i OPTIMASI CLEAN UP EKSTRAK METANOL AIR TEH HIJAU DENGAN MENGGUNAKAN METODE SOLID PHASE EXTRACTION (SPE) UNTUK MENDUKUNG PENETAPAN KADAR KUERSETIN DALAM TEH HIJAU DENGAN KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI SKRIPSI Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm) Program Studi Farmasi Oleh: Adi Wirasaputra NIM : 088114059 FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2012 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
90
Embed
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI - … · (SPE) UNTUK MENDUKUNG PENETAPAN KADAR KUERSETIN ... (eluen) ... Tabel I. Indeks polaritas larutan kimia ...
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
i
OPTIMASI CLEAN UP EKSTRAK METANOL AIR TEH HIJAU
DENGAN MENGGUNAKAN METODE SOLID PHASE EXTRACTION
(SPE) UNTUK MENDUKUNG PENETAPAN KADAR KUERSETIN
DALAM TEH HIJAU DENGAN KROMATOGRAFI CAIR KINERJA
TINGGI
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat
Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm)
Program Studi Farmasi
Oleh:
Adi Wirasaputra
NIM : 088114059
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA
2012
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
ii
Persetujuan Pembimbing
OPTIMASI CLEAN UP EKSTRAK METANOL AIR TEH HIJAU
DENGAN MENGGUNAKAN METODE SOLID PHASE EXTRACTION
(SPE) UNTUK MENDUKUNG PENETAPAN KADAR KUERSETIN
DALAM TEH HIJAU DENGAN KROMATOGRAFI CAIR KINERJA
TINGGI
Skripsi yang diajukan oleh:
Adi Wirasaputra
NIM : 088114059
telah disetujui oleh :
Pembimbing Utama
Prof. Dr. Sri Noegrohati Apt. tanggal...................................................
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
iii
Pengesahan Skripsi Berjudul
OPTIMASI CLEAN UP EKSTRAK METANOL AIR TEH HIJAU
DENGAN MENGGUNAKAN METODE SOLID PHASE EXTRACTION
(SPE) UNTUK MENDUKUNG PENETAPAN KADAR KUERSETIN
DALAM TEH HIJAU DENGAN KROMATOGRAFI CAIR KINERJA
TINGGI
oleh:
Adi Wirasaputra
NIM : 088114059
Dipertahankan di hadapan Panitia Penguji Skripsi
Fakultas Farmasi
Universitas Sanata Dharma
Pada tanggal:............................
Mengetahui
Fakultas Farmasi
Universitas Sanata Dharma
Dekan
Ipang Djunarko, M. Sc., Apt.
Panitia Penguji Tanda tangan :
1. Prof. Dr. Sri Noegrohati, Apt. ...............
2. Prof. Dr. C. J. Soegihardjo, Apt. ...............
3. Jeffry Julianus, M. Si. ..............
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
iv
“Ketika jiwaku letih lesu di dalam aku, teringatlah aku
kepada TUHAN, dan sampailah doaku kepada-Mu, ke
dalam bait-Mu yang kudus.”
(Yunus 2:7)
“Usaha yang sedang – sedang saja membuahkan hasil yang sedang
– sedang saja. Tetapi usaha yang luar biasa membuahkan hasil
yang luar biasa pula.”
(Toyotomi Hideyoshi)
“Terbayangkan berarti terjangkau.”
(Toyotomi Hideyoshi)
Skripsi ini aku persembahkan kepada :
Bapak, Mama, Bagus, dan Candra,
yang selalu mendukungku dan menerimaku apa adanya
semua sahabat, teman, dan almamaterku
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
v
PERNYATAAN KEASLIAN KARYA
Penulis menyatakan dengan sesungguhnya bahwa skripsi yang ditulis ini
tidak memuat karya atau bagian karya orang lain, kecuali yang telah disebutkan
dalam kutipan dan daftar pustaka, sebagaimana layaknya karya ilmiah.
Apabila dikemudian hari ditemukan indikasi plagiarisme dalam naskah
ini, maka penulis bersedia menanggung segala sanksi sesuai peraturan perundang-
undangan yang berlaku.
Yogyakarta, 8 Juli 2012
Penulis
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
vi
(Adi Wirasaputra)
LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI ILMIAH UNTUK
KEPENTINGAN AKADEMIS
Yang bertandatangan dibawah ini, saya mahasiswa Universitas Sanata
Dharma:
Nama : Adi Wirasaputra
No Mahasiswa : 088114059
Demi pengembangan ilmu pengetahuan, saya memberikan kepada perpustakaan
Universitas Sanata Dharma karya ilmiah saya yang berjudul:
OPTIMASI CLEAN UP EKSTRAK METANOL AIR TEH HIJAU
DENGAN MENGGUNAKAN METODE SOLID PHASE EXTRACTION
(SPE) UNTUK MENDUKUNG PENETAPAN KADAR KUERSETIN
DALAM TEH HIJAU DENGAN KROMATOGRAFI CAIR KINERJA
TINGGI
Beserta perangkat yang diperlukan (bila ada). Dengan demikian saya memberikan
kepada perpustakaan Universitas Sanata Dharma hak untuk menyimpan,
mengalihkan dalam bentuk media lain, mengelolanya dalam bentuk pangkalan
data, mendistribusikan secara terbatas, dan mempublikasikan di Internet atau
media lain untuk kepentingan akademis tanpa perlu meminta ijin dari saya
maupun memberikan royalty kepada saya selama tetap mencantumkan nama saya
sebagai penulis.
Demikian pernyataan ini yang saya buat dengan sebenarnya.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
vii
PRAKATA
Segala pujian dan syukur penulis haturkan kepada Tuhan karena hanya
dengan anugerah, berkat, cinta, kasih, dan pertolongan-Nya, penulis dapat
menyelesaikan penelitian dan penyusunan skripsi yang berjudul ”Optimasi Clean
Up Ekstrak Metanol Air Teh Hijau dengan Menggunakan Metode Solid
Phase Extraction (SPE) untuk Mendukung Penetapan Kadar Kuersetin
dalam Teh Hijau dengan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi”. Skripsi ini
disusun guna memenuhi salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Strata
Satu Program Studi Farmasi (S.Farm).
Terselesaikannya penulisan laporan akhir ini tidak lepas dari bantuan
berbagai pihak, karena itu penulis mengucapkan terima kasih kepada:
1. Bapak Ipang Djunarko, M.Sc., Apt. selaku Dekan dan segenap staf serta
karyawan Laboratorium Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma
Yogyakarta.
2. Prof. Dr. Sri Noegrohati, Apt. selaku Dosen Pembimbing yang telah
memberikan petunjuk, saran, arahan, dan bimbingan kepada penulis dalam
proses penyusunan skripsi ini.
3. Prof. Dr. C. J. Soegihardjo, Apt. dan Bapak Jeffry Julianus, M. Si. selaku
Dosen Penguji skripsi yang telah memberikan saran dan masukan demi
kesempurnaan skripsi ini.
4. Seluruh staf laboratorium kimia Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma
: Mas Bimo, Mas Kunto, Pak Parlan, dan Pak Kethul yang telah banyak
membantu selama penelitian di laboratorium.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
viii
5. Pak Sanjaya dan Pak Acang atas bantuan selama menghadapi masalah dalam
penelitian dan mau membagi ilmu yang tidak didapatkan selama kuliah.
6. Keluarga Wirasaputra tercinta Bapak, Mama, Bagus, dan Candra terima kasih
atas dukungan doa yang selalu membanjir tulus untukku yang membuatku
berani bangkit lagi di kala terpuruk.
7. Keluarga Mbah Putri yang selalu mendoakan segala perjuanganku Mbah
Putri, Bulik Etik, Mas Hagai, Heraldi, Kezia, dan Brian.
8. Alfonsus Rosario Heppy Dwiyoga, Paulus Setya Dharma dan Anastasia
Filipa Veritas da Silva teman seperjuangkanku yang telah dengan sabar
menghadapi semua kemalasanku, mendukung dan menyemangati aku selama
masa-masa terpuruk di lab.
9. Kawan-kawan seperjuangan di lab dan grup antistress: Eka Riusinta Wati,
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
24
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Pembuatan Serbuk Daun Teh
Sebelum dilakukan ekstraksi dengan metode sokhletasi, sampel daun teh
kering yang diperoleh dari PT. Pagilaran diserbuk dahulu. Tujuan dari proses
penyerbukan ini adalah untuk memperluas area kontak antara pelarut dengan
sampel sehingga ketika proses ekstraksi, pelarut akan lebih banyak berinteraksi
dengan sel tanaman. Dengan proses penyerbukan sampel ini diharapkan proses
ekstraksi bisa berlangsung maksimal.
Setelah diperoleh serbuk daun teh, dilakukan penyaringan dan
pencampuran serbuk daun teh. Dalam proses penyaringan ini serbuk akan terpisah
berdasarkan ukuran partikelnya. Ukuran partikel serbuk yang diambil adalah
serbuk yang berukuran partikel kecil karena memiliki luas area kontak dengan
pelarut yang lebih besar. Tujuan pencampuran serbuk daun teh adalah untuk
menghomogenkan sampel.
B. Ekstraksi dengan Menggunakan Metode Soxhlet Sekaligus Hidrolisis
Proses ekstraksi ini berdasarkan penelitian yang telah dilakukan oleh
Dharma (2012) dimana diperoleh kondisi ekstraksi optimal yaitu proses sokhletasi
disertai dengan hidrolisis menggunakan larutan penyari metanol-air (90:10) yang
mengandung HCl 1,85 M pada suhu 90°C. Proses soxhletasi ini dilakukan hingga
tercapai 18 sirkulasi.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
25
Metode ekstraksi yang digunakan adalah soxhletasi. Soxhletasi adalah
ekstraksi menggunakan pelarut yang selalu baru umumnya dilakukan dengan alat
khusus sehingga terjadi ekstraksi kontinyu dengan jumlah pelarut yang relatif
konstan dengan adanya pendingin balik (DirJen POM, 2010). Dikatakan “pelarut
selalu baru” karena pelarut yang berada di dalam labu akan menguap dan
terkondensasi oleh adanya pendingin balik sehingga menetes mengisi tabung sifon
dan membasahi tea bag di dalamnya. Pelarut yang membawa ekstrak, akan
memenuhi tabung sifon dan kembali ke dalam labu yang nantinya akan menguap
dan terkondensasi lagi sehingga bisa dikatakan terjadi ekstaksi secara kontinyu
(berkesinamungan).
Kuersetin merupakan flavonoid golongan flavonol yang umumnya
terdapat di alam dalam bentuk glikosida. Adanya glikosida menyebabkan
flavonoid memiliki kelarutan di dalam air. Bentuk glikosida kuersetin salah
satunya adalah rutin (kuersetin-3-rutinoside). Dalam penelitian ini kuersetin yang
akan dianalisis adalah kuersetin dalam bentuk aglikon, oleh karena itu diperlukan
proses hidrolisis untuk mengubah kuersetin glikon menjadi kuersetin aglikon.
O
OH
OH
O
OH
HO
OH
Gambar 1. Kuersetin
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
26
Pada proses ekstraksi yang disertai hidrolisis ini digunakan larutan
penyari metanol:air (90:10) yang mengandung HCl 1,85 M. Pelarut yang dipilih
adalah metanol:air (90:10) karena adanya gugus - gugus hidroksil pada kuersetin
menyebabkan larutan metanol-air mampu berinteraksi secara hidrogen bonding
sehingga kuersetin dapat larut dalam pelarut tersebut.
OO
O
O
O
O
O
H
H
HH
H
H
H
H
O
O
O
O
CH3
H
H3C H
CH3
H
O
O
O
HO
H3C
H
H
OH
H
metanol
air
air
metanol
metanol
metanol
Keterangan : merupakan ikatan hidrogen
H3C
H
H3C
H
O H
H
air
metanol
Gambar 3. Interaksi antara kuersetin dengan pelarut metanol-air(90:10).
Adanya HCL 1,85 M digunakan untuk memberikan suasana asam dan
sebagai katalisator proses hidrolisis. Suasana asam dapat mempercepat proses
hidrolisis dan tetap menjaga kuersetin dalam bentuk molekul. Adapun reaksi
hidrolisis yang terjadi :
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
27
Gambar 4. Reaksi hidrolisis pada suatu kuersetin glikon
Suhu yang digunakan dalam proses sokhletasi sekaligus hidrolisis ini
adalah 90°C. Pada suhu tersebut metanol akan menguap dan mengalami
kondensasi sehingga menetes dan membasahi tea bag mengisi ruang sifon.
C. Skrining Metode Clean Up
Tujuan dilakukan clean up yaitu untuk mengurangi senyawa – senyawa
selain analit yang ikut terekstraksi (ko-ekstraktan) selama proses ekstraksi
berlangsung. Alasan pentingnya dilakukan clean up karena ko-ekstraktan bisa
mengganggu proses determinasi analit, dalam hal ini adalah kuersetin. Gangguan
tersebut bisa menyebabkan tidak tercapainya parameter optimal yang salah
satunya adalah resolusi. Jika parameter resolusi tidak tercapai maka metode tidak
akan valid untuk dapat dilakukan determinasi.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
28
Tabel II. SPE – KLT densitometri
SPE pengelusi hasil keterangan
diol &
silika
toluen tidak ada kuersetin
toluen:metanol (2:1)
ada kuersetin
karena terelusi oleh metanol
metanol ada
kuersetin
mengelusi hampir semua senyawa selain kuersetin, masih ada kuersetin yang terjerap kuat pada diol
aseton ada
kuersetin
etanol ada
kuersetin
etil asetat ada
kuersetin
kloroform tidak ada kuersetin
n-heksana tidak ada kuersetin
C18
campuran air &
metanol
ada kuersetin
karena terelusi oleh metanol
metanol ada
kuersetin
Tabel III. Ekstraksi cair – cair
Ekstraksi Cair – Cair Hasil
Sampel dalam pelarut metanol-air (90:10) diuapkan metanolnya dan ditambahkan aquabidest. Paritsi antara aquabidest dengan etil asetat analit larut dalam etil
asetat. Etil asetat diuapkan dan pelarutnya diganti dengan metanol.
Beberapa senyawa yang polar (larut dalam air)
berkurang
Sampel dalam pelarut metanol-air (90:10) dipartisi dengan n-heksana analit berada dalam fraksi metanol-
aquabidest(90:10). Metanol diuapkan dan ditambahkan aquabidest. Paritsi antara aquabidest dengan etil asetat
analit larut dalam etil asetat. Etil asetat diuapkan dan pelarutnya diganti dengan metanol.
Diperoleh fraksi dengan profil kromatogram terdiri
dari 3 puncak
Namun langkah ini tidak reprodusibel
Banyak kuersetin yang
hilang
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
29
Optimasi metode SPE dengan menggunakan Kromatografi Cair Kinerja
Tinggi (KCKT) akhirnya dipilih karena KCKT lebih sensitif dalam mendeteksi
analit dibadingkan dengan Kromatografi Lapid Tipis Densitometri (KLT-
Densitometri). Selain itu, ekstraksi cair – cair secara partisi tidak lagi dipilih
karena tidak efektif dan tidak efisien dalam mendapatkan analit. Hal ini terkait
dengan banyaknya pelarut yang digunakan dan koefisien distribusi kuersetin pada
dua pelarut yang digunakan saat proses partisi.
Metode KLT Densitometri yang digunakan untuk skrining metode clean
up berdasarkan penelitian Dharma (2012) dimana menggunakan fase diam silika,
fase gerak toluen-etil asetat-asam format (14:5:1). Sedangkan metode KCKT yang
digunakan untuk optimasi jenis fase diam dan fase gerak SPE yang akan dibahas
pada subbab selanjutnya adalah metode KCKT optimal dari penelitian Dwiyoga
(2012), yaitu dengan menggunakan fase diam C8, fase gerak aquabidest-metanol
(52,5:47,5) suhu kolom 30°C, dan flow rate 1,2 ml/menit.
D. Optimasi Jenis Fase Diam dan Fase Gerak SPE
Pemilihan jenis fase diam dan fase gerak SPE dilakukan untuk
mendapatkan sistem SPE yang mampu memenuhi parameter resolusi, selektivitas,
dan efisiensi clean up. Fase diam (cartridge) SPE yang digunakan adalah diol,
silika, dan C18, sedangkan fase gerak yang digunakan juga berbeda karena
perbedaan fase diamnya. Diol dan silika merupakan sistem kromatografi dengan
fase normal, sedangkan C18 merupakan sistem kromatografi fase terbalik.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
30
Adapun tahap – tahap yang dilakukan dalam SPE adalah sebagai berikut :
a. Pengkondisian
Cartridge (penjerap) dialiri dengan pelarut sampel untuk membasahi
permukaan penjerap dan untuk menciptakan nilai pH yang sama, sehingga
perubahan – perubahan kimia yang tidak diharapkan ketika sampel dimasukkan
dapat dihindari.
b. Retensi (tertahannya) sampel
Larutan sampel dilewatkan ke cartridge baik untuk menahan analit yang
dituju, sementara komponen lain terelusi atau untuk menahan komponen yang
tidak diharapkan sementara analit yang dituju terelusi.
c. Pembilasan
Tahap ini penting untuk menghilangkan seluruh komponen yang tidak
tertahan oleh penjerap selama tahap retensi.
d. Elusi
Tahap ini merupakan tahap terakhir untuk mengambil analit yang dituju
jika analit tersebut tertahan pada penjerap (Rohman, 2009).
1. Fase diam (cartridge) silika. Fase diam silika merupakan sistem
kromatografi fase normal. Dikatakan demikian karena fase diam yang digunakan
lebih polar daripada fase geraknya.
Pada langkah awal dilakukan aktivasi fase diam silika dengan metanol.
Langkah ini bertujuan untuk menghilangkan sisa – sisa air yang mungkin
tertinggal di fase diam silika sehingga nantinya analit mampu berinteraksi dengan
fase diam secara maksimal karena sudah tidak ada lagi halangan oleh molekul air.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
31
Pengkondisian dilakukan dengan mengalirkan metanol, etil asetat, dan n-
heksana secara berturut – turut. Digunakan etil asetat sebelum dialirkan n-heksana
karena metanol dan n-heksana tidak saling bercampur dalam volume yang sama
karena tidak terjadi interaksi antara n-heksana dengan metanol, serta adanya
perbedaan indeks polaritas yang jauh antara metanol (5,1) dan n-heksana (0,1).
Oleh karena itu, dibutuhkan fase gerak yang tingkat kepolarannya menengah yang
mampu berinteraksi dengan dua fase gerak tadi yaitu etil asetat dimana memiliki
nilai indeks polaritas 4,4. Dengan demikian tidak ada molekul metanol yang
tertinggal di cartridge saat dialiri n-heksana karena sudah terelusi oleh adanya etil
asetat.
Sejumlah 0,3 ml sampel dimasukkan ke dalam cartridge SPE silika
kemudian berturut – turut dielusi dengan 4 ml n-heksana, 4 ml etil asetat, dan 4 ml
metanol. Kuersetin larut dalam etil asetat dan metanol, namun tidak dalam n-
heksana. Dengan demikian fase gerak yang digunakan sebagai pembilas adalah n-
heksana. Fraksi – fraksi tersebut kemudian diinjeksikan pada KCKT yang telah
dioptimasi oleh Dwiyoga (2012) yaitu dengan menggunakan fase diam C8, fase
gerak aquabidest-metanol (52,5:47,5) suhu kolom 30°C, dan flow rate 1,2
ml/menit.
Analisis kualitatif yang dilakukan adalah dengan membandingkan waktu
retensi (tR) baku kuersetin dengan puncak kromatogram fraksi n-heksana, fraksi
etil asetat, dan fraksi metanol yang memiliki tR yang mirip dengan kuersetin.
Waktu retensi adalah waktu yang dibutuhkan suatu senyawa untuk terelusi keluar
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
32
dari kolom hingga sampai ke detektor. Adapun kromatogram yang didapatkan
sebagai berikut.
Gambar 5. Kromatogram baku kuersetin 65 ppm
Gambar 6. Kromatogram hasil elusi dengan n-heksana (silika)
Berdasarkan hasil kromatogram di atas menunjukkan bahwa fraksi hasil
elusi dengan n-heksana tidak menunjukkan adanya kuersetin. Hal ini ditunjukkan
dengan tidak munculnya puncak kuersetin pada sekitar menit 10. N-heksana tidak
melarutkan kuersetin sehingga n-heksana tidak mampu mengelusi kuersetin dari
fase diam, kuersetin lebih teradsorpsi pada fase diam silika.
Kuersetin
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
33
Gambar 7. Kromatogram hasil elusi dengan etil asetat (silika)
Pada kromatogram fraksi etil asetat terdapat puncak dengan tR 10,428
menit. Puncak tersebut adalah puncak kuersetin karena memiliki tR yang mirip
dengan tR baku kuersetin. Etil asetat mampu mengelusi kuersetin karena kuersetin
larut dalam etil asetat dan juga etil asetat mampu berinteraksi dengan kuersetin.
Gambar 8. Kromatogram hasil elusi dengan metanol
Pada kromatogram fraksi metanol terdapat puncak dengan tR 10,429
menit yang merupakan puncak kuersetin karena kemiripan tR-nya dengan baku
Kuersetin
Kuersetin
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
34
kuersetin. Metanol mampu mengelusi kuersetin karena kuersetin larut dalam
metanol dan metanol mampu berinteraksi dengan kuersetin.
Dari kromatogram di atas tampak bahwa etil asetat dan metanol mampu
mengelusi kuersetin. Area Under Curve kuersetin pada fraksi metanol lebih kecil
daripada AUC kuersertin pada fraksi etil asetat karena kuersetin yang tersisa
dalam cartridge tinggal sedikit, sebagian besar terlusi oleh etil asetat. Jumlah
puncak yang ada dalam kromatogram fraksi etil asetat dan metanol sama, yaitu 14
puncak.
Etil asetat mampu mengelusi kuersetin dengan jumlah besar, namun
demikian juga koekstraktan yang terikut juga banyak. Nilai resolusi kuersetin
dengan puncak di sebelah kirinya sebesar 0,5666 dan nilai resolusi kuersetin
dengan puncak di sebelah kanannya sebesar 1,3716. Hal ini menunjukkan bahwa
etil asetat tetap mengelusi koekstraktan yang memiliki kepolaran yang mirip
dengan kuersetin. Dengan sistem SPE ini nilai resolusi yang baik tidak tercapai,
nilai resolusi yang baik adalah RS ≥ 1,5.
2. Fase diam (cartridge) diol. Fase diam diol yang dipakai dalam
sistem ini merupakan sistem kromatografi fase normal. Dikatakan demikian
karena fase diam yang digunakan lebih polar daripada fase geraknya.
Pengkondisian dilakukan dengan mengalirkan metanol, etil asetat, dan n-
heksana secara berturut – turut. Digunakan etil asetat sebelum dialirkan n-heksana
karena metanol dan n-heksana tidak saling bercampur dalam volume yang sama
karena tidak terjadi interaksi antara n-heksana dengan metanol, serta adanya
perbedaan indeks polaritas yang jauh antara metanol (5,1) dan n-heksana (0,1).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
35
Oleh karena itu, dibutuhkan fase gerak yang semi polar yang mampu berinteraksi
dengan dua fase gerak tadi yaitu etil asetat dimana memiliki nilai indeks polaritas
4,4. Dengan demikian tidak ada molekul metanol yang tertinggal di cartridge saat
dialiri n-heksana karena sudah terelusi oleh adanya etil asetat.
Sejumlah 0,3 ml sampel dimasukkan ke dalam cartridge SPE silika
kemudian berturut – turut dielusi dengan 4 ml n-heksana, 4 ml etil asetat, dan 4 ml
metanol. Kuersetin larut dalam etil asetat dan metanol, namun tidak dalam n-
heksana. Dengan demikian fase gerak yang digunakan sebagai pembilas adalah n-
heksana.
Analisis kualitatif yang dilakukan adalah dengan membandingkan waktu
retensi (tR) baku kuersetin dengan puncak kromatogram fraksi n-heksana, fraksi
etil asetat, dan fraksi metanol yang memiliki tR yang mirip dengan kuersetin.
Adapun kromatogram yang didapatkan sebagai berikut.
Gambar 5. Kromatogram baku kuersetin 65 ppm
Kuersetin
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
36
Gambar 9. Kromatogram hasil elusi dengan n-heksana (diol)
Gambar 10. Kromatogram hasil elusi dengan etil asetat (diol)
Kuersetin
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
37
Gambar 11. Kromatogram hasil elusi dengan metanol (diol)
Dilihat dari kromatogram fraksi n-heksana, etil asetat, dan metanol
memiliki kemiripan profil kromatogram dengan kromatogram hasil SPE
menggunakan cartridge silika. Hal ini karena diol memiliki sistem kromatogrfi
fase normal seperti pada penggunaan cartridge silika.
Nilai resolusi puncak kuersetin yang didapatkan pada kromatogram
fraksi etil asetat juga tidak memenuhi parameter resolusi yang baik. Nilai resolusi
puncak kuersetin dengan puncak di sebelah kirinya adalah 0,4796, sedangkan nilai
resolusi puncak kuersetin dengan puncak di sebelah kanannya adalah 1,4549. Hal
ini menunjukkan bahwa etil asetat mengelusi senyawa lain yang memiliki
kepolaran yang mirip dengan kuersetin, yaitu senyawa yang memiliki tR yang
berdekatan dengan kuersetin.
3. Fase diam (cartridge) C18. Fase diam kolom SPE C18 merupakan
sistem kromatografi fase terbalik. Hal ini karena fase gerak yang digunakan lebih
polar daripada fase diamnya.
Kuersetin
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
38
Pengkondisian dilakukan dengan mengalirkan metanol kemudian
dialirkan HCl 0,002 N. Digunakan metanol karena metanol memiliki viskositas
yang rendah sehingga bisa membasahi seluruh partikel C18 pada kolom.
Kemudian HCl 0,002 N dialirkan agar suasana kolom menjadi asam. Digunakan
HCl 0,002 N karena pH-nya 3 sehingga masih masuk dalam range pH yang aman
untuk fase diam C18. Karena suasana asam maka kuersetin yang berada dalam
kolom akan berubah menjadi bentuk molekul sehingga kuersetin akan mengalami
retensi pada kolom C18.
Setelah dilakukan pengkondisian, sejumlah 0,2 ml sampel dimasukkan ke
dalam kolom SPE lalu dielusi menggunakan HCl 0,002 N. Pengelusian
menggunakan HCl 0,002 N berfungsi sebagai langkah washing (pembilasan)
untuk mengelusi koekstraktan yang larut dalam air. Kemudian dialirkan metanol
untuk mengelusi analit (kuersetin) beserta senyawa lain yang tidak larut dalam air
namun larut dalam metanol. Interaksi yang terjadi antara kuersetin dengan fase
diam C18 adalah interaksi van der Waals, sedangkan interaksi yang terjadi antara
kuersetin dengan metanol adalah interaksi hidrogen.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
39
Gambar 12. Kromatogram baku kuersetin 14 ppm
Gambar 13. Kromatogram hasil elusi dengan HCl 0,002 N
Pada kromatogram di atas tampak bahwa senyawa kuersetin masih ada
yang ikut terelusi oleh fase gerak HCl 0,002 N. Hal ini karena kuersetin memang
memiliki kelarutan pada aquabidest. Jumlah kuersetin yang terelusi tidak
sebanyak pada fase gerak metanol.
Kuersetin
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
40
Gambar 14. Kromatogram hasil elusi dengan metanol
Pada fraksi ini tampak bahwa terdapat puncak kuersetin dilihat dari tR
puncak yang muncul pada menit 10,418. Kuersetin larut dalam metanol sehingga
kuersetin bisa terelusi oleh metanol. Nilai resolusi puncak kuersetin dengan
puncak di sebelah kirinya adalah 1,6773. Dengan demikian parameter resolusi
tercapai yaitu nilai resolusi lebih besar dari 1,5. Hal ini menunjukkan bahwa
kolom SPE C18 mampu menahan senyawa yang memiliki kepolaran mirip dengan
kuersetin yang ditunjukkan dengan tidak munculnya puncak dengan tR dekat
dengan kuersetin.
Metode SPE dengan larutan pembilas (washing) 0,002 N HCl dan
pengelusi metanol juga diaplikasikan pada sistem KCKT optimum yang
didapatkan oleh Dwiyoga (2012). Sistem KCKT tersebut menggunakan fase diam
oktildesilsilan (C18), campuran fase gerak metanol-aquabidest-asam fosfat 5%
(54:45:1), kecepatan alir 1,0 mL/menit, suhu oven 30° C dengan sistem gradien.
Adapun kromatogram yang didapatkan adalah sebagai berikut.
Kuersetin
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
41
Gambar 15. Kromatogram baku kuersetin 10 ppm
Gambar 16. Kromatogram fraksi metanol
Kromatogram di atas merupakan hasil dari sistem KCKT elusi gradien.
Konsentrasi fase gerak metanol meningkat mulai menit ke-20 sehinga baseline
berubah menjadi naik. Tujuan memakai sistem elusi gradien agar puncak terakhir
cepat terelusi sehingga tidak memakan waktu lama untuk menunggu waktu
retensinya.
Dari kromatogram di atas didapatkan tR baku kuersetin pada menit
15,963 sehingga puncak yang memiliki tR 15,557 pada kromatogram fraksi
Kuersetin
Kuersetin
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
42
metanol dipastikan menjadi puncak kuersetin. Dengan demikian puncak kuersetin
muncul di sekitar menit ke-15.
Resolusi yang didapatkan dari fraksi metanol dengan cartridge SPE C18
sejumlah 3x replikasi yaitu :
Tabel IV. Rata – rata resolusi
replikasi kiri puncak kuersetin
Rs puncak kuersetin
w (menit) tR (menit) w (menit) tR (menit)
1 9,333 7,242 7,824 2,695 16,688 13,801 14,532
2 9,959 7,301 7,948 2,227 17,32 13,91 14,706
3 10,815 10,098 10,261 4,061 16,851 14,96 15,557
rata - rata Rs 2,994
Rata – rata resolusi yang didapatkan dari 3x replikasi adalah 2,994. Dengan
demikian metode SPE cartridge C18 dengan larutan pengelusi metanol memenuhi
parameter resolusi. Dengan tertahannya senyawa yang memiliki tR dekat dengan
kuersetin pada cartridge SPE C18, maka proses clean up ini menunjang
tercapainya resolusi yang baik pada sistem KCKT tersebut.
Efisiensi clean up merupakan kemampuan suatu metode SPE dalam
mengurangi jumlah senyawa selain analit yang ikut terekstraksi. Senyawa –
senyawa selain analit yang ikut terekstraksi tersebut disebut koekstraktan.
Koekstraktan bisa menganggu proses determinasi suatu analit, oleh karena itu
sebisa mungkin jumlah koekstraktan dikurangi.
Cara menghitung efisiensi clean up adalah dengan membandingkan
jumlah senyawa sebelum SPE dan sesudah SPE. Adapun kromatogram sampel
yang sebelum sebagai berikut :
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
43
Gambar 17. Kromatogram sampel sebelum SPE
Pada kromatogram fraksi metanol SPE C18 dari kromatogram –
kromatogram sebelumnya didapatkan 9 – 10 puncak dan dari kromatogram
sampel sebelum SPE di atas terdapat 16 puncak. Hal ini menunjukkan bahwa
metode SPE mampu mengurangi jumlah koekstraktan. Adapun perhitungannya