-
OPTIMASI METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI FASE
TERBALIK PADA PEMISAHAN KLORAMFENIKOL DAN LIDOKAIN
HIDROKLORIDA DALAM SEDIAAN TETES TELINGA COLME®
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat
Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm)
Program Studi Ilmu Farmasi
Oleh:
Winarti H. Wibowo
NIM: 088114039
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
2011
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN
TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
ii
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN
TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
iii
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN
TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
iv
HALAMAN PERSEMBAHAN
“Kesuksesan itu jangan dilihat dari hasil yang dicapai tetapi
lihatlah
dari proses hingga mendapatkan hasil yang dicapai tersebut”
“Looking your dream, it’s like looking place far away. The
important thing is don’t ever think about giving up, STAND
UP again towards the dream you’ll meet someday”
“Orang yang pesimistik selalu menemukan kesulitan dalam
setiap kesempatan. Orang yang optimistik justru menemukan
peluang disetiap kesempatan” –Lawrence P.J.-
“Hidup itu keras, mampukan dirimu untuk bertahan di
setiap rintangan dan cobaan. Jadikan semua itu
pengalaman yang berarti dalam hidupmu”
Karyaku ini kupersembahbahkan kepada:
Keluargaku tercinta
Sahabat-sahabat setiaku
Teman-teman seperjuangan
Almamaterku
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN
TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
v
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN
TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
vi
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa
atas
berkat dan anugrah yang diberikan sehingga penelitian dan
penyusunan skripsi
yang berjudul “Optimasi Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
Fase Terbalik
pada Pemisahan Kloramfenikol dan Lidokain Hidroklorida dalam
Sediaan Tetes
Telinga Colme®” dapat diselesaikan dengan baik. Skripsi ini
disusun sebagai
salah satu syarat untuk meraih gelar Sarjana Farmasi (S.Farm) di
Fakultas
Farmasi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.
Dalam pelaksanaan penelitian hingga selesainya penyusunan
skripsi ini,
penulis mendapat banyak dukungan dan bantuan dari berbagai
pihak. Oleh karena
itu, penulis mengucapkan terima kasih kepada:
1. Bapak Ipang Djunarko, M.Sc., Apt. selaku Dekan Fakultas
Farmasi
Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.
2. Ibu Christine Patramurti, M.Si., Apt. selaku Dosen Pembimbing
yang telah
membimbing dan memberikan pengarahan, masukan dan saran
selama
berjalannya penelitian hingga berakhirnya penyusunan
skripsi.
3. Bapak Jeffry Julianus, M.Si. dan Ibu Dra. MM. Yetty
Tjandrawati, M.Si.
selaku Dosen Penguji yang telah memberikan saran dan kritik
yang
membangun dalam penyusunan skripsi.
4. Prof. Dr. Sudibyo Martono, M.S., Apt. dan Ibu Prof. Dr. Sri
Noegrohati,
Apt. selaku Dosen Pengajar yang telah bersedia menyediakan waktu
untuk
diskusi pribadi terkait penelitian ini.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN
TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
vii
5. Seluruh Dosen Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma yang
telah
memberikan ilmu yang bermanfaat demi kemajuan mahasiswa dan
mahasiswi dalam berkarya dalam bidang farmasi.
6. PT. Interbat yang telah bersedia memberikan senyawa standar
yang
berguna bagi penelitian.
7. Seluruh staf kemananan, staf laboratorium kimia Fakultas
Farmasi
Universitas Sanata Dharma terutama Mas Bimo, Pak Parlan, Mas
Kunto,
Mas Otok, dan Pak Timbul yang telah banyak membantu selama
penelitian di laboratorium dan menyediakan sarana untuk
terselesaikannya
seluruh kegiatan akademik dengan lancar.
8. Martha Herati sebagai sahabat terdekatku yang selalu
menyemangatiku
untuk belajar dan mengenal arti kehidupan.
9. Pakde, bude, mas sunu, mas damar, mas daru, mba vero yang
menjadi
keluargaku selama berada di Yogyakarta dan telah memberikan
semangat,
doa dan dukungan dalam penyusunan skripsi ini.
10. Efrida Lusia Sari Tambunan dan Theresia Wijayanti sebagai
teman
seperjuangan skripsi dan tempat saling berbagi suka dan duka.
Terima
kasih atas semangat, doa, kegigihan dan kebersamaannya selama
ini.
11. Felicia, Prasilya dan Sasa sebagai teman seperjuangan
skripsi satu tema
yang selalu membantu dan memberikan semangat.
12. Novi, Citra, Helena, Ayesa, Amel, Dina, Susi, Nona, Susan
sebagai teman
seperjuangan di laboratorium.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN
TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
viii
13. Teman kelompok bermainku: Dea, Siska, Yessi, Lia, Lala yang
selalu
menyemangatiku dan memberikan saran, doa dan tempat saling
berbagi
suka dan duka.
14. Semua teman-teman FST A yang telah menjadi teman terbaik
selama
berada di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma.
15. Seluruh teman-teman Farmasi angkatan 2008, terima kasih
atas
pengalaman dan kebersamaan selama ini.
16. Semua pihak yang tidak dapat disebutkan satu per satu yang
telah
membantu penulis dalam mewujudkan skripsi ini. Terima kasih
atas
dukungannya.
Penulis menyadari bahwa masih di dalam skripsi ini masih
banyak
kekurangan. Oleh karena itu, segala kritik dan saran yang
membangun sangat
penulis harapkan. Semoga skripsi ini membantu dan bermanfaat
bagi pembaca
dan dapat berguna bagi perkembangan ilmu pengetahuan.
Penulis
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN
TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
ix
DAFTAR ISI
Halaman
HALAMAN JUDUL
................................................................................
i
HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING
......................................... ii
HALAMAN PENGESAHAN
...................................................................
iii
HALAMAN PERSEMBAHAN
................................................................
iv
PERNYATAAN KEASLIAN KARYA
.................................................... v
LEMBAR PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA
................................. vi
PRAKATA
...............................................................................................
vii
DAFTAR ISI
............................................................................................
xi
DAFTAR TABEL
....................................................................................
xv
DAFTAR GAMBAR
...............................................................................
xvi
DAFTAR LAMPIRAN
.............................................................................
xix
INTISARI
.................................................................................................
xxi
ABSTRACT
...............................................................................................
xxii
BAB I. PENGANTAR
..............................................................................
1
A. Latar Belakang
....................................................................................
1
1. Permasalahan
..................................................................................
3
2. Keaslian
penelitian..........................................................................
3
3. Manfaat penelitian
..........................................................................
4
B. Tujuan
Penelitian..................................................................................
4
BAB II. PENELAAHAN PUSTAKA
....................................................... 5
A. Kloramfenikol
......................................................................................
5
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN
TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
x
B. Lidokain Hidroklorida
..........................................................................
6
C. Obat Tetes Telinga
...............................................................................
6
D. Spektrofotometer UV
...........................................................................
7
E. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
......................................................... 9
1. Pengenalan dan instrumentasi KCKT
................................................ 9
2. Kromatografi partisi fase terbalik
..................................................... 12
3. Pemisahan puncak dalam kromatografi
............................................ 13
F. Landasan Teori
.....................................................................................
20
G. Hipotesis
..............................................................................................
21
BAB III. METODE PENELITIAN
........................................................... 22
A. Jenis dan Rancangan Penelitian
............................................................ 22
B. Variabel Penelitian
...............................................................................
22
1. Variabel bebas
..................................................................................
22
2. Variabel tergantung
.........................................................................
22
3. Variabel pengacau terkendali
........................................................... 22
C. Definisi Operasional
.............................................................................
23
D. Bahan-bahan Penelitian
........................................................................
23
E. Alat-alat Penelitian
...............................................................................
23
F. Tata Cara Penelitian
..............................................................................
24
1. Pembuatan fase gerak
.......................................................................
24
2. Pembuatan larutan baku kloramfenikol dan lidokain
hidroklorida
yang digunakan untuk untuk penentuan panjang gelombang
pengamatan
......................................................................................
24
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN
TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
xi
3. Pembuatan larutan baku kloramfenikol dan lidokain
hidroklorida
yang digunakan untuk optimasi dengan metode KCKT
.................... 25
4. Pembuatan campuran kloramfenikol dan lidokain
hidroklorida......... 26
5. Penentuan panjang gelombang pengamatan kloramfenikol dan
lidokain hidroklorida dengan spektrofotometer
UV-Vis.................... 26
6. Preparasi sampel
.............................................................................
26
7. Optimasi pemisahan kloramfenikol dan lidokain
hidroklorida
dengan metode KCKT fase terbalik
.................................................. 27
G. Analisis Hasil
.......................................................................................
29
1. Bentuk peak pemisahan kloramfenikol dan lidokain hidroklorida
..... 29
2. Waktu retensi (tR)
.............................................................................
30
3. Nilai resolusi
....................................................................................
30
4. Nilai HETP
......................................................................................
31
5. Reprodusibilitas
...............................................................................
31
BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN
................................................. 32
A. Pemilihan Pelarut
.................................................................................
32
B. Pembuatan Fase Gerak
.........................................................................
32
C. Pembuatan Larutan Baku
......................................................................
34
D. Penentuan Panjang Gelombang Pengamatan Kloramfenikol dan
Lidokain Hidroklorida dengan Spektrofotometer UV-Vis
.................... 36
E. Optimasi Kloramfenikol dan Lidokain Hidroklorida dengan
Metode
KCKT Fase Terbalik
............................................................................
40
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN
TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
xii
1. Fase gerak metanol:aquabides 75:25 dengan flow rate 0,8;
1,0;
dan1,2 mL/menit
..............................................................................
46
2. Fase gerak metanol:aquabides 85:15 dengan flow rate 0,8; 1,0;
dan
1,2 mL/menit
....................................................................................
50
3. Fase gerak metanol:aquabides 95:5 dengan flow rate 0,8; 1,0;
dan
1,2 mL/menit
....................................................................................
54
BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN
.................................................... 64
A. Kesimpulan
..........................................................................................
64
B. Saran
....................................................................................................
64
DAFTAR PUSTAKA
...............................................................................
65
LAMPIRAN
.............................................................................................
68
BIOGRAFI PENULIS
..............................................................................
139
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN
TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
xiii
DAFTAR TABEL
.
......................................................................................................
Halaman
Tabel I. Karakteristik beberapa pelarut pada KCKT
............................ 11
Tabel II. Komposisi fase gerak metanol p.a:aquabides
......................... 24
Tabel III. Indeks polaritas campuran fase gerak
metanol:aquabides ...... 33
Tabel IV. Waktu retensi baku kloramfenikol, baku lidokain
hidroklorida dan baku campuran kloramfenikol dan lidokain
hidroklorida
..........................................................................
40
Tabel V. Tekanan kolom (kgf/cm2=kPa)
............................................. 44
Tabel VI. Hasil optimasi kloramfenikol dan lidokain
hidroklorida
berdasar parameter Asymmetry Factor (AF) dengan fase
gerak metanol:aquabides 75:25; 85:15; dan 95:5 pada flow
rate 0,8; 1,0; dan 1,2 mL/menit
............................................. 45
Tabel VII. Hasil optimasi flow rate baku campuran kloramfenikol
dan
lidokain hidroklorida dengan fase gerak metanol:aquabides
95:5
......................................................................................
58
Tabel VIII. Data hasil perhitungan %CV waktu retensi baku
campuran
kloramfenikol dan lidokain hidroklorida
............................... 60
Tabel IX. Data hasil perhitungan %CV nilai resolusi baku
campuran
kloramfenikol dan lidokain hidroklorida
............................... 61
Tabel XII. Data hasil perhitungan %CV waktu retensi dan nilai
resolusi
kloramfenikol dan lidokain hidroklorida dalam sediaan tetes
telinga Colme®
....................................................................
63
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN
TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
xiv
DAFTAR GAMBAR
Halaman
Gambar 1. Struktur Kloramfenikol
(D-treo-(-)-2,2-Dikloro-N-(β-
hidroksi-α-(hidroksimetil)-p)nitrofenetilasetamida)
............. 5
Gambar 2. Struktur Lidokain Hidroklorida
(2-(Dietilamino)-2’,6’-
aetoksilidida monohidroklorida monohidrat)
....................... 6
Gambar 3. Instrumentasi KCKT
............................................................. 9
Gambar 4. Mekanisme pemisahan kromatografi partisi fase terbalik
...... 13
Gambar 5. Perhitungan bilangan lempeng teoritik
.................................. 14
Gambar 6. Difusi Eddy
..........................................................................
15
Gambar 7. Transfer massa pada fase diam
.............................................. 17
Gambar 8. Transfer massa pada fase gerak
............................................. 17
Gambar 9. Pemisahan dua senyawa
........................................................ 18
Gambar 10. Penentuan Peak Asymmetry dan Peak Tailing Factor
............ 20
Gambar 11. Distribusi analit dalam fase diam dan fase gerak
................... 20
Gambar 12. Gugus kromofor dan auksokrom pada kloramfenikol
............ 37
Gambar 13. Gugus kromofor dan auksokrom pada lidokain
hidroklorida . 37
Gambar 14. Spektra panjang gelombang maksimum kloramfenikol
13
ppm (A) dan lidokain hidroklorida 300 ppm (B) ..................
37
Gambar 15. Spektra panjang gelombang maksimum kloramfenikol
19,5
ppm (A) dan lidokain hidroklorida 450 ppm (B) .................
38
Gambar 16. Spektra panjang gelombang maksimum kloramfenikol
26
ppm (A) dan lidokain hidroklorida 600 ppm (B) ..................
38
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN
TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
xv
Gambar 17. Interaksi kloramfenikol dengan fase diam C18
(oktadesilsilan) melalui interaksi Van Der
Waals................. 41
Gambar18. Interaksi lidokain hidroklorida dengan fase diam
C18
(oktadesilsilan) melalui interaksi Van Der Waals dan
interaksi ion-dipol
...............................................................
41
Gambar 19. Interaksi hidrogen antara kloramfenikol dengan fase
gerak
metanol:aquabides
...............................................................
42
Gambar 20. Interaksi hidrogen antara lidokain hidroklorida
dengan fase
gerak metanol:aquabides
..................................................... 42
Gambar 21. Kromatogram kloramfenikol (A.1), lidokain
hidroklorida
(A.2) dengan fase gerak metanol:aquabides 75:25 dan flow
rate 0,8 mL/menit
...............................................................
46
Gambar 22. Kromatogram kloramfenikol (B.1), lidokain
hidroklorida
(B.2) dengan fase gerak metanol:aquabides 75:25 dan flow
rate 1,0
mL/menit................................................................
47
Gambar 23. Kromatogram kloramfenikol (C.1), lidokain
hidroklorida
(C.2) dengan fase gerak metanol:aquabides 75:25 dan flow
rate 1,2
mL/menit................................................................
48
Gambar 24. Kromatogram kloramfenikol (A.1), lidokain
hidroklorida
(A.2) dengan fase gerak metanol:aquabides 85:15 dan flow
rate 0,8
mL/menit................................................................
50
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN
TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
xvi
Gambar 25. Kromatogram kloramfenikol (B.1), lidokain
hidroklorida
(B.2) dengan fase gerak metanol:aquabides 85:15 dan flow
rate 1,0 mL/menit
.................................................................
51
Gambar 26. Kromatogram kloramfenikol (C.1), lidokain
hidroklorida
(C.2) dengan fase gerak metanol:aquabides 85:15 dan flow
rate 1,2 mL/menit
.................................................................
52
Gambar 27. Kromatogram kloramfenikol (A.1), lidokain
hidroklorida
(A.2) dengan fase gerak metanol:aquabides 95:5 dan flow
rate 0,8 mL/menit
.................................................................
54
Gambar 28. Kromatogram kloramfenikol (B.1), lidokain
hidroklorida
(B.2), baku campuran kloramfenikol dan lidokain
hidroklorida (B.3) dengan fase gerak metanol:aquabides
95:5 dan flow rate 1,0 mL/menit
........................................... 55
Gambar 29. Kromatogram kloramfenikol (C.1), lidokain
hidroklorida
(C.2), baku campuran kloramfenikol dan lidokain
hidroklorida (C.3) dengan fase gerak metanol:aquabides
95:5 dan flow rate 1,2 mL/menit
........................................... 56
Gambar 30. Kromatogram kloramfenikol dan lidokain hidroklorida
dalam
sediaan tetes telinga Colme® pada replikasi 1, replikasi 2,
dan replikasi 3 dengan komposisi fase gerak dan flow rate
hasil
optimasi........................................................................
62
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN
TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
xvii
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
Lampiran 1. Sertifikat analisis kloramfenikol
......................................... 69
Lampiran 2. Sertifikat analisis lidokain hidroklorida
.............................. 70
Lampiran 3. Kromatogram hasil optimasi flow rate pada fase
gerak
metanol:aquabides (75:25)
................................................. 71
Lampiran 4. Nilai Asymmetry Factor (AF) peak kloramfenikol
dan
lidokain hidroklorida pada fase gerak metanol:aquabides
(75:25) dan contoh perhitungannya
.................................... 77
Lampiran 5. Kromatogram hasil optimasi flow rate pada fase
gerak
metanol:aquabides (85:15)
................................................. 79
Lampiran 6. Nilai Asymmetry Factor (AF) peak kloramfenikol
dan
lidokain hidroklorida pada fase gerak metanol:aquabides
(85:15) dan contoh perhitungannya
.................................... 85
Lampiran 7. Kromatogram hasil optimasi flow rate pada fase
gerak
metanol:aquabides (95:5)
................................................... 87
Lampiran 8. Nilai Asymmetry Factor (AF) peak kloramfenikol
dan
lidokain hidroklorida pada fase gerak metanol:aquabides
(95:5) dan contoh perhitungannya
...................................... 95
Lampiran 9. Nilai resolusi dan HETP pada fase gerak
metanol:aquabides (95:5) dan contoh perhitungannya ........
97
Lampiran 10. Reprodusibilitas: Kromatogram baku kloramfenikol,
baku
lidokain hidroklorida, baku campuran kloramfenikol dan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN
TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
xviii
lidokain hidroklorida pada fase gerak metanol:aquabides
(95:5) flow rate 1,0 mL/menit
............................................ 100
Lampiran11. Reprodusibilitas: Kromatogram kloramfenikol dan
lidokain hidroklorida dalam sediaan tetes telinga Colme®
.. 127
Lampiran 12. Data hasil uji reprodusibilitas sistem dan
perhitungan
%CV
..................................................................................
130
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN
TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
xix
INTISARI
Kloramfenikol dan lidokain hidroklorida merupakan zat aktif
yang
terdapat dalam sediaan tetes telinga Colme®. Dalam produk tetes
telinga perlu
adanya penjaminan mutu terkait kadar senyawa aktifnya sehingga
semakin
terjamin keamanan dan khasiatnya. Pada penelitian ini digunakan
metode
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) fase terbalik sebagai
metode analisis
kloramfenikol dan lidokain hidroklorida dalam sediaan tetes
telinga Colme®.
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui kondisi optimum dari
KCKT
sehingga dapat digunakan sebagai penetapan kadar kloramfenikol
dan lidokain
hidroklorida dalam sediaan tetes telinga Colme®. Sistem KCKT
fase terbalik
menggunakan kolom C18 dengan fase gerak metanol:aquabides.
Optimasi
dilakukan dengan mengubah-ubah komposisi fase gerak
metanol:aquabides
(75:25), (85:15) dan (95:5) serta mengubah-ubah flow rate yaitu
0,8; 1,0; dan 1,2
mL/menit dengan detektor ultraviolet pada λmaks 265 nm.
Kondisi optimum sistem KCKT yang didapatkan adalah fase
gerak
metanol:aquabides (95:5) pada flow rate 1,0 mL/menit. Kondisi
optimum ini telah
memenuhi parameter pemisahan yang baik yaitu peak yang simetri,
tR kurang dari
10 menit, nilai resolusi ≥ 1,5 yaitu 3,1819, dan nilai HETP yang
paling kecil yaitu
0,0128.
Kata kunci: kloramfenikol, lidokain hidroklorida, tetes telinga,
optimasi metode,
KCKT fase terbalik
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN
TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
xx
ABSTRACT
Chloramphenicol and lidocaine hydrochloride is the active
substances
contained in preparations Colme® ear drops. Ear drops needs the
quality assurance
of products related to levels of the active compounds, so
security is ensured and
usability. In this study using High Performance Liquid
Chromatography (HPLC)
reverse phase as a method of analysis of chloramphenicol and
lidocaine
hydrochloride in the preparation Colme® ear drops.
This study aims to determine the optimum conditions for HPLC can
be
used as a test of lidocaine hydrochloride and chloramphenicol in
the preparation
Colme® ear drops. Reverse phase HPLC system using C18 column
with mobile
phase methanol:aquabidest. Optimization is done by changing the
composition of
mobile phase methanol:aquabidest (75:25), (85:15) and (95:5) and
varying the
flow rate of 0,8; 1,0; and 1,2 mL/min with an ultraviolet
detector at λmaks 265
nm.
The optimal conditions obtained by HPLC system is the mobile
phase
methanol: aquabidest (95:5) at flow rate of 1,0 mL/min. Optimal
conditions in
accordance with the parameters of a good separation of the peak
of the symmetry,
tR less than 10 minutes, the value of resolution ≥ 1,5 is
3,1819, and the lowest
HETP is 0,0128.
Key words: chloramphenicol, lidocaine hydrochloride, ear drops,
optimization
methods, reversed-phase HPLC
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN
TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
1
BAB I
PENGANTAR
A. Latar Belakang
Guttae auricularies atau obat tetes telinga adalah bahan obat
berbentuk
cairan yang cara penggunaanya dengan meneteskan ke dalam saluran
telinga,
kecuali dibuat dengan pembawa bukan air (Dirjen POM RI, 1974).
Colme®
adalah
salah satu jenis obat tetes telinga yang beredar di Indonesia.
Colme®
mengandung
senyawa antibiotik yaitu kloramfenikol 10% dan obat pemati rasa
yaitu lidokain
hidroklorida 4% (Anonim, 2006).
Kloramfenikol memiliki kelarutan 1 bagian di dalam 400 bagian
air dan 1
bagian didalam 2,5 bagian etanol, sangat larut di eter dan
kloroform (Clarke,
1969). Menurut Farmakope Indonesia edisi IV (1995), tetes
telinga kloramfenikol
adalah larutan steril kloramfenikol dalam pelarut yang sesuai,
mengandung tidak
kurang dari 90,0 % dan tidak lebih dari 130% C11H12Cl2N2O5 dari
jumlah yang
tertera pada etiket.
Lidokain hidroklorida (Otopain) adalah obat pemati rasa yang
bekerja di
dalam kulit dan selaput lendir dengan menghilangkan rasa nyeri,
rasa terbakar,
dan gatal pada telinga (Tan dan Rahardja, 2010). Lidokain
berbentuk bubuk
kristal putih dan memiliki sifat larut 1 bagian dalam 0,7 bagian
air, 1 bagian
didalam 1,5 bagian etanol, dan 1 bagian didalam 40 bagian
kloroform dan tidak
larut dalam eter (Clarke, 1969). Larutan oral-topikal lidokain
hidroklorida
mengandung lidokain hidroklorida tidak kurang dari 95,0
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN
TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
2
% dan tidak lebih dari 105,0% dari jumlah yang tertera pada
etiket (Dirjen POM
RI, 1995).
Dalam rangka menjamin kandungan mutu dari bentuk sediaan
Colme®,
dibutuhkan suatu metode yang sensitif dan selektif sehingga
khasiat dan
keamanannya benar-benar dapat dipertanggungjawabkan. Oleh karena
itu, metode
yang dipilih sebagai metode analisis dalam pemisahan
kloramfenikol dan lidokain
hidroklorida dalam sediaan tetes telinga Colme® adalah metode
KCKT fase
terbalik. Metode KCKT ini sering digunakan sebagai metode
analisis kuantitatif
atau penetapan kadar suatu senyawa tertentu di dalam suatu
matriks yang
kompleks atau terdapat banyak komponen lain di dalam matriks
sampel (Khopkar,
1990). Detektor yang digunakan adalah detektor UV karena
kloramfenikol dan
lidokain hidroklorida memiliki spektrum absorbsi pada sinar
ultraviolet.
Kloramfenikol di dalam metanol memiliki spektrum absorbsi pada
sinar
ultraviolet yaitu pada 272 nm ( ) dan lidokain hidroklorida di
dalam
metanol memiliki spektrum absorbsi pada sinar ultraviolet pada
263 nm (
) dan 271 nm ( ) (Dibbern, Muller and Wirbitzki, 2002).
Penetapan kadar kloramfenikol dan benzokain dalam suatu
bentuk
sediaan dengan menggunakan kromatografi cair kinerja tinggi fase
terbalik pernah
dilakukan oleh Sadana dan Ghogare (1990). Fase diam yang
digunakan adalah
kolom µBondapak C18 (300 mm x 3,9 mm i.d; ukuran partikel 5µm)
dan fase
gerak metanol:aquabides (36:65 v/v). Hal yang membedakan
penelitian ini dengan
penelitian Sadana dan Ghogare adalah senyawa yang akan
dipisahkan, yaitu
kloramfenikol dan lidokain hidroklorida. Selain itu kolom yang
akan digunakan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN
TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
3
pada penelitian ini adalah Kromasil sedangkan Sadana dan Ghogare
adalah kolom
µBondapak. Adanya perbedaan tersebut maka diperlukan adanya
suatu penelitian
optimasi pemisahan kedua senyawa tersebut untuk mendapatkan
kondisi optimal.
Optimasi metode KCKT bertujuan untuk mengetahui kondisi yang
optimum pada metode KCKT sehingga dapat digunakan sebagai
metode
penetapan kadar campuran kloramfenikol dan lidokain hidroklorida
pada obat
tetes telinga Colme®. Kondisi yang optimum yang diharapkan
adalah bentuk peak
yang simetri, waktu retensi (tR) < 10 menit, nilai resolusi ≥
1,5 terhadap peak
terdekat, dan nilai HETP yang semakin kecil (Synder, Kirkland,
and Glajh, 1997).
Optimasi yang dilakukan adalah dengan mengubah komposisi fase
gerak dan
kecepatan alir atau flow rate sehingga parameter-parameter yang
telah disebutkan
tersebut dapat terpenuhi.
1. Permasalahan
Berdasarkan latar belakang, permasalahan yang diperoleh
adalah
bagaimanakah komposisi fase gerak dan flow rate yang optimum
yang dapat
menghasilkan pemisahan dengan peak yang simetri, waktu retensi
(tR) < 10 menit,
nilai resolusi ≥ 1,5 terhadap peak terdekat, dan nilai HETP yang
semakin kecil
untuk penetapan kadar campuran kloramfenikol dan lidokain
hidroklorida pada
obat tetes telinga Colme®
dengan menggunakan metode KCKT fase terbalik?
2. Keaslian penelitian
Penelitian terkait pernah dilakukan oleh Sadana dan Ghogare
(1990),
yaitu penetapan kadar kloramfenikol dan benzokain dalam suatu
bentuk sediaan
dengan menggunakan kromatografi cair kinerja tinggi fase
terbalik dengan fase
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN
TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
4
diam yang digunakan adalah kolom µBondapak C18 (300 mm x 3,9 mm
i.d;
ukuran partikel 5µm) dan fase gerak metanol:aquabides (36:65
v/v). Akan tetapi,
penelitian berupa optimasi campuran kloramfenikol dan lidokain
hidroklorida
dengan metode kromatografi cair kinerja tinggi fase terbalik
belum pernah
dilakukan sebelumnya.
3. Manfaat penelitian
a. Manfaat metodologis. Menjadi sumbangan karya ilmiah
tentang
metode penelitian dalam melakukan optimasi alat KCKT untuk
penetapan kadar
campuran kloramfenikol dan lidokain hidroklorida dalam sediaan
topikal.
b. Manfaat praktis. Dapat digunakan sebagai metode awal
untuk
validasi dan penetapan kadar kloramfenikol dan lidokain
hidroklorida yang
nantinya dapat memberikan informasi bagi masyarakat mengenai
penjaminan
mutu pada obat tetes telinga yang mengandung kedua obat
tersebut.
B. Tujuan Penelitian
Berdasarkan latar belakang dan permasalahan di atas, maka
penelitian ini
bertujuan untuk mengetahui komposisi fase gerak dan flow rate
yang optimum
yang dapat menghasilkan pemisahan dengan peak yang simetri,
waktu retensi (tR)
< 10 menit, nilai resolusi ≥ 1,5 terhadap peak terdekat, dan
nilai HETP yang
semakin kecil untuk validasi dan penetapan kadar campuran
kloramfenikol dan
lidokain hidroklorida pada obat tetes telinga Colme® dengan
menggunakan
metode KCKT fase terbalik.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN
TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
5
BAB II
PENELAAHAN PUSTAKA
A. Kloramfenikol
Kloramfenikol adalah senyawa antimikroba yang bekerja dengan
cara
menghambat sintesis protein mikroba. Penghambatan yang terjadi
yaitu pada
enzim peptidil transferase yang berperan sebagai katalisator
dalam pembentukan
ikatan peptida ketika sintesis protein. Kloramfenikol bersifat
bakteriostatik, dan
dapat bersifat baktersid pada konsentrasi yang tinggi (Setiabudy
dan Kurnadi,
1995).
Gambar 1. Struktur Kloramfenikol
(D-treo-(-)-2,2-Dikloro-N-(β-hidroksi-α-(hidroksimetil)-
p)nitrofenetilasetamida) (Hutt and O’Grady, 1996)
Kloramfenikol memiliki berat molekul (BM) 323,13 g/mol.
Kloramfenikol mengandung tidak kurang dari 97,0% dan tidak lebih
dari 103,0%
C11H12Cl2N2O5. Namun, untuk tetes telinga kloramfenikol
mengandung tidak
kurang dari 90,0% dan tidak lebih dari 130,0% C11H12Cl2N2O5 dari
jumlah yang
tertera pada etiket. Kloramfenikol memiliki hablur halus,
berbentuk jarum atau
lempeng memanjang, berwarna putih kelabu atau putih kekuningan,
dan sifatnya
stabil dalam larutan netral atau larutan agak asam, serta sukar
larut dalam air,
mudah larut dalam etanol, dalam propilenglikol, aseton, etil
asetat (Dirjen POM
RI, 1995). Kloramfenikol di dalam metanol memiliki λmaks pada
272 nm
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN
TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
6
( ) (Dibbern et al., 2002). Kloramfenikol memiliki pH antara 4,5
dan
7,5 (Dirjen POM RI, 1995), dan pKa 5,5 (Clarke, 1969).
B. Lidokain Hidroklorida
Lidokain memiliki daya kerja yang cepat dan merupakan obat
anestesi
lokal yang paling sering digunakan karena lebih stabil dalam
pemanasan dan
jarang menimbulkan reaksi hipersensitivitas (Sutedjo, 2008).
Gambar 2. Struktur Lidokain Hidroklorida
(2-(Dietilamino)-2’,6’-aetoksilidida
monohidroklorida monohidrat) (British Pharmacopeia Comission,
2009)
Lidokain hidroklorida memiliki berat molekul (BM) 270,80
g/mol,
berbentuk serbuk hablur putih, tidak berbau dan rasa sedikit
pahit dan sifatnya
mudah larut dalam air, dalam etanol dan dalam kloroform, tetapi
tidak larut dalam
eter. Larutan oral-topikal lidokain hidroklorida mengandung
lidokain hidroklorida
tidak kurang dari 95,0% dan tidak lebih dari 105,0% dari jumlah
yang tertera pada
etiket (Dirjen POM RI, 1995). Lidokain di dalam metanol memiliki
λmaks pada
263 nm ( ) dan 271 nm ( ) (Dibbern et al., 2002).
Lidokain hidroklorida memiliki pH antara 5,0 dan 7,0 (Dirjen POM
RI, 1995),
dan pKa 7,9 (25°) (Clarke, 1969).
C. Obat Tetes Telinga
Tetesan (guttae) adalah sediaan cair yang mengandung bahan obat
atau
sediaan obat atau bahan obat dan sediaan obat terlarut,
teremulsi, atau tersuspensi,
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN
TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
7
ditakar berdasar jumlah tetesan, digunakan untuk diminum dan
diisikan ke dalam
wadah bertakaran ganda. Untuk tetesan tertentu yang digunakan di
telinga,
dinamakan tetes telinga (otoguttae) (Voigt, 1994).
Menurut Farmakope Indonesia edisi IV, obat tetes telinga
(guttae
auriculares) adalah obat tetes yang digunakan dengan cara
meneteskan ke dalam
telinga. Kecuali dinyatakan lain, dibuat dengan menggunakan
pembawa bukan air.
Pembawa pada obat tetes telinga harus mempunyai kekentalan yang
cocok hingga
obat mudah menempel. Pada umumnya digunakan gliseril dan
propilenglikol,
selain itu dapat juga menggunakan etanol, heksilenglikol, dan
minyak lemak
nabati (Dirjen POM RI, 1995).
D. Spektrofotometer UV
Teknik spektroskopik merupakan salah satu teknik analisis
fisiko-kimia
yang mengamati interaksi atom atau molekul dengan suatu
radiasi
elektromagnetik (REM) (Mulja dan Suharman, 1995). Metode
analisis
spektrofotometri ultraviolet didasarkan pada substitusi pada
daerah panjang
gelombang sekitar 190-380 nm (Khopkar, 1990).
Absorbansi cahaya ultraviolet mengakibatkan transisi elektronik,
yaitu
promosi elektron dari orbital keadaan dasar yang berenergi
rendah ke orbital
keadaan tereksitasi yang lebih tinggi. Panjang gelombang
ultraviolet bergantung
pada mudahnya promosi elektron. Molekul-molekul yang memerlukan
banyak
energi untuk promosi elektron akan menyerap pada panjang
gelombang yang
lebih pendek dan sebaliknya (Fessenden dan Fessenden, 1997).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN
TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
8
Ada empat tipe transisi elektronik yang mungkin terjadi yaitu σ
σ*, n
σ*, n π*, dan π π* (Mulja dan Suharman, 1995). Pada transisi σ
σ*,
elektron pada suatu orbital σ tereksitasi ke orbital σ*, dengan
mengabsorbsi
radiasi. Anti-ikat Transisi n σ* terjadi dalam senyawa-senyawa
jenuh dengan
elektron tidak berpasangan. Transisi tersebut memerlukan energi
yang lebih kecil
dan terjadi dalam daerah 150-250 nm dengan є = 100-3000.
Transisi n π* dan
π π*mencakup sebagian besar senyawa organik. Energi yang
diperlukan untuk
transisi menghasilkan absorbsi maksimum dalam daerah 200-700 nm.
Dengan
adanya orbital π berarti terdapat gugus fungsi tidak jenuh.
Transisi n π*
memiliki є = 10-100 L/cm/mol sedangkan transisi π π* memiliki є
= 1000-
10.000 L/cm/mol (Khopkar, 1990).
Kromofor merupakan suatu gugus fungsional tidak jenuh yang
menyediakan orbital π yang dapat menyerap pada daerah
ultraviolet (Skoog,
1985). Sedangkan auksokrom merupakan gugus jenuh yang bila
terikat pada
kromofor mengubah panjang gelombang dan intensitas serapan
maksimum,
cirinya adalah heteroatom yang langsung terikat pada kromofor
(Sastrohamidjojo,
2001).
Spektrometer menghasilkan sinar dari spektrum panjang
gelombang
tertentu dan fotometer adalah alat pengukur intensitas cahaya
yang ditransmisikan
atau diabsorbsi. Sehingga, spektrofotometer digunakan untuk
mengukur energi
yang ditransmisikan, direfleksikan atau diemisikan sebagai
fungsi dari panjang
gelombang (Khopkar, 1990).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN
TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
9
E. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
1. Pengenalan dan instrumentasi KCKT
Kromatografi cair kinerja tinggi atau yang dikenal dengan HPLC
(High
Performance Liquid Chromatography) mulai dikembangkan akhir
tahun 1960 dan
awal tahun 1970 (Rohman, 2009). Penggunaan High Performance
Liquid
Chromatography (HPLC) tidak terbatas untuk sampel yang bersifat
volatil atau
stabilitasnya yang mudah dipengaruhi oleh suhu. HPLC dapat
memisahkan
makromolekul, spesies ion, produk alami yang bersifat labil,
polimer, dan lain-
lain (Willard, Merrit, Dean, and Settle, 1988).
Pemisahan dengan KCKT dapat dilakukan dengan fase normal atau
fase
terbalik. Fase normal apabila fase diamnya lebih polar
dibandingkan dengan fase
geraknya dan fase terbalik apabila fase diamnya lebih non polar
daripada fase
geraknya. Dengan adanya kedua pemisahan ini, sering kali KCKT
dikelompokkan
menjadi KCKT fase normal dan KCKT fase terbalik (Gritter,
1991).
Gambar 3. Instrumentasi KCKT(Christian, 2004)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN
TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
10
Bagian yang harus diperhatikan pada kromatografi partisi fase
terbalik
adalah kolom, fase gerak, dan detektor.
a. Kolom. Oktadesil silika (ODS atau C18) adalah fase diam yang
paling
umum digunakan pada KCKT fase terbalik karena mampu memisahkan
senyawa
dengan kepolaran rendah, sedang dan tinggi (Rohman, 2009).
Panjang kolom KCKT biasanya sekitar 5-25 cm, dengan tekanan
yang
sangat tinggi yaitu sampai 6000 psi (Gritter, 1991). Standar
diameter kolom
HPLC sekitar 4-5 mm. Diameter partikel berada pada kisaran 4
sampai 7 µm
untuk kolom pada umumnya (Dean, 1995).
b. Fase gerak. Selain susunan kimiawi dari fase gerak, ada empat
hal
pada fase gerak yang harus diperhatikan yakni harus murni secara
kimia, harus
bebas partikel yang dapat menyumbat kolom, harus bebas gas yang
terlarut, dan
jika dilakukan pencampuran, maka saat pencampuran harus dicampur
dengan
benar (Gritter, 1991).
Komposisi fase gerak yang digunakan dapat mempengaruhi
variasi
retensi analit untuk pemisahan yang optimal. Sehingga fase gerak
disesuaikan
komposisinya agar diperoleh kepolaran relatif yang mirip dengan
sampel untuk
memperoleh pemisahan yang optimal (Willard et al., 1998).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN
TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
11
Tabel I. Karakteristik beberapa pelarut pada KCKT (Synder et
al., 1997)
Dalam pemilihan fase gerak yang sesuai, parameter yang
dilihat
berdasarkan kepolaran campuran pelarut yang semakin linier
dengan pelarut
murni. Tingkat kepolaran suatu pelarut menunjukkan kemampuan
pelarut dalam
mengelusi suatu senyawa. Besarnya polaritas dapat dihitung
dengan cara seperti
dibawah ini:
P’camp: Ф1 P’1 + Ф2 P’2 + ........ + Фn P’n (1)
Keterangan:
P’= indeks polaritas
Ф = fraksi volume pelarut (Gritter, 1991).
Semakin besar nilai indeks polaritas campuran maka fase gerak
yang digunakan
semakin polar (Synder et al., 1997).
c. Detektor. Secara umum suatu detektor harus memiliki
karakteristik
tertentu yaitu memiliki respon cepat terhadap solut,
reprodusibel, memiliki
sensitifitas tinggi, stabil dalam pengoperasian, signal yang
dihasilkan berbanding
lurus dengan konsentrasi solut, tidak dipengaruhi suhu dan
kecepatan alir fase
gerak (Rohman, 2009).
Secara umum detektor dibagi menjadi 2 kategori, yaitu:
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN
TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
12
1) Bulk property detectors
Detektor ini merupakan detektor yang mengukur perubahan sifat
fisik fase
gerak dan solut. Detektor ini cenderung relatif tidak sensitif
dan menghendaki
suhu yang terkendali. Contohnya yaitu detektor indeks bias.
2) Solute Property detectors
Detektor ini hanya dapat mengukur sifat fisik solut dan 1000
kali lebih sensitif
serta mampu mengukur solut sampai satuan nanogram atau lebih
kecil lagi.
Contohnya yaitu detektor fluoresensi, detektor penyerapan
(UV-Vis), dan
detektor elektrokimia (Munson, 1991).
2. Kromatografi partisi fase terbalik
Konsep dasar kromatografi partisi yaitu perlakuan sampel dalam
kondisi
cair-cair tergantung pada kelarutannya di dalam kedua cairan
yang terlibat
(Gritter, Bobbit, and Schwarting, 1991). Partisi analit di
antara dua fase yang tidak
saling campur, karena adanya perbedaan koefisien distribusi dari
masing-masing
senyawa. Jika solut ditambahkan ke dalam sistem yang terdiri
dari dua pelarut
tidak saling campur dan keseluruhan sistem dibiarkan setimbang,
maka solut akan
tersebar di antara kedua fase menurut persamaan:
(2)
K = koefisien distribusi
Cs = konsentrasi solut dalam fase diam
Cm = konsentrasi solut dalam fase gerak (Johnson dan Stevenson,
1978).
Mekanisme pemisahan pada kromatografi partisi fase terbalik
dapat digambarkan
sebagai berikut:
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN
TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
13
Gambar 4. Mekanisme pemisahan kromatografi partisi fase terbalik
(Munson,
1991)
3. Pemisahan puncak dalam kromatografi
Parameter pemisahan dengan sistem KCKT sebagai ukuran
kemampuan
kolom untuk memisahkan senyawa dari suatu campuran. Batasan yang
digunakan
adalah efisiensi kolom, waktu retensi (tR), dan faktor resolusi
(Munson, 1991).
a. Efisiensi Kolom. Salah satu karakteristik sistem kromatografi
yang
paling penting adalah efisiensi atau jumlah lempeng teoritis (N)
(Rohman, 2009).
Ada dua teori mengenai pemisahan puncak dalam kromatografi,yaitu
lempeng
teoritik dan teori laju.
Pada teori Lempeng (Plate theory) dijelaskan bahwa ukuran
efisiensi
kolom adalah jumlah lempeng (plate number, N) yang didasarkan
pada konsep
lempeng teoritis (Rohman, 2009). Jumlah lempeng (N) dihitung
dengan
persamaan (Willard et al., 1988):
(3)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN
TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
14
Nilai w adalah lebar alas, w1/2 adalah lebar alas puncak pada
setengah
tinggi puncak, dan tR adalah waktu retensi (Sastrohamidjojo,
2001). Persamaan
dibawah ini menggambarkan hubungan anatra panjang kolom (L)
dengan efisiensi
kolom (H):
(4)
Jumlah lempeng (N) yang tinggi disyaratkan untuk pemisahan yang
baik
yang nilainya sebanding dengan semakin panjang kolom (L) dan
semakin
kecilnya nilai H. H adalah tinggi ekivalen lempeng teoritis atau
HETP (High
Equivalent Theoritical Plate), merupakan panjang kolom yang
dibutuhkan untuk
menghasilkan suatu lempeng teoritis. Kolom yang baik seharusnya
memiliki
jumlah plat teoritis (N) yang tinggi dan nilai H yang rendah.
Ukuran partikel
merupakan suatu hal yang berpengaruh pada nilai H, dimana
semakin kecil
ukuran partikel maka semakin tinggi bilangan lempeng teoritis
(Rohman, 2009).
Gambar 5. Perhitungan bilangan lempeng teoritik
(Willard et al., 1988)
Pada teori laju dapat diketahui adanya pengaruh
variabel-variabel lain
yang menyebabkan pelebaran peak, sedangkan teori lempeng
hanya
menggambarkan laju migrasi secara kuantitatif. Ketika migrasi,
solut mengalami
N
LHETPH
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN
TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
15
transfer pada fase diam dan fase gerak berkali-kali, solut
bergerak bersama fase
gerak sehingga migrasi di dalam kolom tidak teratur yang
mengakibatkan laju
rata-rata solut relatif terhadap fase gerak juga sangat
bervariasi. Laju rata-rata
solut relatif terhadap fase gerak bervariasi sehingga
mengakibatkan pelebaran
peak solut (Noegrohati, 1994).
Berdasarkan teori laju yang ada, efisiensi kolom dinyatakan
dengan
persamaan Van Deemter yang dinyatakan sebagai berikut:
(5)
(6)
Keterangan:
λ = tetapan ukuran ketidakteraturan kemasan
dp = diameter rata-rata partikel penyangga
D = kedifusian linarut dalam fase gerak
k’ = Faktor kapasitas
µ = kecepatan alir
γ = faktor koreksi kelikuan saluran dalam kolom (Willard et al.,
1988).
Berdasarkan persamaan Van Deemter di atas, hal-hal yang
mempengaruhi
efisiensi kolom yaitu Difusi Eddy, Difusi Longitudinal, dan
Transfer Massa
(Willard et al., 1988).
Difusi Eddy disebabkan oleh banyak kemungkinan pada kemasan
kolom
yang kurang baik.
Gambar 6. Difusi Eddy (Noegrohati, 1994)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN
TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
16
Nomor 1 menunjukkan analit yang keluar lebih dahulu karena
melewati kolom
dengan partikel berukuran besar dan kurang kompak. Nomor 2
menunjukkan
analit keluar lebih lambat dari nomor 1 karena ukuran partikel
yang lebih kecil
dan lebih kompak daripada nomor 1. Nomor 3, analit keluar paling
akhir, hal ini
terjadi karena melewati bagian kolom dengan ukuran partikel
halus dan kompak
(Noegrohati, 1994).
Menurut Willard (1988), difusi Eddy dinyatakan sebagai A (2λdp)
yang
menggambarkan ketidakhomogenan kecepatan alir dan panjang
lintasan di sekitar
partikel yang ter-packing. Lintasan alir yang tidak sama pasti
ditemukan dalam
setiap kolom ter-packing. Suatu molekul solut dapat melewati
kolom dekat
dinding kolom di mana kerapatan kolom rendah dengan cepat
mencapai akhir
kolom, khususnya pada kolom berdiameter kecil. Sedangkan suatu
molekul solut
yang melewati bagian tengah kolom menjadi lebih lambat untuk
mencapai akhir
kolom. Dengan demikian, laju tiap molekul melalui kolom
berbeda-beda. Difusi
Eddy dapat diminimalkan dengan memperkecil diameter rata-rata
partikel dalam
kolom hingga sekecil mungkin dan seseragam mungkin.
Difusi longitudinal dilambangkan dengan nilai B (2γD/µ) yang
menggambarkan pergerakan acak molekul dalam fase gerak. Pengaruh
difusi
longitudinal terhadap ketinggian lempeng menjadi signifikan pada
kecepatan fase
gerak yang rendah/lambat. Pada kecepatan difusi solut yang
tinggi dalam fase
gerak menyebabkan molekul solut terdispersi secara aksial dan
lambat bermigrasi
melalui kolom (Willard et al., 1988).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN
TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
17
Transfer massa dinyatakan dengan nilai Cstasionary dan
Cmobile.
Cstasionery yang menunjukkan solut yang tertahan karena adanya
fase diam.
Suatu molekul bergerak lambat pada fase diam, sementara molekul
lainnya
bergerak melalui kolom bersama dengan fase gerak. Untuk
mengatasi hal tersebut,
dapat dibuat fase diam yang lebih encer (tidak terlalu kental)
(Willard et al.,
1988).
Gambar 7. Transfer massa pada fase diam (Willard et al.,
1988)
Sedangkan Cmobile menggambarkan adanya peristiwa dimana solut
dalam fase
diam bertemu dengan fase gerak yang masih baru.
Gambar 8. Transfer massa pada fase gerak (Willard et al.,
1988)
b. Waktu retensi (tR) dan faktor resolusi. Waktu tambat atau
waktu retensi
merupakan selang waktu yang diperlukan oleh analit mulai saat
injeksi hingga
keluar dari kolom dan sinyalnya ditangkap oleh detektor. Waktu
tambat atau
retensi ini dinyatakan sebagai tR. Apabila harga D (koefisien
distribusi) kecil,
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN
TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
18
maka analit akan lebih banyak di dalam fase gerak atau (Cm >
Cs) yang berarti
analit akan lebih lama tinggal di dalam fase gerak dan memiliki
waktu retensi
lebih cepat (Mulja dan Suharman, 1995).
Kolom yang lebih efisien akan memiliki resolusi yang baik.
Tingkat
pemisahan komponen dalam suatu campuran dengan metode
kromatografi
direfleksikan dalam kromatogram yang dihasilkan. Hasil pemisahan
yang baik
ditunjukkan dengan puncak-puncak yang terpisah secara sempurna
atau tidak ada
tumpang tindih (overlapping) (Rohman, 2009).
Faktor resolusi atau daya pisah (Rs) dapat diukur secara
kuantitatif
dengan persamaan (Willard et al., 1988):
(7)
Nilai tR2 dan tR1 adalah waktu tambat atau waktu retensi
komponen, diukur pada
titik puncak maksimum puncak dan ∆t adalah selisih antara tR2
dan tR1. Nilai w2
dan w1 adalah lebar alas puncak (Johnson dan Stevenson,
1978).
Gambar 9. Pemisahan dua senyawa (Willard et al., 1988)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN
TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
19
Pemisahan sempurna dari dua puncak dengan ukuran yang sama
dikenal
dengan base resolution dengan harga Rs ≥1,5. Dalam praktiknya,
pemisahan
dengan nilai Rs = 1,0 (kedua puncak berhimpit 2%) dianggap
memadai (Pescok,
Shields, and Cains, 1976).
Pada analisis dengan metode KCKT, kondisi percobaan yang
dapat
menghasilkan puncak simetris lebih disukai, hal ini dikarenakan
puncak asimetris
menghasilkan pengukuran bilangan lempeng teoritik dan faktor
resolusi yang
tidak akurat, perhitungan yang tidak teliti, penurunan derajat
resolusi dan puncak
minor pada ekor puncak tidak dapat terdeteksi, serta waktu
retensi tidak
reprodusibel (Synder et al., 1997). Peak yang tidak simetris
sering dijumpai bila
konsentrasi sampel dalam fase gerak terlalu besar. Apabila
kapasitas kolom lebih
besar pada konsentrasi yang lebih rendah, bagian eluen dengan
konsentrasi yang
lebih rendah akan bergerak lebih lambat dari pada bagian dengan
konsentrasi solut
lebih tinggi, sehingga peak yang terjadi tidak simetris dengan
bidang bagian
depan naik dengan tajam sedangkan bidang di bagian belakang
turun dengan
landai (tailing). Keadaan sebaliknya dikenal sebagai leading
atau fronting.
Penyebab tailing antara lain karena ketidaksesuaian antara
analit dengan kolom,
pengemasan kolom yang tidak seragam, dan faktor yang terjadi di
luar kolom
seperti pada injektor (Noegrohati, 1994).
Parameter yang digunakan untuk menilai bentuk puncak adalah
peak
asymmetry factor (As), yang diukur 10% tinggi puncak. Peak yang
simetri
memiliki nilai As =1,0. Sedangkan puncak lain dengan nilai As
pada rentang 0,95-
1,1 masih dikatakan baik. Parameter lain yaitu peak tailing
factor (Tf), yang
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN
TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
20
diukur pada 5% tinggi puncak (Synder et al., 1997). Sedangkan
menurut Willard
(1988), nilai asymmetry factor (AF) pada peak yang simetri
dengan rentang 0,95-
1,15.
Gambar 10. Penentuan Peak Asymmetry dan Peak Tailing Factor
(Synder et al.,
1997)
Distribusi analit dalam fase gerak dan fase diam pada saat
terjadinya
tailing dan leading terdapat pada gambar dibawah ini:
Gambar 11. Distribusi analit dalam fase diam dan fase gerak
(Kuwana, 1980)
F. Landasan teori
Kloramfenikol merupakan senyawa antimikroba yang memiliki
sifat
stabil dalam larutan netral, larutan agak asam, sukar larut
dalam air, mudah larut
dalam etanol, dalam propilenglikol, aseton, etil asetat.
Kloramfenikol di dalam
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN
TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
21
metanol memiliki λmaks pada 272 nm ( ). Senyawa ini memiliki
pH
antara 4,5 dan 7,5, dan pKa 5,5.
Lidokain hidroklorida merupakan obat anestesi yang memiliki
sifat
mudah larut dalam air, dalam etanol dan dalam kloroform, tetapi
tidak larut dalam
eter. Lidokain di dalam metanol memiliki λmaks pada 263 nm ( )
dan
271 nm ( ). Senyawa ini memiliki pH antara 5,0 dan 7,0, dan pKa
7,9
(25°).
Sediaan tetes telinga Colme® merupakan sedian tetes telinga
yang
mengandung kloramfenikol 10% dan lidokain hidroklorida 4%. Untuk
menjamin
kandungan mutu dari bentuk sediaan Colme® maka dibutuhkan metode
yang
sensitif dan selektif. Metode yang memiliki sensitifitas dan
selektivitas yang
tinggi adalah metode KCKT. Optimasi dengan KCKT fase terbalik
dilakukan
untuk memperoleh keadaan optimum pada pemisahan campuran
kloramfenikol
dan lidokain hidroklorida. Parameter pemisahan dengan metode
KCKT yang
menunjukkan kondisi optimum yaitu bentuk peak simetri, tR kurang
dari 10 menit,
nilai resolusi ≥ 1,5 dan nilai HETP yang semakin kecil.
G. Hipotesis
Metode KCKT fase terbalik dengan komposisi fase gerak dan flow
rate
yang optimum dapat menghasilkan kromatogram dengan bentuk peak
yang
simetri, tR < 10 menit, resolusi pemisahan ≥ 1,5 terhadap
peak terdekat, dan nilai
HETP yang semakin kecil sehingga dapat digunakan untuk validasi
dan penetapan
kadar kloramfenikol dan lidokain hidroklorida pada sediaan tetes
telinga Colme®.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN
TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
22
BAB III
METODE PENELITIAN
A. Jenis dan Rancangan Penelitian
Penelitian yang dilakukan merupakan jenis rancangan
penelitian
eksperimental analitik karena ada perlakuan pada subjek uji.
B. Variabel Penelitian
1. Variabel bebas
Jenis dan perbandingan fase gerak yaitu metanol:aquabides dan
flow rate
yang digunakan.
2. Variabel tergantung
Pemisahan peak dari tiap komponen yaitu kloramfenikol dan
lidokain
hidroklorida yang dilihat dari bentuk peak, waktu retensi (tR),
nilai resolusi dan
HETP tiap-tiap senyawa.
3. Variabel pengacau terkendali
a. Kemurnian pelarut. Oleh karena itu, digunakan pelarut yang
memiliki
kemurnian tinggi yaitu pelarut pro analysis.
b. Baku kloramfenikol dan lidokain hidroklorida. Oleh karena
itu, digunakan
baku dengan kemurnian tinggi yang disertai dengan Certificate of
Analysis
(CoA).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN
TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
23
C. Definisi Operasional
1. Kloramfenikol dan lidokain hidroklorida yang dianalisis
merupakan senyawa
aktif dalam sediaan tetes telinga Colme® dengan perbandingan
5:2.
2. Lidokain HCl yang digunakan adalah lidokain hidroklorida
monohidrat.
3. Sistem KCKT fase terbalik yang digunakan adalah seperangkat
alat KCKT
menggunakan kolom C18 dengan fase gerak metanol
p.a:aquabides.
4. Optimasi dilakukan dengan mengubah komposisi fase gerak dan
flow rate.
5. Parameter optimum dengan metode KCKT adalah bentuk peak,
waktu retensi,
nilai resolusi dan HETP.
D. Bahan-bahan Penelitian
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah baku
kloramfenikol
(Chemo Lugano Branch, No. batch 8000225001, kemurnian 99,1%) dan
baku
lidokain hidroklorida (Megafine Pharma, No. batch ALH/449/10,
kemurnian
99,20%) (PT. Interbat), metanol p.a (E.Merck), aqua bidestilata
(PT.
Ikapharmindo Putramas), tetes telinga Colme® (PT. Interbat)
dengan volume 8 ml
yang mengandung 10% kloramfenikol dan 4% lidokain
hidroklorida.
E. Alat-alat Penelitian
Alat yang digunakan dalam penelitian adalah seperangkat alat
KCKT fase
terbalik dengan sistem gradien dengan detektor ultraviolet,
Shimadzu LC-2010C,
kolom C-18 merek KNAUER C-18 (No. 25EE181KSJ (B115Y620), Dimensi
250
x 4,6 mm), seperangkat komputer (merk Dell B6RDZ1S Connexant
System
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN
TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
24
RD01- D850 A03-0382 JP France S.A.S, printer HP Deskjet D2566
HP-024-000
625730), UV/Vis Spectrophotometer SP-3000plus merek OPTIMA
dengan
detektor silicon photo diode, timbangan analitik Ohaus Carat
Series PAJ 1003
(max 60/120g, min 0,001g, d = 0,01/0,1 mg), millipore, alat
ultrasonikasi Refsch.,
Tipe: T460 (Schwing.1 PXE, FTZ-Nr. C-066/83, HF-Frequ.:35 kHz),
kertas
saring Whatman 0,45 μm, alat vacuum, dan seperangkat alat
gelas.
F. Tata Cara Penelitian
1. Pembuatan fase gerak
Fase gerak yang digunakan dalam penelitian ini adalah campuran
metanol
dan aquabides dengan komposisi tabel II.
Tabel II. Komposisi fase gerak metanol p.a:aquabides
No. Komposisi Fase gerak
Metanol Aquabides
1. 75 25
2. 85 15
3. 95 5
Masing-masing pelarut disaring dengan penyaring Whatman yang
dibantu
dengan pompa vakum dan didegassing selama 15 menit
menggunakan
ultrasonicator. Untuk mendapatkan komposisi fase gerak di atas,
pencampuran
fase gerak dilakukan di dalam sistem KCKT.
2. Pembuatan larutan baku kloramfenikol dan lidokain
hidroklorida yang
digunakan untuk penentuan panjang gelombang pengamatan
a. Pembuatan larutan baku kloramfenikol. Sebanyak kurang lebih
10,0
mg kloramfenikol ditimbang seksama dan dilarutkan dalam metanol
hingga 10,0
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN
TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
25
mL. Kemudian dibuat larutan seri dengan 3 konsentrasi berbeda
yaitu 13; 19,5;
dan 26 ppm dengan mengencerkan 0,13; 0,195; dan 0,26 mL larutan
stok tersebut
dalam metanol hingga 10,0 mL.
b. Pembuatan larutan baku lidokain hidroklorida. Sebanyak kurang
lebih
10,0 mg lidokain hidroklorida ditimbang seksama dan dilarutkan
dalam metanol
hingga 10 mL. Kemudian dibuat larutan seri dengan 3 konsentrasi
berbeda yaitu
300; 450; dan 600 ppm dengan mengencerkan 3; 4,5; dan 6 mL
larutan stok
tersebut dalam metanol hingga 10,0 mL.
3. Pembuatan larutan baku kloramfenikol dan lidokain
hidroklorida yang
digunakan untuk optimasi dengan metode KCKT
a. Larutan stok kloramfenikol. Lebih kurang 10,0 mg
kloramfenikol baku
ditimbang seksama, kemudian dilarutkan dalam metanol hingga 10,0
mL.
b. Larutan intermediet kloramfenikol. Larutan stok kloramfenikol
1000
ppm tersebut dipipet seksama sebanyak 1 mL kemudian diencerkan
dengan
metanol dalam labu ukur 10 mL hingga tanda batas, sehingga
didapatkan
konsentrasi sebesar 100 ppm. Saring dengan milipore dan
didegassing selama 15
menit.
c. Larutan stok lidokain hidroklorida. Lebih kurang 20,0 mg
lidokain
hidroklorida baku ditimbang seksama, kemudian dilarutkan dalam
metanol hingga
10,0 mL.
d. Larutan intermediet lidokain hidroklorida. Larutan stok
lidokain
hidroklorida 2000 ppm tersebut dipipet seksama sebanyak 5 mL
kemudian
diencerkan dengan metanol dalam labu ukur 10 mL hingga tanda
batas, sehingga
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN
TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
26
didapatkan konsentrasi sebesar 1000 ppm. Saring dengan milipore
dan
didegassing selama 15 menit.
4. Pembuatan larutan baku campuran kloramfenikol dan
lidokain
hidroklorida
Campuran kloramfenikol dan lidokain hidroklorida yaitu
dengan
konsentrasi masing-masing 100 ppm dan 1000 ppm dibuat dengan
mencampur 1
mL stok kloramfenikol dengan 5 ml stok lidokain hidroklorida
dalam labu ukur 10
mL, lalu tambahkan dengan metanol hingga tanda. Campuran
kloramfenikol dan
lidokain hidroklorida tersebut disaring dengan milipore dan
didegassing selama
15 menit.
5. Penentuan panjang gelombang pengamatan kloramfenikol dan
lidokain
hidroklorida dengan spektrofotometer UV-Vis
Masing-masing seri konsentrasi baku kloramfenikol 13; 19,5; 26
ppm dan
lidokain hidroklorida 300; 450; 600 ppm diukur absorbansinya
pada panjang
gelombang 200-400 nm dengan spektrofotometer UV-Vis. Dari
spektra serapan
dapat diketahui panjang gelombang yang dihasilkan pada
masing-masing
konsentrasi. Panjang gelombang yang akan digunakan pada sistem
KCKT
ditentukan yaitu panjang gelombang yang menghasilkan serapan
optimum pada
ketiga konsentrasi tersebut.
6. Preparasi Sampel
Sediaan tetes telinga Colme®
(kloramfenikol 10% dan lidokain
hidroklorida 4 %) digojog homogen, kemudian dipipet seksama
sebanyak 0,1 mL
dan diencerkan dengan metanol sampai 10 mL sehingga didapatkan
konsentrasi
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN
TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
27
kloramfenikol 1000 ppm dan lidokain hidroklorida 400 ppm.
Larutan tersebut
kemudian dipipet seksama sebanyak 1 mL sehingga didapatkan
konsentrasi
kloramfenikol 100 ppm dan lidokain hidroklorida 40 ppm. Larutan
ini kemudian
ditambahkan 2,4 mL larutan stok lidokain hidroklorida 4000 ppm
dan diencerkan
dengan metanol dalam labu takar 10,0 mL hingga batas tanda,
sehingga
didapatkan konsentrasi kloramfenikol 100 ppm dan lidokain
hidroklorida 1000
ppm. Larutan stok lidokain hidroklorida 4000 ppm disiapkan
dengan menimbang
seksama lebih kurang 2,0 mg lidokain hidroklorida yang
diencerkan dengan
metanol dalam labu takar 5,0 mL hingga batas tanda. Larutan
sampel dengan
konsentrasi kloramfenikol 100 ppm dan lidokain hidroklorida 1000
ppm disaring
dengan milipore dan didegassing selama 15 menit.
7. Optimasi pemisahan kloramfenikol dan lidokain hidroklorida
dengan
metode KCKT fase terbalik
a. Pengamatan nilai Asymmetry factor (AF) dan waktu retensi
kloramfenikol. Larutan baku kloramfenikol dengan konsentrasi 100
ppm
diinjeksikan sebanyak 16 µL ke dalam sistem KCKT. Optimasi
dilakukan pada
panjang gelombang pengamatan dengan menggunakan fase gerak
metanol:aquabides dengan perbandingan 75:25; 85:15; dan 95:5
pada flow rate
0,5; 1,0 dan 2,0 mL/menit. Dari berbagai perbandingan fase gerak
dan flow rate
tersebut dipilih yang nilai AF = 0,95-1,15 dan waktu retensinya
kurang dari 10
menit.
b. Pengamatan nilai Asymmetry factor (AF) dan waktu retensi
lidokain
hidroklorida. Larutan baku lidokain hidroklorida dengan
konsentrasi 1000 ppm
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN
TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
28
diinjeksikan sebanyak 16 µL ke dalam sistem KCKT. Optimasi
dilakukan pada
panjang gelombang pengamatan dengan menggunakan fase gerak
metanol:aquabides dengan perbandingan 75:25; 85:15; dan 95:5
pada flow rate
0,5; 1,0 dan 2,0 mL/menit. Dari berbagai perbandingan fase gerak
dan flow rate
tersebut dipilih yang nilai AF = 0,95-1,15 dan waktu retensinya
kurang dari 10
menit.
c. Pemisahan campuran kloramfenikol dan lidokain hidroklorida
dengan
fase gerak hasil optimasi. Baku campuran kloramfenikol dan
lidokain hidroklorida
dengan konsentrasi masing-masing yaitu 100 ppm dan 1000 ppm
diinjeksikan
sebanyak 16 µL ke dalam sistem KCKT menggunakan perbandingan
fase gerak
dan flow rate hasil optimasi. Pemisahan dilakukan pada panjang
gelombang
pengamatan kemudian mengamati kromatogram yang terjadi. Setelah
mendapat
kromatogram dilanjutkan dengan menghitung nilai resolusi dan
HETP dari hasil
pemisahan campuran kloramfenikol dan lidokain hidroklorida.
d. Reprodusibilitas baku campuran kloramfenikol dan lidokain
hidroklorida. Baku campuran kloramfenikol dan lidokain
hidroklorida dengan
konsentrasi masing-masing yaitu 100 ppm dan 1000 ppm direplikasi
sebanyak 3
kali, kemudian diinjeksikan sebanyak 12; 16; dan 20 µL ke dalam
sistem KCKT
menggunakan perbandingan fase gerak dan flow rate hasil
optimasi. Setelah
mendapat kromatogram dilanjutkan dengan menghitung %CV resolusi
dan waktu
retensi dari hasil pemisahan campuran kloramfenikol dan lidokain
hidroklorida.
e. Reprodusibilitas campuran kloramfenikol dan lidokain
hidroklorida
dalam sediaan tetes telinga Colme®. Sampel yang telah
dipreparasi dengan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN
TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
29
konsentrasi kloramfenikol 100 ppm dan lidokain hidroklorida 1000
ppm
direplikasi sebanyak 3 kali, kemudian diinjeksikan sebanyak 16
µL ke dalam
sistem KCKT menggunakan perbandingan fase gerak dan flow rate
hasil optimasi.
Setelah mendapat kromatogram dilanjutkan dengan menghitung %CV
resolusi
dan waktu retensi dari hasil pemisahan campuran kloramfenikol
dan lidokain
hidroklorida
F. Analisis Hasil
Hasil optimasi komposisi fase gerak dan flow rate tertentu
menghasilkan
data kromatogram. Data kromatogram yang didapatkan yaitu
kromatogram baku
dan sampel diamati, sehingga dapat diketahui sistem KCKT fase
terbalik yang
memberikan pemisahan kloramfenikol dan lidokain hidroklorida
paling baik yaitu
dengan mengamati bentuk peak, waktu yang dibutuhkan untuk elusi,
menghitung
nilai resolusi dan HETP. Pemisahan yang baik adalah pemisahan
dengan bentuk
peak yang simetri (tidak tailing atau fronting), waktu retensi
(tR) kurang dari 10
menit, memiliki nilai resolusi ≥ 1,5 terhadap peak terdekat dan
nilai HETP yang
semakin kecil.
1. Bentuk peak pemisahan kloramfenikol dan lidokain
hidroklorida
Bentuk peak yang diharapkan adalah simetri. Sebagai parameternya
yaitu
Asymmetry Factor (AF) yang diukur 0,1 dari tinggi peak.
Perhitungan AF melalui
persamaan: AF = b/a. Apabila AF = 1 maka peak dikatakan simetri
dan pada nilai
AF = 0,95-1,15, peak masih dikatakan baik.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN
TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
30
(Willard et al., 1988)
2. Waktu retensi (tR)
Pengamatan waktu dilakukan untuk melihat waktu yang
dibutuhkan
untuk pemisahan senyawa. Apabila kurang dari 10 menit, maka
pemisahan
dikatakan efisien.
3. Nilai resolusi
Nilai resolusi pemisahan peak dihitung terhadap peak terdekat
dengan
rumus sebagai berikut:
Pemisahan yang baik menghasilkan nilai Rs ≥ 1,5.
(Willard et al., 1988)
(8)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN
TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
31
4. Nilai HETP
Nilai HETP dapat dihitung dengan rumus sebagai berikut:
(9)
dimana “N” merupakan bilangan lempeng teoritik dengan persamaan
sebagai
berikut:
Nilai HETP semakin kecil menandakan efisiensi kolom semakin baik
dan
pemisahan juga semakin baik.
(Willard et al., 1988)
5. Reprodusibilitas
Reprodusibilitas resolusi dan waktu retensi diketahui dengan
menghitung
nilai %CV dari nilai resolusi dan waktu retensi hasil pemisahan
kloramfenikol dan
lidokain hidroklorida pada baku campuran dan sediaan tetes
telinga Colme®.
Perhitungan %CV dengan persamaan sebagai berikut:
Reprodusibilitas yang baik apabila harga CV kurang dari 2%
(Mulja dan Hanwar,
2003).
N
LHETPH
(10)
(11)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN
TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
32
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Pemilihan Pelarut
Pemilihan pelarut menjadi sangat penting karena hanya pelarut
yang
sesuailah yang dapat melarutkan analit yang akan dianalisis.
Syarat utama dari
pelarut yang akan dipilih adalah pelarut yang dapat melarutkan
analit.
Berdasarkan Farmakope Indonesia edisi IV, kelarutan
kloramfenikol adalah 1:2,5
dalam etanol dan kelarutan lidokain hidroklorida adalah 1:1,5
dalam etanol.
Namun dalam penelitian ini bukan menggunakan etanol, melainkan
metanol.
Metanol dipilih karena memiliki viskositas yang lebih rendah
daripada etanol
yaitu 0,54 cP, sehingga penggunaan metanol dapat mengurangi
tekanan pada
kolom. Metanol yang digunakan merupakan metanol pro analysis
karena
memiliki kemurnian yang tinggi sehingga hasil pengukuran lebih
akurat. Syarat
pelarut yang baik untuk digunakan pada KCKT adalah murni, inert,
dapat
melarutkan analit dan dapat bercampur dengan fase gerak.
B. Pembuatan Fase Gerak
Metode KCKT yang digunakan adalah KCKT fase terbalik dengan
fase
diam oktadesilsilan (C18) yang bersifat non polar dan fase gerak
yang bersifat
lebih polar yaitu campuran metanol dan aquabides. Sistem yang
digunakan adalah
sistem gradien yaitu pencampuran komposisi fase gerak berada di
dalam alat
KCKT untuk mendapatkan kepolaran fase gerak yang diinginkan
dengan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN
TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
33
mengubah-ubah komposisi fase gerak. Metanol dipilih karena
memiliki solubilitas
yang baik untuk garam, hal ini sangat menguntungkan karena pada
penelitian ini
menggunakan analit dalam bentuk garam yaitu lidokain
hidroklorida. Metanol
juga merupakan pelarut organik yang umum dan sering digunakan
pada sistem
KCKT fase terbalik. Selain itu digunakan aquabides untuk
mendapatkan indeks
polaritas yang sesuai sehingga dengan komposisi yang tepat pada
campuran
metanol dan aquabides akan dihasilkan profil kromatogram yang
diinginkan dan
memenuhi syarat. Menurut Kellner et al. (1998), pada metode KCKT
fase terbalik
sering kali digunakan solven seperti metanol, asetonitril yang
dimodifikasi dengan
air (aquabides). Pemilihan komposisi fase gerak ini juga mengacu
pada Sadana
dan Ghogare (1990) yang pernah memisahkan kloramfenikol dan
benzokain
dengan campuran metanol dan aquabides dengan perbandingan
35:65.
Komposisi fase gerak yang digunakan pada penelitian ini
adalah
metanol:aquabides dengan perbandingan 75:25 ; 85:15; dan 95:5.
Menurut Synder
et al. (1997), dengan meningkatnya jumlah metanol pada KCKT fase
terbalik
maka analit akan terelusi lebih mudah, sehingga perbandingan
kompisisi fase
gerak ini dipilih dengan meningkatkan jumlah metanol secara
bertahap. Fase
gerak yang telah dibuat terlebih dahulu disaring dengan
penyaring Whatman
untuk menyaring partikel yang dapat menyumbat kolom. Selanjutnya
fase gerak
diawaudarakan dengan menggunakan ultrasonicator untuk
menghilangkan
gelembung udara yang dapat mengganggu pengukuran kloramfenikol
dan lidokain
hidroklorida.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN
TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
34
Tabel III. Indeks polaritas campuran fase gerak
metanol:aquabides
No Komposisi Fase Gerak
Indeks Polaritas Metanol Aquabides
1 75 25 6,375
2 85 15 5,865
3 95 5 5,355
Semakin kecil nilai indeks polaritas berarti semakin non polar
fase gerak
tersebut sehingga urutan kepolaran dari yang polar ke non polar
adalah 75:25,
85:15, dan 95:5. Menurut Mulja dan Suharman (1995), dalam sistem
KCKT fase
terbalik, kemampuan elusi akan semakin meningkat dengan
menurunkan indeks
polaritas fase gerak. Komposisi fase gerak tersebut diubah-ubah
agar hasil
pemisahan kloramfenikol dan lidokain hidroklorida memenuhi
parameter yang
diinginkan yaitu peak yang runcing dan simetri, memenuhi nilai
resolusi, dan
HETP yang semakin kecil.
C. Pembuatan Larutan Baku
Baku kloramfenikol dan lidokain hidroklorida didapatkan dari
PT.
Interbat dan memiliki Certificate of Analysis (CoA) sehingga
terjamin
kemurniannya. Larutan baku ini dibuat dengan menggunakan pelarut
metanol pro
analysis dengan kemurnian 99,85%. Tujuan pembuatan larutan baku
yaitu sebagai
pembanding atau reference standard yang dapat digunakan untuk
memastikan di
dalam sampel benar-benar terdapat analit yang dimaksud.
Dalam optimasi ini dibuat dua larutan baku masing-masing
untuk
kloramfenikol dan lidokain hidroklorida dengan tiga volume
injeksi yang berbeda.
Volume injeksi tersebut dibuat rendah, sedang, dan tinggi yaitu
12; 16; dan 20µL
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN
TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
35
dengan mengambil dari konsentrasi stok kloramfenikol 100 ppm dan
stok lidokain
hidroklorida 1000 ppm. Selain itu dibuat pula baku campuran
untuk
kloramfenikol dan lidokain hidroklorida yang juga dibuat dalam
tiga volume
injeksi yang berbeda dengan konsentrasi masing-masing 100:1000
ppm.
Pada optimasi ini digunakan perbandingan kloramfenikol dan
lidokain
hidroklorida 1:10, perbandingan ini dipilih karena kedua senyawa
tersebut dapat
dilihat pada respon yang sama yaitu 500mV. Kandungan
kloramfenikol dan
lidokain hidroklorida yang tertera pada sediaan tetes telinga
Colme® masing-
masing adalah 10% dan 4% sehingga perbandingannya adalah 10:4
atau 5:2.
Namun, pada penelitian ini tidak digunakan perbandingan tersebut
karena lidokain
hidroklorida dalam metanol memiliki spektrum absorbsi pada sinar
ultraviolet
( ) yang kecil yaitu 14,2 sedangkan kloramfenikol dalam metanol
memiliki
spektrum absorbsi pada sinar ultraviolet ( ) yang jauh lebih
besar yaitu 297
(Dibbern et al., 2002), sehingga dengan perbandingan 5:2
kloramfenikol memiliki
respon yang sangat besar sedangkan lidokain memiliki respon yang
sangat kecil
dan keduanya terpaut jauh maka keduanya sulit dilihat pada
respon yang sama.
Alasan tersebut yang mendasari digunakan perbandingan 1:10
karena dengan
perbandingan tersebut kedua senyawa tersebut dapat dilihat di
respon yang sama.
Volume injeksi 16 µL sebagai volume tengah yang akan digunakan
pada
pengamatan kromatogram dengan komposisi fase gerak 75:25; 85:15;
dan 95:5
dan flow rate 0,8; 1,0; dan 1,2 mL/menit. Sedangkan volume
injeksi 12; 16; dan
20 µL akan digunakan pada uji reprodusibilitas baku campuran
kloramfenikol dan
lidokain hidroklorida dengan komposisi fase gerak yang telah
optimum.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN
TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
36
D. Penentuan Panjang Gelombang Pengamatan Kloramfenikol dan
Lidokain Hidroklorida dengan Spektrofotometer UV-Vis
Penentuan panjang gelombang pengamatan dilakukan dengan
mengukur
panjang gelombang masing-masing senyawa terlebih dahulu.
Penentuan panjang
gelombang ini dilakukan dengan menggunakan spektrofotometer
ultraviolet-
visibel. Secara teoritis kloramfenikol dan lidokain hidroklorida
berada pada
rentang 200-400 nm, oleh karena itu dilakukan pengamatan panjang
gelombang
pada daerah tersebut. Penentuan panjang gelombang pengamatan ini
dilakukan
dengan mengukur absorbansi kedua senyawa dengan konsentrasi
rendah, sedang
dan tinggi yaitu 13; 19,5; dan 26 ppm untuk kloramfenikol dan
300; 450; dan 600
ppm untuk lidokain hidroklorida. Penggunaan tiga seri
konsentrasi ini bertujuan
untuk meyakinkan bahwa panjang gelombang pengamatan yang
didapatkan
benar-benar berasal dari kloramfenikol dan lidokain
hidroklorida. Selain itu, untuk
memastikan bahwa panjang gelombang pengamatan dan bentuk pola
spektra yang
didapatkan sama.
Kloramfenikol dan lidokain hidroklorida memiliki gugus kromofor
dan
auksokrom sehingga dapat memberikan serapan pada panjang
gelombang
ultraviolet. Gugus kromofor bertanggung jawab dalam penyerapan
cahaya
ultraviolet dan gugus auksokrom adalah gugus yang melekat pada
kromofor yang
berperan dalam pergeseran panjang gelombang dan intensitas
serapan maksimum
kloramfenikol dan lidokain hidroklorida.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN
TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
37
Gambar 12. Gugus kromofor dan auksokrom pada kloramfenikol
Gambar 13. Gugus kromofor dan auksokrom pada lidokain
hidroklorida
Kurva serapan kloramfenikol dan lidokain hidroklorida dapat
dilihat pada
gambar dibawah ini:
Gambar 14. Spektra panjang gelombang maksimum kloramfenikol 13
ppm (A)
dan lidokain hidroklorida 300 ppm (B)
A
B
. H2O
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN
TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
38
Gambar 15. Spektra panjang gelombang maksimum kloramfenikol 19,5
ppm (A)
dan lidokain hidroklorida 450 ppm (B)
Gambar 16. Spektra panjang gelombang maksimum kloramfenikol 26
ppm (A)
dan lidokain hidroklorida 600 ppm (B)
Dari hasil spektra menunjukkan bahwa pada konsentrasi rendah,
sedang
dan tinggi, panjang gelombang maksimum kloramfenikol adalah 270
nm dan
lidokain hidroklorida adalah 265 nm dan dihasilkan bentuk pola
spektra yang
sama. Menurut Dibbern et al. (2002) panjang gelombang maksimal
kloramfenikol
dalam metanol adalah 272 nm. Pergeseran panjang gelombang yang
diijinkan
A
A
B
B
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN
TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
39
adalah 2 nm (Dirjen POM RI, 1995). Oleh karena itu panjang
gelombang
kloramfenikol ini dapat diterima karena bergeser 2 nm dari
panjang gelombang
teoritis. Berdasarkan Dibbern et al. (2002) panjang gelombang
maksimal lidokain
hidroklorida dalam metanol adalah 263 nm, sehingga panjang
gelombang ini juga
dapat diterima karena bergeser 2 nm dari panjang gelombang
teoritis.
Berdasarkan pengamatan panjang gelombang maksimum yang ada
dapat
diketahui panjang gelombang overlapping kedua senyawa. Titik
potong panjang
gelombang kedua senyawa yang didapat adalah 267 nm.
Lidokain hidroklorida dalam metanol memiliki spektrum absorbsi
pada
sinar ultraviolet ( ) yang kecil yaitu 14,2 sedangkan
kloramfenikol dalam
metanol memiliki spektrum absorbsi pada sinar ultraviolet ( )
yang jauh lebih
besar yaitu 297 (Dibbern et al., 2002). Sehingga, nilai lidokain
hidroklorida
yang kecil ini yang membuat lidokain hidroklorida lebih sukar
terdeteksi daripada
kloramfenikol. Pada maks lidokain hidroklorida, serapan
kloramfenikol masih
cukup tinggi, sedangkan serapan lidokain hidroklorida menjadi
rendah pada
maks kloramfenikol. Hal ini yang mendasari pemilihan panjang
gelombang
pengamatan yang digunakan dalam pemisahan kloramfenikol dan
lidokain
hidroklorida adalah 265 nm yang merupakan panjang gelombang
lidokain
hidroklorida, hal ini bertujuan agar kedua senyawa tersebut
dapat memberikan
serapan optimum.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN
TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
40
E. Optimasi Kloramfenikol dan Lidokain Hidroklorida dengan
Metode
KCKT Fase Terbalik
Optimasi dengan metode KCKT fase terbalik dilakukan dengan
mengubah-ubah komposisi fase gerak dan flow rate untuk
didapatkan pemisahan
yang baik antara kloramfenikol dan lidokain hidroklorida.
Komposisi fase gerak
yang digunakan yaitu 75:25; 85;15; dan 95:5 dengan flow rate
0,8; 1,0; dan 1,2
mL/menit.
Berikut merupakan waktu retensi yang diperoleh dari
kloramfenikol,
lidokain hidroklorida, dan baku campuran kloramfenikol dan
lidokain
hidroklorida pada masing-masing komposisi fase gerak dan flow
rate yang
berbeda.
Tabel IV. Waktu retensi baku kloramfenikol, baku lidokain
hidroklorida dan baku
campuran kloramfenikol dan lidokain hidroklorida
Komposisi fase gerak Analit
Waktu Retensi (tR)
(menit)
Metanol Aquabides
0,8
(mL/min)
1,0
(mL/min)
1,2
(mL/min)
75 25
Kloramfenikol 3,703 2,919 2,475
Lidokain
Hidroklorida 8,409 6,868 5,653
85 15
Kloramfenikol 3,387 2,534 2,303
Lidokain
Hidroklorida 5,463 4,052 3,690
95 5
Kloramfenikol 3,173 2,527 2,158
Lidokain
Hidroklorida 4,096 3,308 2,956
Baku Campuran
(Kloramfenikol)
-
2,532 2,141
Baku Campuran
(Lidokain
Hidroklorida)
3,306 2,805
Dari masing-masing komposisi fase gerak tersebut menunjukkan
bahwa
dengan semakin meningkatnya metanol maka waktu retensi menjadi
semakin
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN
TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
41
pendek atau singkat dan semakin meningkatnya flow rate pada
masing-masing
komposisi fase gerak juga menunjukkan waktu retensi yang semakin
pendek.
Struktur kloramfenikol dan lidokain hidroklorida memiliki gugus
polar
dan non polar yang dapat berinteraksi dengan fase diam
(oktadesilsilan) dan fase
gerak (campuran metanol dan aquabides). Gugus non polar akan
berinteraksi
dengan fase diam melalui ikatan Van Der Waals sedangkan gugus
polar akan
berinteraksi dengan fase gerak melalui interaksi hidrogen.
Berikut interaksi
kloramfenikol dan lidokain hidroklorida dengan fase gerak dan
fase diam:
Si
CH3
H3C
O
H3C
Interaksi Van Der Waals
Oktadesilsilan (C18)
N
H OH
H
H2C O H
NH
C
O
CHCl2O
o
Gambar 17. Interaksi kloramfenikol dengan fase diam C18
(oktadesilsilan) melalui
interaksi Van Der Waals
Si
CH3
H3C
O
H3C
CH3
HN
CH3
C
O
H2C NH
C2H5
C2H5
Cl
Interaksi Van Der Waals
Oktadesilsilan (C18)
Interaksi ion-dipol
Gambar 18. Interaksi lidokain hidroklorida dengan fase diam C18
(oktadesilsilan)
melalui interaksi Van Der Waals dan interaksi ion-dipol
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN
TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
42
Gambar 19. Interaksi hidrogen antara kloramfenikol dengan fase
gerak
metanol:aquabides
CH3
N
CH3
C
O
H2C NH
C2H5
C2H5H
O
H
H
H
OCH3H
O
H OCH3
H
Cl
Gambar 20. Interaksi hidrogen antara lidokain hidroklorida
dengan fase gerak
metanol:aquabides
Gambar di atas menunjukkan bahwa interaksi kloramfenikol dengan
fase
diam lebih sedikit dibandingkan interaksi lidokain hidroklorida
dengan fase diam
oktadesilsilan. Oleh karena itu, kekuatan ikatan kloramfenikol
pada fase diam
lebih lemah sehingga waktu retensinya lebih pendek atau lebih
cepat
dibandingkan lidokain hidroklorida. Dengan adanya fase gerak
yaitu campuran
metanol dan aquabides akan berfungsi untuk membawa analit untuk
keluar dari
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN
TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
43
kolom. Semakin banyak jumlah interaksi hidrogen antara solut
dengan fase gerak
maka solut akan lebih mudah dibawa oleh fase gerak melewati
kolom (terelusi)
sehingga waktu retensinya akan semakin singkat dan
sebaliknya.
Pada komposisi metanol:aquabides 75:25 menunjukkan waktu
retensi
yang paling lama baik untuk kloramfenikol maupun lidokain
hidroklorida. Hal ini
dikarenakan jumlah metanol yang ada pada komposisi fase gerak
tersebut lebih
sedikit sehingga kemampuan untuk membawa analit lebih rendah
dibandingkan
komposisi metanol:aquabides 85:15 dan 95:5. Oleh karena itu,
interaksi
kloramfenikol dan lidokain hidroklorida dengan fase diam lebih
kuat sehingga
akan lebih tertahan pada fase diam maka waktu retensi menjadi
lebih lama.
Berbeda halnya pada komposisi metanol:aquabides 85:15 yang
memiliki jumlah
metanol yang lebih banyak sehingga waktu