CÔNG NGHỆ VI SINH VÀ LÊN MEN PHÂN LẬP CHỦNG PSEUDOMONAS AERUGINOSA SINH HOẠT CHẤT KHÁNG KHUẨN PYOCYANIN Nguyễn Quang Vinh 1,2 , Nguyễn Chí Thuận 1 , Nguyễn Huyền Trang 1 , Nguyễn Hoàng Uyên 1 , Nguyễn Thị Thanh Lợi 1 1 Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam (VAST) 2 Công ty Cổ phần Dịch vụ phân tích di truyền (GENTIS) TÓM TẮT Pseudomonas aeruginosa được quan tâm là vi khuẩn có nhiều ứng dụng trong công nghệ sinh học và có khả năng sinh các hoạt chất thứ cấp. Pyocyanin (PYO) được sinh tổng hợp từ Pseudomonas aeruginosa, là hợp chất thứ cấp, có khả năng kháng khuẩn, kháng nấm. Nghiên cứu này nhằm mục đích phân lập các chủng Pseudomonas aeruginosa từ mẫu môi trường và đánh giá khả năng kháng khuẩn của hoạt chất PYO sinh ra từ vi khuẩn này. Kết quả phân lập được 11 chủng từ mẫu nước nuôi thủy sản (PS1; PS2; PS3; PS4; PS5; PS6; PS11; PS33; PS35; PS39 và PS44). Trong đó, chủng Pseudomonas sp. PS39 được giải trình tự gen 16S rRNA, đăng ký trên ngân hàng gen mã số KJ579953, cho thấy tương đồng cao 100% với trình tự gen của nhóm chủng P. aeruginosa MCCB117 (EF062511) và P. aeruginosa MCCB102 (EF062514). Sử dụng xét nghiệm API 20NE cho thấy Pseudomonas sp. PS39 có tính chất giống với chủng P. aeruginosa ATCC 27853. PYO được tách chiết từ dịch nuôi cấy ức chế các vi sinh vật kiểm định, các chủng Vibrio sp. kháng kháng sinh, gây bệnh trên tôm nuôi nước lợ. Từ khóa: P. aeruginosa, kháng khuẩn, phenazin, pyocyanin, Vibrio sp. MỞ ĐẦU Pseudomonas aeruginosa là vi khuẩn hiếu khí hình que dài, gram âm, có mặt phổ biến trong tự nhiên. Nó có thể đươc tìm thấy trong môi trường đất, nước ngọt, nước lợ... Pseudomonas aeruginosa được chú ý bởi khả năng sinh sắc tố phenazin mà không có loại vi khuẩn gram âm nào khác có thể sinh sắc tố đặc trưng như chủng này. Sắc tố đặc trưng được tạo ra bởi vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa bao gồm pyocyanin (PYO) có màu xanh đậm, pyoverdin có màu vàng, xanh lá cây và phát huỳnh quang, pyomelanin có màu nâu nhạt và pyorubrin có màu nâu đỏ (Meyer et al., 2000; Reyes et al., 1981). Trong đó, hợp chất thứ cấp pyocyanin được đặc biệt chú ý với khả năng kháng khuẩn, kháng nấm cao có thể dùng làm chất diệt khuẩn sinh học thay thế kháng sinh vì phổ kháng khuẩn rộng, không bị kháng và có khả năng phân hủy dễ dàng trong môi trường. Để phân lập chủng vi khuẩn sinh PYO người ta đựa trên khả năng sinh sắc tố xanh đặc trưng của PYO và sử dụng môi trường phân lập King A. Môi trường này ức chế sự sản sinh của các sắc tố khác như pyoverdine hoặc pyomelanin nhưng lại hỗ trợ cho vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa sản xuất PYO (Jayaseelan et al., 2014). PYO có tính kháng khuẩn mạnh, sự kháng Escherichia coli của PYO được báo cáo lần đâu tiên vào năm 1940. Nghiên cứu về tính kháng khuẩn của PYO từ P. aeruginosa phân lập từ môi trường biển đã cho thấy gần 90 - 95% khả năng ức chế vi khuẩn của các chủng P. aeruginosa là do PYO (Angell et al., 2006). Ngoài ra, PYO còn được biết đến với hoạt tính kháng nấm và khả năng kiểm soát sinh học hiệu quả (Jayaseelan et al., 2014). Do đó PYO đã trở thành hợp chất được quan tâm và ứng dụng làm chất diệt khuẩn và có khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh như Vibrio sp. ứng dụng trong nuôi thủy sản. Để phục vụ cho mục đích tìm kiếm PYO có nguồn gốc tự nhiên từ vi khuẩn ở Việt Nam. Trong nghiên cứu này chúng tôi tiến hành phân lập, sàng lọc các chủng vi khuẩn sinh PYO và đánh giá khả năng kháng khuẩn của hoạt chất thu được dựa vào phương pháp xác định nồng độ ức chế và diệt khuẩn tối thiểu (MIC và MBC). NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Nguyên liệu Các mẫu nước nuôi thủy sản, mẫu tôm và cá thu thập từ Quảng Ninh, Ninh Bình và Nam Định. Các chủng vi khuẩn Vibrio sp. trong bộ sưu tập của phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học tái tạo môi trường, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Thành phần và các môi trường nuôi cấy vi khuẩn King A, King B được sử dụng của các hãng Sigma, Invitrogen… Các hóa chất dùng cho sinh học phân tử đạt tiêu chuẩn dùng cho nghiên cứu với xuất xứ từ các hãng ThermoScience, Invitrogen và máy chạy PCR (Eppendorf - Mỹ), điện di (Mupid R 2plus - Nhật), máy soi gel (UV Transilluminator, Wealtec, Đài Loan). 384
PHÂN LẬP CHỦNG PSEUDOMONAS AERUGINOSA SINH HOẠT CHẤT KHÁNG KHUẨN PYOCYANIN
Jul 18, 2022
Welcome message from author
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
CÔNG NGH VI SINH VÀ LÊN MEN
PHÂN LP CHNG PSEUDOMONAS AERUGINOSA SINH HOT CHT KHÁNG KHUN PYOCYANIN
Nguyn Quang Vinh1,2, Nguyn Chí Thun1, Nguyn Huyn Trang1, Nguyn Hoàng Uyên1, Nguyn Th Thanh Li1
1 Vin Công ngh sinh hc, Vin Hàn lâm Khoa hc và Công ngh Vit Nam (VAST) 2 Công ty C phn Dch v phân tích di truyn (GENTIS)
TÓM TT
Pseudomonas aeruginosa c quan tâm là vi khun có nhiu ng dng trong công ngh sinh hc và có kh nng sinh các hot cht th cp. Pyocyanin (PYO) c sinh tng hp t Pseudomonas aeruginosa, là hp cht th cp, có kh nng kháng khun, kháng nm. Nghiên cu này nhm mc ích phân lp các chng Pseudomonas aeruginosa t mu môi trng và ánh giá kh nng kháng khun ca hot cht PYO sinh ra t vi khun này. Kt qu phân lp c 11 chng t mu nc nuôi thy sn (PS1; PS2; PS3; PS4; PS5; PS6; PS11; PS33; PS35; PS39 và PS44). Trong ó, chng Pseudomonas sp. PS39 c gii trình t gen 16S rRNA, ng ký trên ngân hàng gen mã s KJ579953, cho thy tng ng cao 100% vi trình t gen ca nhóm chng P. aeruginosa MCCB117 (EF062511) và P. aeruginosa MCCB102 (EF062514). S dng xét nghim API 20NE cho thy Pseudomonas sp. PS39 có tính cht ging vi chng P. aeruginosa ATCC 27853. PYO c tách chit t dch nuôi cy c ch các vi sinh vt kim nh, các chng Vibrio sp. kháng kháng sinh, gây bnh trên tôm nuôi nc l.
T khóa: P. aeruginosa, kháng khun, phenazin, pyocyanin, Vibrio sp.
M U
Pseudomonas aeruginosa là vi khun hiu khí hình que dài, gram âm, có mt ph bin trong t nhiên. Nó có th c tìm thy trong môi trng t, nc ngt, nc l... Pseudomonas aeruginosa c chú ý bi kh nng sinh sc t phenazin mà không có loi vi khun gram âm nào khác có th sinh sc t c trng nh chng này. Sc t c trng c to ra bi vi khun Pseudomonas aeruginosa bao gm pyocyanin (PYO) có màu xanh m, pyoverdin có màu vàng, xanh lá cây và phát hunh quang, pyomelanin có màu nâu nht và pyorubrin có màu nâu (Meyer et al., 2000; Reyes et al., 1981). Trong ó, hp cht th cp pyocyanin c c bit chú ý vi kh nng kháng khun, kháng nm cao có th dùng làm cht dit khun sinh hc thay th kháng sinh vì ph kháng khun rng, không b kháng và có kh nng phân hy d dàng trong môi trng. phân lp chng vi khun sinh PYO ngi ta a trên kh nng sinh sc t xanh c trng ca PYO và s dng môi trng phân lp King A. Môi trng này c ch s sn sinh ca các sc t khác nh pyoverdine hoc pyomelanin nhng li h tr cho vi khun Pseudomonas aeruginosa sn xut PYO (Jayaseelan et al., 2014).
PYO có tính kháng khun mnh, s kháng Escherichia coli ca PYO c báo cáo ln âu tiên vào nm 1940. Nghiên cu v tính kháng khun ca PYO t P. aeruginosa phân lp t môi trng bin ã cho thy gn 90 - 95% kh nng c ch vi khun ca các chng P. aeruginosa là do PYO (Angell et al., 2006). Ngoài ra, PYO còn c bit n vi hot tính kháng nm và kh nng kim soát sinh hc hiu qu (Jayaseelan et al., 2014). Do ó PYO ã tr thành hp cht c quan tâm và ng dng làm cht dit khun và có kh nng c ch vi khun gây bnh nh Vibrio sp. ng dng trong nuôi thy sn.
phc v cho mc ích tìm kim PYO có ngun gc t nhiên t vi khun Vit Nam. Trong nghiên cu này chúng tôi tin hành phân lp, sàng lc các chng vi khun sinh PYO và ánh giá kh nng kháng khun ca hot cht thu c da vào phng pháp xác nh nng c ch và dit khun ti thiu (MIC và MBC).
NGUYÊN LIU VÀ PHNG PHÁP
Nguyên liu
Các mu nc nuôi thy sn, mu tôm và cá thu thp t Qung Ninh, Ninh Bình và Nam nh.
Các chng vi khun Vibrio sp. trong b su tp ca phòng thí nghim Công ngh sinh hc tái to môi trng, Vin Công ngh sinh hc, Vin Hàn lâm Khoa hc và Công ngh Vit Nam. Thành phn và các môi trng nuôi cy vi khun King A, King B c s dng ca các hãng Sigma, Invitrogen…
Các hóa cht dùng cho sinh hc phân t t tiêu chun dùng cho nghiên cu vi xut x t các hãng ThermoScience, Invitrogen và máy chy PCR (Eppendorf - M), in di (Mupid R 2plus - Nht), máy soi gel (UV Transilluminator, Wealtec, ài Loan).
384
Phng pháp
Phân lp vi khun
Nc nuôi thy sn, các xoang tiêu hoá c nghin k và c pha loãng ti các nng ti 10-3,10-4 và 10-5,
cy tri 0,1 ml dch pha loãng lên a thch King A và 30C. Sau 24 gi, quan sát và chn nhng khun lc
màu xanh và môi trng i màu sang xanh thc hin tip các thí nghim sàng lc chn chng thun. Nhng
chng này c cy trong môi trng lng King A kim tra kh nng tit pyocyanin và trên a thch King B
quan sát kh nng phát hunh quang (King et al., 1954).
c im hình thái t bào
Nhum Gram theo phng pháp Hucker ci tin (Hucker, 1921) và chp nh kính hin vi in t quét (SEM -
JSM-5410LV, JEOL, Nht)
nh danh vi khun (theo Kit 20NE cho vi khun Gram -)
Phng pháp c thc hin theo hng dn ca nhà sn xut Kit API 20NE (BioMérieux, Pháp), c tóm tt
nh sau: ly 2 khun lc t a thch nuôi sau 18-24 gi cho vào 4ml mui sinh lý 0,9% ã kh trùng; trn u,
tránh phá hu tiên mao, tiêm mao và không to bt. Dch vi khun này c nh vào các phn ng có sn c
cht bng pipet, trong ó các phn ng vi hiu khí GLU, ADH và URE cn b sung du khoáng, các phn ng
hiu khí GLU, ARA, MNE, MAN, NAG, MAL, GNT, CAP, ADI, MLT, CIT VÀ PAC nh dch vi khun di ming
ging (không cho dch y). mu trong khay m 30C trong 24 gi và c kt qu.
Xác nh gen c trng loài Pseudomonas aeruginosa
S dng cp mi PA-F và PA-R: PA-F: 5’-GGGGATCTTCGGACCTCA-3’; PA-R: 5’-TCCTTAGAGTGCCC
ACCCG - 3’ c hiu (Spilker et al., 2004) khuch i on gen PA 956 bp các chng vi khun nghiên cu,
có c hiu và nhy 100% vi chng P. aeruginosa. Chu trình nhit cho ph ng gm 94oC-5 phút; 35 chu
kì (94oC-30 giây; 58oC-30 giây; 72oC-45 giây) và kt thúc phn ng 4C. Kim tra sn phm PCR trên gel
agarose 1,5%, m TAE 1X.
Phng pháp xác nh hàm lng PYO (Essar et al., 1990)
Dch nuôi vi khun c ly tâm 5000 v/ph trong 10 phút, thu dch ni, loi b t bào, thêm chloroform theo t l
1:2 v th tích (1 dch : 2 chloroform), lc u, lng khong 15 phút, loi b phn dch trên, thu lp chloroform
cha PYO có màu xanh. Sau ó, thêm HCl 0,2M axit hóa vi t l 1:1 v th tích, lc u, dung dch chuyn
sang màu . Pha loãng o OD bc sóng 520 nm xác nh nng hot cht. Hàm lng PYO xác nh
theo công thc: PYO (µg/ml) = OD520 x pha loãng x 17,072.
Xác nh nng c ch ti thiu (Minimum Inhibitory Concentration - MIC) (Hadacek, Greger et
al., 2000)
Dch chit pyocyanin và các kháng sinh c pha loãng gim dn 1/2 có gii nng cui cùng ca
pyocyanin là 6,5; 3,25; 1,625; 0,8; 0,4; 0,2 và 0,1 (µg/ml); ca các kháng sinh 256, 128, 64, 32, 16, 8, 4 và 2
(µg/ml). Mi nng c lp li 3 ln trên 3 ging. Thêm dch nuôi vi sinh vt kim nh (VSVK) và các chng
Vibrio sp. nghiên cu ln lt a vào các ging và 37C. Sau 24 gi, xác nh giá tr MIC bng cách o
c t bào 620 nm trên máy Biotec và s dng phn mm Raw data.
Xác nh nng dit khun ti thiu (Minimum Bactericidal Concentration - MBC)
Nng dit khun ti thiu là nng thp nht ca dch chit hay hp cht tinh khit mà dit 99,9% vi
khun. Thí nghim c thc hin theo phng pháp pha loãng dung dch ca Hadacek có thay i cho
phù hp vi i tng nghiên cu (Hadacek, Greger et al., 2000).
Thêm vào các ng thí nghim 1 mL dch chit pyocyanin, 1 mL dch vi khun ca 3 chng V. parahaemolyticus
3.105 cfu/mL t gii nng pyocyanin cui cùng 0,4; 0,8; 1,2; 1,5; 2; 2,5; 3; 3,5; 4 và 5 g/mL. Nuôi lc
200 vòng/phút 30oC. Sau 18 - 24 gi cy 100 L dch vi khun t các ng lên a thch TCBS. m khun
lc sau 24 gi và xác nh MBC.
Phng pháp khuch tán trên a thch
Phng pháp xác nh theo Bauer có thay i cho phù hp vi hot cht nghiên cu (Bauer et al., 1966). Làm
giàu các chng vi khun Vibrio sp. trong môi trng APW, lc 30ºC, 24 gi. Cy tri dch vi khun Vibrio sp. lên
a thch 2216E. t khoanh giy tm PYO vi các nng khác nhau 0,02; 0,04; 0,08; 0,16; 0,33; 0,65; 1,3 và
2,6 µg và kháng sinh i chng Gentamycine 10 µg lên các a ã cy vi khun và 30C. o ng kính
vùng c ch sau 24 gi.
385
KT QU VÀ THO LUN
Phân lp vi khun và c im hình thái chng Pseudomonas sinh PYO
Vi khun sinh PYO c phân lp và sàng lc da trên kh nng sinh sc t có màu xanh c trng ca PYO trên môi trng King A, làm i màu môi trng (hình 1-A), phát hunh quang trên môi trng King B di ánh sáng t ngoi 360 nm (hình 1B) và tit PYO trong môi trng King A lng. 11 chng vi khun thu nhn có kh nng sinh PYO vi các mc khác nhau t các mu nc thu sn ã c phân lp (bng 1). Danh sách các chng sinh PYO c trình bày ti bng di ây gm: PS1; PS2; PS3; PS4; PS5; PS6; PS11; PS33; PS35; PS39 và PS44.
T kt qu nhn c ch ra rng chng PS39 có kh nng sinh PYO cao nht khi so sánh vi các chng còn li da vào vic xác nh hàm lng PYO tit ra trong môi trng King A lng. T kt qu này chng vi khun PS39 c la chn tin hành các nghiên cu tip theo.
Kt qu nhum Gram (hình 1-C) và chp kính hin vi in t quét (hình 1-D) cho thy chng vi khun PS39 là trc khun gram âm, hình que, hai u tròn, chiu dài khong 1 - 1,5 μm, chiu rng khong 0,5 - 1μm, ng mt mình hoc thành ôi.
Kt qu PCR on gen c trng loài P. aeruginosa
Cp mi trên (PA-F; PA-R) có c hiu và nhy 100% vi loài P. aeruginosa (Spilker et al.,
2004), c s dng khuch i on gen PA vi chiu dài mong mun là 956 bp. Kt qu in di sn phm PCR khuch i gen c trng loài P. aeruginosa trên hình 2 cho thy, các chng
vi khun c phân lp da vào các c tính hình thái và s tit PYO u dng tính vi mt bng ADN duy nht có kích thc khong 1.000 bp.
nh danh chng vi khun Pseudomonas phân lp sinh PYO
Xác nh trình t gen mã hoá 16S rRNA ca chng vi khun sinh PYO PS39 và so sánh vi các trình t ã c công b trên Ngân hàng gen quc t. D liu trình t gen 16S rRNA ca chng vi khun PS39 c ng kí trên Ngân hàng gen vi mã s KJ579953.
Kt qu so sánh trình t gen 16S rRNA ca chng PS39 vi các chng vi khun khác trên Genbank ch ra tng ng cao t 93% n 100% (hình 3). c bit, chng vi khun PS39 có tng ng 100% vi các chng P. aeruginosa MCCB117 c phân lp t nc bin ca n và chng P. aeruginosa MCCB102 có ngun gc t nc l ca n . ây là các mu c các nhà khoa hc n dùng nghiên cu thu nhn PYO có kh nng c ch vi khun Vibrio sp. gây bnh tôm sú. Kt hp c im hình thái ca chng PS39 vi kt qu so sánh trình t gen 16S rRNA có th khng nh chng PS39 thuc chi Pseudomonas và c t tên là Pseudomonas sp. PS39.
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Hình 2. Sn phm PCR on gen PA 956 bp ca mt s chng vi khun phân lp.
M: Thang chun ADN 1kp, ging 1: chng âm; ging 2: DNA EI, ging 3-11: các chng phân lp
Hình 3. Cây phát sinh loài ca chng Pseudomonas sp. PS39
(KJ579953)
Bng 1. Kh nng sinh PYO ca các chng vi khun phân lp
TT Kí hiu Kh nng sinh PYO
1 PS1 +
2 PS2 ++
3 PS3 ++
4 PS4 ++
5 PS5 +
6 PS6 ++
7 PS11 ++
8 PS33 ++
9 PS35 ++
10 PS39 +++
11 PS44 ++
B-Vi khun phát quang di ánh sáng UV 360 nm
C-nh nhum Gram vi khun phân lp
D-T bào vi khun di kính hin vi in t quét (SEM) 1000X
Hình 1. Chng Pseudomonas sp. PS39 c phân lp
386
c im sinh hoá ca chng phân lp
nh danh các chng vi khun Gram (-), b Kit 20NE (Biomerieux, Pháp) c s dng nghiên cu. Chng vi khun phân lp quan tâm Pseudomonas sp. PS39 c s dng và kt qu thu nhn so sánh vi chng chun ATCC 27853 và trình bày theo bng 2 di ây. Vi chng PS39, các phn ng (-): sinh indole (TRP); Urease (URE), arabinose (ARA); mannose (MNE), penylacetic acid (PAC); các phn ng (+): kh NO3 (NO3); chuyn hóa Arginine Dihydrolase (ADH); thy phân esculin (ESC), gelatin (GEL); chuyn hoá -galatosidase (PNPG), glucose (GLU), mannitol (MAN), Nacetylglucosamine (NAG), potassium gluconate (GNT), capric acid (CAP), trisodium citrate (CIT).
Bng 2. c im sinh hóa chng Pseudomonas sp. PS39
1-Chng Pseudomonas sp. PS39; 2 - ATCC 27853 b chng chun ca M, theo kit test - API20NE ca BIOMERIEUX; V: tùy theo chng. (-) âm tính; (+) dng tính
T bng 2 cho thy c im sinh hoá ca chng Pseudomonas sp. PS39 phân lp ging vi c im sinh hoá ca chng chun Pseudomonas aeruginosa ATCC27853 t ATCC. Kt qu này thêm phn khng nh các kt qu v ã nhn c ca chng Pseudomonas sp. PS39 trong các thí nghim trc.
Tách chit hot cht pyocyanin và nh lng
ánh giá kh nng sinh PYO bi chng Pseudomonas sp. PS39, chng PS39 c nuôi cy trong môi trng King A 30oC, lc 200 vòng/phút trong khong 5 ngày, tit sc t PYO có màu xanh lá cây (hình 4-A), tan trong nc và chloroform, khuch tán ra môi trng làm môi trng có màu xanh. Thc hin tách chit PYO theo phng pháp mô t trên c minh ho nh hình 4-B. Dch chit thu nhn có màu xanh dng, trong sut (hình 4-C) hàm lng c xác nh theo phng pháp so màu bc sóng 520 nm.
Kh nng kháng khun ca pyocyanin ca chng Pseudomonas sp. PS39
Kh nng kháng các vi sinh vt kim nh ca PYO
Nhm nghiên cu ph kháng khun, dch chit PYO thu c t chng Pseudomonas sp. PS39 c kim tra hot tính c ch ca nó trên các vi sinh vt kim nh (VSVK) theo mô t nh phn phng pháp.
Kt qu cho thy, PYO c ch s tng trng ca vi khun Gram (-) và nm giá tr MIC thp hn (1,625 g/ml) so vi giá tr MIC c ch vi khun Gram (+) (3,25 và 6,5 g/ml). Trong khi giá tr MIC ca kháng sinh cn c ch vi khun cao hn rt nhiu so vi PYO trong nghiên cu này; ví d: c ch chng Gram (+) E. faecalis ATCC299212, kháng sinh Streptomycin cn nng gp 79 ln so vi nng MIC ca PYO và c ch chng Gram (-) P. aeruginosa ATCC27853 thì Streptomycin cn nng cao gp 158 ln (bng 3).
Bng 3. Nng c ch ti thiu ca PYO và các kháng sinh i vi vi sinh vt kim nh
Ghi chú: Gram (+)a: Enterococcus faecalis ATCC299212, Stapphylococus aureus ATCC25923, Bacillus cereus ATCC 13245. Gram (-)b: Escherichia coli ATCC25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC27853, Salmonella enterica ATCC13076. Du -: không thc hin phn ng
Nng c ch ti thiu (MIC) ca PYO i vi các chng Vibrio sp. gây bnh trên tôm
Nng c ch ti thiu ca PYO lên các chng vi khun bnh Vibrio sp., kháng kháng sinh gây bnh hoi t gan tu trên tôm th chân trng ã c th trên 5 chng vi khun i din gây bnh Vibrio sp. bao gm c V. parahaemolyticus (VpKG12T1, VpST22T, VpCMT31) và V. harveyi (Vh3) và V. alginolyticus (Val) mang các
N 0 3
B-Tách chit PYO
C-Dch chit PYO
Hình 4. c im tit sc t xanh ca vi khun Pseudomonas sp. 39 và tách chit, thu nhn PYO
Nng
men
E .
A T
C C
S .
B .
E .
P .
S .
C .
PYO 3,25 6,5 6,5 1,625 1,625 1,625 1,625
Streptomycin 256 256 128 32 256 128 -
Tetracyline 4 16 64 8 256 256 -
Kanamycin 128 4 8 128 64 16 -
Nystatin - - - - - - 8
Cycloheximide - - - - - - 32
CÔNG NGH VI SINH VÀ LÊN MEN
c tính gen quan tâm ánh giá kh nng c ch ti thiu ca dch chit PYO i vi các chng vi khun này. T bng 4 kt qu cho thy, 2 chng VpKG12T1 và VpST22T b c ch sinh trng hoàn toàn nng ti thiu 1,25 g/ml, 3 chng còn li gm VpCMT31, Vh3 và Val b c ch nng 1,75 g/ml.
Bng 4. Nng c ch ti thiu, MIC (g/ml), ca PYO i vi các chng Vibrio sp.
VpKG12T1 VpST22T VpCMT31 Vh3 Val
PYO (g/ml) 1,25 1,25 1,75 1,75 1,75
* Ghi chú: Vp: Vibrio parahaemolyticus; Vh: Vibrio harveyi; Val: Vibrio alginolitycus
Nng dit khun ti thiu (MBC) ca PYO i vi các chng Vibrio gây bnh trên tôm
Các chng Vibrio sp. sau 24 gi c vi PYO các nng khác nhau t 0,4 n 5 g/ml, quan sát c cho thy, tt c 5 chng u sinh trng c nng 1,2 g/ml nhng trong ó 2 chng Val và Vh3 sinh trng c c nng dch chit PYO cao hn là 1,5 g/ml.
Sau khi cy dch vi khun này lên a thch TCBS, kt qu…
PHÂN LP CHNG PSEUDOMONAS AERUGINOSA SINH HOT CHT KHÁNG KHUN PYOCYANIN
Nguyn Quang Vinh1,2, Nguyn Chí Thun1, Nguyn Huyn Trang1, Nguyn Hoàng Uyên1, Nguyn Th Thanh Li1
1 Vin Công ngh sinh hc, Vin Hàn lâm Khoa hc và Công ngh Vit Nam (VAST) 2 Công ty C phn Dch v phân tích di truyn (GENTIS)
TÓM TT
Pseudomonas aeruginosa c quan tâm là vi khun có nhiu ng dng trong công ngh sinh hc và có kh nng sinh các hot cht th cp. Pyocyanin (PYO) c sinh tng hp t Pseudomonas aeruginosa, là hp cht th cp, có kh nng kháng khun, kháng nm. Nghiên cu này nhm mc ích phân lp các chng Pseudomonas aeruginosa t mu môi trng và ánh giá kh nng kháng khun ca hot cht PYO sinh ra t vi khun này. Kt qu phân lp c 11 chng t mu nc nuôi thy sn (PS1; PS2; PS3; PS4; PS5; PS6; PS11; PS33; PS35; PS39 và PS44). Trong ó, chng Pseudomonas sp. PS39 c gii trình t gen 16S rRNA, ng ký trên ngân hàng gen mã s KJ579953, cho thy tng ng cao 100% vi trình t gen ca nhóm chng P. aeruginosa MCCB117 (EF062511) và P. aeruginosa MCCB102 (EF062514). S dng xét nghim API 20NE cho thy Pseudomonas sp. PS39 có tính cht ging vi chng P. aeruginosa ATCC 27853. PYO c tách chit t dch nuôi cy c ch các vi sinh vt kim nh, các chng Vibrio sp. kháng kháng sinh, gây bnh trên tôm nuôi nc l.
T khóa: P. aeruginosa, kháng khun, phenazin, pyocyanin, Vibrio sp.
M U
Pseudomonas aeruginosa là vi khun hiu khí hình que dài, gram âm, có mt ph bin trong t nhiên. Nó có th c tìm thy trong môi trng t, nc ngt, nc l... Pseudomonas aeruginosa c chú ý bi kh nng sinh sc t phenazin mà không có loi vi khun gram âm nào khác có th sinh sc t c trng nh chng này. Sc t c trng c to ra bi vi khun Pseudomonas aeruginosa bao gm pyocyanin (PYO) có màu xanh m, pyoverdin có màu vàng, xanh lá cây và phát hunh quang, pyomelanin có màu nâu nht và pyorubrin có màu nâu (Meyer et al., 2000; Reyes et al., 1981). Trong ó, hp cht th cp pyocyanin c c bit chú ý vi kh nng kháng khun, kháng nm cao có th dùng làm cht dit khun sinh hc thay th kháng sinh vì ph kháng khun rng, không b kháng và có kh nng phân hy d dàng trong môi trng. phân lp chng vi khun sinh PYO ngi ta a trên kh nng sinh sc t xanh c trng ca PYO và s dng môi trng phân lp King A. Môi trng này c ch s sn sinh ca các sc t khác nh pyoverdine hoc pyomelanin nhng li h tr cho vi khun Pseudomonas aeruginosa sn xut PYO (Jayaseelan et al., 2014).
PYO có tính kháng khun mnh, s kháng Escherichia coli ca PYO c báo cáo ln âu tiên vào nm 1940. Nghiên cu v tính kháng khun ca PYO t P. aeruginosa phân lp t môi trng bin ã cho thy gn 90 - 95% kh nng c ch vi khun ca các chng P. aeruginosa là do PYO (Angell et al., 2006). Ngoài ra, PYO còn c bit n vi hot tính kháng nm và kh nng kim soát sinh hc hiu qu (Jayaseelan et al., 2014). Do ó PYO ã tr thành hp cht c quan tâm và ng dng làm cht dit khun và có kh nng c ch vi khun gây bnh nh Vibrio sp. ng dng trong nuôi thy sn.
phc v cho mc ích tìm kim PYO có ngun gc t nhiên t vi khun Vit Nam. Trong nghiên cu này chúng tôi tin hành phân lp, sàng lc các chng vi khun sinh PYO và ánh giá kh nng kháng khun ca hot cht thu c da vào phng pháp xác nh nng c ch và dit khun ti thiu (MIC và MBC).
NGUYÊN LIU VÀ PHNG PHÁP
Nguyên liu
Các mu nc nuôi thy sn, mu tôm và cá thu thp t Qung Ninh, Ninh Bình và Nam nh.
Các chng vi khun Vibrio sp. trong b su tp ca phòng thí nghim Công ngh sinh hc tái to môi trng, Vin Công ngh sinh hc, Vin Hàn lâm Khoa hc và Công ngh Vit Nam. Thành phn và các môi trng nuôi cy vi khun King A, King B c s dng ca các hãng Sigma, Invitrogen…
Các hóa cht dùng cho sinh hc phân t t tiêu chun dùng cho nghiên cu vi xut x t các hãng ThermoScience, Invitrogen và máy chy PCR (Eppendorf - M), in di (Mupid R 2plus - Nht), máy soi gel (UV Transilluminator, Wealtec, ài Loan).
384
Phng pháp
Phân lp vi khun
Nc nuôi thy sn, các xoang tiêu hoá c nghin k và c pha loãng ti các nng ti 10-3,10-4 và 10-5,
cy tri 0,1 ml dch pha loãng lên a thch King A và 30C. Sau 24 gi, quan sát và chn nhng khun lc
màu xanh và môi trng i màu sang xanh thc hin tip các thí nghim sàng lc chn chng thun. Nhng
chng này c cy trong môi trng lng King A kim tra kh nng tit pyocyanin và trên a thch King B
quan sát kh nng phát hunh quang (King et al., 1954).
c im hình thái t bào
Nhum Gram theo phng pháp Hucker ci tin (Hucker, 1921) và chp nh kính hin vi in t quét (SEM -
JSM-5410LV, JEOL, Nht)
nh danh vi khun (theo Kit 20NE cho vi khun Gram -)
Phng pháp c thc hin theo hng dn ca nhà sn xut Kit API 20NE (BioMérieux, Pháp), c tóm tt
nh sau: ly 2 khun lc t a thch nuôi sau 18-24 gi cho vào 4ml mui sinh lý 0,9% ã kh trùng; trn u,
tránh phá hu tiên mao, tiêm mao và không to bt. Dch vi khun này c nh vào các phn ng có sn c
cht bng pipet, trong ó các phn ng vi hiu khí GLU, ADH và URE cn b sung du khoáng, các phn ng
hiu khí GLU, ARA, MNE, MAN, NAG, MAL, GNT, CAP, ADI, MLT, CIT VÀ PAC nh dch vi khun di ming
ging (không cho dch y). mu trong khay m 30C trong 24 gi và c kt qu.
Xác nh gen c trng loài Pseudomonas aeruginosa
S dng cp mi PA-F và PA-R: PA-F: 5’-GGGGATCTTCGGACCTCA-3’; PA-R: 5’-TCCTTAGAGTGCCC
ACCCG - 3’ c hiu (Spilker et al., 2004) khuch i on gen PA 956 bp các chng vi khun nghiên cu,
có c hiu và nhy 100% vi chng P. aeruginosa. Chu trình nhit cho ph ng gm 94oC-5 phút; 35 chu
kì (94oC-30 giây; 58oC-30 giây; 72oC-45 giây) và kt thúc phn ng 4C. Kim tra sn phm PCR trên gel
agarose 1,5%, m TAE 1X.
Phng pháp xác nh hàm lng PYO (Essar et al., 1990)
Dch nuôi vi khun c ly tâm 5000 v/ph trong 10 phút, thu dch ni, loi b t bào, thêm chloroform theo t l
1:2 v th tích (1 dch : 2 chloroform), lc u, lng khong 15 phút, loi b phn dch trên, thu lp chloroform
cha PYO có màu xanh. Sau ó, thêm HCl 0,2M axit hóa vi t l 1:1 v th tích, lc u, dung dch chuyn
sang màu . Pha loãng o OD bc sóng 520 nm xác nh nng hot cht. Hàm lng PYO xác nh
theo công thc: PYO (µg/ml) = OD520 x pha loãng x 17,072.
Xác nh nng c ch ti thiu (Minimum Inhibitory Concentration - MIC) (Hadacek, Greger et
al., 2000)
Dch chit pyocyanin và các kháng sinh c pha loãng gim dn 1/2 có gii nng cui cùng ca
pyocyanin là 6,5; 3,25; 1,625; 0,8; 0,4; 0,2 và 0,1 (µg/ml); ca các kháng sinh 256, 128, 64, 32, 16, 8, 4 và 2
(µg/ml). Mi nng c lp li 3 ln trên 3 ging. Thêm dch nuôi vi sinh vt kim nh (VSVK) và các chng
Vibrio sp. nghiên cu ln lt a vào các ging và 37C. Sau 24 gi, xác nh giá tr MIC bng cách o
c t bào 620 nm trên máy Biotec và s dng phn mm Raw data.
Xác nh nng dit khun ti thiu (Minimum Bactericidal Concentration - MBC)
Nng dit khun ti thiu là nng thp nht ca dch chit hay hp cht tinh khit mà dit 99,9% vi
khun. Thí nghim c thc hin theo phng pháp pha loãng dung dch ca Hadacek có thay i cho
phù hp vi i tng nghiên cu (Hadacek, Greger et al., 2000).
Thêm vào các ng thí nghim 1 mL dch chit pyocyanin, 1 mL dch vi khun ca 3 chng V. parahaemolyticus
3.105 cfu/mL t gii nng pyocyanin cui cùng 0,4; 0,8; 1,2; 1,5; 2; 2,5; 3; 3,5; 4 và 5 g/mL. Nuôi lc
200 vòng/phút 30oC. Sau 18 - 24 gi cy 100 L dch vi khun t các ng lên a thch TCBS. m khun
lc sau 24 gi và xác nh MBC.
Phng pháp khuch tán trên a thch
Phng pháp xác nh theo Bauer có thay i cho phù hp vi hot cht nghiên cu (Bauer et al., 1966). Làm
giàu các chng vi khun Vibrio sp. trong môi trng APW, lc 30ºC, 24 gi. Cy tri dch vi khun Vibrio sp. lên
a thch 2216E. t khoanh giy tm PYO vi các nng khác nhau 0,02; 0,04; 0,08; 0,16; 0,33; 0,65; 1,3 và
2,6 µg và kháng sinh i chng Gentamycine 10 µg lên các a ã cy vi khun và 30C. o ng kính
vùng c ch sau 24 gi.
385
KT QU VÀ THO LUN
Phân lp vi khun và c im hình thái chng Pseudomonas sinh PYO
Vi khun sinh PYO c phân lp và sàng lc da trên kh nng sinh sc t có màu xanh c trng ca PYO trên môi trng King A, làm i màu môi trng (hình 1-A), phát hunh quang trên môi trng King B di ánh sáng t ngoi 360 nm (hình 1B) và tit PYO trong môi trng King A lng. 11 chng vi khun thu nhn có kh nng sinh PYO vi các mc khác nhau t các mu nc thu sn ã c phân lp (bng 1). Danh sách các chng sinh PYO c trình bày ti bng di ây gm: PS1; PS2; PS3; PS4; PS5; PS6; PS11; PS33; PS35; PS39 và PS44.
T kt qu nhn c ch ra rng chng PS39 có kh nng sinh PYO cao nht khi so sánh vi các chng còn li da vào vic xác nh hàm lng PYO tit ra trong môi trng King A lng. T kt qu này chng vi khun PS39 c la chn tin hành các nghiên cu tip theo.
Kt qu nhum Gram (hình 1-C) và chp kính hin vi in t quét (hình 1-D) cho thy chng vi khun PS39 là trc khun gram âm, hình que, hai u tròn, chiu dài khong 1 - 1,5 μm, chiu rng khong 0,5 - 1μm, ng mt mình hoc thành ôi.
Kt qu PCR on gen c trng loài P. aeruginosa
Cp mi trên (PA-F; PA-R) có c hiu và nhy 100% vi loài P. aeruginosa (Spilker et al.,
2004), c s dng khuch i on gen PA vi chiu dài mong mun là 956 bp. Kt qu in di sn phm PCR khuch i gen c trng loài P. aeruginosa trên hình 2 cho thy, các chng
vi khun c phân lp da vào các c tính hình thái và s tit PYO u dng tính vi mt bng ADN duy nht có kích thc khong 1.000 bp.
nh danh chng vi khun Pseudomonas phân lp sinh PYO
Xác nh trình t gen mã hoá 16S rRNA ca chng vi khun sinh PYO PS39 và so sánh vi các trình t ã c công b trên Ngân hàng gen quc t. D liu trình t gen 16S rRNA ca chng vi khun PS39 c ng kí trên Ngân hàng gen vi mã s KJ579953.
Kt qu so sánh trình t gen 16S rRNA ca chng PS39 vi các chng vi khun khác trên Genbank ch ra tng ng cao t 93% n 100% (hình 3). c bit, chng vi khun PS39 có tng ng 100% vi các chng P. aeruginosa MCCB117 c phân lp t nc bin ca n và chng P. aeruginosa MCCB102 có ngun gc t nc l ca n . ây là các mu c các nhà khoa hc n dùng nghiên cu thu nhn PYO có kh nng c ch vi khun Vibrio sp. gây bnh tôm sú. Kt hp c im hình thái ca chng PS39 vi kt qu so sánh trình t gen 16S rRNA có th khng nh chng PS39 thuc chi Pseudomonas và c t tên là Pseudomonas sp. PS39.
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Hình 2. Sn phm PCR on gen PA 956 bp ca mt s chng vi khun phân lp.
M: Thang chun ADN 1kp, ging 1: chng âm; ging 2: DNA EI, ging 3-11: các chng phân lp
Hình 3. Cây phát sinh loài ca chng Pseudomonas sp. PS39
(KJ579953)
Bng 1. Kh nng sinh PYO ca các chng vi khun phân lp
TT Kí hiu Kh nng sinh PYO
1 PS1 +
2 PS2 ++
3 PS3 ++
4 PS4 ++
5 PS5 +
6 PS6 ++
7 PS11 ++
8 PS33 ++
9 PS35 ++
10 PS39 +++
11 PS44 ++
B-Vi khun phát quang di ánh sáng UV 360 nm
C-nh nhum Gram vi khun phân lp
D-T bào vi khun di kính hin vi in t quét (SEM) 1000X
Hình 1. Chng Pseudomonas sp. PS39 c phân lp
386
c im sinh hoá ca chng phân lp
nh danh các chng vi khun Gram (-), b Kit 20NE (Biomerieux, Pháp) c s dng nghiên cu. Chng vi khun phân lp quan tâm Pseudomonas sp. PS39 c s dng và kt qu thu nhn so sánh vi chng chun ATCC 27853 và trình bày theo bng 2 di ây. Vi chng PS39, các phn ng (-): sinh indole (TRP); Urease (URE), arabinose (ARA); mannose (MNE), penylacetic acid (PAC); các phn ng (+): kh NO3 (NO3); chuyn hóa Arginine Dihydrolase (ADH); thy phân esculin (ESC), gelatin (GEL); chuyn hoá -galatosidase (PNPG), glucose (GLU), mannitol (MAN), Nacetylglucosamine (NAG), potassium gluconate (GNT), capric acid (CAP), trisodium citrate (CIT).
Bng 2. c im sinh hóa chng Pseudomonas sp. PS39
1-Chng Pseudomonas sp. PS39; 2 - ATCC 27853 b chng chun ca M, theo kit test - API20NE ca BIOMERIEUX; V: tùy theo chng. (-) âm tính; (+) dng tính
T bng 2 cho thy c im sinh hoá ca chng Pseudomonas sp. PS39 phân lp ging vi c im sinh hoá ca chng chun Pseudomonas aeruginosa ATCC27853 t ATCC. Kt qu này thêm phn khng nh các kt qu v ã nhn c ca chng Pseudomonas sp. PS39 trong các thí nghim trc.
Tách chit hot cht pyocyanin và nh lng
ánh giá kh nng sinh PYO bi chng Pseudomonas sp. PS39, chng PS39 c nuôi cy trong môi trng King A 30oC, lc 200 vòng/phút trong khong 5 ngày, tit sc t PYO có màu xanh lá cây (hình 4-A), tan trong nc và chloroform, khuch tán ra môi trng làm môi trng có màu xanh. Thc hin tách chit PYO theo phng pháp mô t trên c minh ho nh hình 4-B. Dch chit thu nhn có màu xanh dng, trong sut (hình 4-C) hàm lng c xác nh theo phng pháp so màu bc sóng 520 nm.
Kh nng kháng khun ca pyocyanin ca chng Pseudomonas sp. PS39
Kh nng kháng các vi sinh vt kim nh ca PYO
Nhm nghiên cu ph kháng khun, dch chit PYO thu c t chng Pseudomonas sp. PS39 c kim tra hot tính c ch ca nó trên các vi sinh vt kim nh (VSVK) theo mô t nh phn phng pháp.
Kt qu cho thy, PYO c ch s tng trng ca vi khun Gram (-) và nm giá tr MIC thp hn (1,625 g/ml) so vi giá tr MIC c ch vi khun Gram (+) (3,25 và 6,5 g/ml). Trong khi giá tr MIC ca kháng sinh cn c ch vi khun cao hn rt nhiu so vi PYO trong nghiên cu này; ví d: c ch chng Gram (+) E. faecalis ATCC299212, kháng sinh Streptomycin cn nng gp 79 ln so vi nng MIC ca PYO và c ch chng Gram (-) P. aeruginosa ATCC27853 thì Streptomycin cn nng cao gp 158 ln (bng 3).
Bng 3. Nng c ch ti thiu ca PYO và các kháng sinh i vi vi sinh vt kim nh
Ghi chú: Gram (+)a: Enterococcus faecalis ATCC299212, Stapphylococus aureus ATCC25923, Bacillus cereus ATCC 13245. Gram (-)b: Escherichia coli ATCC25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC27853, Salmonella enterica ATCC13076. Du -: không thc hin phn ng
Nng c ch ti thiu (MIC) ca PYO i vi các chng Vibrio sp. gây bnh trên tôm
Nng c ch ti thiu ca PYO lên các chng vi khun bnh Vibrio sp., kháng kháng sinh gây bnh hoi t gan tu trên tôm th chân trng ã c th trên 5 chng vi khun i din gây bnh Vibrio sp. bao gm c V. parahaemolyticus (VpKG12T1, VpST22T, VpCMT31) và V. harveyi (Vh3) và V. alginolyticus (Val) mang các
N 0 3
B-Tách chit PYO
C-Dch chit PYO
Hình 4. c im tit sc t xanh ca vi khun Pseudomonas sp. 39 và tách chit, thu nhn PYO
Nng
men
E .
A T
C C
S .
B .
E .
P .
S .
C .
PYO 3,25 6,5 6,5 1,625 1,625 1,625 1,625
Streptomycin 256 256 128 32 256 128 -
Tetracyline 4 16 64 8 256 256 -
Kanamycin 128 4 8 128 64 16 -
Nystatin - - - - - - 8
Cycloheximide - - - - - - 32
CÔNG NGH VI SINH VÀ LÊN MEN
c tính gen quan tâm ánh giá kh nng c ch ti thiu ca dch chit PYO i vi các chng vi khun này. T bng 4 kt qu cho thy, 2 chng VpKG12T1 và VpST22T b c ch sinh trng hoàn toàn nng ti thiu 1,25 g/ml, 3 chng còn li gm VpCMT31, Vh3 và Val b c ch nng 1,75 g/ml.
Bng 4. Nng c ch ti thiu, MIC (g/ml), ca PYO i vi các chng Vibrio sp.
VpKG12T1 VpST22T VpCMT31 Vh3 Val
PYO (g/ml) 1,25 1,25 1,75 1,75 1,75
* Ghi chú: Vp: Vibrio parahaemolyticus; Vh: Vibrio harveyi; Val: Vibrio alginolitycus
Nng dit khun ti thiu (MBC) ca PYO i vi các chng Vibrio gây bnh trên tôm
Các chng Vibrio sp. sau 24 gi c vi PYO các nng khác nhau t 0,4 n 5 g/ml, quan sát c cho thy, tt c 5 chng u sinh trng c nng 1,2 g/ml nhng trong ó 2 chng Val và Vh3 sinh trng c c nng dch chit PYO cao hn là 1,5 g/ml.
Sau khi cy dch vi khun này lên a thch TCBS, kt qu…
Related Documents
