Percorso di alternanza scuola- lavoro Biotechlab Classi IV DSA- Classi IV BSA – IV CSA – IV B Referente: prof T. Macolino Tutor scolastici: proff. Macolino-Caranfa- Iozzi- Antonucci Docenti e tutor aziendali: dott. R. Scrima –dott A. Tonti – dott. V. De Simone – M . Russo Liceo Scientifico “A. Volta” – Foggia Dirigente scolastico Prof Gabriella Grilli a.s. 2014-2015
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Transcript
Percorso di alternanza scuola-lavoro
Biotechlab
Classi IV DSA-
Classi IV BSA – IV CSA – IV B
Referente: prof T. MacolinoTutor scolastici: proff. Macolino-Caranfa- Iozzi- AntonucciDocenti e tutor aziendali: dott. R. Scrima –dott A. Tonti – dott. V. De Simone – M . Russo
Il principale obiettivo di questo corso è quello di fornire un
in modo tale da indirizzarvi per i vostri studi futuri
Attività laboratoriali tecnico-pratiche (esercitazioni)
Quali saranno gli argomenti delle esercitazioni?
– Tecniche di biologia molecolare– Procedure e le tecniche delle analisi chimiche,
microbiologiche e biotecnologiche– Regole per la sicurezza e la qualità alimentare– Biologia molecolare– Analisi genetiche– Chimica analitica– Tecniche di sterilizzazione– Tecniche di miglioramento genetico– Sicurezza e prevenzione in laboratorio– Caratteristiche dei principali microrganismi patogeni
per l’uomo– Principali norme ISO nelle analisi microbiologiche– Procedure di analisi chimico-biologiche - biochimiche
attraverso l'uso di strumentazioni tecniche
Le aziende/ gli Enti
Principali interessi di RICERCA del laboratorio di Chimica Medica e Biochimica
del Dipartimento di Medicina Clinica e Sperimentale Università di Foggia
(Responsabili: Prof. Nazzareno Capitanio, Prof. Domenico Boffoli, Prof.ssa Claudia Piccoli, Dott.ssa Rossella Scrima, Dott.ssa Olga Cela)
Metabolismo ossidativo mitocondriale ed extramitocondriale
ROS signaling e differenziamento in cellule staminali ematopoietiche
Disfunzioni mitocondriali in malattie neurodegenerative
Valutazione della «biosafety» di cellule mesenchimali ingegnerizzate derivate da midollo osseo
Analisi delle disfunzioni bioenergetiche mitocondriali indotte dal virus C dell’epatite (HCV)
Analisi delle disfunzioni bioenergetiche mitocondriali indotte dalla trisomia del cromosoma 21
Il Lachimer è una Azienda speciale della Camera diCommercio di Foggia, dal 1996 svolge attività dianalisi, attraverso l'effettuazione di prove chimiche,fisiche e microbiologiche.Scopo dell'Azienda è quello di svolgere un servizio diprova, consulenza e certificazione di merci e prodottiin settori di analisi rispondenti alle esigenzedell'economia locale.
Centro di Ricerca
per la Cerealicoltura
La missione
Il Centro di Ricerca per la Cerealicoltura di
Foggia si occupa di genetica, miglioramentogenetico, selezione varietale e dell’agrotecnicadei cereali per il consumo umano e animalecon particolare attenzione agli aspetti diresistenza agli stress biotici e abiotici, allasostenibilità della coltivazione e alla qualitàdelle produzioni in un’ottica di filiera.
Il Centro di Ricerca per la Cerealicoltura di Foggia dispone di un’azienda agricola sperimentale di 145 ettari, e di attrezzature per la sperimentazione cerealicola ed agronomica.
Azienda sperimentale
Centro di Collegamento Ricerca-Divulgazione
Sala congressi (100 posti), Foresteria, e Sala mensa.
Miglioramento genetico e
Sperimentazione agronomica
Chimica analitica
(metabolomica)
Tecnologia alimentare
(pasta e pane)
Genetica,
Biologia molecolare
e Biochimica
(Genomica)
Centro di Ricerca per
la Cerealicoltura:aree di ricerca
Laboratorio dedicato alla qualità della semola/pasta
Estrusione
Essicazione
Impianto pilota di pastificazione
Laboratorio di tecnologia della
trasformazione (pane e pasta)
Parametri qualitativi del frumento duro
• PESO ETTOLITRICO >80kg/hl
• PESO 1000 SEMI
• RESA ALLA MACINAZIONE
• CONTENUTO IN CENERI <0,9%
• QUANTITA’ E QUALITA’ DELLE PROTEINE > 13%
• INDICE ALVEOGRAFICO (W >200 e P/L<1,8)
• INDICE DI GLUTINE >60
• INDICE DI GIALLO >25
Laboratorio di metabolomicaHPLC
Ditta: AGILENT
Modello: 1100 anno: 2004
CONFIGURAZIONE
DAD (diode array detector)
FLD (fluorimetric detector)
Thermostatic autosampler
GC MS
Ditta: AGILENT
Modello: GC 6890 anno: 2004
MS 5973
CONFIGURAZIONE
PURGE and TRAP
Autosampler
LC MS MS
Ditta: APPLIED BIOSYSTEM
Modello: API 2000 anno: 2004
CONFIGURAZIONE
HPLC 1100 AGILENT
Thermostatic autosampler
Interface: ESI APCI
ICP
Ditta: VARIAN
Modello: VISTA MPX anno: 2004
CONFIGURAZIONE
autosampler
hydride generator
IC
Ditta: DIONEX
Modello: GP50 ED50 anno: 2004
Fibre, Fibre solubili, Carotenoidi, Tocoli,
Steroli, Minerali, Acidi fenolici, Lignani
Metabolomica:
ricerca di composti con valenza nutrizionale
Utilizzando le tecniche metabolomiche sono in corso ricerche
per migliorare il contenuto di sostanze antiossidanti, di
vitamine, di microelementi negli alimenti a base di cereali
Laboratorio di genomica
Luminex
ABI 3130
• Identificazione di geni utili e loro localizzazione cromosomica
Gene: regione di DNA che contiene le informazioni per la codifica di una proteina. Contiene pertanto le informazioni che determinano il fenotipo dell’organismo.
Uno dei modi per comprendere il ruolo biologico di un gene è quello di confrontare ilfenotipo di individui normali con quello di mutanti nei quali l’espressione del gene in esame èannullata o fortemente ridotta.
• Identificazione di geni utili e loro localizzazione cromosomica
Il DNA rappresenta una caratteristica UNICA per ogni organismo. Dal DNA si può quindi risalire all’IDENTITA’ di una persona e risolvere, per esempio, un
caso giudiziario…
Scena del
crimineSospetto
A
Sospetto B Sospetto
C
Nel DNA si cerca quel frammento che rivela se la pianta sarà resistente o meno ad una determinata malattia
Pianta resistente Pianta ammalata
Centinaia di marcatori molecolari vengono analizzati tra i parentali di mappa e nella progenie.
I dati ottenuti vengono raccolti in un file Excel ed analizzati attraverso un software (Joinmap), il quale a sua volta li elabora statisticamente e li raggruppa in cromosomi, generando una mappa genetica.
• PCR (Reazione a catena della Polimerasi)
• Gel d’agarosio o elettroforesi capillare
500 marcatori totali
1820 cM
ANALISI QTL
DATI GENOTIPICI DATI FENOTIPICI
RICERCA DELLE REGIONI SUL GENOMA CHE INFLUENZANO LA
MANIFESTAZIONE DEL CARATTERE E DI MARCATORI MOLECOLARI
STRETTAMENTE ASSOCIATI
MAS (Marker Assisted Selection)Selezione Assistita da Marcatori Molecolari
PR22D89
Alta resaOttimo glutineRidotta attività
LOX
UC1113
Proteine, Fe, ZnResistenza alla Ruggine
gialla
5BIL-42
Gene Pm36Resistenza all’Oidio
CRESO
Gene Lr14cResistenza alla Ruggine
bruna
NEODUR
SBCMV - Virosi
SUMAI 3
FBH – Fusariosi della spiga
PRIMADURPEDROSO
Indice di giallo
CIRILLO
Ug99 – Ruggine nera
PYRAMIDING GENI IN UNA CV DI ELITE
Galileo Galilei(1564-1642)
OSSERVAZIONE
IPOTESI
ESPERIMENTO
La fase sperimentale ha lo scopo di CONVALIDARE o CONFUTARE l’ipotesi che lo scienziato ha formulato
Se l’ipotesi è esattaRipetere n volte l’esperimento
ANALISI STATISTICA(in genere l’esperimento va
ripetuto almeno 3 volte)
Se l’ipotesi è SBAGLIATA
Formulare una nuova ipotesi
una teoria non è mai definitiva ma è suscettibile di modifiche o di sostituzioni, qualora vengano
alla luce nuovi aspetti non ancora considerati.
Precisione ed accuratezza nelle misurazioni
PRECISIONE: questo termine indica quanto sono in accordo fra diloro diverse determinazione della stessa quantità
ACCURATEZZA: questo termine indica quanto sono in accordo fra diloro una determinata misura e il valore accettato perquella quantità
Errore Sperimentale: differenza tra il risultato ottenuto e il valore accettato
Deviazione Standard: radice quadrata della somma dei quadrati delledifferenze fra ogni misura e il valore medio, diviso per ilnumero delle misure meno uno
(errore sistematico o errore casuale)
Espressione dei dati analitici
Retta di taratura per pipettata
COLTURE CELLULARIScongelamento e congelamento di linee cellulari
Colture Cellulari: introduzione
• Colture cellulari in vitro: cellule isolate dal loroambiente e messe in condizioni di vivere all'internodi un sistema definito
– strumento fondamentale per studi biochimici,microbiologici, farmacologici…
– utili nella produzione di fattori di crescita, anticorpimonoclonali, vaccini, proteine ricombinanti in generale…
Introduzione
• 1951 messa in coltura della prima linea cellulare(derivante da cellule epiteliali della cervice uterina)stabilizzata umana, di origine tumorale: la lineaHeLa (dal nome della prima paziente, HenriettaLacks).
• Conoscendo le caratteristiche delle colture èpossibile apprezzarne i vantaggi (ad esempio studidi tossicità sulla nostra specie, per la quale in vivoesistono evidenti problemi).
Colture cellulari
• Batteri
• Lieviti (eucarioti inferiori)
• Colture di cellule vegetali
• Colture primarie di cellule animali
• Linee cellulari
Tipologia di crescita cellulare
• In sospensione
• Adese
COLTURA PRIMARIA
La coltura primaria di un determinato tipo cellulare corrispondealla fase in cui le cellule sono state appena isolate dal tessuto ehanno proliferato in appropriate condizioni, occupando in talmodo tutto la superficie a disposizione (situazione di confluenza).In questa fase le cellule possono essere «sottocoltivate»trasferendole in nuovi contenitori (piastre o fiasche) con terrenofresco in modo tale da espaderle.
Colture primarie
• Prelievo delle cellule da un campione(organo, embrioni o uova).
• dissezione meccanica.
• Trattamento con tripsina (o altro enzima)per eliminare i contatti tra cellule.
• Inibitore per bloccare la digestioneenzimatica
• Controllo della vitalità cellulare (ad esempiotrypan blue)
• Le colture cellulari possono essere seminatesu terreno solido in piastra Petri oppure insospensione.
Allestimento di una coltura primaria
LINEA CELLULARE
Dopo la prima sottocoltura, la coltura primaria diventa notacome LINEA CELLULARE o SOTTOCLONE.
Le linee cellulari derivanti dalle colture primarie hanno unavita limitata (sono cioè delle colture cellulari «finite»)
Differenza tra linea cellulare FINITA vs linea cellulare CONTINUA:
Le cellule normali si dividono solo un numero limitato di volte,dopodichè esse perdono la loro capacità proliferativa; questoevento è geneticamente determinato ed è noto come SENESCENZAe la linea cellulare in questo caso è finita.Altre linee cellulari invece diventano «immortali» tramite unprocesso detto «TRASFORMAZIONE», che può avvenirespontaneamente oppure può essere indotto chimicamente o conagenti virali.Quindi quando una linea cellulare finita va incontro atrasformazione acquisendo la capacità di dividersi infinite volte,essa diventa una linea cellulare continua.
Cellule primarie animali: esempi
• Linfociti/timociti
• Macrofagi
• Cellule di embrione di pollo/ratto
• Cellule di fegato /cuore (di embrione)
• Fibroblasti (cellule del tessuto connettivo)
Morfologia delle colture cellulari
• Fibroblastoidi: le cellule sono bipolari omultipolari, presentano forma allungata ecrescono attaccate alla superficie.
• Epithelial-like: le cellule sono poligonali conuna forma di regolari dimensioni, e cresconoattaccate alla superficie a gruppetti (patches).
• Lymphoblast-like: le cellule presentano unaforma sferica e solitamente crescono insospensione senza attaccarsi alla superficie.
Vantaggi nelle colture cellulari
• Larga disponibilità di tipi di cellule
• Disponibilità commerciale di media , fattori, ecc.
• Documentazione su isolamento/conservazione
• Controllo delle variabili ambientali (T, pH...)
• Semplicità nel replicare esperimenti
• Possibilità di dimensionare gli esperimenti con finalità biotecnologiche
• Riduzione nel numero di animali uccisi
Svantaggi nelle colture cellulari
• Metodi molto specializzati e laboriosi
• Costo dei materiali richiesti (ad esempio, siero, fattori di crescita...)
• Sistemi semplificati rispetto ad un organismo integrato
• Difficoltà di correlare le concentrazioni in vitro con quelle in vivo
Tipi di colture cellulari
• Colture a breve/lungo termine: nel primo caso il numero di cicli cuivanno incontro le cellule è ridotto: in colture a lungo termine le cellule sidividono molte volte, o addirittura illimitatamente (linee cellularistabilizzate)
• Colture in monostrato/ in sospensione: le cellule tendono ad aderirealla superficie del recipiente di coltura: moltiplicandosi formano unmonostrato, in quanto risentono dell’inibizione da contatto. Celluletrasformate possono formare pluristrati.
• Colture clonali: le cellule vengono diluite prima della “semina” in mododa avere ogni cellula separata, che prolifera formando una singolacolonia (clone).
Evoluzione di una linea cellulare in coltura
Tra la “semina” e la ripresa della crescitac’è un intervallo (“lag”). Nel grafico,l’evoluzione del logaritmo del numero dicellule nel tempo.
La coltura primaria è caratterizzata da untempo di duplicazione lento, cheaumenta notevolmente nei successivipassaggi in coltura, quando si parla dilinea cellulare primaria.
Nella terza fase si nota la senescenza,con tempi di dupli-cazioneprogressivamente più lunghi (sino allamorte), a meno che (porzionearancione) non intervenga unatrasformazione, che produce una lineacellulare immortalizzata in grado direplicarsi indefinitamente.
Il laboratorio per le colture cellulari
incubatorecappa
centrifuga
Contaminazioni delle colture
• L’ingresso indesiderato nel terreno di coltura di microrganismi èdannoso: questi competono con le cellule in coltura (chegeneralmente hanno ritmo di crescita inferiore) e possonosecernere sostanze tossiche. Tipici contaminanti sono batteri,micoplasmi, lieviti, muffe.
• In caso di infezione batterica il terreno vira in fretta (acidifica) eintorbidisce. Le infezioni da micoplasmi sono più subdole, inquanto il microrganismo è meno visibile e richiede un paio disettimane per formare colonie visibili.
• Questo pericolo determina la prassi di aggiungere antibiotici alterreno (ad esempio: streptomicina-penicillina); va ricordato chesono stabili per pochi giorni a 37°C.
Contaminazioni di una coltura cellulare da E.Coli
Contaminazioni di una coltura cellulare da lieviti
Contaminazioni di una coltura cellulare da micoplasma (o mollicutes)
A CB
Sterilità
• Al fine di mantenere la sterilità per la colturacellulare, il laboratorio di biologia cellulare deveessere esclusivo: occorre lavorare sotto cappe aflusso laminare, in cui vanno sostituitiperiodicamente i filtri.
• Per la sterilizzazione dei materiali:
– Stufa a secco, 150°C per 3 ore per la vetreria
– Autoclave (calore umido), 1 atm, 121°C per filtri,soluzioni saline…
– Filtrazione con filtri da 0.22 μm terreni di coltura,soluzioni organiche…
• Fase gassosa, Temperatura, Substrato di adesione eterreno di coltura
• Le cellule di mammifero crescono a 37°C, sature diumidità, in un mezzo tamponato a pH 7,3. Il sistematampone più comunemente utilizzato èbicarbonato/acido carbonico
• Il pH viene controllato aggiungendo un indicatore come ilrosso fenolo (giallo a pH acido, rosso-viola a pH alcalino).
Terreni di coltura
• La composizione dei mezzi di coltura prevede:
– Sali inorganici (Na+, K+, Mg++, Ca++, Cl -,..)
– Glucosio, glutammina
– Amminoacidi essenziali
– Vitamine del gruppo B
– Tracce di Fe, Zn, Cu, Se, Mn, Mo (tracce significa che non occorreaggiungerli in quanto le minime contaminazioni presenti in altricomponenti sono sufficienti).
– Siero fetale bovino, 5-20% o un sostituto
• MEM Minimal Essential Medium (Eagle)
• DMEM Dulbecco’s modified MEM
• RPMI Roswell Park Memorial Institute
Composizione di un terreno per cellule animali: un esempio
• Fattori di crescita che favoriscono i fibroblasti rispetto ad altri tipi cellulari
Vantaggi
• Protegge le membrane grazie al corretto grado di viscosità;
• Introduce fattori di crescita ed ormoni;
• Veicola lipidi, ferro e molecole organiche;
• Favorisce interazioni cellule-substrato;
• Contiene inibitori della tripsina
L’uso del siero è controverso. Generalmente si preferisce il siero fetale in quanto contiene meno anticorpi.
Terreni definitiL’uso di terreni privi di siero nasce dal desiderio di avere condizioni controllate,riproducibili e specifiche per il tipo cellulare in esame.Devono contenere: un inibitore della tripsina, fattori di adesione, ormoni, fattoridi crescita, nutrienti e proteine.
Svantaggi
Cellule più sensibili alle condizioni ambientali;
Crescita più lenta;
Alcuni additivi sono costosi e/o labili;
I terreni sono specifici per un tipo cellulare.
Vantaggi
Maggiore riproducibilità;
Standardizzazione anche fra laboratori diversi;
Può favorire subpopolazionispecifiche (non solo fibroblasti);
Agevola la purificazione di un prodotto.
Congelamento di cellule• Per il congelamento delle cellule si utilizza un criopreservante, ad esempio il
DMSO (dimetilsolfossido).
La cappa
I filtri HEPA e la tecnologia del flusso laminare hanno resopossibile la realizzazione di "clean rooms", di laboratorimicrobiologici di massima sicurezza, di cappe sterili e di cabine"Biohazard'.
Filtrazione a flusso laminare
• Il flusso laminare è ottenuto dalla combinazione di un filtro assoluto (HEPA)con una massa d'aria che lo attraversa alla velocità costante di di 0,45m/sec. (+/- 20%).
• Il flusso laminare è un flusso d'aria unidirezionale formato da filetti d'ariasterili paralleli che si muovono alla medesima velocità in tutti i punti, cosìda creare una corrente d'aria omogenea senza turbolenze.
• In un ambiente sterile così ottenuto ogni contaminante libero nella zona dilavoro viene trascinato lontano da un fronte di aria sterile.
Campi d’applicazione
Esempi d’indagine Ambito
Controllo della crescita e del metabolismo, analisi deldifferenziamento. Ingegneria tissutale (coltura eproduzione in vitro di porzioni di tessuto).
Biologia cellulare
Studio di promotori e enhancers, di espressione genica edi interi genomi.
Biologia molecolare
Analisi di mutanti. Mappaggio, trasfezione con DNAesogeno.
Genetica
Diagnosi cliniche (anche prenatali) Citogenetica
Caratterizzazione di tumori. Oncologia
Test di citotossicità. Farmacologia
Produzione di proteine ricombinanti (ormoni…) e dianticorpi monoclonali.
Immunologia
Camera di Bürker
Reticolo della camera di Bürker
Legge di Lambert-Beer
A= εlc
ε coefficiente di estinzione molare
l cammino ottico
c concentrazione
ElettroforesiSeparazione delle proteine mediante
elettroforesi su gel di poliacrilammide: SDS-PAGE
Elettroforesi
Separazione differenziata di molecole cariche
(aminoacidi, peptidi, proteine,
acidi nucleici, ecc) sottoposte a un campo elettrico
Migrazione di particelle cariche sotto l’azione di un campo elettrico
Tecnica sia ANALITICA che PREPARATIVA
Forza elettrica : Fel = q · EForza frizionale : Ffr = f ·v (f = 6 r )
Quando le forze si bilanciano:
q ·E = f ·v q
v = — · E f
v qmobilità elettroforetica : = — =
—E f
ELETTROFORESI – principi generali
Una molecola con una carica netta non nulla posta tra due elettrodi di
segno opposto migra verso
l’elettrodo con segno opposto alla sua carica netta
La molecola si muove verso l’elettrodo di segno opposto con una
velocità(v) che è proporzionale
all’entità del campo elettrico (E) e della sua carica (q) e inversamente
proporzionale all’attrito che
incontra nel muoversi (f – coefficiente d’attrito) v = Eq/f
FASI DELLA PREPARAZIONE DEL CAMPIONE
CROMATOGRAFIA PER FILTRAZIONE SU GEL
CROMATOGRAFIA A SCAMBIO IONICO
CROMATOGRAFIA PER AFFINITA’
ELETTROFORESI
Gel di agarosio – Elettroforesi orizzontale
Visualizzazione del DNA: etidio bromuro
luce UV
Poiché il DNA sottoposto ad un campo elettrico migra ad una velocità proporzionale all’inverso del log10 del peso molecolare, facendo migrare il campione in esame insieme ad uno standard di pesi molecolari di dimensione nota è possibile estrapolare il peso molecolare del campione ignoto
pozzetti
distanza in cm dai pozzetti
-20-10-7.0
x
1
2
3
4
5
6
7
8
ELETTROFORESI SU GEL DI POLIACRILAMIDE
ELETTROFORESI SU GEL DI POLIACRILAMIDE
SDS-PAGE
(Sodium DodecylSulfate Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis)
Permette la separazione delle proteine solo in base al peso molecolare
Colorazione con Coomassie
Colorazione con nitrato di Ag
Si possono effettuare valutazioni
quantitative delle bande proteiche
col densitometro: misurazione della
luce trasmessa quando un raggio luminoso
è fatto passare attraverso il gel colorato.
Si hanno picchi di assorbimento di cui si può
calcolare l’area che è proporzionale
alla quantità di proteina
Applicazioni della SDS-PAGE
• Purezza del campione
• Determinazione del PM
• Western blot
• Purificazione della proteina
MAPPE GENETICHE AD ELEVATA DENSITA’ DIMARCATORI
Dott.ssa Russo Maria Anna
Il Frumento duro in Italia
Il frumento duro rappresenta la materiaprima dell’industria delle paste alimentaririvestendo, pertanto, un ruolo strategico perl’intero settore agro-industriale del nostroPaese.
Attualmente per coprire le esigenze deipastificatori, l’Italia importa oltre 1 M ditonnellate di frumento duro per anno.
Oggi gli strumenti della genetica, della genomica e della bioinformatica, offrono concrete opportunità per accelerare e rendere più efficiente la costituzione di varietà di frumento più produttive e con spiccate caratteristiche qualitative.
I marcatori molecolari
• RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorfism)
• RAPD (Random Amplified Polymorfic DNA)
• AFLP (Amplified Fragment Lenght Polymorfism)
• SSR (Simple Sequence Repeat)
• STS (Sequence Tagged Site)
• SCAR (Sequence Characterized Amplified Regions)
• CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic Sequence)
• TRAP (Target region amplification polymorphism)
• SNP (Single Nucleotide Polymorfism)
• DArT (Diversity Array Technology)
I microsatelliti (SSR) sono polimorfismi di lunghezza del DNAGli SNPs sono polimorfismi di sequenza del DNA
Sequenze di DNA che consistono di corte unità (da una a sei basi) ripetute in tandem
CCG TGT CAT AGA TCT AGT CGA TCT GAT GCA ACG TAC GAT
Vantaggi:
• Abbondanza e alto livello di polimorfismo,
• codominanti,
• Facili da utilizzare.
SSR (Simple Sequence Repeat) o Microsatelliti
• Gli SNPs,scoperti negli anni 80, sono variazioni di sequenza del DNA che si verificano quando è alterato un singolo nucleotide della sequenza genomica
• SNP (Single Nucleotide Polymorfism)
Attualmente sono i marcatori molecolari più utilizzati, il grande vantaggio nell’utilizzarli è dato dall’elevato numero di polimorfismi e dalla loro elevata densità lungo tutto il genoma
• E’ il polimorfismo più semplice• Altamente abbondante• Largamente usati come marcatori
SNP markers
INDIVIDUAZIONE DEGLI SNP
• Il più semplice approccio consiste nell’eseguire il sequenziamentodiretto dei prodotti di PCR di regioni genomiche contenenti il gene di interesse in individui diversi
• Tale approccio è però molto costoso in quanto richiede lo studio di primers specifici ed inoltre è limitato a regioni di cui è nota la sequenza.
• Genotipizzazione degli SNP mediante microarray…
• Incrocio tra due varietà chesiano distinte per il carattere inesame e sviluppo di unapopolazione segregante
• Il carattere in studio deve essere ereditabile
• Marcatori che risultino polimorfici tra le diverse varietà
F8
xParental
P1 P2
HybridF1
Recombinant inbred line (RIL) population
F2 population
F2
F3
F4
F5
F6
F7
Prerequisiti per la realizzazione di mappe genetiche:
Centinaia di marcatori molecolari vengono analizzati tra i parentali di mappa e nella progenie.
I dati ottenuti vengono raccolti in un file Excel ed analizzati attraverso un software (Joinmap), il quale a sua volta li elabora statisticamente e li raggruppa in cromosomi, generando una mappa genetica.
• PCR (Reazione a catena della Polimerasi)
• Gel d’agarosio o elettroforesi capillare
500 marcatori totali
1820 cM
Caratteri fisiologici e agronomici• Precoce• Resitente all’allettamento e alle alte temperature• Resistente alla Septoria e all’odio• Suscettibile alla Ruggine bruna• Elevato contenuto proteico• Indice di glutine buono• Elevato indice di giallo
Caratteri fisiologici e agronomici•Accentuata rusticità (adattamento a terreni poveri, resistenza al freddo, alla siccità e alle malattie, competitività con le infestanti) che ne fanno una coltura particolarmente adatta alla valorizzazione di zone agricole marginali, al recupero delle aree collinari, più in generale, alla coltivazione con ridotto impiego di input energetici. •Il farro è caratterizzato da bassa produttività, taglia elevata, rachide molto debole e scarsa attitudine alla panificazione e pastificazione.
In pratica, l’uso di marcatori molecolari permette di individuare le piante con determinateproprietà sulla base delle loro caratteristiche genetiche (genotipo) e non solo sulla base dicome queste caratteristiche si manifestano nel corso del ciclo vitale della pianta a seguitodell’interazione con l’ambiente (fenotipo).
R R S S R S S R R S S R RR R S S R S S R R S S R R
MAS - Selezione assistita da marcatori molecolari
IL MIGLIORAMENTO GENETICO DEL FRUMENTO DURO E L’IMPIEGO DI MARCATORI MOLECOLARI
Dott.ssa Maria Anna Russo
1900 1920 1940 1960 1980 20002
3
4
5
6
Res
a (
t h
a-1
)
Centro di Ricerca per la Cerealicoltura
Il Miglioramento genetico in frumento duro
L’importanza dei marcatori molecolari nel breeding
Come individuare i marcatori molecolari associati al carattere (analisi QTL e BSA)
La MAS (Marker Assisted Selection)
Pyramiding dei geni
Il miglioramento geneticoDef.: processo di modifica del patrimonio genetico al fine di migliorarele caratteristiche utili all'uomo nelle specie coltivate o allevate
prima dai contadini cheinconsapevolmente sceglievano eselezionavano le varietà miglioridirettamente nei campi …
… poi dai genetisti nei laboratori e nei campi sperimentali.
Il miglioramento delle varietà è praticato con successo da migliaia di anni,
La nascita dell’agricoltura: un’evoluzione “contro natura”
NASCITA DELL’AGRICOLTURA - DOMESTICAZIONE DELLE PIANTE SELVATICHE
l’uomo inizia a scegliere tra le piante selvatiche e coltivare le piante utili per i suoi bisogni essenziali
Svantaggi: 1) le piante diventano dipendenti dall’uomo e incapaci di sopravvivere da sole 2) Perdita della biodiversità
Vantaggi: 1) Aumento parte edibile della pianta;2) Diminuzione dispersione dei semi;3) Omogeneità germinazione semi.
Domesticazione frumenti selvatici
Mezzaluna fertile
Domesticazione frumenti selvatici
Obiettivo: Ridurre dispersione semi
Seme vestito
Rachide fragile
Frumento coltivato
Frumento selvatico
Miglioramento genetico
2) l’ambiente cambia in continuazione ( clima; i parassiti si adattano e vincono le difese delle piante)
1) le popolazioni umane tendono ad aumentare più velocemente rispetto alla produzione agricola (malnutrizione, carestie)
A partire da quei primi passi decisivi nel Vicino Oriente, il processo di modificazionegenetica delle piante coltivate per migliorare le caratteristiche dei raccolti non si è maifermato. Per 2 importanti motivi:
Dai contadini agli scienziati
Seconda rivoluzione per l’agricoltura nel 1900: le leggi diMendel
Dai contadini agli scienziati
Nasce la GENETICA
Il miglioramento genetico non avviene più nei campi, ma nei centri di ricerca agronomica
Diventa più rapido e mirato
1900 1990
La rivoluzione verde
VANTAGGI: Aumento della produzione e diminuzione della fame nel mondo
SVANTAGGI: le varietà coltivate sono poche e c’è una diminuzione delle biodiversità e di geni utili
Miglioramento genetico tradizionale
SCELTA DEI GENITORI INCROCIO SELEZIONE FENOTIPO
F2
P2
F1
P1 x
SELEZIONE FENOTIPICA
Re-incrocio
Marcatori molecolari
Associazione carattere qualitativo-marcatore
MAS (Marker Assisted Selection)Selezione Assistita da Marcatori Molecolari
Nel DNA si cerca quel frammento che rivela se la pianta sarà resistente o meno ad una determinata
Scienza che studia le molecole di interesse biologico, le molecole della vita:
DNA e proteine
La Biologia Molecolare
D.ssa Russo Maria Anna
Il DNA !!!
Ciò che viene trasmesso da una generazione all’altra e
determina le caratteristiche di ogni essere vivente è il
DNA
Oswald Avery, McLeod e McCarthy
- 1944
Esiste un PRINCIPIO TRASFORMANTE che
trasmette le caratteristiche da una generazione all’altra
Frederick Griffith - 1928
Alfred Hershey e Martha Chase – 1952
La struttura del DNA !!!
Il DNA o ACIDO DESOSSIRIBONUCLEICO è
un POLIMERO di NUCLEOTIDI
I nucleotidi sono costituiti da un fosfato, uno zucchero e una base azotata.- ESISTONO 4 TIPI DI BASI AZOTATE: A, T, C, G
Le basi si accoppiano seguendo una regola precisa:
Adenina con TiminaCitosina con Guanina
Erwin Chargaff - 1950
L’ordine delle basi costituisce la SEQUENZA del DNA
FORMA A DOPPIA ELICA: DUE FILAMENTI UNITI TRAMITE LE BASI AZOTATE (COMPLEMENTARIETA’) AVVOLTI L’UNO INTORNO ALL’ALTRO
DETERMINATI SEGMENTI DI DNA FORMANO I GENI
I GENI CONTENGONO LE INFORMAZIONI PER
PRODURRE LE PROTEINE
“SERIE” DI GENI FORMANO I CROMOSOMI
I CROMOSOMI VENGONO EREDITATI
IL MATERIALE GENETICO DI UN INDIVIDUO VIENE DETTO GENOMA
Come funziona il DNA ???
Funzione
Informazione genetica
Trascrizione Traduzione
Come fa un GENE a “costruire” una PROTEINA???
Dal DNA viene TRASCRITTA una molecola di RNA
L’RNA viene TRADOTTO in una
PROTEINA
Cos’è una PROTEINA???
Una PROTEINA è un POLIMERO costituito da
MONOMERI: gli AMINOACIDI
Esistono 21 tipi diversi di AMINOACIDI
L’ordine degli aminoacidi costituisce la
SEQUENZA della proteina.
Diversa SEQUENZA = diversa FUNZIONE
argval
trp
trp
ile
phearg lys
ile
leu
trp
lysphe
ile
trp
ile
arg
lystrp
ile
phe
Come si studia il DNA??? Il DNA può essere
AMPLIFICATO…
..e si può SEQUENZIARE
Come si studia il DNA???
Si può VISUALIZZAREsu dei GEL con l’aiuto di
lampade particolari
Con l’aiuto di ENZIMI(speciali proteine) il DNA
si può “TAGLIARE” e “RICUCIRE”
Utilizzati come “forbici”, che permettono ai biologi di
tagliare/incollare le molecole di DNA
Tagliando una molecola di DNA e determinando l’ordine dei tagli (ottenuti con più enzimi) ed il numero di frammenti, si può comprendere la specifica organizzazione e sequenza della molecola mappe di restrizione
Con gli enzimi di restrizione si possono isolare e manipolare sperimentalmente i singoli geni
Estrazione del DNA
Soluzione salina per facilitare la rottura delle cellule(perdono molta acqua per il fenomeno dell’osmosi) Detergente, per disciogliere i lipidi delle membrane ecompletare la rottura delle cellule Calore (60-65°C): l’alta temperatura inattiva le DNAsi,gli enzimi che degradano il DNA, e facilita la rottura dellemembrane
L’estrazione di acidi nucleici è il primo passo nelle applicazioni di biologia molecolare
Il DNA può essere estratto da qualsiasi tessuto o cellula nucleata• con metodo classico (Fenolo/Cloroformio)• con diversi kit
FASI:• Rompere la parete o la membrana cellulare (LISI CELLULARE) per liberare il DNA• Separare gli acidi nucleici dagli altri componenti cellulari (DEPROTENEIZZAZIONE)• Separare gli acidi nucleici tra loro, il DNA dall’RNA (PRECIPITAZIONE DELL’ACIDO NUCLEICO).
La tecnica della reazione a catena della polimerasi(Polymerase Chain Reaction, PCR, K. Mullis, 1985) offreuno strumento straordinariamente potentenell’amplificare in vitro e in poco tempo definitesequenze di DNA
Questa tecnica consente di ottenere centinaia dimigliaia di copie del DNA di interesse per successivecaratterizzazioni (determinazione della lunghezzadella sequenza nucleotidica, etc.)
Il maggior vantaggio della PCR, tuttavia, consiste nelpoter iniziare con quantità di materiale (come quelletipicamente associate a campioni provenienti da musei,o fossili o forensi) molto minori di quanto non sianosolitamente disponibili
Reazione a catena della polimerasi (PCR)
Gli ingredienti della PCR sono:
• un templato
• due primer
• una miscela di deossinucleotidi trifosfati (dNTP)
• una DNA-polimerasi termostabile
Inizialmente, nella reazione venivautilizzata una polimerasi di Escherichiacoli. Tuttavia, questo enzima non è stabilealle alte temperature e viene inattivatodurante la fase di denaturazione di ciascunciclo PCR. Era pertanto necessarioaggiungerne una nuova aliquota prima dellafase di estensione. Tutto ciò rendeva latecnica laboriosa e costosa e aumentava laprobabilità di avere prodotti di reazioneaspecifici.
Nel 1988 fu isolata una DNA polimerasitermostabile prodotta dal batteriotermoresistente Thermus aquaticus (TaqDNA Polimerasi).L’uso di questa polimerasi ha consentito dieffettuare la fase di estensione a 72 °Caumentando la resa e la specificità deiprodotti di reazione e soprattutto ha resopossibile l’automazione del processo.
Le tre tappe della PCR:
• denaturazione per separare le due eliche del DNA
• appaiamento dei primer con le sequenze complementari sul DNA templato
• estensione dei primer con i nucleotidi complementari al templato ad opera della polimerasi
Denaturazione del DNAIl DNA deve essere portato ad una condizione di singola elica in modoche successivamente si verifichi l’appaiamento (annealing) allemolecole di primer (anch’esse a singolo filamento)La denaturazione viene favorita dalla presenza di concentrazionisaline relativamente alte (circa 150mM NaCl)
Appaiamento dei primer (annealing)
Questo secondo step consiste nella programmazione dellatemperatura e del tempo di appaiamento dei primer. La temperaturadi annealing (Ta) dei primer dipende dal loro contenuto in G+C e dallaloro lunghezza. Considerando primer di lunghezza media di 20 basiuna formula empirica spesso utilizzata per il calcolo della Tm è laseguente: TA = [4(G + C) + 2(A + T)] – 5Il tempo di annealing infine non deve essere troppo lungo (in modo dasfavorire appaiamenti aspecifici). Di solito si utilizzano tempidell’ordine di 30 sec o meno.
Estensione dei primer
L’estensione dei primer avviene ad una velocità di circa 100 basi/sec.Generalmente 1 min è sufficiente per amplificare stampi lunghi circa1000 bp.
Elettroforesi su gel
E’ il metodo standard utilizzato per:
• separare
• identificare
• purificare frammenti di DNA
Il tampone di elettroforesi è una soluzione salina che serve sia a condurre la corrente elettrica che a controllare il pH durante l’elettroforesi.
Elettroforesi su gel
I gel contengono pori attraverso i quali il DNA migra al polo positivo.
Più piccole sono le molecole, più velocemente migrano sul gel
Il gel può essere costituito da:
Poliacrilammide DNA 5-500 bpAlto potere risolutivo (1bp) – Gel verticali – Più complicati e pericolosi da utilizzare
Agarosio DNA 200-50000 bpVarie concentrazioni. Minore potere risolutivo - Gel orizzontali – Semplici da preparare e utilizzatiper separare frammenti di dimensioni variabili
L’agarosio è un polimero di carboidrati estratto dalle alghe. Esso, se fuso e gelificato, forma unamatrice, la cui porosità dipende dalla concentrazione dell’ agarosio.Più elevate concentrazioni si usano per separare le molecole più piccole e, viceversa, concentrazionipiù basse sono più adatte a separare frammenti più grandi.
L’agarosio, in concentrazione opportuna, viene fuso insieme alla soluzione tampone.La soluzione fusa viene versata nella vaschetta e lasciata solidificare.Quando un campo elettrico viene applicato al gel il DNA, carico negativamente, si muove versol’anodo.
Preparazione di un gel di agarosio
Oggi l’intercalante utilizzato è il gel red, meno tossico e pericoloso dell’etidio bromuro
Il tampone di caricamento (colorante + addensante), LB, che si aggiunge ai campioni prima dell’elettroforesi, serve ad appesantire” icampioni, permettendo la loro permanenza nei pozzetti, e a fornire un marker visivo del progredire della corsa elettroforetica.
Per sciogliere l’agarosio, piuttosto che usare l’acqua distillata, si usano soluzioni tamponate che consentono al DNA di muoversi uniformementelungo il gel. Queste soluzioni hanno lo scopo, infatti, di determinare e mantenere stabili il pH e la concentrazione di ioni del gel.TAE e TBE sono i tamponi più comunemente usati per l’elettroforesi. T sta per Tris, che consente il mantenimento di un valore costante di pHdella soluzione; E sta per EDTA, che chela i cationi divalenti, come il magnesio. Questo è importante, perché la maggior parte delle nucleasirichiede cationi divalenti per funzionare. A o B sta per acido Borico o Acetico che forniscono l’appropriata forza ionica al tampone.
Dopo aver pesato l’agarosio e misurato il tampone, i due vengono mescolati. Dal momento che l’agarosio non è solubile a temperaturaambiente, esso deve essere portato ad ebollizione o in forno a microonde o in autoclave o su un agitatore magnetico.
Il sistema di costruzione di un gel di agarosio è costituito da tre parti, la piastra, il supporto e il pettine. Quest’ultimo serve a realizzare ipozzetti: si immerge nel gel “a denti in giù”, quando è caldo e liquido e poi, quando l’agarosio si sarà solidificato, si estrae, lasciando glispazi precedentemente occupati dai denti.Il gel viene quindi sistemato nella camera di elettroforesi e sommerso completamente con il tampone di elettroforesi, in modo che l’interogel sia soggetto ad uguale corrente elettrica.
Il campione di DNA, di qualsiasi tipo (estratto, restrizione enzimatica, etc.) è in soluzione acquosa. Questa , essendo di densità pari al quelladel tampone, non riuscirebbe ad impedire che il campione “scappi” dal pozzetto. Questo è il motivo per cui si aggiunge al campione unasostanza addensante: glicerolo, il blu di bromofenolo.
A questo punto si collega l’apparecchio ad un alimentatore e si applica il campo elettrico.
Dopo aver rimosso il gel dall’apparecchio di elettroforesi, si può visualizzare il DNA su un transilluminatore a luce UV
Il Clonaggio Molecolare
Dott.ssa De Simone VanessaConsiglio per la ricerca in agricoltura e l’analisi dell’economia agraria (CREA)24-28 settembre2015
Significa ottenere molte copie identiche di unframmento di DNA.
Cosa significa Clonaggio Molecolare?
Scopo del clonaggio molecolare
1. studiare un gene a livello molecolare (struttura, funzione,posizione nel genoma, regolazione fisiologica, ecc);
2. Identificare componenti cellulari che interagiscono con acidi nucleici;
3. facilitare lo studio dell’espressione genica e della regolazione fisiologica;
4. identificare il prodotto di un gene e/o per ottenerne la sovraespressione;
5. studiare la relazione fra struttura e funzione delle proteine
Terapia genica: Trattamento causale delle malattie geneticheattraverso la correzione del difetto genetico presente in unpaziente, quindi, il ripristino del corretto funzionamentocellulare.
Ottenere microrganismi in grado di produrre molecole come l’insulina umana, l’interferone, ormoni della crescita…
Ricerca applicata
Applicazioni mediche
Ricerca di base
Procedura di Clonaggio
ISOLAMENTO del frammento di DNA
INTRODUZIONE del Vettore Ricombinante in cellule viventi per propagarlo (Trasformazione)
INSERZIONE del frammento in un VETTORE di clonaggio (Ligazione)
Procedura di Clonaggio
Cosa serve per un clonaggio ?
1) Gene (DNA di interesse)
4) DNA ligasi
2) Enzimi di restrizione
3) Vettore di clonaggio
5) Cellula ospite
2) Mediante l’uso di enzimi di restrizione
Isolamento del frammento del gene o DNA di interesse
1) Mediante l’uso della reazione a catena della polimerasi o PCR
PCR
Metodologia ideata nel 1980 da K. Mullis, utilizzata per ottenerecopie di segmenti specifici di DNA o di RNA, partendo da quantitàminime (anche una sola molecola)Le sue numerose applicazioni riguardano la genetica molecolare, ladiagnostica, le analisi alimentari e microbiologiche e gli studi difilogenesi molecolare.
Sono enzimi in grado di tagliare i legami fosfodiesterei del DNA per dare frammenti specifici.
Enzimi di restrizione
Sono enzimi di originebatterica necessari perdegradare il DNA virale deibatteriofagi e riconosconosequenze di 4,6, o 8 coppienucleotidiche (siti direstrizione)
Gli enzimi di restrizione tagliano il DNA secondo diverse modalità e possono produrre: - estremità piatte (blunt ends) - estremità coesive (sticky ends)
Enzimi di restrizione
Gli enzimi di restrizione sono usati per il clonaggio molecolare per formarenuove molecole, dette molecole ricombinanti
Vettori di Clonaggio
I vettori di clonaggio sono particolari molecole di DNA, naturale o anche artificiale
- sono molecole di DNA, generalmente di piccole dimensioni- sono facilmente estraibili dalle cellule e quindi purificabili - possiedono un cosiddetto marcatore selettivo, ossia una proprietà che può essere utilizzata per selezionare i batteri che hanno incorporato il vettore di clonaggio (sia esso ricombinante o no) - sono capaci di replicarsi autonomamente, ossia in modo indipendente dalla replicazione del cromosoma della cellula ospite - possiedono una zona in cui può essere inserito il DNA esogeno
LigazioneE’ l’inserimento del DNA esogeno nel vettore
Ligazione
La reazione avviene a temperatura di 10°C o temperaturaambiente, per poche ore.La bassa temperatura è consigliata in quanto, diminuendol’energia cinetica delle molecole, riduce la possibilità che leestremità appaiate si separino prima di venire stabilizzate dallaligazione.
La reazione necessita della presenza dell’enzima DNA ligasi.
Questo enzima è implicato nella riparazione e la replicazione delDNA.
L’enzima comunemente utilizzato è la T4 DNA Ligasi, perchéstabile e poco costosa.
DNA ligasi
E’ in grado di legare due frammenti di DNA che hanno subito una rottura ed è implicato nella riparazione e la replicazione del DNA . Questo enzima catalizza infatti la formazione di legami covalentifosfodiesterici tra nucleotidi di DNA adiacenti.
Al termine della reazione di ligazione, nella provetta sono presentidiversi tipi di molecole:
Ligazione
molecole ricombinanti vere e proprie(vettore + inserto)
molecole di vettore che si è richiuso su sestesso senza aver incorporato l’inserto
molecole ricombinanti contenenti più di uninserto
molecole di solo inserto
molecole di vettore che sono rimaste lineari
Il plasmide è il vettore di clonaggio più comunemente usato.
E’ una molecola circolare di DNA a doppio filamento,normalmente presente nella cellula batterica, in grado direplicarsi autonomamente dalla cellula ospite.
Il plasmide
Requisiti dei Plasmidi per il Clonaggio
1) piccole dimensioni
2) sito di origine della replicazione (ORI)
3) siti di restrizione unici (polylinker)
4) marcatori genetici specifici (in genere un gene di resistenza ad un antibiotico: es. ampR)
Il plasmide
I Plasmidi si dividono in:
• Plasmidi ad elevato numero di copie, la cui replicazione avviene più frequentemente rispetto a quella del DNA cromosomico (alta resa);
• Plasmidi a basso numero di copie, la cui replicazione avviene con la stessa frequenza del DNA cromosomico.
• Possono essere classificati anche in base alla Specificità d’ospite: Alcuni plasmidi sono in grado di replicare in un numero limitato di specie batteriche e si dicono a specificità d’ospite limitata (per es. PBR322 e PUC18 si replicano solo in E.Coli).
• Altri plasmidi sono in grado di replicarsi in una vasta gamma di specie batteriche e si dicono a largo spettro d’ospite.
Il plasmide
TrasformazioneInserimento del vettore ricombinante nella cellula ospite
La riproduzione dei batteri è di tipoasessuale, cioè senza il contributodei due genitori ed il conseguenterimescolamento del patrimoniogenetico.
Trasformazione
In realtà, anche i batteriposseggono dei meccanismi discambio di geni, che sono:- la trasduzione- la coniugazione- la trasformazione
TrasformazioneNella trasduzione è un batteriofago,cioè un virus che infetta i batteri, atrasferire porzioni di DNA da unbatterio ad un altro.
Nella trasformazione la cellularicevente incorpora DNA libero concui viene in contatto.
Nella coniugazione il trasferimentodi DNA si realizza attraverso ilcontatto fisico tra una cellulabatterica donatrice ed una cellulabatterica ricevente.
Trasformazione
In una popolazione di batteri, solo una frazione di cellule ètrasformabile: tale proprietà prende il nome di competenza.
Trasformazione
Per poter utilizzare un batterio in esperimenti di clonaggiomolecolare, si deve indurre lo stato di competenza
METODI FISICI •Shock termico •Elettroporazione
METODI CHIMICI •Trasformazione con Cloruro di Calcio
METODI BIOLOGICI •Lipofezione
Trasformazione
Esistono svariati metodi per rendere competenti le cellulebatteriche. Essi si basano su principi chimici o fisici e variano anchein funzione del grado di efficienza di trasformazione che si vuolottenere.
Le cellule competenti trasformate sono cresciute in terreno dicoltura selettivo in modo da ottenere tante copie del DNA inserito
Coltura cellulare
Ogni batterio vitale si divideràsul terreno solido fino agenerare una colonia visibilea occhio nudo. In circa 12 oreogni cellula di E. coli generauna colonia che contiene circa107 cellule.
Quando si effettua un esperimento di clonaggio molecolaretramite trasformazione, non tutti i batteri vengono trasformatima è indispensabile poter distinguere le cellule batterichetrasformate da quelle non trasformate.
Trasformazione
E’ possibile ricorrendo all’uso dei cosiddetti “marcatori selettivi”del vettore di clonaggio.
Selezione del giusto clone
Selezione per inattivazione inserzionale
Il gene che conferisce resistenzaall’ampicillina codifica per l’enzimaβ-lattamasi.
Il gene LacZ codifica per l’enzima β-Galattosidasi, il quale è in grado didemolire il substrato cromogeno X-Gal con la produzione di unacolorazione blu
Selezione del giusto clone
Se un frammento di DNA èinserito nel gene lacZ, esso nonsarà più funzionale e laconversione di X-gal non saràpiù possibile. Le colonieresteranno dunque bianche.
In assenza dell’inserto, ilgene lacZ sarà funzionalee la colonia battericadiventerà blu.
Ogni cellula competente trasformata crea una colonia di celluleidentiche
Selezione bianco-blu
Coltura cellulare
INTERVALLO o Fase LagI batteri vengono diluiti nella colturainiziale; la divisione procedelentamente in quanto le cellule sistanno adattando al terreno fresco.
FASE LOGARITMICAI batteri crescono esponenzialmente
FASE STAZIONARIALa densità cellulare rimane costante.La coltura può anche entrare in unafase di declino in cui le cellule si lisanoed il DNA si degrada parzialmente.
Curva di crescita batterica
4 - 5 ore
10 - 11 ore
In ogni esperimento di clonaggio è necessario estrarre il DNAplasmidico dalle cellule trasformate ed analizzarlo medianteelettroforesi per verificare la presenza di DNA esogeno nelvettore plasmidico.
Esistono numerose procedure per isolare il DNA plasmidico esepararlo dal DNA del cromosoma di E. coli.
Purificazione del DNA plasmidico
In un tipico esperimento di clonaggiosi utilizzano delle procedure rapidedi estrazione di DNA plasmidico(miniprep) che permettono divalutare il risultato di unesperimento di clonaggio in tempimolto brevi (poche ore).
1. RISOSPENSIONE E. coli
3. NEUTRALIZZAZIONE
2. LISI
DNA cromosomico eDNA plasmidico
4. CENTRIFUGAZIONE erecupero del DNA plasmidico
Surnatante: DNA plasmidico
Pellet: DNA genomico, proteine,detriti cellulari
Purificazione del DNA plasmidico
Purificazione del DNA plasmidico
- Precipitazione DNA con etanolo assoluto
- Centrifugazione a velocità alta
- Evaporazione etanolo
- Risospensione del DNA precipitato in H2O o tampone
Purificazione del DNA plasmidico
Mediante digestione con enzimi di restrizione e succesivaseparazione per elettroforesi che separa le molecole di DNA inbase alla lunghezza facendole migrare in un campo elettrico.
Analisi del DNA ricombinante
Analisi del DNA ricombinante
Mediante amplificazione del frammento con primer specifici e sequenziamento.
Esempi di applicazione del clonaggioFermentazioni microbiche: per la produzione di antibiotici anchemodificati
Produzione di Vaccini: sintesi del gene virale che induce alla malattia al fine di ottenere vaccini più sicuri per il paziente
Sintesi di proteine : produzione di proteine di interesse su larga scala
Produzione di Animali e piante transgeniche: per migliorare la produttivitàdi alcune colture o migliorare la qualità nutrizionale di vegetali e carni.
Biotecnologie ambientali: produzione su larga scala di proteine batterichein grado di eliminare contaminanti ambientali (pesticidi, cancerogeni ecc.)
Regolazione dei geni e gene terapia: controllo dell’espressione di alcunigeni e trattamento di malattie genetiche