Spectroscopies optiques Spectroscopies optiques Pierre-Yves TURPIN Pierre-Yves TURPIN Professeur à l Professeur à l’ Université Pierre et Marie Curie Université Pierre et Marie Curie Absorption électronique & Dichroïsme circulaire Fluorescence & Développements : FRET, FRAP et FLIM Spectroscopies vibrationnelles : absorption InfraRouge, diffusions Raman et Raman résonnant Plan
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Spectroscopies optiquesSpectroscopies optiques
Pierre-Yves TURPINPierre-Yves TURPINProfesseur à lProfesseur à l’’Université Pierre et Marie CurieUniversité Pierre et Marie Curie
Absorption électronique & Dichroïsme circulaire
Fluorescence & Développements : FRET, FRAP et FLIM
2 trains d’onde perpendiculaires, électrique (E) etmagnétique (M), se déplaçant à la vitesse de la lumière
dans le milieu considéré
Lumière ?
Lumière
Longueur d’onde de l’onde EM : ! (en m, cm, !m, nm...)Fréquence de l’onde : " = c/! (en Hz), avec c = 3.108 m.s-1
Energie du photon associé : E = h ", avec h = 6,63.10-34 J.sNombre d’onde : "’ = 1/ ! = "/c (en cm-1)
Etotal = Eorientation spin électronique
+ Eorientation spin nucléaire
+ Etranslation + Erotation
+ Evibration + Eélectronique
EkT
-!nhaut
nbas= exp ( )
Boltzmann : rapport des populationsdes niveaux d’énergie
avec k = 1,38 10-23 J.K-1
Matière
Etotal = Eorientation spin électronique
+ Eorientation spin nucléaire
+ Etranslation
+ Erotation
+ Evibration
+ Eélectronique
continu
10-3 J/mole radio
10 J/mole microondes
1-40 kJ/mole IR
105-106kJ/mole UV-Vis
Interaction Lumière-Matière
Principalement trois types:
Diffusion : changement de direction de la lumière sanschangement d’énergie (sauf exceptionvibrationnelle des noyaux)
Interaction Lumière-Matière
Absorption électronique : énergie EM transférée auxélectrons de la molécule (transition d’un état de”basse
énergie” à un état de “haute énergie”)
E0
En
h!
Interaction Lumière-Matière
Emission : énergie EM perdue par la molécule sous la forme d’unphoton (transition «"radiative"» d’un état de “haute énergie” à un
état de “basse énergie”)
E0
En
h!
Dans les molécules, les orbitales électroniques décrivant les niveaux d’énergie sont descombinaisons d’orbitales électroniques atomiques.
exemple:
# et # “bonding”
#* et #* “antibonding”
électronsélectrons moléculesmolécules$$
Absorption électronique
Transitions entre différents niveaux d’énergie électroniques pourcertaines molécules : des «"chromophores"».
Soumis à une énergie lumineuse donnée (photon), un électron peut êtretransféré d’une orbitale moléculaire à une autre... si le résultatcorrespond à un mouvement asymétrique des charges.
HOMO
LUMO
Loi de Beer-Lambert
Sur une épaisseur traversée dx, l’intensité suit une loi de décroissance du 1er ordre : dI / dx = - I c "(!)
soit - dI / I = "(!) c dx
intégration sur l : ln (I0 / It) = "(!) l c
ou It = I0 exp (- "(!) l c)
I0 Itransmis It
l
échantillon homogène, concentration c
une fraction constante de lumière est absorbée pour chaque intervalle dx $$
Loi de Beer-Lambert
It = I0 exp (- "(!) l c)
A(!) est la «"densité optique"» ou DO : elle varie avec !
%(!) est le «"coefficient d’extinction molaire"» = "(!) / 2.303
* variation de I en fonction de la distance l traversée, à c donnée
* variation de la concentration c sur une distance donnée
A(!) = log10 I0/It = %(!) c l
Absorption
On peut aussi définir la transmission : T = It / I0
ou le % de transmission : %T = 100 T liés à A : A = - log10 T
Absorption
absorbée observée
Absorption électronique
S0
S1
S2
!0 !4 !'0 !'4
Absorption
A! = "! l c
"! est une mesure du “pouvoir d’absorption” , et il est lié à la
probabilité de transition électronique à une ! donnée.
Molécule !max (nm) " à !max (M-1. cm-1)
Trytophane 280 5600
219 47000
A
!
spectre d’absorption du Trp
Absorption
Molécule !max (nm) " à !max (M-1. cm-1)
Trytophane 280 5600
219 47000
Adénine 260,5 13400
NAD+ 260 18000
ADN 258 6600
Applications de l’absorption
caractérisationspectrale des
espèces
Applications de l’absorption
conjugaisonschimiques
shiftbathochromiques
Applications de l’absorption
effet de solvant :
[1,2,4]Triazine
Applications de l’absorption
effet de solvant: pH
pH ! moins d’électrons “non-bonding”
coefficient " moins élevé
délocalisation diminuée hypsochromique
!, " = 280, 1430 254, 169
NH2
NH3+
Aniline Anilinium ion
H2O OH-+ +
Applications de l’absorption
effet de solvant: pH
Tyrosine
utilisation: détermination de l’environnement, ou interne/externe
solutions diluées, pour éviter l’auto-absorption de la lumière émise
L’intensité est liée à la probabilité de transition (constante kf en s-1)
- d'excitation de fluorescence = I (!émission fixe)
- d'émission de fluorescence = I (!excitation fixe)
Fluorescence
495 nm 520 nm
Stokes Shift is 25 nmFluorescein
molecule
Flu
ore
scen
ce I
nte
nsi
ty
Wavelength
«"Déplacement de Stokes"» : la fluorescence et toujours déplacée vers le rougede l’absorption électronqiue
Spectres
Ethidium
PE
cis-Parinaric acid
Texas Red
PE-TR Conj.
PI
FITC
600 nm300 nm 500 nm 700 nm400 nm
Spectres
Spectre d'émission : la forme est indépendante de !exc
mais l'intensité est proportionnelle à %(!exc)$ Spectre d’excitation
Spectres
Mélange de 2 fluorophores
Spectres
Mélange de 2 fluorophores
Spectres
Mélange de 3 fluorophores
Spectres
Nuclease
Folded protein
Unfolded protein
Spectres
290 330 370 410 450
wavelength, nm
A
B
C
D
E
abc
abc
d
a
bc
d
ab
c
abc
Ca-parvalbumin: Trp est enfoui, 305 nm
Ca-free parvalbumin: tryptophan est exposé au solvant
Trp dans différents solvants: hexane, trehalose glass,
glycerol, water
Paramètres de la fluorescence
)f:
Durée de vie defluorescence
Intensité
t (ns)
kf = 1 / )f
Si fluo. uniquement : cinétique du premier ordre
I = IO e -kf t
Paramètres
*f :kf = 1 / )f
en fait : k = kf + +ki
) = 1 / k = 1 / (kf + +ki) < )ftemps de relaxation
*f = kf / (kf + +ki) rendement quantique
*f = ) / )f < 1
*f = nbre h" fluo / nbre de h" abs
mesure par comparaison
Transfert intermoléculaire de Fluorescence,
par résonance (non-radiatif)
Fluorescence Resonance Energy Transfer FRET
Inte
nsi
té
!
DONNEUR D ACCEPTEUR A
1ère condition : recouvrement spectral Fluo D - Abs A
Transfert intermoléculaire de Fluorescence,
par résonance (non-radiatif)
Fluorescence Resonance Energy Transfer FRET
S0
S1
S0
S1
donneur D accepteur A
résonance
2ème condition : R pas trop grand (R est la distance intermoléculaire D - A)
Constante de transfert : kD-A = kDseul (R0/R)6
R0 «"distance critique"» D-A pour laquelle la proba. detransfert est de 50%
non-radiatif
Transfert de Fluorescence
FRET
10-100 Å
Transfert de Fluorescence
Exemples:
Donneur
accepteur
Donneur-accepteur
BenzèneBenzène CC66HH66
Toluène C6H5-CH3Toluène C6H5-CH3
Stratégie «Stratégie «""antisensantisens""» : blocage de l» : blocage de l’’ARN par une séquence complémentaireARN par une séquence complémentaire résistante aux nucléases cellulairesrésistante aux nucléases cellulaires