Universidad de Oviedo Departamento de Cirugía y Especialidades Médico-Quirúrgicas “PERFIL ONCOGÉNICO DEL CARCINOMA ADENOIDE QUÍSTICO DE GLÁNDULAS SALIVALES” Guadalupe Sequeiros Santiago Tesis Doctoral (que opta al grado de Doctor por la Universidad de Oviedo)
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PERFIL ONCOGÉNICO DEL CARCINOMA ADENOIDE QUÍSTICO DE ... Perfil oncogénico... · adenoide quístico, por brindarme su dilatada y valiosa experiencia en el campo de la investigación
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Universidad de Oviedo Departamento de Cirugía y Especialidades Médico-Quirúrgicas
“PERFIL ONCOGÉNICO
DEL CARCINOMA ADENOIDE QUÍSTICO
DE GLÁNDULAS SALIVALES”
Guadalupe Sequeiros Santiago Tesis Doctoral (que opta al grado de Doctor por la Universidad
de Oviedo)
Universidad de Oviedo Departamento de Cirugía y Especialidades Médico-Quirúrgicas
“PERFIL ONCOGÉNICO
DEL CARCINOMA ADENOIDE QUÍSTICO
DE GLÁNDULAS SALIVALES”
Tesis Doctoral (que opta al grado de Doctor por la Universidad
de Oviedo)
Autor Guadalupe Sequeiros Santiago
Directores Maria Victoria González Meana Juan Pablo Rodrigo Tapia
“Lo que sabemos es una gota de agua;
lo que ignoramos es el océano”
Isaac Newton
ii
a mi hermana
que forma parte de mi existencia
por los sueños no realizados
a mis padres
iii
AGRADECIMIENTOS
Quiero expresar mi agradecimiento más sincero a todas
aquellas personas que, con su colaboración, han contribuido a
la realidad de este trabajo:
A la Dra. Mª Victoria González Meana, directora de la Tesis,
por su dedicación, contribuyendo con su experiencia y la gran
calidad de su trabajo a elaborar esta Tesis.
Al Dr. Juan Pablo Rodrigo Tapia, codirector de la Tesis, que
encauzó mi trabajo de investigación hacia el carcinoma
adenoide quístico, por brindarme su dilatada y valiosa
experiencia en el campo de la investigación y la práctica
clínica para forjar y dar forma a esta Tesis.
Al Dr. Carlos Suárez Nieto, por su apoyo permanente y
estímulo constante fomentando la investigación en el cáncer
de cabeza y cuello, por la seriedad y rigor con la que lleva a
cabo su trabajo, siendo una referencia a seguir; y por darme
la oportunidad de realizar la Tesis en su servicio.
ii
Al Servicio de Anatomía Patológica del Hospital Central de
Asturias, por su inestimable colaboración en la obtención de
muestras tumorales de sus archivos; especialmente al Dr. D.
Manuel Florentino Fresno Forcelledo, Jefe del Servicio, por su
importantísima participación en la realización e interpretación
de las técnicas inmunohistoquímicas.
Al Servicio de Cirugía Máxilofacial del Hospital Central de
Asturias, que me permitió utilizar los pacientes intervenidos
por ellos para realizar este trabajo; especialmente al Dr. D.
Juan Sebastián López-Arranz, Jefe del Servicio, por su buen
asesoramiento y por brindarme todo tipo de facilidades, de
manera desinteresada, para la obtención del material a
estudio; al Dr. D. Santiago Llorente Pendás, por su generosa
colaboración y disponibilidad, proporcionándome información
clínica de sus pacientes; y al Dr. Jacobo Sánchez Mayoral, que
colaboró en la búsqueda inicial de los pacientes intervenidos
en su servicio.
A los compañeros del Laboratorio de Oncología Quirúrgica del
IUOPA, Doctores y doctorandos, Darío, Juani, Cristina, Emma,
iii
Pablo, Marta y Mariló, por su ayuda y comprensión siempre
que tuve que recurrir a ellos.
A todos mis antiguos compañeros otorrinolaringólogos del
Hospital Central de Asturias, adjuntos y residentes, por
proporcionarme información sobre la evolución de los
pacientes, en especial al Dr. José Luís Llorente Pendás, que,
con su buen hacer, me transmitió sus valiosos conocimientos.
A quienes me quieren y compartieron mi esfuerzo: mis
El trabajo realizado durante esta Tesis Doctoral, ha dado lugar a la siguiente publicación: Sequeiros Santiago G, Rodrigo Tapia JP, Garcia-Carracedo D, Garcia Pedrero J, Suarez Nieto C, Gonzalez Meana MV. CCND1 gene amplification in the adenoid cystic carcinoma of the minor salivary glands. Acta Otorrinolaringol Esp. 2004 Feb;55(2):88-92.
1
Introducción
Introducción
1.1. GENERALIDADES DEL CARCINOMA ADENOIDE
QUÍSTICO DE GLÁNDULAS SALIVALES
1.1.1. Epidemiología
El carcinoma adenoide quístico (CAQ) es un tumor maligno
de estirpe epitelial, descrito por primera vez por Billroth en
1856 (1), quien lo denominó inicialmente “cilindroma” por su
apariencia histológica cilíndrica. Representa aproximadamente
el 1% de los tumores de cabeza y cuello y el 10% de los
tumores de glándulas salivales (2, 3). Es el tumor más
frecuente de las glándulas salivales menores, donde
representa el 60%, siendo el paladar la localización más
frecuente en este tipo de glándulas. Globalmente, a nivel de
cabeza y cuello, la glándula parótida es la localización más
frecuente del CAQ (25%) (4). Se desconocen los factores
etiológicos ligados a su desarrollo.
1.1.2. Histología
De forma característica, este tumor presenta
diferenciación mioepitelial y produce gran cantidad de
proteínas que forman parte de membranas basales y de la
2
Introducción
matriz extracelular. Las tinciones inmunohistoquímicas
confirman la presencia de, al menos, dos tipos de células:
• Células ductales que expresan el antígeno
carcinoembrionario (CEA) y el antígeno de membrana
epitelial (EMA).
• Células no ductales que expresan la actina muscular
específica, característica del mioepitelio.
El CAQ presenta tres patrones de crecimiento o subtipos
histológicos (Figura 1) (4):
• Tubular, presenta conductos bien formados y túbulos
con luces centrales que están delimitadas por una doble capa
de células epiteliales internas y mioepiteliales externas.
• Cribiforme, que es el más frecuente, se caracteriza por
nidos de células con espacios microquísticos cilindromatosos.
Estos espacios están llenos de material hialino o mucoide
basófilo.
• Sólido o basaloide, único en el que se observan focos de
necrosis, pleomorfismo celular y mitosis. Formado por
sábanas de células basaloides uniformes que pierden la
formación tubular o microquística. Es el menos frecuente.
3
Introducción
Ciertos tumores del subtipo sólido contienen estructuras
trabeculares, por lo que algunos autores han reconocido un
cuarto subtipo, el trabecular.
En la mayoría de los tumores se observan los cuatro
patrones en proporciones variables, siendo el de mayor
representación el que condiciona el diagnóstico patológico.
Numerosos estudios han descrito una asociación entre el
subtipo histológico y el pronóstico de la enfermedad (5); así,
el subtipo tubular tiene el mejor pronóstico con respecto a la
recurrencia o metástasis, el cribiforme tiene un pronóstico
intermedio, y el subtipo sólido tiene el peor pronóstico, ya que
se asocia con recurrencia precoz de la enfermedad, desarrollo
temprano de metástasis a distancia (2, 6) y elevada tasa de
mortalidad. El patrón trabecular presenta un comportamiento
intermedio entre los subtipos cribiforme y sólido (7).
4
Introducción
TUBULAR
CRIBIFORME
SÓLIDO
Figura 1. Subtipos histológicos del CAQ (H-E, X20)
Esta asociación entre el subtipo histológico y el pronóstico
ha llevado a clasificar el CAQ según su grado de malignidad,
admitiéndose dos tipos de clasificaciones:
Según Szanto (5):
• Grado I: tumores con áreas tubulares y cribiformes
sin componentes sólidos.
• Grado II: tumores cribiformes puros o mixtos, con
menos del 30% de áreas sólidas.
5
Introducción
• Grado III: tumores consistentes en más del 30% de
patrón sólido.
Según Yamamoto et al. (7):
- Tumores de bajo grado (subtipos tubular y cribiforme)
- Tumores de alto grado (subtipos trabecular y sólido).
A nivel histológico un fenómeno único en el CAQ es la
propensión a la invasión perineural, tanto microscópica como
macroscópica, a través de nervios mayores y menores (3, 4,
8, 9). No se conoce la causa de este patrón de crecimiento,
presente por igual en los tumores de alto y bajo grado de
malignidad, y también en estadios tumorales precoces. La
existencia de invasión perineural se relaciona con un peor
pronóstico de la enfermedad cuando afecta a nervios mayores
(10, 11).
1.1.3. Clínica
El CAQ se caracteriza por presentar un curso clínico
prolongado, con un crecimiento lento y progresivo, y una
infiltración insidiosa de los tejidos adyacentes. Parece existir
una correlación entre el sitio de origen y el pronóstico; los
CAQs que asientan en glándulas salivales menores, por lo
general, están avanzados en el momento del diagnóstico, ya
6
Introducción
que, debido a este lento crecimiento, el diagnóstico suele ser
tardío. A diferencia de éstos, los tumores de glándulas
salivales mayores presentan un mejor pronóstico por su
diagnóstico más precoz y su más fácil acceso. Así, se ha
descrito que los CAQs de la cavidad nasal y senos paranasales
presentan peor pronóstico que los de cualquier otra
localización en el área de cabeza y cuello (12, 13).
Debido a su crecimiento y progresión perineural, a través
de nervios mayores y menores (3, 4, 8, 9), no es infrecuente
que los carcinomas localizados en las fosas nasales pasen a la
cavidad intracraneal por los agujeros oval o redondo mayor, o
bien aparezcan recidivas intracraneales tiempo después de la
cirugía.
Otra característica de este tumor es su tendencia a las
recidivas locales múltiples; así, a pesar de realizar un
tratamiento local agresivo, la mayoría de los pacientes (60%)
desarrollan recurrencias. Aproximadamente el 2% de las
recurrencias son clínicamente evidentes en los dos primeros
años después del tratamiento.
Las metástasis ganglionares no son frecuentes en este
tumor (5%), ni al diagnóstico ni durante el curso de la
enfermedad. Las metástasis a distancia ocurren en un 33-
7
Introducción
40% de los casos, y pueden aparecer incluso décadas después
del tratamiento del tumor primario (14) y tras haber logrado
un adecuado control locorregional; suelen asentar en pulmón,
seguido del hueso y, con menor frecuencia, en el hígado. A
diferencia de otros tumores malignos de cabeza y cuello, los
pacientes con CAQ a menudo sobreviven durante largos
períodos de tiempo con metástasis a distancia (15).
1.1.4. Tratamiento
El tratamiento de elección es la cirugía. La extensión de la
resección quirúrgica (completa vs residual microscópica) tiene
un impacto significativo en la supervivencia libre de
enfermedad y en el control local, pero carece de impacto
sobre la supervivencia global debido al lento crecimiento de
este tipo de tumores (16).
El CAQ es un tumor radiosensible pero no radiocurable.
Varios estudios señalan que la combinación de cirugía y
radioterapia ofrece las mejores tasas de control de la
enfermedad (15). Así, la radioterapia estaría indicada en los
siguientes casos: localización tumoral próxima a base de
Tabla 5. Resultados de amplificación génica de las recidivas
(R) y sus tumores primarios (T) correspondientes, en caso de estar disponibles.
4.3. NIVELES DE EXPRESIÓN PROTEICA
4.3.1. Expresión de c-kit
Se observó un patrón de tinción de membrana en todos
los casos positivos. Los resultados de IHQ para c-kit se
valoraron teniendo en cuenta tanto el nivel de la tinción (en
una escala 0-3) (a) como el porcentaje de células teñidas (en
una escala 0-100) (b), y se estableció una puntuación con el
producto de estos parámetros (a x b). Los casos negativos se
consideraron como una categoría, y entre los casos positivos
se diferenciaron dos, en función del valor de la mediana de la
puntuación. Los resultados se recogen en la Tabla 6. La Figura
56
Resultados
11 muestra imágenes representativas de los distintos niveles
de tinción observados.
IHQ c-kit Nº casos % Negativo Moderado Intenso
9 7 5
42,86 33,33 23,81
TOTAL 21 100
Tabla 6. Distribución de los casos según el nivel de
expresión de c-kit
57
Resultados
Figura 11. Imágenes representativas de los distintos niveles de expresión observados para c-kit en los CAQ primarios por análisis inmunohistoquímico, con un patrón de tinción de membrana característico.A, control positivo (melanoma), B, CAQ negativo para c-kit; C, CAQ con expresión moderada; D, tumor con expresión intensa. (Barra de escala, 250 µm).
58
Resultados
4.3.2. Expresión de EGFR
La expresión de EGFR fue negativa en todos los casos
analizados (Figura 12).
Figura 12. Imagen representativa de los resultados obtenidos mediante IHQ para la detección de EGFR. En
ningún caso se detectó señal. El control positivo (muestra de carcinoma de colon) presenta el patrón de membrana esperado con una intensidad elevada (Barra
de escala, 250 µm).
4.3.3. Expresión de ciclina D1
La tinción IHQ de ciclina D1 presentaba un patrón nuclear.
Únicamente resultaron positivas las células epiteliales. Estas
células forman ductos que contienen mucopolisacáridos, a
diferencia de las células mioepiteliales que las rodean
(negativas para ciclina D1), que secretan componentes de la
membrana basal. Dado que el 100% de las células epiteliales
59
Resultados
mostraban tinción de ciclina D1, se estableció la puntuación
para este marcador atendiendo únicamente al nivel de
expresión nuclear, en las siguientes categorías: bajo,
moderado e intenso (Figura 13). Los resultados se recogen en
la Tabla 7.
Por otro lado, se recogió la información referente al
porcentaje de células epiteliales observadas en cada caso.
Tras una división de la población en función del valor de la
mediana, se clasificaron los tumores en dos grupos:
proporción reducida (11/22 casos) vs proporción elevada de
componente epitelial (11/22 casos).
IHQ ciclina D1 Nº casos % Bajo
Moderado Intenso
4 7 11
18,18 31,82
50 TOTAL 22 100
Tabla 7. Distribución de los casos
según el nivel de expresión de ciclina D1
60
Resultados
Figura 13. Imágenes representativas de los distintos niveles de expresión detectados para ciclina D1. A, control positivo (tejido de amígdala normal); B, CAQ mostrando intensidad baja; C, intensidad moderada; D, intensidad elevada. (Barra de escala, 250 µm).
61
Resultados
4.4. RELACIÓN ENTRE LA AMPLIFICACIÓN GÉNICA
DE DIVERSAS DIANAS
• Se encontró una correlación estadísticamente
significativa entre las amplificaciones génicas de PIK3CA
y CCND1 (χ2 = 5,919, p = 0,015) (Tabla 8).
CCND1 PIK3CA No amplificado Amplificado Total
No amplificado 11 4 15 Amplificado 2 7 9
Total 13 11 24
Tabla 8. Distribución de los CAQs según el estado de amplificación de PIK3CA y CCND1.
• De los 16 casos con amplificación de ERBB1, 8
mostraban esta alteración para PIK3CA (χ2 = 3,2, p =
0,074) (Tabla 9), y en 10/16 se hallaba su
coamplificación con CCND1 (χ2 = 5,371, p = 0,02)
(Tabla 10).
62
Resultados
PIK3CA ERBB1 No amplificado Amplificado Total
No amplificado 7 1 8 Amplificado 8 8 16
Total 15 9 24
Tabla 9. Distribución de los CAQs según el estado de amplificación de ERBB1 y PIK3CA.
CCND1 ERBB1 No amplificado Amplificado Total
No amplificado Amplificado
7 6
1 10
8 16
Total 13 11 24
Tabla 10. Distribución de los CAQs según el estado de amplificación de ERBB1 y CCND1.
• 7/24 (29,1%) casos contaban con la amplificación
de los genes ERBB1, CCND1 y PIK3CA, lo cual convierte
a este patrón de amplificación oncogénica en el más
frecuentemente observado en nuestra serie de CAQs.
63
Resultados
4.5. RELACIÓN ENTRE LA AMPLIFICACIÓN GÉNICA
Y LA EXPRESIÓN PROTEICA
4.5.1. ERBB1 – EGFR
La amplificación génica de ERBB1 no se refleja en un
aumento de la expresión protéica de EGFR, ya que ningún
caso presentaba expresión de EGFR.
4.5.2. c-kit - c-kit
El único caso positivo para amplificación génica mostraba
un nivel moderado de expresión de c-kit.
4.5.3. CCND1 – ciclina D1
La variable que recoge los resultados de expresión
proteica de ciclina D1 se recodificó, con fines estadísticos, en
dos categorías: bajo vs moderado-intenso. Se observó una
tendencia en la correlación de esta variable con el nivel de
amplificación de CCND1, aunque no se alcanzó significación
estadística (χ2 = 0,306, p = 0,08). La distribución de los casos
en función de estas variables se recoge en la Tabla 11. Como
se puede apreciar, la expresión de la ciclina D1 fue
moderada/intensa en todos los casos, excepto uno, con
64
Resultados
amplificación del gen. Sin embargo, 8 de los 11 casos sin
amplificación también mostraron expresión moderada/intensa,
lo que sugiere que otros mecanismos, además de la
amplificación, pueden ser responsables de la sobreexpresión
de la ciclina D1.
Ciclina D1 CCND1 Bajo Moderado/intenso Total
No amplificado 3 8 11 Amplificado 1 10 11
Total 4 18 22
Tabla 11. Distribución de los CAQs según el nivel de expresión de ciclina D1 y el estado de
amplificación génica para CCND1.
La Tabla 12 muestra el detalle de los resultados obtenidos
para los estudios de amplificación génica y la correspondiente
expresión proteica de los marcadores estudiados para cada
Tabla 12. Resultados obtenidos del estudio de amplificación génica y su correspondiente proteína. SR, sin resultado. Los casos T8 y T15 no pudieron ser estudiados por IHQ por no
disponer de tejido parafinado.
66
Resultados
67
4.6. RELACIÓN ENTRE LAS ALTERACIONES
MOLECULARES Y LOS PARÁMETROS CLÍNICO-
PATOLÓGICOS
Una vez dicotomizada la variable “categoría T” en los
grupos 1-2 y 3-4, se observó una asociación entre los
tumores avanzados (T3-T4) y la presencia de amplificación en
CCND1 (χ2 = 3,962, p = 0,047).
Asimismo, se encontró una asociación entre la
amplificación de PIK3CA y el subtipo histológico, siendo más
frecuente en los subtipos tubular y sólido (100% y 66%,
respectivamente) (χ2 = 5,04, p = 0,019). Las Tablas 13 y 14
muestran la distribución de los casos en función de los
estudios llevados a cabo en los genes y proteínas,
respectivamente, y las variables clínico-patológicas
consideradas.
ERBB1 c-kit PIK3CA CCND1 c-mycPatrón más frecuente
Amp TOTAL Amp TOTAL Amp TOTAL Amp TOTAL Amp TOTAL SI TOTAL Menor 11 17 1 16 7 17 8 17 2 17 5 17 Mayor 5 7 0 5 2 7 3 7 0 6 2 7 TOTAL 16 24 1 21 9 24 11 24 2 23 7 24
Tabla 13. Distribución de los casos en función de los resultados obtenidos en cuanto a la amplificación de los distintos oncogenes estudiados, relacionado con las variables clínico-patológicas de interés. p
correspondiente a la prueba χ2.
Resultados
69
c-kit Ciclina D1 Negativo Moderado Intenso TOTAL Bajo Moderado Intenso TOTAL
Menor 7 4 4 15 4 5 6 15 Mayor 2 3 1 6 0 2 5 7 TOTAL 9 7 5 21 4 7 11 22
Tabla 14. Distribución de los casos en función de los resultados obtenidos en cuanto a la expresión de c-kit y ciclina D1, relacionados con las variables clínico-patológicas de interés.
p correspondiente a la prueba χ2.
Resultados
Conviene apuntar que, dado que la práctica totalidad de
los casos no mostraban afectación ganglionar ni metástasis a
distancia en el momento del diagnóstico, su distribución
según la categoría T y el estadio tumoral son coincidentes, por
lo que en las tablas sólo se muestra el primero.
Cabe destacar que los casos en los que se observaba un
mayor porcentaje de células epiteliales, la expresión de ciclina
D1 presentaba mayor intensidad (χ2 = 4,961, p = 0,084)
(Tabla 15). La proporción de componente epitelial no se
correlacionaba con ninguna otra variable clínico-patológica.
Nivel expresión ciclina D1 % células epiteliales Bajo Moderado Intenso Total Reducido 4 3 4 11 Elevado 0 4 7 11
Total 4 7 11 22
Tabla 15. Distribución de los tumores en función del nivel de expresión de ciclina D1 y el porcentaje de
células epiteliales observado.
Teniendo en cuenta el número de oncogenes amplificado
en cada caso (ninguno-uno vs dos o más), se observó una
tendencia a encontrar mayor frecuencia de invasión perineural
en los casos con amplificación en dos o más oncogenes frente
70
Resultados
a los que tenían uno o ningún oncogén amplificado (p > 0,05)
(Tabla 16).
Nº oncogenes amplificados Invasión
perineural Ninguno o
uno Dos a cuatro
Total
NO 4 2 6 SI 5 8 13
Total 9 10 19
Tabla 16. Distribución de los CAQs según el número de oncongenes amplificados en relación con la invasión
perineural.
La aparición de recidivas era independiente de cualquier
variable molecular. Sin embargo, se encontró una asociación
entre la amplificación de ERBB1 y la aparición de metástasis a
distancia (χ2 = 4,941, p = 0,026). Así, mientras el 44% de los
casos (7/16) con amplificación en ERBB1 desarrollaron
metástasis a distancia, éstas no se presentaron en ninguno de
los casos que carecían de esta alteración génica (Tabla 17).
71
Resultados
ERBB1 Metástasis No amplificado Amplificado Total
NO 8 9 17 SI 0 7 7
Total 8 16 24
Tabla 17. Distribución de los CAQs según el estado de amplificación de ERBB1 en relación con la
aparición de metástasis.
Análogamente, la aparición de metástasis a distancia
tendía a ser más frecuente (χ2 = 3,601, p = 0,058) en los
casos que presentaban coamplificación de las dianas ERBB1 y
CCND1 (50% vs 14% de los casos sin coamplificación) (Tabla
18).
Coamplificación ERBB1/CCND1
Metástasis Negativo Positivo Total NO SI
12 2
5 5
17 7
Total 14 10 24
Tabla 18. Distribución de los CAQs según el estado de coamplificación de ERBB1 y CCND1
en relación con la aparición de metástasis.
72
Resultados
0 50 100 150 200 250 300
Tiempo (meses)
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Supe
rviv
enci
a ac
umul
ada
Función de supervivencia Censurados
4.7. ANÁLISIS DE SUPERVIVENCIA
La media de supervivencia para la población global fue de
6 años y 1,5 meses (73,54 meses, rango 1-276). La media de
supervivencia para los pacientes que murieron por CAQ fue de
3 años y 11 meses (47 meses, rango 1-159). Los resultados
del análisis univariante de supervivencia (Kaplan-Meier)
mostraron una supervivencia global del 81% a los 5 años y
del 58% a los 15 años (Figura 14).
Figura 14. Supervivencia global de los pacientes estudiados.
73
Resultados
En cuanto a la influencia de las distintas variables clínico-
patológicas consideradas, cabe destacar el impacto del
subtipo histológico sólido (supervivencia media 28 meses
(S.E. 14)), asociado de manera estadísticamente significativa
con una supervivencia reducida (log rank p = 0.0206), frente
al subtipo histológico cribiforme (supervivencia media 193
meses (S.E. 40)). La Figura 15 muestra las curvas de
Figura 15 . Análisis de Kaplan-Meier que muestra la supervivencia, estratificando a los pacientes según el subtipo
histológico.
74
Resultados
Asimismo, el tipo de tratamiento elegido, considerando
únicamente a los pacientes tratados con cirugía vs cirugía y
radioterapia, mostró tener un efecto sobre la supervivencia.
Así, los pacientes sometidos a cirugía y radioterapia
presentaron una supervivencia media de 222,93 meses (S.E.
32,5), frente al otro grupo, cuya supervivencia media fue de
36 meses (S.E. 17,0) (log rank p = 0,008) (Figura 16).
Tratamiento Cirugía Cirugía &radio
Censurados
0 50 100 150 200 250 300
Tiempo (meses)
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Supe
rviv
enci
a ac
umul
ada
Tra
Figura 16. Análisis de Kaplan-Meier que muestra la supervivencia, estratificando a los pacientes según el
tratamiento aplicado.
75
Resultados
Las variables categoría T, invasión perineural y los
márgenes quirúrgicos no mostraron ninguna influencia en la
supervivencia de estos pacientes (Figuras 17-19).
Categoría T 1-2 3-4
0 50 100 150 00 250 300
Tiempo (meses)2
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Supe
rviv
enci
a ac
umul
ada
Ca
Censurados
Figura 17. Análisis de Kaplan-Meier que muestra la supervivencia, estratificando a los pacientes según la
categoría T (p = 0,735).
76
Resultados
Invasión perineural NO SI
0 100 200 300
Tiempo (meses)
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Supe
rviv
enci
a ac
umul
ada
Inpe
Censurados
Figura 18. Análisis de Kaplan-Meier que muestra la supervivencia, estratificando a los pacientes según la
invasión perineural (p = 0,234).
77
Resultados
Márgenes Quirúrgicos No afectados Afectados
Censurados
0 100 0 300
Tiempo (meses)
20
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Supe
rviv
enci
a ac
umul
ada
Mqu
Figura 19. Análisis de Kaplan-Meier que muestra la supervivencia, estratificando a los pacientes según la afectación de los márgenes quirúrgicos (p = 0,281).
78
Resultados
En cuanto a las alteraciones moleculares estudiadas,
ninguna de ellas mostró un efecto sobre la supervivencia
(Figuras 20-25).
0 100 200 300
Tiempo (meses)
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Supe
rviv
enci
a ac
umul
ada
ERBB1 No amplificado Amplificado
Censurados
Figura 20. Análisis de Kaplan-Meier que muestra la supervivencia, estratificando a los pacientes según el estado
de amplificación del oncogén ERBB1 (p = 0,142).
79
Resultados
0 50 100 150 200 250 300
Tiempo (meses)
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Supe
rviv
enci
a ac
umul
ada
CCND1 No amplificado
Amplificado
Censurados
Figura 21 Análisis de Kaplan-Meier que muestra la
supervivencia, estratificando a los pacientes según el estado de amplificación de CCND1 (p = 0,474).
80
Resultados
PIK3CA No amplificado Amplificado
Censurados
0 50 100 150 200 250 300
Tiempo (meses)
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Supe
rviv
enci
a ac
umul
ada
P
Figura 22. Análisis de Kaplan-Meier que muestra la supervivencia, estratificando a los pacientes según el estado
de amplificación de PIK3CA (p = 0,342).
81
Resultados
Amplificación ERBB1/PIK3CA/CCND1
Negativo Positivo
Censurado
0 50 100 150 200 250 300
Tiempo (meses)
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Supe
rviv
enci
a ac
umul
ada
EP
Amp
Figua 23. Análisis de Kaplan-Meier que muestra la supervivencia, estratificando a los pacientes según la
presencia de la amplificación simultánea de ERBB1, PIK3CA y CCND1 (p = 0,175).
82
Resultados
Número oncogenes Amplificados
0-1 2 o más
Censurados
0 50 100 150 200 250 300
Tiempo (meses)
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Supe
rviv
enci
a ac
umul
ada
Non
am
Figura 24. Análisis de Kaplan-Meier que muestra la supervivencia, estratificando a los pacientes según el número
de oncogenes con amplificación (p = 0,674).
83
Resultados
Ciclina D1
Bajo
Moderado-intenso
Censurados
0 100 200 300
Tiempo (meses)
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Supe
rviv
enci
a ac
umul
ada
Ci
Figura 25. Análisis de Kaplan-Meier que muestra la supervivencia, estratificando a los pacientes según el nivel de
expresión de ciclina D1 (p = 0,407).
84
Discusión
5
Discusión
85
Discusión
Uno de los retos actuales de la Biología Molecular es llegar
a esclarecer las bases genéticas y moleculares que conducen
al desarrollo y progresión de una neoplasia. El carcinoma
adenoide quístico (CAQ) es un tipo de tumor caracterizado por
un lento crecimiento, pero con una elevada tendencia al
desarrollo de metástasis a distancia. Las alteraciones
moleculares y citogenéticas subyacentes a su desarrollo,
están aún por determinar, a diferencia de otros cánceres,
para los que se ha logrado establecer un patrón de
alteraciones genético-moleculares responsables de la
tumorigénesis y con implicaciones terapéuticas y pronósticas
(como es el caso del adenocarcinoma de colon o del
carcinoma epidermoide de cabeza y cuello, HNSCC). Por ello,
se hace necesaria la identificación de las alteraciones
genéticas y los consiguientes cambios de expresión proteica
responsables del crecimiento y la progresión de los CAQs.
En este estudio hemos analizado seis oncogenes cuya
ganancia de función se relaciona con el desarrollo tumoral y
hemos valorado su grado de implicación en el desarrollo del
CAQ de glándulas salivales.
La sobreexpresión de ciclina D1 es una característica de
muchos tumores y resulta con frecuencia de la amplificación
86
Discusión
de su gen, CCND1. Se cree que ambos fenómenos
contribuyen al crecimiento de las células tumorales y a la
progresión del cáncer (54).
En nuestro estudio, el nivel de expresión de ciclina D1 fue
intenso en la mitad de los casos y un 31,82% adicional
mostraba tinción moderada, resultados que concuerdan con
estudios previos que han mostrado una sobreexpresión entre
el 32 y el 90% de los casos (69-71). Estos resultados
sugieren que se trata de un fenómeno muy frecuente en este
tipo de tumor. Sin embargo, el hecho de que ciclina D1 se
encuentre sobreexpresada de forma independiente del subtipo
histológico, sugiere que este fenómeno podría jugar un papel
en la progresión del CAQ global, más que en la generación de
las características propias de un subtipo concreto. En la línea
de nuestros resultados, otros autores han demostrado que la
presencia de la sobreexpresión de ciclina D1 no es diferente
entre los tumores benignos o malignos de las glándulas
salivales (72), lo cual limita su valor pronóstico.
El impacto de la sobreexpresión de ciclina D1 en la
proliferación celular en el CAQ es una cuestión controvertida.
Estudios básicos previos demuestran que la inhibición de la
expresión de ciclina D1 en líneas celulares de CAQ, no influye
87
Discusión
en el crecimiento celular (73). En nuestro estudio se describe
por primera vez que la tinción IHQ de ciclina D1 se observaba
únicamente en el componente epitelial de cada tumor
estudiado. Estas células forman ductos que contienen
mucopolisacáridos, a diferencia de las células mioepiteliales,
que secretan componentes de la membrana basal. El 100%
de las células epiteliales mostraban tinción de ciclina D1. El
hecho de que la intensidad de expresión de ciclina D1
tendiese a ser superior en aquellos casos que mostraban una
proporción de células epiteliales más elevada sugeriría que la
expresión de ciclina D1 contribuiría a una mayor tasa de
proliferación, lo cual concuerda con el papel establecido para
esta proteína en el control del ciclo celular.
La distribución de los casos en función de la proporción de
componente epitelial era independiente del subtipo histológico
(tubular, cribiforme y sólido), lo cual sugiere una ausencia de
relación entre la abundancia de células epiteliales (asociada a
una expresión más intensa de ciclina D1) y el pronóstico de la
enfermedad derivado de la clasificación histológica.
Los mecanismos exactos responsables de la
sobreexpresión de ciclina D1 en CAQ están aún por
determinar. La amplificación génica podría ser uno de ellos y
88
Discusión
se encuentra presente en otros tipos de carcinomas humanos,
como es el caso de HNSCC, para el que se describe con una
frecuencia en torno al 30% (74, 75). La tasa de amplificación
génica de CCND1 descrita para CAQ en la literatura se
encuentra en un 5% (71). En nuestro estudio encontramos
esta alteración en el 45,8% de los casos (11/24). Los
diferentes abordajes técnicos podrían justificar la diferencia,
siendo la detección basada en PCR, como la del presente
estudio, de mayor sensibilidad frente a FISH. En nuestra
serie, aunque no observamos una asociación significativa
entre la amplificación de CCND1 y la sobreexpresión de la
proteína (p = 0,08), 10/11 casos con amplificación génica
muestran una expresión proteica moderada/intensa. Sin
embargo, 8/18 casos con expresión moderada/intensa no
tenían amplificado el gen, lo cual indica que la sobreexpresión
de ciclina D1 podría justificarse sólo en parte por amplificación
génica y sugeriría la presencia de otros mecanismos
responsables de tal sobreexpresión. Entre ellos, se podría
mencionar un aumento en la tasa de transcripción o de la
estabilidad del mRNA. Adicionalmente, los niveles de ciclina
D1 podrían estar modulados por la degradación en el
proteasoma mediada por ubiquitina (76).
89
Discusión
Cabe destacar la asociación encontrada en el presente
estudio entre la presencia de amplificación en CCND1 y una
categoría T/estadio tumoral más avanzado (p = 0,047),
observación que ha sido descrita en el HNSCC (74, 77).
La sobreexpresión de c-kit se encuentra en varios tipos de
neoplasias humanas, entre los que cabe destacar los tumores
estromales gastrointestinales (GIST) (29), para los que se ha
demostrado una relación entre la activación de c-kit y la
patogénesis de la enfermedad (30). El papel de la expresión
de c-kit en la historia natural del CAQ es desconocido. En
nuestro estudio, hemos utilizado el anticuerpo A4502 de
DAKO, que ha sido testado previamente junto con una batería
de diversos anticuerpos anti-c-kit, mostrando los resultados
más reproducibles y específicos frente a varios tipos de
tumores humanos (78). Mediante IHQ, hemos encontrado una
expresión moderada/intensa en el 57,14% (12/21) de los
CAQs. Un mecanismo que podría justificar esta
sobreexpresión de c-kit podría ser un incremento del número
de copias del gen, como fue demostrado para otros tipos de
tirosin quinasas transmembrana tipo III, como ABL y PDGFR,
donde una tasa de transcripción incrementada resulta de un
efecto de dosis del gen. Sin embargo, sólo uno de los CAQs
90
Discusión
estudiados contaba con amplificación génica, caso que
mostraba un nivel de expresión moderado. Estos resultados
coinciden con un estudio previo en el que, mediante el uso del
mismo anticuerpo y la misma técnica de detección, se
muestra sobreexpresión en 29/55 (52,7%) tumores, de los
que sólo 3 fueron positivos para amplificación génica,
detectada por FISH. La tinción era menos intensa en los CAQs
de subtipo sólido frente a los tubulares o cribiformes (79),
resultado que no se reproduce en nuestro estudio, en el que
el nivel de expresión de c-kit era independiente del subtipo
histológico. Otros estudios detectaron una sobreexpresión de
c-kit en el 78% y 71% de los CAQs, respectivamente (28,
80). Estos resultados sugieren que la amplificación génica
podría no contribuir a la frecuente sobreexpresión proteica,
cuyos mecanismos responsables están, por tanto, por
determinar.
Ninguna de las recidivas presentó amplificación de c-kit, y
tampoco recidivó el único caso que presentó amplificación del
gen. Las tasas de recurrencia permanecieron similares en los
grupos c-kit positivos y c-kit negativos. Estos resultados están
en concordancia con el estudio de Aslan (81) en el que no se
encontró relación entre la expresión de c-kit y la recurrencia
91
Discusión
de la enfermedad, lo cual sugeriría que c-kit podría no influir
en el curso natural del CAQ.
c-kit es una diana molecular frente a la que actúa el
mesilato de imatinib (Glivec®). El éxito de esta terapia en
GIST que expresan c-kit, hizo pensar en su posible utilidad en
el tratamiento de los CAQs, donde, como se ha demostrado,
la sobreexpresión de c-kit es también muy frecuente. Sin
embargo, los resultados del uso terapéutico de Glivec® en
CAQ son controvertidos. Varios estudios, entre ellos un
ensayo en fase II, han mostrado que Glivec® no tiene efecto
sobre el CAQ avanzado de cabeza y cuello (82, 83). No se
sabe con certeza qué factor determina el éxito del
tratamiento. Algunos autores sugieren que el nivel de
expresión de c-kit, podría establecer un subgrupo de
pacientes con mayor probabilidad de beneficiarse del mismo
(79). Sin embargo, la idea de que los tumores que expresan
c-kit serán sensibles a Glivec® es simplista, ya que la
expresión de c-kit por sí sola no predice la respuesta a este
fármaco. La presencia de mutaciones activantes puede ser
crítica (82), como las descritas en GIST, en el que se han
encontrado mutaciones somáticas en los exones 9 y 11, que
codifican el dominio juxtamembrana de c-kit (84) y que
92
Discusión
confieren a la proteína una ganancia de función. Por otro lado,
éstas no se han encontrado en tumores de mama (85), ni en
neoplasias de las glándulas salivales (86), hecho que podría
justificar el fracaso de Glivec® en el tratamiento del CAQ.
El gen ERBB1 se encuentra frecuentemente
sobreexpresado en varios tipos de tumores humanos. En
HNSCC esta alteración se produce con elevada frecuencia y se
asocia a enfermedad avanzada, desarrollo de un fenotipo
metastático y un pronóstico pobre (24, 25).
El hecho de que se trate de un receptor de membrana ha
permitido el desarrollo de anticuerpos monoclonales y
pequeñas moléculas inhibidoras dirigidos a disminuir su
actividad en aquellos casos que muestren sobreexpresión de
EGFR.
Hasta el momento, la prevalencia y el papel que pueda
jugar la sobreexpresión de EGFR en CAQ no están claros. Los
diferentes estudios realizados hasta la fecha para su detección
presentan datos contradictorios. Mientras un solo estudio
clasifica como positivos el 85% de los casos estudiados
(23/27) (87), la mayoría apuntan a una prevalencia mínima
de sobreexpresión de EGFR (0/16 y 1/43 casos) (88, 89). Así,
nuestro estudio se sumaría al argumento de la baja o nula
93
Discusión
prevalencia de sobreexpresión de EGFR en CAQ, ya que
ninguno de los casos estudiados resultó positivo. Las
discrepancias frente al estudio de Vered (87) se podrían deber
a cuestiones técnicas, dada la variedad de anticuerpos
disponibles y diversos protocolos utilizados en cada
laboratorio. En nuestro caso, el hecho de haber utilizado un
anticuerpo anti-EGFR con los debidos controles y
sobradamente validado en la práctica hospitalaria, nos
permite confiar en la validez de los resultados obtenidos.
Uno de los mecanismos mejor descritos para justificar la
sobreexpresión de EGFR es el de la amplificación oncogénica,
presente en los casos de HNSCC con niveles elevados de la
proteína. La frecuencia descrita en este tipo de tumor varía
entre el 15% y el 58%, habiéndose observado su asociación
con un pronóstico pobre, con tumores clínicamente más
avanzados, pobremente diferenciados, con presencia de
metástasis ganglionares y de localización hipofaríngea (24,
90-92).
Nuestro estudio es el primero en el que se evalúa el nivel
de amplificación génica de ERBB1 en CAQ. En nuestra serie,
ERBB1 fue el oncogén que presentaba esta alteración con
mayor frecuencia (66,67%, 16/24 tumores primarios), y este
94
Discusión
fenómeno se asociaba a la aparición de metástasis (p =
0,026), lo cual convierte a este oncogén en una diana de
potencial interés en la práctica clínica.
El hecho de que la amplificación génica no se refleje en un
aumento de la expresión proteica induce a pensar en la
posibilidad de que otros genes localizados en la región en la
que se localiza ERBB1 (7p11.2) sean las verdaderas dianas de
la amplificación, proceso que podría arrastrar a ERBB1. Uno
de estos genes candidatos localizado en 7p11.2 podría ser
Grb10, que codifica una proteína adaptadora que interacciona
con varias tirosin quinasa celulares, y se ha visto implicado en
la tumorigénesis humana (93).
Cabe destacar que 10 de los 11 tumores primarios que
mostraron amplificación para CCND1, también mostraban esta
alteración para ERBB1 (p = 0,02). La aparición de metástasis
tendía a ser más frecuente entre los casos que presentaban
coamplificación de estas dos dianas (p > 0,05).
La amplificación génica afectaba al gen PIK3CA en 9/24
casos (37,9%), frecuencia similar a la encontrada para
HNSCC en nuestro laboratorio (94), siendo éste el primer
trabajo en el que se describe esta alteración en CAQ.
Teniendo en cuenta la función de la proteína codificada por
95
Discusión
PIK3CA, p110α, y a falta de estudios moleculares básicos
llevados a cabo de forma específica sobre líneas de CAQ, se
podría especular con la posible activación constitutiva de la
vía de señalización de la que forma parte y que, a través de la
activación de una de las proteínas clave, la serin-treonín
quinasa Akt, conduciría a respuestas celulares de resistencia a
apoptosis y mayor tasa de proliferación celular.
Se encontró una asociación entre la amplificación de
PIK3CA y el subtipo histológico. Mientras el 100% y el 67% de
los tumores tubulares y sólidos, respectivamente, mostraban
esta alteración, tan sólo estaba presente en el 22,22% de los
cribiformes (p = 0,019). Sin embargo, esta observación
carece de valor pronóstico, dado que la asociación encontrada
relaciona la amplificación de PIK3CA, tanto con el subtipo
histológico de mejor evolución como con el de peor evolución.
Por otro lado, se encontró una correlación entre la
presencia de amplificación génica en CCND1 y en PIK3CA (p =
0,015), con una frecuencia del 21,17% (7/24). 7 de los 11
casos (63,64%) con amplificación en CCND1 contaban con
esta alteración en PIK3CA. Este fenómeno ha sido observado
también en una serie de HNSCC estudiada en nuestro
laboratorio, en la que aparecía con una frecuencia del 28%
96
Discusión
(32/111), y se encontraba asociado a estadio tumoral
avanzado. Algunos autores (95) muestran que el 50% de los
casos de HNSCC con amplificación en 11q13 mostraban una
recombinación con la parte distal de 3q, lo cual podría reflejar
un efecto sinérgico entre la amplificación de CCND1 y la
ganancia en 3q en la tumorigénesis. Se podría especular
acerca de la posibilidad de que este tipo de mecanismos
estuviera presente en los CAQs, para los que la
coamplificación se observa con una frecuencia similar.
Además, ERBB1 se encontró amplificado en 8/9 casos que
mostraban esta alteración para PIK3CA (p = 0,074), por lo
que se podría también especular con un efecto sinérgico entre
las ganancias en 3q y 7p, aunque esto no ha sido descrito
hasta la fecha.
La amplificación de MDM2 confiere potencial tumorigénico
a células de roedores, por lo que se ha clasificado como
oncogén (96). En tumores humanos, la amplificación se
produce típicamente en sarcomas (97), mientras que la
proteína se encuentra sobreexpresada, en ausencia de
amplificación génica, en tumores de mama (98) y en
leucemias (99), para los que se ha descrito una ganancia de
función durante la transcripción.
97
Discusión
En el CAQ, se ha descrito la sobreexpresión de MDM2 en el
76.9% de los casos (100), con valor pronóstico adverso,
particularmente cuando ocurre junto con mutaciones de p53
(101). En otro estudio llevado a cabo sobre diversos tumores
de las glándulas salivales no se detecta amplificación génica,
aunque sí se describe la acumulación de tinción nuclear (102).
En líneas celulares de CAQ se ha sugerido que la
sobreexpresión de MDM2 se produce a nivel de RNA (103). En
nuestra serie de CAQs ningún caso mostró amplificación del
oncogén MDM2, resultado que apoya los estudios previos en
los que se sugiere la posibilidad de que sean otros
mecanismos los responsables de la acumulación proteica
observada en CAQ. La imposibilidad de obtener RNA de buena
calidad a partir de tejido embebido en parafina nos impide
abordar la detección del nivel de RNA de MDM2 en nuestra
serie de CAQs.
La incidencia de la amplificación de c-myc no ha sido
previamente estudiada en CAQ. Tampoco se encuentran en la
literatura trabajos de investigación básica que hagan
referencia al posible papel de este oncogén en estos tumores.
En nuestra serie de CAQs la incidencia de la amplificación
génica afectando a c-myc fue reducida (8,7%), encontrándose
98
Discusión
asociada a estadios tumorales tempranos (p = 0,025). Los
resultados descritos para HNSCC son controvertidos, ya que
mientras unos autores muestran una baja incidencia de esta
alteración (17%) (104), asociada al estadio tumoral avanzado
(105), otros autores han observado un peor pronóstico para
los casos con una disminución en el nivel de mRNA de c-myc
en carcinoma epidermoide de lengua (106).
El estado de amplificación oncogénica en las recidivas
tumorales estudiadas era semejante a la encontrada en los
correspondientes tumores primarios disponibles. Tan sólo en
un caso la recidiva contaba con una amplificación génica de
ERBB1 que no estaba presente en el primario.
La mitad de los tumores primarios (12/24) contaban con
dos o más oncogenes amplificados. Cabe destacar que el 61%
(8/13) de los tumores con invasión perineural portaban
amplificación en dos o más oncogenes, frente al 33% (2/6)
entre los que no presentaban tal invasión (p > 0,05).
El patrón de amplificación génica que se repetía con mayor
frecuencia (7/24 casos, 29%) consistía en la acumulación de
esta alteración en los oncogenes ERBB1, CCND1 y PIK3CA.
Aunque este patrón no mostró utilidad como factor pronóstico
(con resultados estadísticamente significativos), se observó
99
Discusión
una tendencia de los casos positivos a presentar una
supervivencia reducida (p = 0,175). Este resultado merece
ser tenido en cuenta en el diseño de futuros trabajos
encaminados a validar el aquí presentado, ya que el reducido
número de muestras que componen la serie estudiada
compromete la posibilidad de extraer conclusiones definitivas.
Sin embargo, esta serie presenta un comportamiento
esperado, de acuerdo con lo descrito en la literatura. Así, los
resultados obtenidos en cuanto a la supervivencia global
(85% a los 5 años y 58% a los 15 años), así como el impacto
del subtipo histológico sobre la supervivencia (peor pronóstico
para los sólidos, p = 0,0206) y la supervivencia más larga
para los pacientes tratados con cirugía y radioterapia, frente a
los tratados únicamente con cirugía (p = 0,008) dan cuenta
del carácter representativo de la serie de CAQs considerada.
La dificultad de acumular un número elevado de estos
tumores es conocida en el ámbito de la práctica de
Otorrinolaringología y una constante en la mayoría de los
trabajos encontrados en la literatura. En el presente estudio
se han recogido los casos intervenidos en el Servicio de
Otorrinolaringología y en el Servicio de Cirugía Maxilofacial de
un centro de referencia como es el HUCA entre los años 1984
100
Discusión
y 2004, lo cual da muestra de la baja incidencia de este tipo
de tumor, y la dificultad de contar con series que permitan
hacer estudios estadísticos concluyentes.
101
Conclusiones
6
Conclusiones
102
Conclusiones
1. La amplificación oncogénica más frecuentemente
observada en nuestra serie de CAQs es la que afecta al
gen ERBB1. Su presencia en el tumor primario se asocia
con la aparición de las metástasis, observación que
sugiere el potencial interés del estudio de esta alteración
en la práctica clínica.
2. La frecuente sobreexpresión de la ciclina D1
(81,82%) se justifica sólo en parte mediante la
amplificación génica (45,8%), alteración más frecuente
entre los tumores en estadio avanzado.
3. c-kit se encuentra sobreexpresado en un 57,14%
de los casos, fenómeno no justificado por la
amplificación génica, observada en tan solo un caso.
4. Mientras que la mayoría de los tumores de los
subtipos tubular y sólido mostraban amplificación de
PIK3CA, esta alteración no era frecuente entre los del
subtipo cribiforme.
5. La mitad de los CAQs mostraban amplificación en
dos o más oncogenes. Esta alteración se presentaba rara
103
Conclusiones
vez en los oncogenes c-myc, c-kit y MDM2. La
coamplificación de ERBB1, CCND1 y PIK3CA es el patrón
oncogénico presente con mayor frecuencia en nuestra
serie de CAQs, apuntándose una tendencia hacia una
reducción en la supervivencia de los casos afectados.
104
Bibliografía
7
Bibliografía
105
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