because of
the inhibition of the microbial enzymes. On the other hand, when nitrogen content was
increased in the diet, a slight increase was observed in cell wall digestibility, from 5 to
2.5% for ray grass and lucerne respectively. Both situations have a direct impact on the
rate, time LAG and volume of gas produced. When observing the effect of the PEG on the
tannins inhibition, an accumulated increment of 40% was obtained in the in vitro gas
production at different times of measurement. The management of the diet protein content,
will allow the negative effects of the tannins on the digestibility and microbial enzymatic
system to decrease.
Key words: Tannins, rumen, protein, gas production, digestibility, polysaccharides, cell
wall
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INTRODUCCION
Los taninos son compuestos fenólicos que ocurren de forma natural en las plantas,
tienen un alto peso molecular y cantidad de grupos fenólicos hidroxilos libres
suficientemente alta que le permiten formar fuertes complejos con las proteínas y otras
macromoléculas (Barry & McNabb, 1999). Su presencia se asocia a mecanismos
naturales de defensa contra el ataque de microorganismos, insectos y animales
herbívoros y consecuentemente disminuyen el valor nutritivo del forraje (Van Soest,
1983).
Los taninos como grupo poseen una amplia diversidad estructural, han sido
clasificados tanto por su estructura química y sitios de unión, así como por los
subproductos de su hidrólisis o degradación (Min et al., 2003 y Barry & McNabb, 1999).
Los taninos usualmente son agrupados en taninos hidrolizables (HT) y taninos
condensados (CT) o Proantocianidinas (PA), los cuales a su vez pueden subdividirse en
solubles e insolubles. Estos últimos resultan de la unión covalente entre ellos y los
carbohidratos de la pared celular (Reed, 1995; Silanikove et al., 2001; Min et al., 2003 y
Wiegand et al., 1995).
La estabilidad de los complejos formados por los taninos dependen de las
características propias de los taninos y de las proteínas, tales como su peso molecular,
estructura terciaria y punto isoeléctrico de las proteínas, además de la compatibilidad de
los sitios de unión. Fuertes complejos entre taninos y proteínas son formados a pH
ruminal entre 3.5 a 7.0. Sin embargo, estos complejos son inestables en pH menores
como los alcanzados en el abomaso, permitiendo que la proteína vuelva a ser disponible
para la digestión enzimática (complejo pH dependiente), principalmente en aquellos
complejos que involucran taninos hidrolizables debido a su gran vulnerabilidad a hidrólisis
enzimática y no enzimática (Min et al., 2003; Reed, 1995 ; Schofield et al., 2001;
Silanikove et al., 2001; Van Soest, 1983 y Wiegand et al., 1995).
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Los taninos tienen efectos tanto positivos como negativos en la alimentación
animal. Altas concentraciones de taninos en el forraje reducen el consumo y la
digestibilidad de la proteína y carbohidratos, afectando el desarrollo del animal (Reed,
1995; Silanikove et al., 2001 y Wiegang et al., 1995). Entre los efectos positivos se ha
encontrado que bajas o moderadas concentraciones de taninos impiden la ocurrencia de
meteorismo y aumentan el flujo de nitrógeno no amoniacal y aminoácidos esenciales
hacia el tracto post ruminal, ocasionado por la protección a la acción enzimática que
ejercen los taninos sobre la proteína (Reed, 1995).
Estos compuestos fenólicos se encuentran ausentes en muchos de los cultivos
forrajeros, sin embargo en las praderas naturales su presencia y concentración varia
dependiendo de las condiciones medioambientales (especialmente estrés hídrico) en las
que se desarrolla la planta; consecuentemente éste factor interfiere en la calidad del
forraje ocasionando una menor digestibilidad de la proteína y carbohidratos estructurales
(Van Soest, 1983).
Los taninos tienen efecto sobre el consumo de los forrajes debido a la disminución
de la palatabilidad o por su efecto negativo sobre la tasa de digestión ruminal, así como
en el balance del nitrógeno. En corderos las altas concentraciones de taninos (20% MS),
ocasionan una rápida pérdida de peso (100 g/día). Aumentos en la concentración de
taninos tienen un mayor efecto negativo sobre la digestibilidad de la proteína y la pared
celular que en el consumo total de forraje, debido tanto a la inhibición de las
carbohidrasas bacterianas, como también a la formación de complejos indigestibles con
los carbohidratos de la pared celular, especialmente con la celulosa (Reed, 1995;
Schofield et al., 2001; y Silanikove et al., 2001).
La tasa de digestión ruminal y pasaje de la proteína es variable y está
directamente influenciada por el tipo de dieta y nivel de consumo (Van Soest, 1982).
Forrajes que han crecido con alto grado de estrés muestran una mayor concentración de
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taninos, lo cual asociado a un forraje con alto contenido de lignina y bajo contenido de
proteína generan un problema en la disponibilidad de ésta para la digestión ruminal,
causando una disminución del crecimiento bacteriano y por lo tanto una depresión del
sistema ruminal. La naturaleza física y la concentración de proteína en la dieta es también
un factor que influencia el escape de ésta hacia el tracto postruminal. La proteína en la
forma hidrosoluble es más rápidamente fermentable, sin embargo, esta condición
agregada a una alta presencia de taninos en el medio ruminal conlleva a una mayor
formación de complejos indigestibles tanino-proteína. En praderas naturales de zonas
áridas y semiáridas la cantidad de proteína disponible se vuelve una limitante en la
alimentación animal sobre todo en los períodos secos. En estas condiciones el ramoneo
de leguminosas arbustivas es una fuente potencial de proteína, pero en ellas se observa
la presencia de compuestos fenólicos que poseen un marcado efecto de protección de la
proteína, reduciendo así su valor como suplemento proteico (Pichard et al., 1988).
Sin embargo, forrajes con niveles moderados de taninos (ej. Lotus sp.) aumentan
el flujo de proteína hacia el duodeno disminuyendo la tasa de degradación y deaminación
de la proteína, causando una disminución del NH3 ruminal y generando de esta manera
una economía para el proceso de reciclaje de la urea (Reed, 1995 y Wiegand et al.,
1995).
Los taninos condensados pueden inhibir la actividad de las proteasas de algunas
especies de bacterias ruminales (Streptococus bovis y Butyrivibrio fibrisolvens), siendo
éste uno de los mayores efectos de los taninos sobre el sistema ruminal (Reed, 1995).
Por otro lado, la cantidad de proteína en la dieta se convierte en un factor determinante
del impacto de los taninos en la dieta. Para McNabb et al. (1998) la cantidad de taninos
condensados necesaria para precipitar toda la proteína soluble de la dieta es
aproximadamente 50 µg CT/ml de extracto de Lotus corniculatus, cantidad que
eventualmente puede estar asociada a dietas con bajo contenido proteico, efecto que
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pudo no haber sido tan marcado si la dieta hubiese presentado un mayor contenido
proteico.
Agentes inhibidores de taninos como el polietilenglicol (PEG) han sido usados
como un medio para la cuantificación de los taninos en los forrajes, o simplemente para la
neutralización de sus efectos negativos en la alimentación animal. Silanikove et al. (2001),
realizaron estudios sobre el uso de PEG, observando claramente que el mayor efecto
antinutricional de algunos taninos es la reducción de la disponibilidad de la proteína y la
disminución de la actividad enzimática ruminal, produciendo una caída en la digestibilidad
de la pared celular por la adherencia de éstos a la enzimas bacterianas o por la formación
de complejos indigestibles con los carbohidratos de la pared celular.
El modo de acción de los polímeros artificiales tales como PEG se basa en el gran
número de átomos de oxígeno, lo que los vuelve capaces de formar enlaces de hidrógeno
con los grupos fenólicos de los taninos y precipitarlos. Estudios in vitro e in situ han
encontrado resultados positivos en la incubación de forrajes ricos en taninos con agentes
neutralizadores de éstos. En ovejas, corderos y novillos al haber un aumento en el
consumo de PEG no solo hubo un incremento en el consumo, sino también en la
digestibilidad de la dieta particularmente de la proteína (Silanikove et al., 2001).
La relación planta medioambiente en particular nutrición y estrés, y su influencia
sobre el contenido proteína y taninos de los forrajes, lleva al planteamiento que en el
rumen el efecto de inhibición fermentativa por presencia de taninos es modificado por las
características del perfil nitrogenado de la dieta. El presente estudio busca evaluar el
efecto de la proteína sobre la actividad de los taninos en la digestión ruminal in vitro de los
carbohidratos estructurales. Además, se busca medir el impacto de los taninos sobre la
digestión de la pared celular en el rumen y estudiar el efecto de la adición de nitrógeno no
proteico y polietilenglicol como agente inhibidor sobre la actividad de los taninos en la
digestión ruminal.
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MATERIALES Y METODOS
Metodología general:
En este estudio se evaluará el efecto de los taninos provenientes del orujo de uva
(Vitis vinifera) sobre la digestibilidad de la pared celular de ballica (Lolium perenne L.) y de
alfalfa (Medicago sativa L.), utilizando diferentes compuestos nitrogenados como fuente
de proteína. Para tal fin se utilizará la técnica de producción de gas in vitro como
estrategia para describir en más detalle el proceso de fermentación ruminal.
Adicionalmente se evaluará la acción del polietilenglicol (PEG) como agente inhibidor de
taninos, cuyo efecto también será evaluado por medio de la producción de gas.
Los resultados serán interpretados por medio de un ajuste de curva utilizando el
modelo logístico de dos componentes, generando los valores para los parámetros de
cinética: tasa de fermentación, el tiempo LAG y volumen de producción de gas.
Fuente de taninos:
Se preparó un extracto de orujo de uva (V. vinifera, cepas Cabernet y Carmenère)
como fuente de taninos. La extracción se realizó sobre una pasta de orujo, utilizando agua
destilada y etanol como solvente orgánico a relación de 30:70. Para obtener una mejor
extracción se aplicó temperatura (75ºC) durante dos horas, después el material fue filtrado
con malla tipo osnaburgo para eliminar las partículas sólidas de mayor tamaño. En la
segunda etapa de extracción, se procedió a eliminar el etanol por ebullición en un baño de
María a 90ºC, seguido por un proceso de centrifugación a 10,000 rpm por 10 minutos y
filtrado en papel de filtrado rápido con retención de moléculas de 10 micrones. El extracto
se almacenó en un frasco oscuro y cerrado, a 4ºC para evitar la oxidación de los taninos.
La caracterización química del orujo y del extracto se realizó sobre muestras
verdes sin presecado (Cuadro 1). La reactividad de los taninos del extracto de orujo se
determinó cuantitativamente por su capacidad de precipitar proteínas sobre hidrolizado de