PODMÍNKY PĚSTOVÁNÍ KULTUR IN VITRO

PODMÍNKY PĚSTOVÁNÍ KULTUR PODMÍNKY PĚSTOVÁNÍ KULTUR IN VITROIN VITRO

Potřebné látkyPotřebné látky, které je celistvá rostlina schopna syntetizovat v dostatečném množství a transportovat na místo určení, mohou být explantátem syntetizovány v nedostatečné míře nebo vůbec (je třeba dodat - heterotrofie).

Stresové situaceStresové situace, se kterými se celistvá rostlina vypořádá, není často explantát schopen řešit a zvládnout.

Nutnost indukce organogenních zmindukce organogenních změěnn vyžaduje zabezpečení indukčních podmínek jak fyzikálních, tak chemických.

Teplota Světlo Vlhkost Složení plynné fáze Složení médií Aseptická

kultivace Ošetření mateřských rostlin Typ explantátu

Příprava

a komponenty kultivačních médií

komponenty kultivačních médií

minerální soli • makroelementy (nad 0,5mmol/l)• mikroelementy

zdroj uhlíku a energie

vitaminy

růstové regulátory

zdroje org. dusíku (aminokyseliny apod.)

další organické doplňky

Makroelementy:

N (25-60mM) - NH4 (2-20mM) (nitrátreduktáza),

- NO3(25-40mM) (ne samotnýpH)

bílkoviny, aminokyseliny

P (1-3mM) - H2PO3, - HPO3, (- PO3)

energetický metabolismus - ATP;

DNA, RNA; fosfolipidy

K (20-30mM) - osmotická regulace, pH a iontová rovnováha

Makroelementy:

S (1-3mM) - obranné reakce (glutathion, flavonoidy)

Ca (1-3mM) - transport, signály, membrána,

iontová rovnováha, zakořenění,

buněčné dělení

Mg (1-3mM) - enzymy, syntéza DNA, fotosyntéza

Mikroelementy: Fe (0,1 mM)- (FeNaEDTA - etylendiaminotetraoctová kys.) do

pH8

přenašeče el., proteiny - nitrátreduktáza, biosyntéza chlorofylu,

Zn (5-30 M) - enz. např alkohol dehydrogenáza v meristémech, účast při syntéze proteinů

Mn (20-90 M)- metaloproteiny, Hillova reakce (rozklad vody při fotosyntéze)

Mo (1 M)- kofaktor v nitrátreduktáze

Cu (0,1 M)- redoxní reakce, fotosyntéza

B (25-100 M) stabilita membrán

• Zdroje C (sacharidy) 2-5%• sacharoza• glukoza• fruktoza (*termolabilní)• laktoza• maltoza (*)• škrob• inositol (do 0,5%)• (polyetylenglykol, manitol, sorbitol apod.)

Vitamíny (*)• hlavně skupiny B (0,1-10mg/l) (kvasniční

extrakt): B1(thiamin), k. nikotinová, B6 pyridoxin• k. pantothenová• biotin, cholin chlorid• k. listová, k. p-aminobenzoová• riboflavin• k. askorbová jako antioxidant • (myo-inositol (50-5000mg/l))

Růstové regulátory

auxiny - • IAA * • NAA(2x), IBA(2x), 2,4-D (8-12x),

Picloram (2-4x)(4-amino,3,5,6-trichloropikolinová

kys.)

(2,4,5-T(4x), pCPA)

Působení auxinů in vitro

• indukce kalusu a jeho růst • podporuje dělení buněk konc (v poměru k CK) kořeny konc (v poměru k CK) prýty konc - indukce somatické embryogeneze• inhibice axilár (apikální dominance)• indukce kořenů x inhibice prodl. růstu kořenů

cytokininy • 2iP *, zeatin*• BAP (6-benzylaminopurin) (*)

• kinetin (furfurylaminopurin) *• adenin *• TDZ thidiazuron *

Působení cytokininů in vitro konc prýty • dělení buněk• (SE indukce somatické embryogeneze)• indukce kalusu a jeho růst• stimulace růstu axilárních pupenů• inhibice tvorby kořenů• inhibice prodlužování prýtů• oddálení stárnutí listů konc - riziko hyperhydricity (vitrifikace)

Vitrifikace hyperhydricita

Fyziologický stav:

•Příčiny vitrifikacePříčiny vitrifikace vysoká relativní vlhkost etylén cytokininy

?? NH4+

Nutnost snížit R.H., zvýšit výměnu vzduchu, snížit obsah cytokininů

Vitrifikace hyperhydricita

Fyziologický stav:

ztluštělé stonky i listy, světle zelené, křehké s abnormálním sklovitým vzhledem nadměrný příjem vody narušené stomatální uzavírání změny ve složení epikutikulárních vosků defektní kutikula redukovaná vodivá pletiva velké mezibuněčné prostory v houbovém parenchymu disbalance mezi buněčným dělením a diferenciací (lignin, celulóza) změny ve stavbě buněčných stěn velké vakuoly

gibereliny GA3 GA7 *

Působení in vitro • prodlužování prýtů• vymanění z dormance:

semen, SE, apikálních pupenů, hlíz• inhibice tvorby adventivních kořenů

k. abscisová ABA*

působení in vitro • maturace SE• usnadnění aklimatizace• formování hlíz a cibulí• vstup do dormance

Další látky s růstově regulační povahouPolyaminy (spermin, spermidin a putrescin)*• indukce adventivních kořenů• indukce prýtů• podpora SE

Jasmonová kyselina *• podpora tvorby hlíz• podpoření formování meristému

Fenolické látky- k. salicylová (obranné reakce), trans-skořicová (antiauxin) apod.

Organické dusíkaté látky -

• L- aminokyseliny - glycin (2mg/l),

glutamin (*) (150-400), asparagin (100),

cystein (10)

• peptidy (*) nebo jejich ne přesně definované směsi: pepton, trypton

kazein hydrolyzát (0,2-1g/l)

Nedefinované doplňky media

• kvasniční (yeast) a sladový (malt) extrakt, • kokosové mléko, pomeranč., rajč. a mrkvový džus,

banánový homogenát, březová míza

• huminové sloučeniny

Moderátory pH pufry

Moderátory oxidace, produkce a kumulace fenolických látekaktivní uhlí (0,1 - 0,5%) pohlcuje i část RR!

PVP - polyvinil pyrolidon (250-1000 mg/l)

k. askorbová a citronová (po 100 mg/l) L-cystein (10 mg/l)thiourea, dithiothreitol

Další doplňky media

• Antibiotika *

(penicilin, ampicilin, bacitracin, gramicidin, neomycin, nystatin, cefotaxim, ticarcilin, timentin, kanamycin aj.)

• Prekurzory a elicitory

(produkce sekundárních metabolitů)

• Odpěňovací prostředky (bioreaktory)

Ztužovací látky

Agar (0,6-1%) - polymer galaktózy (agarózy) - z buněčných stěn řas (Sphaerococcus euchema, Gelidium a Gracilaria)

• teplota (snese opakované roztavení)• pH (optimum 5,5-5,8) pH<4 neztuhne• čistota

Ztužovací látky

Gelrit (0,2-0,35%) glukóza, glukuronová kyselina a rhamnóza - tetrasacharid

gel jen za přítomnosti iontů Ca2+ a Mg2+

pH 4 4.92g/L

pH 5 2.93g/L

pH 6 1.36g/L

pH 7 0.64g/L

pH 8 0.50g/L

pH 9 0.40g/L

• čirý

• nesnese opakované zahřátí!

Ztužovací látky

• Phytagel (Mg, Ca)• biogel P200 (polyacrylamidová blanka)

• agargel (směs agaru a synt. gelu)

• alginát (protoplastové kultury)

• agaróza

• rozpustný škrob

Osmotikamanitol, inositol PEG 4000 - polyetylene glycol

pH

• Po autoklavování pokles o cca 0,3-0,5

(pH 4,5 a 7 hranice; pH 5-6 optimum)