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5. EFECTOS DEL SO2 Y DEL O3 SOBRE LA CONCENTRACIN
FOLIAR DE PIGMENTOS FOTOSINTTICOS
5.1. INTRODUCCIN
La cuantificacin de los pigmentos fotosintticos es un mtodo que
se ha
empleado tradicionalmente como complemento a las valoraciones de
los daos
visibles en bosques afectados por contaminantes atmosfricos en
interaccin con
otros tipos de estrs (Tausz et al., 1996). Comenz a emplearse a
raz de los
fenmenos de declive registrados en los bosques de Europa y
Norteamrica desde los
aos 1980 que incluan, como sntoma ms aparente, la decoloracin de
las acculas
de las conferas, particularmente en las acculas ms viejas
(Kstner et al., 1990;
Siefermann-Harms, 1992; Tausz et al., 1996). La alteracin en la
composicin de
pigmentos se ha relacionado as clsicamente con los contaminantes
atmosfricos
(Wolfenden et al., 1988) constituyendo una herramienta
ampliamente extendida para
la cuantificacin de la decoloracin y la valoracin del dao
producido por los
contaminantes (Darrall y Jgger, 1984;Pandey y Agrawal, 1994)
No obstante, las alteraciones en la composicin de los pigmentos
del aparato
fotosinttico no son especficas del impacto de un determinado
tipo de estrs por lo
que su valor de diagnstico es limitado si no se acompaa de otras
determinaciones
fisiolgicas (Bermandinger et al., 1990; Tausz et al., 1996).
En los tejidos fotosintticamente activos de las plantas
superiores se
encuentran, entre otros, los pigmentos clorofila a, clorofilab y
carotenoides. Los
pigmentos estn asociados a protenas especficas formando sistemas
ligados a las
estructuras de membrana de los cloroplastos. El pigmento
mayoritario es la clorofilaa. La clorofilab y los carotenoides
funcionan como pigmentos accesorios en la
captacin y la absorcin de luz, aunque parece que el papel
fundamental de estos
ltimos sera actuar como pigmentos fotoprotectores. Molculas
especializadas de
clorofilaa son el nico pigmento con capacidad de transduccin de
la energa
luminosa en energa fotoqumica en los centros de reaccin del
fotosistema II (el
P680) y el fotosistema I (el P700) en los organismos oxignicos.
Adems de la clorofila
a/protena, en el centro de reaccin existe -caroteno, cuya misin
parece ser la
proteccin de la clorofilaa de la fotooxidacin (Lichtenthaler,
1987) y feofitinas.Los centros de reaccin tienen estrechamente
asociados a su vez complejos
pigmento-protena que contienen clorofila a, clorofila by
xantofilas (light harvesting
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complex, LHC) que funcionan como antenas recolectoras de la
energa luminosa
procedente del sol. Los LHC contienen principalmente clorofila
b, clorofilaa (en
menor proporcin que la b) y xantofilas. Las xantofilas son
carotenoides cuya
funcin es triple: por una parte, atrapan la energa luminosa en
bandas no accesibles
a la clorofila en el rango del visible (Sieferman-Harms, 1985,
1987). Por otra, poseenuna funcin de fotoproteccin de los sistemas
pigmento-protena mediante la
extincin (quenching) del estado de triplete de las molculas de
clorofila y la
eliminacin de especies de oxgeno txicas, radicales libres que se
generan en los
cloroplastos como consecuencia de las reacciones primarias de la
fotosntesis
(Cogdell, 1988; Koyama, 1991). Ms recientemente se ha propuesto
un papel de las
xantofilas en la disipacin del exceso de energa que no se
canaliza a travs de
procesos fotoqumicos u otros procesos. Esa capacidad
fotoprotectora parece estar
relacionada con la interconversin cclica de las xantofilas
violaxantina,
antheraxantina y zeaxantina en lo que se ha dado en denominar
ciclo VAZ (Demmig-
Adams, 1990; Demmig-Adams y Adams, 1992b). En el ciclo VAZ o
ciclo de la
xantofila la zeaxantina (forma libre de grupos epoxi) se forma
en condiciones de
exceso de luz a travs de la des-epoxidacin de la violaxantina
(con dos grupos
epoxi) va anteraxantina (con un grupo epoxi). El exceso de luz
se alcanza no
solamente debido a un incremento de la irradiacin incidente,
sino tambin cuando
ante una determinada irradiacin constante las plantas se exponen
a otros factores de
estrs que reducen sus tasas fotosintticas y por tanto su
capacidad de utilizar la luz
solar absorbida (Demmig-Adams, 1990).
Adems de los carotenoides, en el cloroplasto existen otros
sistemas de
eliminacin de los radicales libres que se forman comnmente en
las clulas. Los
radicales libres son molculas con electrones desapareados muy
agresivas, que
reaccionan con los cidos grasos insaturados de membrana y con
las protenas y
pueden conducir a la destruccin de sistemas de membrana
celulares. As, pueden
causar dao a membranas y molculas asociadas, entre ellas los
pigmentos
fotosintticos. Los radicales libres se forman comnmente en el
metabolismo de lasclulas, por ejemplo en la cadena de transporte
electrnico de los organismos que
poseen sistemas fotosintticos que utilizan el O2y el H2O como
aceptor y donador de
electrones, respectivamente. En condiciones normales los
radicales libres son
eliminados por el sistema antioxidante de la clula, formado por
enzimas como la
superxido dismutasa, la peroxidasa, la catalasa y otras
sustancias como el ascorbato,
el glutatin y los carotenoides.
Se ha demostrado que los contaminantes atmosfricos, entre ellos
el SO2y elO3, estimulan la formacin de radicales libres en las
clulas (Asada, 1980; Elstner,
1987). Ambos contaminantes tienen en comn un mismo mecanismo de
accin: la
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destoxificacion del SO2 en las clulas, con formacin de sulfatos,
incluye su
oxidacin a travs de mecanismos enzimticos (a travs de la sulfito
oxidasa) o bien
a travs de mecanismos que incluyen la formacin de radicales
libres (Jger, 1982).
La molcula de O3es en s una molcula altamente reactiva que puede
reaccionar
con cidos insaturados de las membranas y otras molculas, pero
adems suhidratacin forma radicales libres (Tingey y Taylor, 1982;
Elstner, 1987).
Numerosos autores han observado una alteracin de los
sistemas
antioxidantes de las clulas en plantas por efecto de los
contaminantes atmosfricos.
En conferas se han descrito cambios en esas sustancias por
efecto del SO2y del O3
en concentraciones realistas (Bermandinger et al., 1990; De Kok,
1990; Smith et al.,
1990; Lucas et al., 1993; Winsgle y Hallgren, 1993; Pandey y
Agrawal, 1994; Tausz
et al., 1996; Elvira et al., 1998). Ahora bien, cuando la
acumulacin de radicales
libres excede la capacidad destoxificadora de la planta, puede
existir un dao
fotooxidativo en los sistemas pigmento-protena y peroxidacin de
lpidos de
membrana, entre otros tipos de dao (Asada y Takahashi, 1987;
Beauregard, 1991;
Elstner y Owald, 1991). Sin embargo, en experimentos in vivoe in
vitro, se ha
observado que son necesarias unas concentraciones de
contaminante elevadas
(tpicamente del orden de 1000 ppb, que no ocurren en condiciones
naturales en la
troposfera) para encontrar efectos directos de destruccin de
pigmentos, tanto en el
caso del SO2(Grunwald, 1981; Sandman y Gonzales, 1989; Hegazy y
El Hamid,
1998) como en el del O3(Senser et al., 1987).
Teniendo en cuenta esta premisa y la metodologa experimental
utilizada en
nuestra experimentacin no son esperables efectos directos de dao
fotooxidativo en
el caso del SO2ni del O3, debido a las bajas concentraciones
empleadas. De hecho,
los efectos que una gran mayora de autores ha observado en el
contenido de
pigmentos en conferas en experimentaciones controladas y en
condiciones naturales
con concentraciones realistas de contaminantes, han sido
interpretados generalmente
desde el punto de vista de efectos indirectos. Los efectos de
los contaminantes sobrelos pigmentos pueden estar mediados por
deficiencias nutricionales o por la
induccin de la senescencia acelerada, consecuencia de la
inhibicin o disminucin
de actividades enzimticas.
As, se han encontrado efectos del SO2a travs de deficiencias
nutricionales,
fundamentalmente en Mg (Lange et al., 1989; Oren y Schultze,
1989; Weikert et al.,
1989; Kstner et al., 1990) y en N (Wedler et al., 1995). El
hecho de encontrar
efectos del SO2 y del O3 solamente en las hojas ms maduras, con
ausencia deefectos e incluso estimulacin de los pigmentos en las
hojas ms jvenes
(Bermandinger et al., 1990; Senser et al., 1990;
Siefermann-Harms, 1990; Ballach et
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al., 1992a; Wallin et al., 1992; Lucas et al., 1993; Elvira et
al., 1998) se ha
interpretado por algunos autores como una manifestacin de la
aceleracin de la
senescencia inducida por los contaminantes (Ballach et al.,
1992a; Lucas et al.,
1993).
Otros autores no han observado en conferas efectos destacables
del SO2
(Wolfenden et al., 1991; Pfanz y Beyschlag, 1993; Wingsle y
Hllgren, 1993; Polle
et al., 1994; Tausz et al., 1996; Mller et al., 1997) ni del
O3(Alscher et al., 1989;
Bermandinger et al., 1990; Bytnerowicz et al., 1990;
Siefermann-Harms, 1990;
Thornton et al., 1990; Fincher y Alscher, 1992; Wedler et al.,
1995; Mller et al.,
1997). En algunas ocasiones se ha sugerido que la ausencia de
efectos puede deberse
a que los productos dainos no llegan al cloroplasto, o bien son
destoxificados antes
de que se pongan en contacto con los pigmentos (Wolfenden et
al., 1991).
No solamente el contenido de pigmentos en trminos absolutos
puede verse
afectado por los contaminantes, sino tambin sus proporciones
relativas. Por ejemplo,
una disminucin preferente de la clorofila a respecto a la
clorofila b (con la
consiguiente disminucin de la relacina/b)puede ser indicativo de
acculas daadas
por fotooxidacin, y se ha encontrado disminucin del cociente por
efecto del SO2y del
O3 (Van Hove et al., 1992; Lucas et al., 1993; Takemoto et al.,
1997). Otros autores, sin
embargo, no han encontrado efectos (Grunwald, 1981; Bermandinger
et al., 1990;
Siefermann-Harms, 1990; Wallin et al., 1992). Por otra parte,
dada la funcin
protectora del -caroteno sobre la clorofila, una destruccin
preferente de ste (con
disminucin de la relacin -caroteno/clorofila) indicara una
fotooxidacin directa de
los pigmentos (Senser et al., 1990). Se han propuesto tambin
otros ndices de dao,
como el ndice de feofitinizacin (A435/415); cuando la relacin de
absorbancias a esas
longitudes de onda disminuye, implica que ha habido un proceso
de degradacin de
clorofila a feofitinas. El ndice de absorbanciasA430/665nm tiene
un significado similar.
La clorofilaa absorbe la radiacin luminosa especialmente
alrededor de dos mximos o
picos situados a 430 y 665 nm de longitud de onda. Los
carotenoides y los productos dedegradacin de las clorofilas tienen
una relacin de absorbancias aA430/665mayor que la
de la clorofila a. Por tanto, el ndice A430/665 estima la
proporcin de los pigmentos
totales con respecto a la clorofila a. Por otra parte, a medida
que distintos factores del
entorno limitan las posibilidades de crecimiento, la proporcin
de pigmentos diferentes
a la clorofilaa aumenta relativamente (aumentando el ndice), por
lo que dicho cociente
ha sido sugerido por Margalef (1986) como indicador de la
productividad de los
ecosistemas.
Los factores que en el clima mediterrneo causan disminucin de la
actividad
fotosinttica, como en verano el exceso de luz, las altas
temperaturas y la sequa,
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pueden estimular asimismo la produccin de especies reactivas de
oxgeno (Faria et
al., 1996), incrementar por tanto el dao fotooxidativo potencial
a los pigmentos e
interactuar con los contaminantes atmosfricos en la produccin de
daos.
Los objetivos del captulo que se presenta a continuacin son:
evaluar losefectos del SO2, del O3y de la mezcla de SO2+O3 en la
concentracin de pigmentos
fotosintticos y sus proporciones relativas; sugerir los posibles
mecanismos de accin
implicados en esos efectos; evaluar las variaciones estacionales
de los pigmentos y las
posibles interacciones con los efectos de los contaminantes;
establecer los efectos de la
cmara, que se producen por aclimatacin de las plantas a
distintos regmenes de luz
entre otros factores.
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5.2. MATERIAL Y MTODOS
La concentracin foliar de clorofila a, clorofila b y
carotenoides totales se
midi en una muestra de dos acculas de cada clase de edad,
plenamente
desarrolladas, extradas de 6 individuos tomados al azar en cada
cmara y parcela
ambiente (un total de 18 individuos por tratamiento). Se
realizaron 8 muestreos de la
concentracin foliar de pigmentos a lo largo de la
experimentacin, coincidiendo con
cada estacin del ao. En el momento de la recoleccin de las
acculas, se
desecharon en todos lo tratamientos aqullas con sntomas visibles
de dao. Una vez
recolectadas, las acculas se conservaron inmediatamente en nieve
carbnica y a
continuacin se almacenaron a -80 C hasta su procesamiento. La
duracin del
perodo de almacenamiento fue inferior a 6 meses.
Se seccion la base y el pice de las acculas, emplendose
solamente
fragmentos centrales para el anlisis. Una vez pesados en fresco,
los pigmentos se
extrajeron mediante homogeneizacin con un equipo PotterS Braun
utilizando una
solucin acuosa de acetona al 80 % (V/V) hasta obtener los
fragmentos de acculas
de color blanco. Los extractos, de volumen conocido, se
clarificaron mediante
centrifugacin, midindose su absorbancia a las longitudes de onda
que se indican a
continuacin con un espectrofotmetro Shimadzu UV240. El proceso
se realiz a
4C y en oscuridad. El clculo del contenido en clorofilas y los
carotenoides se bas
en las ecuaciones de Lichtenthaler (1987):
Ca= 12.25 A663.2- 2.79 A646.8
Cb= 21.50 A646.8 - 5.10 A663.2
Cx+c= (1000 A470- 1.82 Ca-85.02 Cb) / 198
siendo:Ca= clorofila a(mg/l)
Cb= clorofila b(mg/l)
Cx+c= carotenoides (mg/l)
An= absorbancia a la longitud de onda n
Conocido el volumen del extracto acetnico y el peso fresco de la
muestra
foliar de la que proceda, se obtuvo la cantidad de pigmento por
unidad de masa
foliar en mgg-1
peso fresco. Se midi tambin la relacin entre el peso fresco y el
pesoseco de las acculas y su rea especfica (ver captulo 8.2),
calculndose la
concentracin foliar de pigmentos sobre la base del rea foliar
(en mgm-2) y del peso
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seco (en mgg-1peso seco). Se analizaron estadsticamente las
concentraciones de
pigmentos expresadas en las tres unidades, peso fresco, rea
foliar y peso seco,
obtenindose resultados similares. Los resultados que se
presentan a continuacin
estn calculados sobre la base del rea foliar.
Para cada muestra se calcularon tambin las relaciones clorofila
a/b,
clorofila/carotenoides y la relacin de absorbancias A430/665.
Los resultados de los 6
individuos de cada cmara o parcela ambiente se promediaron con
lo que al existir
tres cmaras por tratamiento, el tamao de muestra fue n=3. El
tratamiento
estadstico consisti en un anlisis de la varianza de dos factores
(SO 2 y O3) con
interaccin para determinar el efecto del SO2y del O3y su posible
interaccin. En el
caso de observarse una interaccin significativa entre ambos
factores, se procedi a
un anlisis de la mnima diferencia significativa (LSD) calculada
para el nivel del 5
%, con objeto de determinar las diferencias significativas entre
los tratamientos.
Cuando se compararon solamente dos muestras independientes (por
ejemplo el SO2
con el AF, el AA con el ANF, o dos clases de edad diferentes),
se emple el test de la
t-Student. En los casos en que se estudi el comportamiento de
las mismas unidades
experimentales a lo largo del tiempo, se realiz un test ANOVA
con medidas
repetidas, con la finalidad de valorar posibles tendencias de
variacin. En los
resultados que se presentan a continuacin se sealan las
diferencias significativas
para p
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5.3. RESULTADOS
Variaciones estacionalesLa concentracin media de pigmentos en el
tratamiento de control se presenta
en la tabla 5.1 expresada en diversas unidades. Las variaciones
de la concentracin
de pigmentos en el mismo tratamiento a lo largo del experimento
se muestran en la
figura 5.1. La concentracin de pigmentos mostr variaciones en
funcin de la poca
de muestreo en todos los parmetros estudiados.
Tabla 5.1. Concentracin media de pigmentos a lo largo del
experimento en el tratamiento de control(aire filtrado, AF). Cada
parmetro medido se ha expresado en diversas unidades. En las
grficas quesiguen se han expresado en mgm-2.
EdadPigmento Unidades
1995 1996 1997
mgm-2 704 409 218
mggps-1 2.68 1.98 1.15
Clorofilaa + b
mggpf-1
1.37 0.87 0.51
mgm-2 544 326 177
mggps-1 2.05 1.57 0.93lorof
ila amggpf
-1 1.06 0.69 0.42
mgm-2 159 83 40
mggps-1 0.62 0.41 0.22lorof
ila bmggpf
-1 0.31 0.18 0.01
Mgm-2 219 131 78
mggps-1 0.83 0.64 0.42
arote
noides mggpf
-1 0.43 0.28 0.19
En las acculas de 1996 se observaron mximas concentraciones de
clorofilaa,b,clorofilaa+b y carotenoides totales en otoo-invierno y
mnimas concentraciones enverano (figura 5.1). Las acculas de 1997
mostraron el mismo patrn de
comportamiento entre verano y otoo, con los mnimos valores
registrados enverano. En las acculas ms maduras (de 1995) la
concentracin de pigmentostambin mostr una disminucin en verano de
1996, pero a partir de ese muestreo los
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valores no experimentaron aumento, como en las otras clases de
edad, sino quesufrieron una disminucin durante el resto del
experimento, probablemente comoconsecuencia de un proceso de
senescencia.
Tambin se presenta la evolucin de las relaciones entre pigmentos
(clorofila
a/b, clorofila/carotenoides), la relacin de absorbancias
A430/665y la proporcin declorofila con respecto a la concentracin
de nitrgeno foliar (figura 5.2). En esta
ltima relacin solamente se representan los promedios, debido a
que la
concentracin de N y la de pigmentos se analizaron en muestras
vegetales distintas
(ver en el captulo 5.2 una descripcin detallada del protocolo
seguido). En las
acculas de 1995 la proporcin clorofila a/clorofilab fue mnima en
verano, mientras
que en las acculas de 1996 permaneci aproximadamente constante a
lo largo del
experimento con una disminucin en verano de 1997. En las acculas
de 1997 la
relacin permaneci constante. La proporcin clorofila/carotenoides
se mantuvoconstante en las acculas de 1996, reflejando que las
variaciones en la clorofila
fueron similares a los cambios en los carotenoides. Sin embargo
en las acculas de
1995 la relacin fue superior en verano que en el resto de los
muestreos, indicando
una disminucin ms acentuada de los carotenoides que de la
clorofila en esa poca.
La relacin de absorbancias A430/665, que expresa la cantidad de
pigmentos totales
respecto a la clorofila a, se mantuvo constante en las acculas
de 1995 a lo largo de
1996, aumentando en el ao siguiente. En las acculas de 1996,
tras una disminucin
en otoo de 1996, la proporcin A430/665 aument durante el ao
siguiente. En lasacculas de 1997 la relacin disminuy entre verano y
otoo. La proporcin de
clorofila con respecto a la concentracin foliar de N mostr
valores mnimos en
verano en las tres clases de edad.
La importancia de las variaciones en funcin de la fecha de
muestreo est
reflejada en la elevada significacin estadstica del factor
muestreo en los
resultados de los ANOVA (tabla 5.2 y siguientes).
La concentracin foliar de pigmentos fue significativamente
superior en las
acculas ms maduras respecto a las ms jvenes (p
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Tabla 5.2. Resultados del anlisis de la varianza con medidas
repetidas a lo largo de los sucesivosmuestreos (ANOVA-RM) del
efecto de la edad de las acculas sobre la concentracin foliar
de
pigmentos para el tratamiento de control (aire filtrado). El
anlisis se ha realizado sobre las acculas de1995 y 1996. Se indican
las probabilidades p. Las probabilidades menores de 0.05 se han
sealado con
negrita, las p
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1995SO2MuestreoSO2 x muestreo
0.6760.0000.927
0.6830.0000.916
0.6580.0000.954
0.2990.0000.976
0.4920.0020.850
(0.083)0.0000.023
0.2620.0000.851
1996SO2Muestreo
SO2 x muestreo
0.2030.000
0.490
0.1820.000
0.483
0.2800.001
0.508
0.1830.000
0.692
0.2580.000
0.459
0.9790.000
0.012
0.5900.000
0.275
1997SO2MuestreoSO2 x muestreo
0.7430.0340.965
0.6290.0300.851
0.833(0.093)0.559
0.531(0.084)0.773
0.6250.2390.302
0.7580.0280.324
0.7000.0160.784
En las acculas ms jvenes (de 1997) la tendencia fue similar a la
observada
en las acculas de 1996, con un aumento en julio de 1997 del 23 %
de la
concentracin de clorofilab en el tratamiento de SO2respecto al
AF (p
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acculas. Los resultados del ANOVA con medidas repetidas (RM) a
lo largo de los
muestreos se presentan en la tabla 5.4.
El efecto del O3fue, como en el caso del SO2, de distinta ndole
en funcin de
la edad de las acculas. En las acculas de 1995 se registr un
aumento de laconcentracin de clorofilaa, b y a+b debido al O3 en un
18, 23 19 %
respectivamente en mayo de 1997 (p
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1996
SO2O3SO2 x O3MuestreoSO2 x muestreoO3x muestreo
SO2 x O3x muestreo
0.5510.1590.8440.0000.7100.443
0.760
0.5760.1440.8310.0000.6770.469
0.774
0.4870.2270.8870.0000.7820.365
0.727
0.4420.1540.7640.0000.7400.547
0.889
0.4360.7610.9980.0000.4470.152
0.918
0.7610.3240.5480.0000.7250.138
0.007
0.8130.3480.3880.0000.6580.596
(0.066)
1997
SO2O3SO2 x O3MuestreoSO2 x muestreoO3x muestreoSO2 x O3x
muestreo
--
0.0280.0010.9220.7220.983
--
(0.050)0.0010.8960.7310.838
--
0.0130.0060.9640.7170.366
--
(0.058)0.0040.9930.8040.612
0.5490.1630.2410.0420.7380.7770.063
0.4730.8690.3230.0310.5590.6600.141
0.1880.6630.2970.0120.6470.9850.497
La relacin clorofilaa/b no indic un efecto preferente del O3
sobre uno u
otro tipo de clorofila, excepto en las acculas de 1997 en
octubre del mismo ao
(figura 5.4a), sealando en consonancia con lo que se ha descrito
anteriormente una
disminucin ms acusada de la clorofilab que de la clorofilaapor
efecto del O3. Por
otra parte, las diferencias significativas encontradas en el
ndice
clorofila/carotenoides sealan que las alteraciones producidas
por el O3 en la
clorofila fueron ms importantes que las generadas en los
carotenoides (figura 5.4b).
El O3solamente afect a la relacin de absorbanciasA430/665en las
acculas de 1995
en mayo de 1997, en que produjo una disminucin de esa relacin.
En el resto de los
muestreos y clases de edad no se observaron diferencias
significativas debidas al
contaminante (figura 5.4c).
Los efectos de la mezcla de SO2+O3no reflejaron interacciones
entre los
contaminantes en las acculas de 1995 y 1996: en marzo de 1997
los efectos de la
mezcla fueron similares a los del SO2, con una disminucin de la
concentracin de
pigmentos respecto al control. En las acculas de 1996 los
efectos del SO2+O3fueron
semejantes a los del O3con una tendencia, como se ha comentado,
al aumento de la
concentracin de pigmentos respecto al control.
Sin embargo, en las acculas de 1997 se observaron
interacciones
significativas de los contaminantes: mientras que los pigmentos,
principalmente la
concentracin de clorofila b, reaccionaron al SO2con una
tendencia a aumentar y al
O3con una tendencia a disminuir, la coexistencia de los dos
contaminantes aument
proporcionalmente ms la concentracin que con slo SO2. Aunque la
existencia de
interaccin fue generalizada (tabla 5.4), el anlisis LSD no seal
diferenciassignificativas entre el SO2+O3y el AF en cada muestreo
(figura 5.3). Las mximas
diferencias entre esos tratamientos fueron del 16 % en el caso
de la clorofila a en
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octubre de 1997. En las acculas de 1995 la presencia del SO2
increment las
diferencias debidas al O3, aunque la interaccin no fue
estadsticamente significativa.
Efecto de cmaraLa comparacin entre la concentracin de pigmentos
en las cmaras con aire
no filtrado (ANF) respecto a las parcelas ambiente (AA) se
presenta en las figuras
5.5 y 5.6. Los resultados del ANOVA-RM para el efecto de cmara
se muestran en la
tabla 5.5.
La cmara increment la concentracin foliar de clorofilaa, b ya+b
en las
dos clases de edad, 1995 y 1996, de manera significativa (p
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respectivamente, tabla 5.5 y figura 5.6c) en el tratamiento de
ANF respecto al AA.
La proporcin de la concentracin de clorofila con respecto a la
concentracin de N
tuvo tendencia a ser superior en el tratamiento de ANF que en el
de AA (figura 5.6d).
La cmara tambin influy en las variaciones estacionales de la
concentracinde clorofila, puesto que mientras en otoo de 1996 su
concentracin se mantuvo
constante (acculas de 1995) o aument en un 46 % (acculas de
1996) en el interior
de las cmaras, en el aire ambiente dicha concentracin disminuy
en un 15 %
(acculas de 1995) o aument slo en un 11 % (acculas de 1996)
(figura 5.5 a). En el
caso de los carotenoides el efecto de la cmara en la evolucin
temporal fue menos
marcado (figura 5.5d).
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5.4. DISCUSIN
Variaciones estacionales
Se observ una marcada estacionalidad en la concentracin foliar
de
pigmentos, con una disminucin en verano y una recuperacin de
valores en otoo-
invierno, salvo en las acculas ms maduras, en las que no se
registr la recuperacin
otoal debido posiblemente a su senescencia. Se han descrito
cambios estacionales
en la concentracin de pigmentos en una amplio rango de especies
arbreas (Martin
y quist, 1979; quist, 1983; Weikert et al., 1989; Kstner et al.,
1990; Garca-
Plazaola et al., 1997; Elvira et al., 1998). En la mayora de
esos estudios se han
encontrado, no obstante, aumentos de la concentracin de
pigmentos en verano y
disminuciones en invierno. Sin embargo, en consonancia con los
resultados de
nuestra experimentacin, enPinus halepensisse han registrado
disminuciones de la
concentracin de pigmentos en verano en condiciones naturales
(Velissariou et al.,
1992), en nuestros experimentos previos en invernadero
(Barrantes et al., 1993,
1994) y en experimentacin de OTCs (Elvira et al., 1995, 1998;
Elvira, 1996). La
reduccin de la concentracin de pigmentos en determinadas pocas
del ao se ha
interpretado como una posible fotooxidacin de las clorofilas
mediada por altas
temperaturas y sequa estivales en el caso dePinus halepensisen
Grecia (Velissariou
et al., 1992), altas temperaturas asociadas a elevados niveles
de radiacin luminosa
en verano en esa misma especie en el NE espaol (Elvira et al.,
1998) o por bajas
temperaturas invernales en el caso dePinussylvestrisyPicea
abies(quist, 1983;
Kstner et al., 1990). Otros autores han sealado tambin a los
cambios
ultraestructurales en la organizacin de los cloroplastos como
responsables de la
prdida de clorofila durante la estacin de reposo del perodo
vegetativo (Martin y
quist, 1979). En condiciones mediterrneas, se ha sugerido que la
disminucin de la
concentracin de clorofila en verano puede formar parte de una
estrategia adaptativade proteccin del dao fotoinhibitorio
(Kyparissis et al., 1995; Elvira et al., 1998)
mediante la disminucin de la captacin de luz y por tanto
disminucin de la
sobreexcitacin de los fotosistemas.
La disminucin de la clorofila en verano estuvo asociada en las
acculas de un
ao de edad a una disminucin de la proporcin clorofila a/b,
mientras que en las del
ao en curso la proporcin clorofila a/b permaneci aproximadamente
constante.
Tales resultados indican una disminucin preferente de los
complejos core (corecomplex, CC) respecto a los pigmentos
captadores de luz (light harvesting complex,
LHC) en acculas de un ao (Lichtenthaler, 1987). Elvira et al.
(1998) obtuvieron
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similares resultados, aunque no existieron diferencias en funcin
de la edad de las
acculas.
La concentracin de pigmentos, tanto en lo que se refiere a la
clorofila como
a los carotenoides, fue superior en las acculas ms maduras que
en las ms jvenes,coincidiendo con los resultados obtenidos por
diversos autores para otras especies en
condiciones naturales (Kstner et al., 1990; Pfanz y Beyschlag,
1993; Wedler et al.,
1995) y en cmaras de cultivo (Siefermann-Harms, 1990; Tausz et
al., 1996) y otras
condiciones de experimentacin (Ballach et al., 1992a; Wulff et
al., 1996). Los
valores medios de la concentracin foliar de pigmentos
registrados en nuestra
experimentacin son similares a los de experimentos anteriores
realizados en
invernadero (Barrantes et al., 1993, 1994) y a los descritos por
otros autores para
Pinus halepensis(Barnes et al., 1991; Elvira et al., 1995;
Elvira, 1996).
Efectos del SO2Los efectos del SO2sobre el contenido de
pigmentos fotosintticos fueron
mnimos en 1996, no observndose una influencia generalizada de
ese tratamiento a
lo largo de la experimentacin durante dicho ao. Sin embargo, en
1997, aunque
cuantitativamente el efecto del SO2no fue muy importante, se
observaron ciertas
tendencias: las acculas de dos aos (originadas en 1995)
mostraron una disminucin
de la concentracin de clorofila de hasta un 11 % en marzo de
1997. En las acculasde un ao (de 1996) no se observaron diferencias
significativas, mientras que en las
acculas ms jvenes (de 1997) se registr un aumento significativo
(p
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Se han descrito efectos directos del SO2 sobre la disminucin de
la
concentracin de pigmentos en algunos estudios con
concentraciones de SO2
elevadas, del orden de 800 a 1000 ppb (Shimazaki et al., 1980;
Grunwald, 1981;
Sandman y Gonzales, 1989). Sin embargo, la concentracin empleada
en nuestro
estudio est considerada por diversos autores como demasiado baja
para producirefectos directos importantes (Wedler et al., 1995;
Tausz et al., 1996). Dichos autores,
as como Cornic (1987), Wolfenden et al. (1991), Pfanz y
Beyschlag (1993),
Wingsle y Hallgreen (1993) y Polle et al. (1994) no obtuvieron
efectos en una amplia
variedad de conferas con tratamientos de SO2de entre 10 y 80
ppb. Contrastan no
obstante con los resultados anteriores los efectos de disminucin
de la concentracin
de pigmentos en experimentos con 36 ppb de SO2durante 8 meses
enPseudotsuga
menziesii (Van Hove et al., 1992) y con 28 ppb de SO2 en tan slo
3 meses de
tratamiento conPinus sylvestris(Prez-Soba, 1995).
Los efectos directos del SO2 sobre los pigmentos fotosintticos
se han
relacionado con la formacin de sulfatos a partir de sulfitos,
proceso en el que se
desencadena una serie de reacciones que involucran la formacin
de radicales libres
(Asada y Takahashi, 1987; Weigel et al., 1989a). Los radicales
libres son molculas
muy reactivas que atacan a los sistemas de membranas
fotosintticas, los sistemas
pigmento-protena y las biomembranas en general (Shimazaki et
al., 1980;
Beauregard, 1991; Elstner y Osswald, 1991). Las clulas tienen
mecanismos de
proteccin frente a los radicales libres, como son los
carotenoides (carotenos y
carotenoides del ciclo de la xantofila), ascorbato, glutatin,
superxido dismutasa,
conocidos genricamente con el trmino de antioxidantes. Numerosos
estudios han
demostrado la existencia de tales mecanismos de proteccin de los
sistemas
pigmentarios por los radicales libres y la alteracin de las
sustancias o enzimas del
sistema antioxidante de las clulas por efecto de contaminantes
atmosfricos como el
SO2 (Wellburn, 1982; Peiser y Yang, 1985; Sandman y Gonzales,
1989;
Bermandinger et al., 1990; Tausz et al., 1996). Sin embargo,
cuando la acumulacin
de radicales libres excede a la capacidad destoxificadora de la
planta, se puedeproducir un dao fotooxidativo con prdida de
pigmentos.
En nuestra experimentacin, se observaron en agosto de 1996
disminuciones
de -caroteno y alteraciones en las relaciones de los componentes
del ciclo de las
xantofilas por efecto del SO2, as como alteraciones en la
concentracin de ascorbato
a lo largo de toda la experimentacin (Moliner et al., datos no
publicados); adems,
se registraron debido al contaminante una disminucin de los
carotenoides totales y
una tendencia a la disminucin de la relacin clorofila a/b en las
acculas msmaduras en marzo de 1997, as como una tendencia al
aumento de la relacin
clorofila/carotenoides generalizada a lo largo del experimento
en las acculas de
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1995. Segn Senser et al., (1987), el pigmento ms sensible a la
fotooxidacin es el
-caroteno, por lo que una degradacin preferente de ste podra
indicar una accin
fotooxidativa. Ello se puede relacionar con el papel del
-caroteno como protector de
la clorofila a cerca o en el centro de reaccin (Lichtenthaler,
1987). La funcin de
proteccin del complejo protena-pigmento y de los cloroplastos
frente a la oxidacines desempeada por los carotenoides en general
(Siefermann-Harms, 1990), pero es
el -caroteno, junto con la lutena, el ms activo (Young y
Britton, 1990). En otros
trabajos se ha encontrado tambin una disminucin de la
concentracin foliar de
carotenoides por efecto del SO2 (Sandmann y Gonzales 1989;
Bermadinger et al.,
1990; Prez-Soba, 1995; Tausz et al., 1996), en algunos casos
junto con otras
alteraciones en el sistema de antioxidantes. Algunos autores
(Lichtenthaler y
Buschann, 1984) han observado una proporcin de
clorofilaa/breducida en acculas
daadas por fotooxidacin, aunque en otros estudios no se han
observado variaciones
(Siefermann-Harms, 1990).
Los resultados obtenidos en nuestra experimentacin en cuanto a
las
alteraciones en el sistema de extincin de radicales libres
(Moliner et al., datos no
publicados) apuntan a un incremento del estrs oxidativo en las
acculas por efecto
del SO2. Sin embargo, debido al empleo de una concentracin
relativamente baja del
contaminante, la capacidad destoxificadora en las plantas sera
suficiente para evitar
el dao fotooxidativo de los sistemas pigmento-protena, no
detectndose en general
disminucin de las concentraciones de clorofila. Solamente la
coexistencia de varios
factores disminuy la concentracin de pigmentos. Tales factores
fueron: el tiempo
de fumigacin con SO2superior a 1 ao; la edad de las acculas (de
2 aos de edad),
puesto que las acculas ms maduras posiblemente tienen una menor
capacidad
destoxificadora que las acculas ms jvenes (Grunwald, 1981). El
efecto observado
pudo adems estar coadyuvado por fenmenos de retranslocacin de N
desde las
acculas ms viejas a las de menor edad. Finalmente, esos efectos
se produjeron
precisamente en el momento de la produccin de nuevos brotes de
acculas, lo que
apoya la hiptesis de mecanismos compensatorios de estimulacin de
la actividad delas hojas ms jvenes frente a las de menor
actividad.
Efectos del O3Los efectos del O3sobre la concentracin de
pigmentos variaron como en el
caso del SO2en funcin de la edad de las acculas. No obstante,
fueron opuestos a los
observados para el SO2en 1997, en el sentido de que mientras la
concentracin de
clorofila tendi a aumentar en las acculas ms jvenes y a
disminuir en las msmaduras por efecto del SO2, el O3produjo una
disminucin de la concentracin de
clorofila (sobretodo de la clorofila b) en las acculas ms jvenes
y una tendencia al
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aumento de la concentracin de clorofila en las ms maduras. En
las acculas de un
ao de edad, de 1996, no se produjeron efectos importantes,
aunque la tendencia fue
similar a la observada en las acculas ms maduras. La disminucin
de la clorofila b
por efecto del O3en las hojas ms jvenes fue de hasta un 29 %, el
aumento en las
ms maduras fue de hasta un 19 %.
En estudios realizados por diversos autores en conferas se ha
observado
tambin un efecto distinto del O3dependiendo de la edad de las
acculas, pero la
tendencia fue diferente a la observada en nuestra
experimentacin: en Picea abiesse
observ una disminucin de la concentracin de clorofila en las
acculas ms
maduras y una disminucin no significativa en las ms jvenes
(Wallin et al., 1992)
o bien aumento de la concentracin de clorofila en las acculas
del ao en curso
(Senser et al., 1990); el aumento de la concentracin de
clorofila en las hojas ms
jvenes y su disminucin en las ms viejas ha sido tambin observado
enPopulus
nigra(Ballach et al., 1992a). EnPinus halepensisse observ una
disminucin de la
concentracin de clorofila en las acculas de un ao y no se
observaron efectos en las
acculas del ao en curso (Elvira, 1995; Elvira et al., 1998). Sin
embargo, en general
en esos trabajos las acculas de ms edad estuvieron expuestas a
una mayor
dosificacin acumulada de O3, mientras que en nuestro caso las
tres clases de edad
recibieron la misma dosificacin acumulada del contaminante. Se
ha descrito una
disminucin de la conductancia estomtica con la edad de las
acculas (p.e.,
Zimmermann et al., 1988; Wedler et al., 1995) lo que podra
explicar una mayor
captacin y efecto del contaminante en las acculas ms jvenes
respecto a las ms
maduras. Otra posibilidad sera una interferencia del O3 con el
patrn normal de
movilizacin y retranslocacin de nutrientes desde las acculas de
ms edad a las de
menor edad, tal y como ha sido sugerido por algunos autores
(Lucas et al., 1993). Sin
embargo, esta hiptesis no parece plausible, ya que no se
registraron cambios, como
en el caso del SO2, en la concentracin de nutrientes debidos al
efecto del O3.
La concentracin foliar de glutatin disminuy por efecto del O3en
octubrede 1997 en acculas del ao en curso y del ao anterior
(Moliner et al., datos no
publicados), lo que indica la existencia de mecanismos de
destoxificacin de
radicales libres generados por el contaminante. Otros autores
han observado tambin
alteraciones en el sistema de extincin de radicales libres de
las clulas por efecto del
O3 (Weigel et al., 1989a; Bermandinguer et al., 1990; Elstner y
Osswald, 1991;
Lucas et al., 1993; Elvira et al, 1998). Sin embargo,
aparentemente esos mecanismos
no fueron suficientes para evitar el dao en la clorofila ben las
acculas de 1997. La
degradacin preferente de la clorofila bobservada por efecto del
O3por algunosautores (Khl y Wagner, 1970; Nobel, 1974) y el aumento
consistente de la relacin
clorofilaa/bimplica un mayor ataque del O3a los sistemas de
captacin de luz, ya
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que la clorofila b se localiza fundamentalmente en los pigmentos
antena del LHC
(ligth-harvesting complex, complejo captador de luz) perifricos
asociados al PSII.
En ese sentido, algunos autores han relacionado el efecto del
O3con una degradacin
del PSII, como en el caso de exceso de luz (Godde y Buchhold,
1992).
No obstante, es difcil establecer si el O3 produjo un dao
fotooxidativo
directo sobre la clorofila en las acculas de 1997. En nuestro
trabajo no se observ un
efecto del O3sobre la concentracin de carotenoides y de hecho
hubo una tendencia
al aumento de la relacin clorofila/carotenoides en esa clase de
edad. Segn Senser et
al. (1987) los carotenoides (y fundamentalmente el -caroteno)
son los pigmentos
ms susceptibles al dao fotooxidativo, por lo que habra cabido
esperar un aumento
de la relacin clorofila/carotenoides. Sin embargo, esos
resultados se obtuvieron
solamente a altas intensidades de luz y exposicin a altos
niveles de O3(del orden de
1000 ppb) y otros autores no han observado tampoco tal aumento
con niveles de O3
ms realistas (Bermandinger et al., 1990; Senser et al., 1990;
Lucas et al., 1993;
Elvira, 1995; Takemoto et al., 1997)
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Efectos del SO2+O3Se observ un efecto de interaccin entre el
SO2y el O3en las acculas ms
jvenes, de 1997, con un aumento proporcionalmente mayor en la
concentracin de
pigmentos en el tratamiento con SO2+O3que con el SO2slo; adems,
el tratamiento
con slo O3, como se ha mencionado, produjo el efecto opuesto al
del SO2con unadisminucin de la concentracin de pigmentos. En
cualquier caso, las diferencias
entre el control y el tratamiento con SO2+O3 no fueron
cuantitativamente
importantes, observndose como mximo un 16 % de aumento en la
concentracin
de clorofilaa .
Son relativamente escasas las referencias a trabajos acerca de
la interaccin
del SO2y del O3sobre los pigmentos fotosintticos. A pesar de que
hipotticamente
la coexistencia de los dos contaminantes disminuye el umbral de
dao para los
contaminantes por separado, en estudios realizados con
concentraciones bajas y
realistas no se ha encontrado dicho efecto. As, Siefermann-Harms
(1990) no
encontr efectos interactivos sobre la concentracin de pigmentos,
observando
efectos similares en Picea abies fumigados con SO2 y con SO2+O3.
En el mismo
experimento, Bermandinger et al. (1990) hallaron un efecto ms
bien antagnico de
ambos contaminantes, donde el efecto de disminucin de la
concentracin de
clorofila por efecto del SO2fue menos pronunciado en presencia
de SO2+O3. Ballach
et al.(1992a) sealaron mayor reactividad del tratamiento de
SO2+O3+NOxque de
los tratamientos por separado en la disminucin de la
concentracin de pigmentos en
las hojas ms maduras y aumento en las ms jvenes.
Las interacciones observadas en nuestro estudio son difciles de
interpretar.
Se descartan efectos mediados por una acumulacin diferencial de
nutrientes en la
mezcla, ya que apenas se observaron efectos interactivos en ese
aspecto (ver captulo
4). Los resultados apuntan a una estimulacin de la sntesis o
disminucin de la
degradacin de los pigmentos en las acculas ms nuevas, al menos
en los primeros
meses de experimentacin. Nuestros resultados coinciden con el
aumento de laconcentracin de pigmentos registrado por (Wedler et
al., 1995) en el tratamiento de
SO2+O3respecto al control enPicea abiesdurante el primer ao de
experimentacin.
Efecto de cmara
El efecto de la cmara sobre la concentracin y composicin de los
pigmentos
fotosintticos se explica satisfactoriamente desde el punto de
vista de la aclimatacin
de las plantas a mayores o menores intensidades de luz durante
un perodo de tiempo
suficientemente extenso (tratamiento fuera de las cmaras, AA,
respecto al interiorde stas, ANF).
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La concentracin de clorofila a , b , a+b, carotenoides y la
proporcin
clorofila/carotenoides fueron menores en el exterior de las
cmaras respecto a su
interior, mientras que la proporcin clorofila a/by la relacin de
absorbanciasA430/665
aumentaron fuera de las cmaras. Otros autores han encontrado
resultados similares
en experimentaciones con plantas de Pinus halepensisexpuestas a
niveles de PARcrecientes (Espelta, 1996) y debidos al efecto de las
cmaras OTC (Peuelas et al,
1995), que los autores atribuyen a la atenuacin de la radiacin
solar y de la
velocidad del viento que se produce en el interior de las
cmaras.
La disminucin de la proporcin clorofila a/b en hojas adaptadas a
la sombra
se ha interpretado como una respuesta adaptativa de las hojas
encaminada a
maximizar la capacidad de captacin de luz de los cloroplastos
(Alberte et al., 1976;
Chow et al., 1991; Dale y Causton, 1992). Al parecer el PSII,
con su LHC asociado
compuesto mayoritariamente por clorofila b, carotenoides,
clorofila ay protenas
asociadas, es el fotosistema que ms importancia tiene en la
aclimatacin de las hojas
a diferentes regmenes de luz (Chow et al., 1991). Como la
clorofila ase encuentra
en todos los complejos pigmento-protena del cloroplasto pero la
clorofila bse sita
fundamentalmente en el LHC asociado al PSII, el mayor desarrollo
que experimenta
el LHCII en condiciones de sombra explica la menor relacin
clorofila a/b y el
aumento de la relacin clorofila/carotenoides en esas condiciones
(Lichtenthaler,
1987).
Adems, es interesante sealar una tendencia a la mayor
proporcin
clorofila/N en las plantas del interior de las cmaras respecto
al AA, lo que coincide
con los resultados obtenidos por Espelta (1996) en Pinus
halepensisaclimatados a
condiciones de menor PAR. La mayor proporcin clorofila/N se ha
interpretado
como una distribucin preferente de este nutriente a la formacin
de pigmentos que a
enzimas fotosintticos, maximizando por tanto la captacin y
absorcin de luz frente
a la fijacin de CO2. En condiciones de mayor iluminacin la
distribucin de N se
dedicara preferentemente a los enzimas implicados en la
carboxilacin,disminuyendo la proporcin Clorofila/N (Seeman et al.,
1987; Evans, 1989;
Ellsworth y Reich, 1992).