-
PENETAPAN KADAR KURKUMIN PADA SEDIAAN HERBAL YANG
MENGANDUNG Curcuma longa DENGAN METODE ULTRA HIGH
PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY-MASS
SPECTROMETRY (UHPLC-MS/MS)
TUGAS AKHIR
Untuk Memenuhi Persyaratan
Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi
Oleh :
Rifky Afrizal Fajar Kurniawan
NIM 155070500111011
PROGRAM STUDI SARJANA FARMASI
FAKULTAS KEDOKTERAN
UNIVERSITAS BRAWIJAYA
MALANG
2018
-
ii
HALAMAN PENGESAHAN
TUGAS AKHIR
Penetapan Kadar Kurkumin Pada Sediaan Herbal yang Mengandung
Curcuma longa dengan Metode Ultra High Performance Liquid
Chromatography – Mass Spectrometry (UHPLC-MS/MS)
Oleh:
Rifky Afrizal Fajar Kurniawan
NIM: 155070500111011
Telah diuji pada: Hari : Rabu Tanggal : 12 Desember 2018
dan dinyatakan lulus oleh :
Penguji-I,
Alvan Febrian Shalas, S.Farm., M.Farm.,Apt.
NIP.2011068502181001
Pembimbing-I/Penguji-II, Pembimbing-II/Penguji-III,
Bachtiar Rifai P, M.Farm.,Apt Ika Putri N, S.Farm., M.Sc.,
Apt.
NIP. 2012058709291001 NIP. 2013048909152001
Mengetahui, Kepala Program Studi Farmasi,
Alvan Febrian Shalas, S.Farm., M.Farm.,Apt. NIP.
2011068502181001
-
iii
PERNYATAAN KEASLIAN TULISAN
Saya yang bertandatangan di bawahini:
Nama : Rifky Afrizal Fajar Kurniawan
NIM : 155070500111011
Program Studi : Program StudiFarmasi
FakultasKedokteranUniversitasBrawijaya
MenyatakandengansebenarnyabahwaTugasAkhir yang
sayatulisinibenar-
benarkaryasayasendiri,
bukanmerupakanpengambilalihantulisanataupikiran
orang lain yang sayaakuisebagaitulisanataupikiransaya. Apabila
di
kemudianharidapatdibuktikanbahwaTugasAkhiriniadalahhasiljiplakan,
makasayabersediamenerimasanksiatasperbuatantersebut
Malang, Desember 2018
Yang menyatakanpernyataan,
(Rifky Afrizal Fajar Kurniawan)
NIM.155070500111011
-
iv
KATA PENGANTAR
Puji syukur kapada Allah SWT atas karunia dan rahmat-Nya
sehingga
penulis dapat menyelesaikan Tugas Akhir yang berjudul “Penetapan
Kadar
Kurkumin Pada Sediaan Herbal yang Mengandung Curcuma longa
dengan
Metode Ultra High Performance Liquid Chromatography – Mass
Spectrometry
(UHPLC-MS/MS)” dengan lancar untuk memenuhi persyaratan
menyelesaikan
studi di Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran Universitas
Brawijaya.
Ketertarikan penulis terhadap topik yang dibahas didalam
penelitian ini
didasarkan pada banyaknya sediaan herbal khususnya yang
mengandung kunyit
telah beredar di masyarakat dan tingkat konsumsinya yang
meningkat pada.
Oleh karena itu diperlukan pemantauan kualitas dari sediaan
tersebut. Salah
satu parameter pemantauan kualitas sediaan herbal secara
spesifik yaitu
penetapan kadar senyawa marker yaitu kurkumin dalam sediaan
tersebut
dengan metode UHPLC-MS/MS. Sehingga kadar kurkumin yang
terkandung
dalam sediaan herbal mengandung Curcuma longa dapat diketahui
.
Dengan selesainya Tugas Akhir ini, penulis ingin mengucapkan
terimakasih kepada seluruh pihak yang telah membantu
penyelesaiannya, antara
lain:
1. Dr. dr. Sri Andarini, M. Kes, selaku dekan Fakultas
Kedokteran
Universitas Brawijaya yang telah memberikan kesempatan untuk
menuntut ilmu di Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya
2. Alvan Febrian Shalas, S.Farm., M.Farm., Apt, selaku Ketua
Program
Studi Farmasi Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya yang
telah
memberikan kesempatan untuk menyelesaikan studi dengan baik
3. Bachtiar Rifai Pratita Ihsan, S.Farm., M.Farm.,Apt., selaku
dosen
pembimbing pertama yang telah memberikan pengarahan,
bimbingan dan saran-saran yang membangun selama penulisan
Tugas Akhir ini.
4. Ika Putri Nurhayati, S.Farm., M.Sc.,Apt., selaku dosen
pembimbing
kedua yang telah memberikan pengarahan, bimbingan dan saran-
saran yang membangun selama penulisan Tugas Akhir ini.
-
v
5. Alvan Febrian Shalas, S.Farm., M.Farm., Apt. Sebagai penguji
yang
telah memberi masukan dan wawasan terhadap penelitian ini
6. Hananditia Rachma Pramestutie.,S.Farm.,M.Farm.Klim.,Apt.,
selaku
ketua tim Tugas Akhir Program Studi Farmasi Fakultas
Kedokteran
Universitas Brawijaya.
7. Orang tua penulis, bapak Agung Saptono, S.Si, dan ibu
Nurul
Hidayati, serta saudara penulis Raditya Afreyzha Ramadhany
yang
senantiasa memberikan dukungan dan doa kepada penulis
sehingga
Tugas Akhir ini tidak mungkin selesai tanpa bantuan mereka.
8. Teman teristimewa, Winfika Wibisono Putri yang selalu
memberikan
dukungan dan bantuan serta doa selama proses penyelesaian
Tugas
Akhir ini.
9. Teman-teman penghuni grima, Arip, Birrul, Abu, Panji, Alif,
Adit, Dio,
Danil, Bidin, Sandi, Ramen, Wisnu yang selalu menyediakan
tawa
ceria di setiap sore hari di kampus.
10. Teman-teman Farmasi UB 2015 yang telah bersama berjuang
di
farmasi sejak mahasiswa baru.
11. Kakak-kakak tingkat yang telah memberikan banyak ilmunya
kepada
penulis dan adik-adik tingkat yang siap meneruskan perjuangan
dan
inovasi penulis.
12. Segenap keluarga organisasi tempat saya menambah ilmu
dan
pengalaman yaitu HMF Aecus Prospisio.
13. Semua Pihak yang telah membantu dan tidak dapat disebutkan
satu
persatu.
Penulis sadar bahwa tidak ada yang sempurna di dunia ini,
demikian
pula dengan penelitian Tugas Akhir yang penulis yakin masih
sangat jauh dari
kesempurnaan. Sehingga penulis mengharapkan kritik dan saran
yang
membangun. Semoga penelitian ini bermanfaat bagi kita semua.
Malang, 20 Desember 2018
Penulis
-
vi
ABSTRAK
Kurniawan, Rifky Afrizal Fajar. 2018. Penetapan Kadar Kurkumin
Pada Sediaan Herbal yang Mengandung Curcuma longa dengan Metode
Ultra High Performance Liquid Chromatography – Mass Spectrometry
(UHPLC-MS/MS).Tugas Akhir, Program Studi Sarjana Farmasi, Fakultas
Kedokteran Universitas Brawijaya. Pembimbing: (1) Bachtiar Rifa’i
Pratita Ikhsan, S.Farm., M.Farm., Apt. (2) Ika Putri Nurhayati,
S.Farm., M.Sc., Apt.
Kunyit banyak dipilih sebagai agen antiinflamasi dan antikanker
secara tradisional. Terdapat banyak produk herbal mengandung kunyit
untuk mengatasi antiinflamasi atau meredakan nyeri. Senyawa yang
paling berperan memberikan efek farmakologis yaitu kurkumin dalam
kunyit tersebut. Perlu dilakukan validasi metode analisis kurkumin
menggunakan UHPLC-MS/MS karena memiliki hasil pemisahan senyawa dan
deteksi senyawa yang sangat baik. Serta perlu dilakukan monitoring
kualitas dengan penetapan kadar kurkumin dalam sediaan herbal
tersebut. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui validitas
medote analisis kurkumin yang digunakan dan mengetahui kadar
kurkumin dalam beberapa sediaan herbal guna memenuhi monitoring
kualitas sediaan tersebut. Sampel dipilih dengan cara metode
purposive sampling dengan beberapa kriteria tertentu. Dilakukan
validasi metode analisis kurkumin menggunakan UHPLC-MS/MS dengan
fase gerak gradien A (0,1% asam format dalam aquabidest) dan B
(0,1% asam format dalam acetonitrile) serta fase diam yaitu Kinetex
EVO C18 100oA. Metode analisis dinyatakan valid dengan memenuhi
parameter validasi yaitu selektivitas, linieritas (r=0,9997),
akurasi (% perolehan kembali = 98,63-101,76%), presisi
(%RSD=0,38-5,7%), LOD (0,11µg/ml) dan LOQ (0,34µg/ml). Berikutnya
dilakukan penetapan kadar kurkumin dalam 3 sampel sediaan herbal
mengandung kunyit. Kadar yang didapatkan sampel serbuk (0,03%),
sampel kapsul (4,78%), dan sampel cair (0,03%).
Kata kunci: Kunyit, Kurkumin, UHPLC-MS/MS, Validasi Metode,
Sediaan Herbal
-
vii
ABSTRACT
Kurniawan, Rifky Afrizal Fajar. 2018. Determination of Curcumin
in Herbal
Medicine Containing Curcuma longa Using Ultra High Performance
Liquid
Chromatography-Mass Spectrometry (UHPLC-MS/MS). Final
Assignment,
Pharmacy Program, Medical Faculty Brawijaya University.
Advisers: (1) Bachtiar
Rifa’i Pratita Ikhsan, S.Farm., M.Farm., Apt. (2) Ika Putri
Nurhayati, S.Farm.,
M.Sc., Apt.
Turmeric (Curcuma longa) widely used as the main ingredient of
some herbal medicines to relieve pain and inflammation. Curcumin is
the main secondary metabolites of Curcuma longa that has also shown
some therapeutic activities such as anti-inflammatory and
anti-cancer agent. An efficient, sensitive and precise Ultra High
Performance Liquid Chromatography – Mass Spectrometry (UHPLC-MS/MS)
was developed to determine curcumin content in several herbal
medicine contains turmeric. The method was validated for linearity,
selectivity, accuracy, precision, LOD and LOQ. Thus, the method can
be used to determine curcumin content in herbal medicine to control
herbal medicine quality. Objective of this research is to validate
the method of curcumin analysis and determine curcumin content in
herbal medicine. Validation was done through curcumin analysis
using UHPLC-MS/MS with the gradient mobile phase A (0.1% format
acid in aquabidest) and B (0.1% format acid in acetinitrile), while
the static phase was Kinitex EVO C18 100o A. The method was finally
recognized as valid by fulfilling several validation parameters
such selectivity showed 3,2 minute as Retention Time (RT) also 285
m/z and 177 m/z as quantifier and qualifier product mass of
curcumin , linearity (r=0.9997), accuracy (% recovery =
98,63-101.76%), precision (%RSD=0,38-5,70%), LOD (0,11 µg/ml) and
LOQ (0,34 µg/ml). Curcumin level in three samples was determined
from the herbal medicines containing turmeric. It showed that each
herbal medicines sample contain curcumin 0.03%, 4,78% and liquid
0.03% for powder, capsule and liquid dosage form respectively. This
research showed that the proposed method may be useful as an
accurate, effective and sensitive for quantitative determination of
curcumin content.
Keywords: Turmeric, Curcumin, UHPLC-MS/MS, Method Validation,
Dosage Form
-
viii
DAFTAR ISI
HALAMAN
PENGESAHAN.................................................................................
ii
PERNYATAAN KEASLIAN TULISAN
...............................................................
iii
KATA PENGANTAR
..........................................................................................
iv
ABSTRAK
..........................................................................................................
vi
ABSTRACT
.......................................................................................................
vii
DAFTAR ISI
......................................................................................................
vii
DAFTAR TABEL
................................................................................................
ix
DAFTAR GAMBAR
............................................................................................
xi
DAFTAR LAMPIRAN
......................................................................................
xiiii
DAFTAR SINGKATAN
.....................................................................................
xiii
BAB 1 PENDAHULUAN ..........................................
Error! Bookmark not defined.
1.1 Latar belakang .................................... Error!
Bookmark not defined.
1.2 Rumusan Masalah .............................. Error!
Bookmark not defined.
1.3 Tujuan ................................................
Error! Bookmark not defined.
1.4 Manfaat ..............................................
Error! Bookmark not defined.
BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA .................................. Error!
Bookmark not defined.
2.1. Obat Tradisional ................................. Error!
Bookmark not defined.
2.2. Kunyit .................................................
Error! Bookmark not defined.
2.3. Kurkumin ............................................
Error! Bookmark not defined.
2.4. High Performance Liquid Chromatography (HPLC)Error!
Bookmark
not defined.
2.5. Ultra High Performance Liquid Chromatography – Mass
Spectrometry
(UHPLC-MS/MS) ................................ Error! Bookmark
not defined.
2.6. Validasi Metode Analisis ..................... Error!
Bookmark not defined.
BAB 3 KERANGKA KONSEP ................................. Error!
Bookmark not defined.
3.1. Kerangka Konsep ............................... Error!
Bookmark not defined.
-
ix
BAB 4METODE PENELITIAN .................................. Error!
Bookmark not defined.
4.1. Rancangan Penelitian ..................... Error! Bookmark
not defined.
4.2. Populasi dan sampel ........................ Error!
Bookmark not defined.
4.3. Lokasi dan Waktu Penelitian ............ Error! Bookmark
not defined.
4.3.1. Lokasi Penelitian ................... Error! Bookmark not
defined.
4.3.2. Waktu Penelitian ................... Error! Bookmark not
defined.
4.4. Bahan dan Alat Penelitian ................ Error! Bookmark
not defined.
4.4.1. Bahan Penelitian ................... Error! Bookmark not
defined.
4.4.2. Alat / Instrumen Penelitian .... Error! Bookmark not
defined.
4.5. Prosedur Penelitian .......................... Error!
Bookmark not defined.
4.5.1. Kondisi Operasional UHPLC-MS/MSError! Bookmark not
defined.
4.5.2. Pembuatan larutan baku kurkuminError! Bookmark not
defined.
4.5.3. Preparasi Sampel ................. Error! Bookmark not
defined.
4.5.3.1 Sediaan Cair. ......... Error! Bookmark not defined.
4.5.3.2. Sediaan Serbuk........ Error! Bookmark not defined.
4.5.3.3. Sediaan Kapsul ........ Error! Bookmark not
defined.
4.5.4. Validasi metode analisis ........ Error! Bookmark not
defined.
4.5.5. Analisis data ......................... Error! Bookmark
not defined.
BAB 5HASIL DAN ANALISA DATA ........................ Error!
Bookmark not defined.
5.1. Kondisi Operasional UHPLC-MS/MS Error! Bookmark not
defined.
5.2. Validasi Metode Analisa ................... Error! Bookmark
not defined.
5.3. Penetapan Kadar Kurkumin pada Sediaan HerbalError!
Bookmark
not defined.
BAB 6 PEMBAHASAN ............................................
Error! Bookmark not defined.
6.1 Pembahasan .................................... Error!
Bookmark not defined.
6.2 Implikasi Penelitian........................... Error!
Bookmark not defined.
6.3 Keterbatasan Penelitian ................... Error! Bookmark
not defined.
BAB 7 PENUTUP
..................................................... Error!
Bookmark not defined.
7.1 Kesimpulan ...................................... Error!
Bookmark not defined.
7.2 Saran ............................................... Error!
Bookmark not defined.
DAFTAR PUSTAKA .................................................
Error! Bookmark not defined.
-
x
LAMPIRAN
...............................................................
Error! Bookmark not defined.
-
xi
DAFTAR TABEL
Table 2.1. Kategori Metode Pengujian (United States
Pharmacopeial Convention,
2007). ...................................................
Error! Bookmark not defined.
Table 2.2. Parameter Analisis yang Dibutuhkan Dalam Validasi
Metode Analisis
(United States Pharmacopeial Convention, 2007).Error!
Bookmark
not defined.
Tabel 2.3. Kriteria Rentang Recovery yang Dapat Diterima (AOAC,
2002) .. Error!
Bookmark not defined.
Tabel 2.4. Kriteria Akurasi dan Presisi yang Masih Dapat
Diterima (AOAC, 2002).
.............................................................
Error! Bookmark not defined.
Tabel 4.1. Gradien Kecepatan Fase Gerak ........... Error!
Bookmark not defined.
Tabel 5.1. Gradien Kecepatan Fase Gerak ........... Error!
Bookmark not defined.
Tabel 5.2. Optimasi Parameter Massa untuk CurcuminError!
Bookmark not
defined.
Tabel 5.3. Tabel Hasil Selektivitas Berdasarkan Waktu
RetensiError! Bookmark
not defined.
Tabel 5.4. Tabel Hasil Selektivitas Berdasarkan Detektor MS/MS
............... Error!
Bookmark not defined.
Tabel 5.5. Kriteria Batas Perolehan Kembali yang DapatError!
Bookmark not
defined.
Tabel 5.6. Kriteria Batas %RSD yang Dapat Diterima (AOAC, 2002)
.......... Error!
Bookmark not defined.
Tabel 5.7. Tabel Hasil Akurasi dan Presisi ............ Error!
Bookmark not defined.
Tabel 5.8. Tabel Hasil Penetapan Kadar Kurkumin dalam Sampel
.............. Error!
Bookmark not defined.
-
xii
DAFTAR GAMBAR
Gambar 2.1. Logo-logo sediaan jamu (A), Obat Herbal Terstandart
(B) dan
Fitofarmaka (C) (BPOM, 2015) ...... Error! Bookmark not
defined.
Gambar 2.2. Struktur Kimia Kurkumin (a), Demetoksikurkumin (b),
dan
Bisdemetoksikurkumin (c) (Sethi at al, 2009)Error! Bookmark
not
defined.
Gambar 2.3. Skema Instrumen HPLC (Ahuja dan Dong, 2005).Error!
Bookmark
not defined.
Gambar 2.4.. Skema Injektor (a) posisi pada saat memuat sampel
dan (b) posisi
saat menyuntikkan sampel (Ahuja dan Dong, 2005) .............
Error!
Bookmark not defined.
Gambar 2.5 . Skema Pompa Piston Tunggal Pada HPLC (Ahuja dan
Dong, 2005)
...................................................... Error!
Bookmark not defined.
Gambar 2.6 . Efektifitas kolom dengan perbandingan besar ukuran
partikel pada
masing-masing dekakde plot van Deemter (Seelam, 2013). .
Error!
Bookmark not defined.
Gambar 2.7. Sistem Kerja MS/MS pada UHPLC-MS/MS (Kang, 2015).
..... Error!
Bookmark not defined.
Gambar 5.1. Hasil Waktu Retensi antara Standar (a) dan Sampel
Serbuk (b)
...................................................... Error!
Bookmark not defined.
Gambar 5.2. Hasil Detektor MS/MS antara Standar (a) dan Sampel
Serbuk (b)
...................................................... Error!
Bookmark not defined.
Gambar 6.1. Residual Silanol Pada Kolom UHPLC (Crawford, 2016)
.......... Error!
Bookmark not defined.
Gambar 6.2. Sistem Kerja ESI-Triple Quadrupole (Kang,
2015)Error! Bookmark
not defined.
Gambar 6.3. Produk Mass Curcumin pada ESI-MS/MS Mode Ion
Positif. (A)
spektra kurkumin dalam plasma darah. (A’) spektra kurkumin
oleh
SRM ESI-MS/MS (Wang, 2012) ..... Error! Bookmark not
defined.
Gambar 6.4. Fragmentasi Kurkumin pada MS a. (Liu, 2016) b.(
Albert, 2018)
...................................................... Error!
Bookmark not defined.
-
xiii
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1. Kromatogram Standar Kurkumin ....... Error! Bookmark
not defined.
Lampiran 2. Kromatogram Kurkumin dalam Sampel Sediaan Serbuk
Mengandung Curcuma longa ......... Error! Bookmark not
defined.
Lampiran 3. Kromatogram Kurkumin dalam Sampel Cair Serbuk
Mengandung
Curcuma longa............................... Error! Bookmark not
defined.
Lampiran 4. Kromatogram Kurkumin dalam Sampel Kapsul Serbuk
Mengandung
Curcuma longa............................... Error! Bookmark not
defined.
Lampiran 5. Kondisi Sistem UHPLC-MS/MS ......... Error! Bookmark
not defined.
Lampiran 6. Tabel data Area Respon Kromatogram dan Waktu Retensi
Sampel
Sediaan Herbal dan Standar KurkuminError! Bookmark not
defined.
Lampiran 7. Tabel Perhitungan Kadar Kurkumin dalam Sampel
Sediaan Herbal
...................................................... Error!
Bookmark not defined.
Lampiran 8. Tabel Perhitungan Akurasi, Presisi, LOD, dan LOQ
Standar
Kurkumin ........................................ Error!
Bookmark not defined.
-
xiv
DAFTAR SINGKATAN
UHPLC-MS/MS = Ultra High Performance Liquid Chromatography-Mass
Spectrometry
OHT = Obat Herbal Terstandar
LOD = Limit of Detection
LOQ = Limit of Quantification
ESI =Electrospray Ionization
SRM = Selected Reaction Monitoring
-
vi
ABSTRAK
Kurniawan, Rifky Afrizal Fajar. 2018. Penetapan Kadar Kurkumin
Pada Sediaan Herbal yang Mengandung Curcuma longa dengan Metode
Ultra High Performance Liquid Chromatography – Mass Spectrometry
(UHPLC-MS/MS).Tugas Akhir, Program Studi Sarjana Farmasi, Fakultas
Kedokteran Universitas Brawijaya. Pembimbing: (1) Bachtiar Rifa’i
Pratita Ikhsan, S.Farm., M.Farm., Apt. (2) Ika Putri Nurhayati,
S.Farm., M.Sc., Apt.
Kunyit banyak dipilih sebagai agen antiinflamasi dan antikanker
secara tradisional. Terdapat banyak produk herbal mengandung kunyit
untuk mengatasi antiinflamasi atau meredakan nyeri. Senyawa yang
paling berperan memberikan efek farmakologis yaitu kurkumin dalam
kunyit tersebut. Perlu dilakukan validasi metode analisis kurkumin
menggunakan UHPLC-MS/MS karena memiliki hasil pemisahan senyawa dan
deteksi senyawa yang sangat baik. Serta perlu dilakukan monitoring
kualitas dengan penetapan kadar kurkumin dalam sediaan herbal
tersebut. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui validitas
medote analisis kurkumin yang digunakan dan mengetahui kadar
kurkumin dalam beberapa sediaan herbal guna memenuhi monitoring
kualitas sediaan tersebut. Sampel dipilih dengan cara metode
purposive sampling dengan beberapa kriteria tertentu. Dilakukan
validasi metode analisis kurkumin menggunakan UHPLC-MS/MS dengan
fase gerak gradien A (0,1% asam format dalam aquabidest) dan B
(0,1% asam format dalam acetonitrile) serta fase diam yaitu Kinetex
EVO C18 100oA. Metode analisis dinyatakan valid dengan memenuhi
parameter validasi yaitu selektivitas, linieritas (r=0,9997),
akurasi (% perolehan kembali = 98,63-101,76%), presisi
(%RSD=0,38-5,7%), LOD (0,11µg/ml) dan LOQ (0,34µg/ml). Berikutnya
dilakukan penetapan kadar kurkumin dalam 3 sampel sediaan herbal
mengandung kunyit. Kadar yang didapatkan sampel serbuk (0,03%),
sampel kapsul (4,78%), dan sampel cair (0,03%).
Kata kunci: Kunyit, Kurkumin, UHPLC-MS/MS, Validasi Metode,
Sediaan Herbal
-
vii
ABSTRACT
Kurniawan, Rifky Afrizal Fajar. 2018. Determination of Curcumin
in Herbal
Medicine Containing Curcuma longa Using Ultra High Performance
Liquid
Chromatography-Mass Spectrometry (UHPLC-MS/MS). Final
Assignment,
Pharmacy Program, Medical Faculty Brawijaya University.
Advisers: (1) Bachtiar
Rifa’i Pratita Ikhsan, S.Farm., M.Farm., Apt. (2) Ika Putri
Nurhayati, S.Farm., M.Sc.,
Apt.
Turmeric (Curcuma longa) widely used as the main ingredient of
some herbal medicines to relieve pain and inflammation. Curcumin is
the main secondary metabolites of Curcuma longa that has also shown
some therapeutic activities such as anti-inflammatory and
anti-cancer agent. An efficient, sensitive and precise Ultra High
Performance Liquid Chromatography – Mass Spectrometry (UHPLC-MS/MS)
was developed to determine curcumin content in several herbal
medicine contains turmeric. The method was validated for linearity,
selectivity, accuracy, precision, LOD and LOQ. Thus, the method can
be used to determine curcumin content in herbal medicine to control
herbal medicine quality. Objective of this research is to validate
the method of curcumin analysis and determine curcumin content in
herbal medicine. Validation was done through curcumin analysis
using UHPLC-MS/MS with the gradient mobile phase A (0.1% format
acid in aquabidest) and B (0.1% format acid in acetinitrile), while
the static phase was Kinitex EVO C18 100o A. The method was finally
recognized as valid by fulfilling several validation parameters
such selectivity showed 3,2 minute as Retention Time (RT) also 285
m/z and 177 m/z as quantifier and qualifier product mass of
curcumin , linearity (r=0.9997), accuracy (% recovery =
98,63-101.76%), precision (%RSD=0,38-5,70%), LOD (0,11 µg/ml) and
LOQ (0,34 µg/ml). Curcumin level in three samples was determined
from the herbal medicines containing turmeric. It showed that each
herbal medicines sample contain curcumin 0.03%, 4,78% and liquid
0.03% for powder, capsule and liquid dosage form respectively. This
research showed that the proposed method may be useful as an
accurate, effective and sensitive for quantitative determination of
curcumin content.
.
Keywords: Turmeric, Curcumin, UHPLC-MS/MS, Method Validation,
Dosage
Form
-
1
BAB 1
PENDAHULUAN
1.1 Latar belakang
Indonesia merupakan negara yang kaya akan sumber daya alam
dan
dikenal sebagai negara yang mengandung unsur kebudayaan daerah
terbanyak
di dunia. Budaya-budaya tersebut masih melekat hingga era modern
ini. Salah
satu budaya yang masih dipertahankan yaitu tradisi pengobatan
alami, atau
biasa dikenal dengan jamu. Budaya minum jamu ini tidak hanya
menonjol pada
bidang kesehatan tapi juga bidang kebudayaan karena sifatnya
yang turun
temurun dari generasi ke generasi berikutnya. Antusiasme
masyarakat terhadap
jamu masih cukup besar. Berdasarkan Data Riset Kesehatan Dasar
(Riskesdas),
pada tahun 2013 menyebutkan bahwa 30,4% rumah tangga di
Indonesia
memanfaatkan pelayanan kesehatan tradisional, dengan rincian
77,8%
menggunakan keterampilan kesehatan tradisional tanpa alat dan
49% rumah
tangga memanfaatkan ramuan (Kemenkes RI, 2013). Menurut Badan
Pengawas
Obat dan Makanan (BPOM), obat herbal diklasifikasikan secara
umum menjadi 3
bagian besar yaitu jamu yang merupakan ramuan bahan tumbuhan
yang
digunakan secara turun-temurun, OHT atau Obat Herbal Terstandar
merupakan
sediaan herbal yang telah dibuktikan keamanan dan khasiatnya
secara ilmiah,
dan Fitofarmaka yang telah diujikan secara praklinik dan uji
klinik serta bahan
baku dan produk jadinya telah distandarisasi (BPOM, 2005).
Indonesia merupakan negara agraria. Tanahnya yang subur
menghasilkan
beragam tanaman yang tentunya memiliki banyak manfaat dalam
kehidupan
-
2
sehari-hari. Hasil-hasil agraria tersebut banyak dimanfaatkan ke
berbagai aspek
umum kehidupan seperti, sandang, pangan dan papan, termasuk
aspek khusus
yaitu kesehatan. Terdapat sekitar 25% obat modern atau obat
konvensional
berasal dari tumbuhan obat (WHO,2013). Berdasarkan Riset
Tumbuhan Obat
dan Jamu (RISTOJA) oleh Kementrian Kesehatan pada tahun 2015
menjelaskan bahwa terdapat data informasi tumbuhan obat sebanyak
19.871,
16.218 diantaranya terdiri dari 1.559 spesies meliputi 156
famili. Salah satunya
adalah penggunaan kunyit (Curcuma longa) di bidang medis atau
pengobatan
dan sebagai bahan pangan. Kunyit termasuk dalam salah satu
ramuan terbanyak
yaitu sejumlah 462 informasi (Kemenkes RI, 2015).
Kunyit merupakan salah satu produk jamu yang banyak dikonsumsi
oleh
masyarakat. Terdapat beberapa ramuan kunyit untuk berbagai
penyakit. Pada
Etnis Jawa di Yogyakarta terdapat 50 ramuan mengandung kunyit
yang
digunakan untuk terapi pasca persalinan. Pada Etnis Jawa daerah
Jawa Tengah
terdapat 29 ramuan mengandung kunyit untuk mengatasi penyakit
Jaundice atau
gangguan pada organ hati. Pada Etnis Simalungun daerah Sumatera
terdapat 1
ramuan untuk pengobatan HIV/AIDS, dan 26 ramuan untuk pengobatan
kanker
pada Etnis Suku Hutan Provinsi Riau (Kemenkes RI, 2015). Kunyit
memiliki efek
farmakologis antara lain, sebagai antiinflamasi, sebagai agen
hipotensi,
pengobatan pada dispepsia antikanker, antikoagulan,
antiprotozoa,
antinematoda dan hepatoprotektor (Simanjuntak, 2012).
Efektifitas kunyit sebagai
terapi beberapa penyakit sudah banyak dilakukan. Kunyit dosis
200 dan 600
mg/kg akan efektif digunakan sebagai antiinflamasi (Chuang,
2000). 1% dan
0,2% diet kunyit mampu memberikan inhibisi pada expresi gen
Rasp21 dan
Fosp62 pada kanker kulit dan menurunkan level dari pailoma (EMA,
2009).
-
3
Penggunaan secara oral 100 mg/kg dapat mengatasi ulcer pada
permukaan
lambung dengan membentuk lapisan protektif (Simanjuntak,
2012).
Penyembuhan sekresi empedu pada saluran empedu yang terhambat
dapat
dilakukan dengan pemberian 25 mg/kg natrium
kurkuminat.Kemampuanantiprotozoapadakunyitmemilihiefekhambatyaitusebesar
65% dengandosispemberian 9µg/ml. Senyawa aktif yang terkandung
dalam
kunyit adalah kurkuminoid yang terdiri dari kurkumin, dimetoksi
kurkumin,
desmetoksi kurkumin, trietil kurkumin dan bisdemetoksi kurkumin
(Rukmana,
2005). Senyawa kurkumin terpilih menjadi senyawa marker pada
kunyit, karena
merupakan senyawa yang bersifat khas, mempunyai struktur kimia
yag jelas,
stabil, tersedia, dapat diisolasi dan memiliki efek farmakologis
(Patterson, 2006).
Seiring dengan meningkatnya konsumsi produk herbal terutama
jamu
mengandung kunyit, maka monitoring kualitas sediaan tersebut
juga menjadi
sangat penting demi menjaga keamanan produk, kualitas produk dan
efikasi dari
produk yang terdapat di pasaran. Monitoring kualitas sangat
diperlukan guna
menjamin produk dapat tepat indikasi dan memiliki efikasi yang
maksimal ketika
dikonsumsi oleh pasien (Oka, 2017). Dosis atau takaran maksimal
konsumsi
kunyit pada tubuh manusia berdasarkan WHO monograf menyatakan
bahwa
serbuk kunyit maksimal 3 gram/harinya, sedangkan pada sediaan
tinktur (1:10)
yaitu 3 ml per harinya (WHO Monographs, 1999).Untuk
menghindarkan dan
memberikan tindakan preventif serta edukatif terhadap produksi
dan konsumsi
jamu serta menghindarkan pasien dari resiko toksisitas, resiko
kurangnya efek
obat atau efikasi yang dibawah nilai ambang, atau efek samping
yang tidak
diinginkan akibat inkompatibilitas dari sediaan akibat
kualitasnya tidak terjamin.
Berdasarkan pendapat yang telah dijelaskan maka perlu dilakukan
validasi
-
4
metode analisis kurkumin sebagai salah satu dari tahap
penjaminan mutu
sediaan kefarmasian baik herbal maupun sediaan oral dan non-oral
lainnya.
Analisis suatu sediaan atau senyawa sangat diperlukan dalam
proses
produksi, bergantung pada spesifikasi sediaan atau senyawa yang
akan diuji.
Efektifitas dalam proses analisis sangatlah diperlukan,salah
satu faktor utama
yang berperan dalam efektifitas dan efisien suatu proses
analisis adalah metode
dan kromatogram yang digunakan. Banyak pilihan dalam melakukan
analisis
suatu senyawa, seperti menggunakan GC-MS, NMR,
KLT-Densitometri,
Spektrofotometri UV-Vis. Analisis kurkumin telah banyak
dilakukan dengan
menggunakan beragam metode kromatografi, diantaranya adalah
analisis
kurkumin menggunakan High Performance Liquid Chromatography
(HPLC)
dengan optimasi isokratik pada ekstrak kunyit komersial
(Wichitnithad, 2009),
validasi metode HPLC analisis kurkumin dalam sediaan sirup
(Sumule, 2007)
dan beberapa penelitian penetapan kadar kurkumin pada beberapa
bentuk
sediaan yang mengandung kurkumin menggunakan HPLC (Ida, 2010).
Dari
beberapa metode analisis yang digunakan tersebut, yang paling
efektif adalah
menggunakan HPLC karena memiliki pemisahan puncak yang paling
spesifik,
serta memberikan informasi yang lengkap dibandingkan metode
kromatogram
lainnya. Berdasarkan penjelasan tersebut, maka pada penelitian
ini analisis
dilakukan menggunakan HPLC. Metode HPLC dipilih karena HPLC
memiliki
sensitivitas dan selektivitas yang lebih baik terhadap suatu
molekul kimia
dibandingkan dengan metode analisis kromatografi yang lainnya.
HPLC mampu
memisahkan senyawa dengan sangat baik, teliti dan spesifik.
Tidak hanya
berlaku untuk obat saja, HPLC sangat bermanfaat dan efektif
untuk analisis
herbal sebgai bentuk identifikasi kandungan senyawa dalam herbal
tersebut. Hal
-
5
ini dibuktikan dengan kemampuan daya pisah molekul yang baik dan
mendeteksi
analit dalam jumlah yang kecil (Parwa, 1991). Efektifitas sebuah
analisis
senyawa dalam sampel dapat meningkat dengan menggunakan Ultra
High
Performance Liquid Chromatography (UHPLC). UHPLC memiliki
diameter kolom
-
6
1.3 Tujuan
1. Untuk mengetahui metode analisis kurkumin dalam kunyit
dengan
metode UHPLC-MS/MS dapat memenuhi parameter validasi metode
yaitu selektivitas, linieritas, akurasi, presisi, LOD dan
LOQ.
2. Untuk mengetahui kadar kurkumin pada sediaan herbal
mengandung
Curcuma longa di Kota Malang.
1.4 Manfaat
1.4.1 Manfaat Akademik
1. Membantu dan mendukung perkembangan ilmu pengetahuan dan
teknologi di bidang kesehatan khususnya di bidang farmasi
dalam
penentuan dosis yang tepat dalam penggunaan jamu kurkumin.
2. Sebagai acuan dalam validasi metode penetapan kadar
kurkumin
dalam sediaan jamu di Kota Malang
1.4.2 Manfaat Praktisi
Bagi tenaga kesehatan utamanya apoteker dapat menentukan
dosis yang tepat untuk pasien dalam mengkonsumsi sediaan
jamu
kurkumin yang ada di Kota Malang, guna mencapai efektifitas
terapi
dan menghindari toksisitas.
-
7
BAB 2
TINJAUAN PUSTAKA
2.1. Obat Tradisional
Berdasarkan Pasal 1 peraturan Kepala Badan POM No.
HK.00.05.4.1384 Tahun 2005 tentang Kriteria dan Tata Laksana
Pendaftaran Obat Tradisional, Obat Herbal Terstandar dan
Fitofarmaka,
maka obat tradisional tersebut diklasifikasikan menjadi :
1. Jamu berasal dari kata “jampi”, sebuah kata dalam bahasa
Jawa Krama. Kata jampi tersebut secara bahasa memiliki
makna ramuan ajaib. Sedangkan kata menjampi berarti
menyembuhkan dengan magis/mantera oleh dukun pada era
kuno (Tilaar et al, 2010). Jamu adalah obat tradisional
Indonesia yang dibuat dari tumbuhan, bahan hewan, bahan
mineral, sediaan sarian (galenik) atau campuran dari bahan-
bahan tersebut, yang telah digunakan secara turun-temurun
untuk pengobatan berdasarkan pengalaman.
2. Obat Herbal Terstandar adalah obat tradisional yang
disajikan
dari ekstrak atau penyarian bahan alam yang dapat berupa
tanaman obat, binatang maupun mineral yang telah dibukukan
keamanan dan khasiatnya secara ilmiah dengan uji praklinik
dan bahan bakunya telah di standarisasi.
3. Fitofarmaka adalah sediaan obat bahan alam yang telah
dibuktikan keamanan dan khasiatnya secara ilmiah dengan uji
praklinik dan uji klinik, bahan baku dan produk jadinya telah
di
standardisasi.
-
8
A B C
1.1 Gambar 2.1. Logo-logo sediaan jamu (A), Obat Herbal
Terstandart
(B) dan Fitofarmaka (C) (BPOM, 2015)
2.2. Kunyit
Kunyit adalah tanaman tropis yang banyak terdapat di benua
Asia.
Mayoritas masyarakat menggunakan kunyit sebagai zat pewarna dan
zat
pemberi aroma pada makanan. „Ayurvedic‟ menuliskan bahwa
kunyit
berperan sebagai aromatika, stimulan, dan sebagai sumber warna
merah
tua. Dan pada era yang baru ini menyebutkan bahwa kunyit
berperan
besar dalam penyakit yang berhubungan dengan empedu maupun
hepatobilliary disorders, sinusitis, penyakit hepatik dan
diabetes
(Simanjuntak, 2012). Kunyit dapat bertahan hidup sampai lebih
dari 2
tahun dan termasuk dalam keluarga Zingiberaceae. Kunyit
banyak
tumbuh di wilayah tropis seperti Indonesia, Cina dan India.
Kunyit dapat
tumbuh subur di dataran rendah antara 90 meter sampai dengan
2000
meter di atas permukaan laut (Labban, 2014). Menurut
Linnaeus,
klasifikasi kunyit adalah :
Kingdom : Plantae
Phylum : Magnoliophyta
Kelas : Liliopsida
Subkelas : Zingiberidae
Ordo : Zingiberales
-
9
Famili : Zingiberaceae
Genus : Curcuma
Spesies : Curcuma longa Linn.
Kandungan utama dalam rimpang kunyit yaitu kurkuminoid yang
terdiri dari kurkumin, demektosikurkumin dan
bisdemetoksikurkumin.
Selain itu, kunyit juga mengandung minyak atsiri, senyawa
yang
terkandung dalam minyak atsiri antara lain, Tumerone, Curlone,
Curdione,
Turmeronol B, 1,8 cineole, α-zingiberene, β-pinene,
β-bisabolene, p-
cynene, Curcumene (Jayaprakasha, 2005).
Kunyit memiliki banyak manfaat di bidang kesehatan, seperti
berperan sebagai anti-inflamasi dengan mekanisme menghambat
LOX,
COX fosfolipase, leukotrien, pembentukan prostalglandin,
collagenase
dan TNF (Labban, 2014). Peradangan pada hati dapat diberi
alternatif
terapi yaitu 200 mg/kg atau 600 mg/kg kurkumin (Agruim,
2012).
Kombinasi antara 480 mg kurkumin dengan 20 mg quercetin dalam
1
kapsul, telah diuji pada 43 pasien transplantasi ginjal, 71%
pasien pada
kelompok dosis rendah mengalami penurunan serum kreatinin.
Peran
kurkumin besar dalam pengobatan ini yaitu sebagai agen
antiinflamasi
dan antioksidan, dengan mekanisme induksi enzim hemeoksigenase
dan
sitokin pro-inflmasi yang berbanding lurus dengan tingkat
kerusakan pada
sel (Labban, 2014).
Kunyitjugadimanfaatkansebagaiterapialternatifkanker,
atausebagaiagen anti-tumor.Kunyitmenginhibisi 3
tahapdalamcarsinogenesis, yaitufaseinitiasi,
-
10
fasepromosidanfaseprogresi.Selamafaseinsiasidanfasepromosi,
kurkumindalamkunyitbekerjadenganmengontrol factor
transkripsifase I
dan II, menurunkansitokin pro-inflamasi, menurunkan
metabolism
asamarachidonatjalurlipoxygenasedanvicyclooxygenase.Efektifitasdarikur
kumin yang diberikansebesar 0,2% dan 1%
telahdiujipadaDimetylbenz (α)
Antrasen (DMBA) dan12-O-Tetradecanoylphorbol-13-Acetate(TPA)
tumor, ditemukanbahwapapilomapadagrup yang
diberikanterapikukurminmengalamipenurunanataukadarnyalebihrendahda
rikelompoklainnya, serta ditemukanjugaekspresidari gen
p21danp62
jugamenurun (EMA, 2009).
Padastudikliniklainmenyebutkanbahwadosisuntuksetiapjeniskankeradalah
berbeda, 100 mg
kurkumindiberikanuntukkankerprostatdengankombinasi
40 mg isolavonselama 6 bulan.
Pengobatanuntukkankerususdiberikan
360 mg kurkumin 3 kali sehariselama 10-30 hari, untukpasien
yang
belummengalamioperasipengangkatankanker. Dosis 8000
mg/haridiberikanuntukpasien yang menderitakanker pancreas,
dalamstudiinijugamenyebutkanbahwacurcuminamandikonsumsihingga
8000mg/harinya (Muthu, 2015). Kunyit juga dapat berperan
sebagai
antioxidan dan hepatoprotektor, antidiabetes, anti kanker,
dispepsia dan
antimikroba (Labban, 2014).
2.3. Kurkumin
Kurkumin merupakan senyawa aktif yang dominan dalam
Curcuma longa. Kurkumin merupakan salah satu turunan dari
kurkuminoid, turunannya yang lain yaitu demetoksikurkumin
dan
bisdemetoksikurkumin.
-
11
A B C
1.2 Gambar 2.2. Struktur Kimia Kurkumin (a), Demetoksikurkumin
(b),
dan Bisdemetoksikurkumin (c) (Sethi at al, 2009)
Kurkumin mempunyai rumus molekul C21H20O6. Kurkumin
termasuk dalam senyawa flavonoid yang tidak larut dalam air
tetapi larut
dalam ethanol, dimethilsulfoxid dan aseton. Titik didih kurkumin
yaitu
183oC dengan berat molekul 368,37 g/mmol (Sethi at al, 2009).
Kurkumin
akan terdegradasi dalam kondisi pH diatas 6,5 dan paparan
cahaya
matahari yang berlebih (Tonnesen dan Karlsen, 1985). Kurkumin
akan
berwarna kuning hingga jingga pada kondisi asam dan pada kondisi
basa
akan berwarna merah. Kurkumin pada kondisi basa dengan pH
8,5-10,0
pada waktu yang relatif lama dapat mengalami proses disosiasi,
kurkumin
akan terdegradasi membentuk asam ferulat dan feruloilmetan.
Apabila
kurkumin terkena cahaya maka akan juga terjadi reaksi
degradasi
fitokimia. Gugus metilen tersebut akan aktif diantara 2 gugus
keton pada
senyawa tersebut (Sethi at al, 2009).
2.4. High Performance Liquid Chromatography (HPLC)
High Performance Liquid Chromatography merupakan salah satu
alat analisis yang berprinsip pada pemisahan dengan kecepatan
dan
efisiensi yang tinggi sampel terhadap fase gerak dan fase
diam,
-
12
dengan optimalisasi kondisi tertentu. Fase gerak dialirkan
melalui
kolom dengan tekanan dari pompa, sehingga alirannya cepat,
kemudian sampel akan dideteksi dengan detektor (Hendyana,
2006).
Pemisahan solut-solut ini diatur oleh distribusi solut dalam
fase gerak
dan fase diam (Gandjar dan Rohman, 2007).
1.3 Gambar 2.3. Skema Instrumen HPLC (Ahuja dan Dong, 2005).
Alat ini didukung dengan sistem pompa tekanan tinggi dan
detektor yang sangat sensitif dan beragam sehingga dapat
memunculkan
peak yang sensitif dan beragam senyawa yang spesifik dalam
suatu
molekul. Metode HPLC ini telah luas diterima untuk analisis
dan
pemurnian senyawa tertentu dalam suatu sampel, karena
merupakan
metode yang tidak destruktif dan selektif (Gandjar dan Rohman,
2007).
Titik berat dari analisis menggunakan kromatografi adalah pada
senyawa
yang tidak mudah menguap dan tidak stabil pada suhu tinggi, yang
tidak
dapat dianalisis menggunakan kromatografi gas. Kelebihan lainnya
dalam
penggunaan HPLC yaitu, kolom dapat digunakan kembali,
memiliki
resolusi yang baik, dapat menghindari adanya dekomposisi,
mudah
melakukan sample recovery, serta dapat menggunakan berbagai
macam
detektor (Effendy, 2004).
-
13
Banyak tipe dari HPLC berdasarkan prinsip kerjanya, seperti
kromatografi partisi, kromatografi adsorpsi, kromatografi
pertukaran ion
dan kromatografi eklusi. Kromatografi partisi terbagi menjadi 2
jenis, yaitu
HPLC fase normal dan HPLC fase terbalik. HPLC fase normal
menggunakan fase diam yang lebih polar dibandingkan dengan
fase
geraknya, sedangkan HPLC fase terbalik menggunakan fase diam
yang
lebih non-polar dibandingkan dengan fase geraknya (Synder,
2010).
Fase gerak yang digunakan dalam HPLC biasanya terdiri dari
satu pelarut atau campuran beberapa pelarut yang berperan dalam
daya
elusi dan resolusi, sedangkan daya elusi dan resolusi ini
ditentukan oleh
polaritas pelarut tersebut, polaris fase diam dan sifat sampel
yang diuji.
Terdapat 2 tipe elusi pada HPLC yaitu, cara isokratik dan cara
gradien.
Cara isokratik berprinsip pada ketetapan fase gerak selama
proses elusi
berlangung, sedangkan pada cara gradien berprinsip pada
gradien
komposisi fase gerak yang digunakan (Gandjar dan Rohman,
2007).
Kebanyakan fase diam pada HPLC yang dipilih berupa silika
yang
dimodifikasi secara kimiawi, silika yang tidak dimodifikasi atau
polimer
stiren dan divinil benzen. Sifat pada permukaan silika bersifat
polar dan
sedikit asam akibat adanya residu dari gugus silanol (Si-OH).
Salah satu
jenis silika yang dimodifikasi yaitu oktadesil silika (ODS atau
C18). ODS
banyak digunakan karena dapat memisahkan senyawa yang
memiliki
tingkat kepolaran rendah, sedang dan tinggi (Gandjar dan
Rohman,
2007).
HPLC memiliki bagian-bagian terpentingnya, yaitu reservoir
pelarut, pompa, injektor, kolom dan detektor. Reservoir pelarut
terbuat
-
14
dari kaca atau stainless steel yang mampu memuat 200-1000 mL
pelarut.
Reservoir dilengkapi dengan degasser yang berfungsi untuk
menghilangkan gas terlarut pada fase gerak yang digunakan,
kebanyakan
gas tersebut adalah oksigen dan nitrogen yang berpotensi kuat
untuk
mengganggu proses analisis akibat pembentukan gelembung pada
kolom
dan sistem detektor. Reservoir juga dilengkapi dengan penyaring
milipore
yang mampu menyaring partikel halus yang terdapat pada
pelarut.
Penyaring ini berfungsi untuk menghindari kerusakan berupa
sumbatan
pada kolom, injektor, dan pompa (Susanti, 2017). Injektor atau
alat
penyuntik sampel pada HPLC terbuat dari tembaga tahan karat dan
katup
teflon. Sampel akan dimasukkan melewati keluk sampel, katup
akan
diputar sehingga fase gerak akan melewati keluk sampel dan
membawa
sampel ke dalam kolom (Gandjar dan Rohman, 2007)
1.4 Gambar 2.4.. Skema Injektor (a) posisi pada saat memuat
sampel
dan (b) posisi saat menyuntikkan sampel (Ahuja dan Dong,
2005)
Pompa pada HPLC terbuat dari gelas, baja tahan karat,
teflon,
dan batu nilam. Sifat pompa ini haruslah inert atau tidak
bereaksi
terhadap samel maupun fase gerak yang digunakan. Pompa yang
-
15
digunakan sebaiknya memiliki kemampuan memberikan tekanan
hingga
5000 psi dan mampu mengalirkan fase gerak degnan kecepatan 3
mL/menit. Fungsi adanya pompa adalah menjamin penghantaran
fase
gerak dapat berlangsung secara tepat, konstan dan terbebas dari
adanya
gangguan (Gandjar dan Rohman, 2007).
1.5 Gambar 2.5 . Skema Pompa Piston Tunggal Pada HPLC (Ahuja
dan
Dong, 2005)
Kolom merupakan tempat terjadinya senyawa tersebut terpisah
dari ikatannya akibat interaksi penyerapan molekul antara fase
gerak dan
fase diam dengan prinsip kepolaran molekul. Kolom merupakan
salah
satu kunci utama dalam proses kromatografi yang baik. Silika
merupakan
bahan pengisi kolom yang terdiri dari ikatan siloksan (Si-O-Si).
Silanol
pada permukaan dalam kolom memiliki sifat polar. Namun pada
sistem
HPLC fase terbalik, fase diam akan bersifat lebih non polar
dikarenakan
adanya penambahan hidrokarbon pada permukaan silika (Moffat,
2011).
Kolom yang digunakan pada sistem HPLC pada umumnya memiliki
panjang 5-25 cm dengan diameter bagian dalam sebesar 4,6 mm,
ukuran
partikel 5µm dan mengandung 40.000 sampai 70.000 plat/meter
(Skoog,
2007).
-
16
Oven pada sistem HPLC berfungsi untuk menentukan suhu yang
digunakan atau kontrol suhu pada sistem HPLC. Terutama pada
sistem
HPLC fase terbalik, suhu akan memengaruhi waktu retensi dan
selektivitas. Kisaran suhu yang digunakan untuk analisis adalah
30o
sampai 50o C (Ahuja dan Dong, 2005). Detektor diperlukan
untuk
mendeteksi komponen yang terdapat dalam kolom serta untuk
mengukur
jumlah konsentrasi komponen tesebut. Detektor yang baik
adalah
detektor yang memenuhi persyaratan sensitivitas yang tinggi
dengan
rentang sensitivitas 10-8 -10-15 gram solut per detik,
kestabilan dan
reprodusibilitas yang sangat baik, respon yang linear
terhadap
konsentrasi solut, dapat bekerja dari temperatur kamar sampai
400oC,
tidak dipengaruhi perubahan temperatur dan kecepatan pelarut
pengembang, mudah didapat, mudah dipakai operator, selektif
terhadap
macam-macam linarut dalam pelarut pengembang dan tidak
merusak
sampel (Mulja dan Suharman, 1995).
2.5. Ultra High Performance Liquid Chromatography – Mass
Spectrometry
(UHPLC-MS/MS)
Prinsip kerja HPLC dengan UHPLC adalah sama, pemisahan
larutan berdasarkan daya ikatnya antara fase diam dan fase gerak
dalam
sebuah kolom. Kelebihan UHPLC dibandingkan dengan HPLC
adalah
memiliki ukuran partikel yang lebih kecil, efisiensi dan
resolusi yang lebih
baik dibandingkan dengan HPLC. UHPLC pada dasarnya
menggunakan
ukuran partikel sebesar
-
17
meningkat. Ketika dikombinasikan dengan kolom yang pendek atau
aliran
fase gerak yang cepat. Resolusi yang dihasilkan oleh kolom
juga
mengingkat antar puncak. Tingkat resolusi kolom dengan ukuran
partikel
sebesar 1,7 µm membaik sebesar 70% dibandingkan dengan
ukuran
partikel 5 µm (Seelam, 2013).
1.6 Gambar 2.6 . efektifitas kolom dengan perbandingan besar
ukuran partikel
pada masing-masing dekakde plot van Deemter (Seelam, 2013).
Hasil kromatogram pada UHPLC akan lebih baik dibandingkan
HPLC
yang memiliki nilai tekanan sebesar 2500-5000 PSI. UHPLC
dapat
konsisten menghasilkan pemisahan dengan resolusi yang baik
dengan
tekanan yang diberikan yaitu 8.000-15.000 PSI (Seelam,
2013).
Deteksi menggunakan MS akan memiliki efektifitas analisis
yang
lebih tinggi dibandingkan deteksi menggunakan
UV(Ultraviolet)-visible.
Karena detektsi analit menggunakan instrumen MS akan
memberikan
kepastian selektivitas terhadap analit yang ingin di analisis
atau diteliti.
Pada prinsipnya MS dapat menyusun molekul gas(ion)
berdasarkan
massanya. MS bekerja dengan mengionisasi atom-atom atau
molekul-
-
18
molekul kemudian menyeleksi dan mendeteksi ion berdasarkan
perbandingan massa terhadap muatannya. MS dan sistem UPLC
dihubungkan dengan alat pengionisasi dengan teknik ionisasi
berdasarkan tekanan atmosfer (API, Atmospheric Pressure
Ionization).
Salah satu teknik API yang sering digunakan adalah ESI
(Electrospray
Ionization) untuk campuran yang bersifat ion atau sangat polar,
tidak
stabil terhadap suh tinggi atau yang memiliki berat molekul
lebih tinggi
dari 100 (Watson, 2007).
1.7 Gambar 2.7. Sistem Kerja MS/MS pada UHPLC-MS/MS (Kang,
2015).
MS/MS memiliki beberapa tipe instrumen berdasarkan
fungsionalnya dalam analisis tertarget dan analisis tidak
tertarget. Analisis
tertarget menggunakan beberapa instrumen seperti QqQ atau
biasa
disebut dengan Triple Quadrupoleyang merupakan jenis analisis
massa
yang menggunakan osilasi medan listrik yang digunakan digunakan
untuk
menyeleksi ion yang stabil atau tidak stabil yang melewati
frekuensi radio.
Quadrupole yang pertama bertindak sebagai mass filter, yang
bertugas
-
19
untuk mengirimkan ion masuk ke dalam qudrupole kedua. Tugas
dari
quadrupole yang kedua yaitu terjadi tumbukan ion yang
mengalami
pemecahan. Sedangkan quadrupole ketiga memiliki tugas sebagai
mass
filter yang mengirimkan ion hasil pemecahan ke detektor.
Analisis
tertarget bermakna bahwa senyawa kimia lain tidak akan
dimunculkan
pada kromatogram karena telah ditarget suatu senyawa yang akan
di
analisis. Metode yang biasanya digunakan adalah SRM
(Selected
Reaction Monitoring). Sedangkan analisis yang tidak tertarget,
akan
banyak keluar senyawa kimia yang lain pada kromatogram,
sehingga
tidak spesifik terhadap senyawa yang sedang akan dianalisis.
Insrumen
MS yang digunakan pada analisis tidak tertarget yaitu salah
satunya TOF
(Time-of-flight) dengan prinsip penembakan laser dengan
panjang
gelombang tertentu kepada matriks yang akan menyerap cahaya
tersebut. Tegangan pulsa laser ditembakkan ke pelar target
untuk
mempercepat sampel terionisasi menuju analyzer massa time of
flight
(Kang, 2015).
2.6. Validasi Metode Analisis
Validasi metode analisis adalah proses pembuktian yang
meyakinkan bahwa performa karakteristik suatu metode telah
memenuhi
persyaratan untuk aplikasi analisis (United States
Pharmacopeial
Convention, 2007). Menurut Harmita (2004), bahwa validasi
metode
adalah suatu proses penilaian terhadap metode analisis
tertentu
berdasarkan percobaan labolatorium untuk membuktikan bahwa
metode
tersebut memenuhi persyaratan untuk digunakan. Validasi
metode
analisis ini berfokus pada beberapa parameter tertentu, seperti
ketepatan
-
20
(akurasi), ketelitian (presisi), selektivitas, limit deteksi,
limit kuantitasi,
lineartitas dan rentang (United States Pharmacopeial Convention,
2007).
Tujuan dari dilaksanakannya validasi metode ini adalah
menjamin
bahwa metode analisis yang dikembangkan dapat memberikan
hasil
pengukuran yang cermat, tepat dan sesuai dengan yang
diharapkan
secara konsisten. Untuk menghindari penurunan kualitas produk,
dalam
upaya menjaga kualitas, keamanan dan efikasi dari produk yang
akan
dikonsumsi oleh masyarakat.
Table 2.1. Kategori Metode Pengujian (United States
Pharmacopeial Convention,
2007).
Kategori Keterangan
I
Metode untuk penetapan kadar komponen utama bahan baku atau
bahan aktif (termasuk pengawet) dalam produk jadi sediaan
farmasi
II Metode analisis untuk penetapan ketidakmurnian bahan baku
atau
hasil degradasi dalam produk jadi sediaan farmasi
III Metode analisis untuk penetapan karakteristik performa
(seperti
disolusi, pelepasan obat)
IV Uji identifikasi
-
21
Table 2.2. Parameter Analisis yang Dibutuhkan Dalam Validasi
Metode Analisis
(United States Pharmacopeial Convention, 2007).
Karateristik
Analisis Kategori I Kategori II Kategori III Kategori IV
Akurasi Y Y - - T
Presisi Y Y T Y T
Batas deteksi Y Y Y - Y
Selektivitas T T Y - T
Batas kuantitasi T Y T - T
Linieritas Y Y T - T
Rentang Y Y - - T
a. Selektivitas
Selektivitas merupakan salah satu kemampuan untuk mengukur
analit secara spesifik, cermat dan seksama dengan adanya
komponen
yang mungkin ada dalam sampel. Selektivitas dinyatakan dalam
derajat
bias dari hasil yang diperoleh dengan membandingkan dengan
impuritas, produk degradasi atau senyawa kimia yang mirip.
Selektivitas
ditentukan dengan menginjeksikan sampel pada sistem
kromatografi,
puncak yang lain tidak tercampur dengan puncak yang lain,
dinyatakan
dalam perhitungan resolusi (Yuwono dan Indrayanto, 2005).
Nilai resolusi (Rs) yang diterima yaitu >1,5 (baseline
resolution),
artinya puncak sudah terpisah dan senyawa tersebut telah
murni
terdeteksi tanpa adanya kontaminasi dengan bahan lain (Pescok,
1976)
-
22
b. Linieritas dan rentang
Linieritas adalah kemampuan metode analisis untuk
menunjukkan
hasil uji yang secara langsung dengan grafik atau secara
perhitungan
matematis proporsional atau sebanding dengan kenaikan
konsentrasi
analit dalam sampel pada beberapa sampel atau pada rentang
tertentu.
Minimal jumlah konsentrasi atau sampel yang dibutuhkan adalah
4
sampel, untuk menghasilkan nilai resolusi. Linieritas
digambarkan dalam
bentuk persamaan regresi linear yaitu y=bx+a. Hasil slope (b),
intersep
(a) dan resolusi (r) menggambarkan informasi linieritas.
Intersep
menunjukkan tingkat kepekaan analisis instrumen yang
digunakan
(Harmita, 2004). Nilai koefisien yang diterima yaitu sebesar
0,999, jika
nilai koefisien kurang dari 0,999 maka perlu dilakukan
perhitungan
parameter lain yaitu Vxo ≤5 (Yuwono dan Indrayanto, 2005)
Rentang merupakan jarak antara kadar terendah dengan kadar
tertinggi analit yang sudah ditujukkan dapat diterapkan
dengan
ketepatan, ketelitian dan linieritas yang dapat diterima sesuai
ketentuan-
ketentuan. Rentang dinyatakan dalam satuan yang sama dengan
hasil
yang diperoleh dengan metode analisis (Harmita, 2004).
c. Ketepatan (akurasi)
Ketepatan diartikan dengan kedekatan antara hasil analisis
dengan kadar analit yang sebenarnya. Ketepatan dinyatakan
dalam
-
23
persen perolehan kembali (% recovery). Banyak faktor-faktor
yang
mempengaruhi tingkat ketepatan, seperti kalibrasi alat, peraksi
dan
pelarut yang tidak menimbulkan residual atau kontaminan, kontrol
suhu,
dan pelaksanaan praktikan yang handal (Harmita, 2004).
Secara
Internasional, terdapat 3 cara yang digunakan untuk
mengevaluasi
ketepatan metode analisis kimia, yaitu dengan bahan rujukan
baku
(SRM/Standart Reference Material), menggunakan baku sebagai
pembanding (standart method) dan recovery dengan menempatkan
analit plasebo (Spiked plasebo recovery) (Synder, 1997).
Tabel 2.3. Kriteria Rentang Recovery yang Dapat Diterima (AOAC,
2002)
Konsentrasi analit (%) Akurasi (recovery, %)
100 98-101
10 95-102
1 92-105
0,1 90-108
0,01 85-110
10 µg/g (ppm) 80-115
1 µg/g 75-120
10 µg/kg (ppb) 70-120
d. Kecermatan (presisi)
Ketelitian menunjukkan ukuran kesesuaian antara hasil uji
individual diukur melalui penyebaran hasil individual kemudian
di rata-
-
24
rata jika prosedur diterapkan secara berulang pada sampel yang
diambil
dari campuran yang homogen (Synder, 1997). Ketelitian
dinyatakan
sebagai simpangan baku atau simpangan baku relatif (Harmita,
2004).
Suatu metode tersebut akan memenuhui syarat apabila nilai
koefisian variasinya (KV) yaitu
-
25
BAB 3
KERANGKA KONSEP DAN HIPOTESIS PENELITIAN
3.1. Kerangka Konsep
Gambar 3.1. Kerangka Konsep
Prevalensi penggunaan obat tradisional mencapai 30,4%
masyarakat Indonesia (Kemenkes RI, 2013)
Ramuan mengandung kunyit mencapai 86
ramuan di berbagai etnis (Kemenkes RI, 2015)
monitoring mutu sediaan obat tradisional
Analisis menggunakan UHPLC-MS/MS
Validasi metode
analisis
Linieritas Selektivitas Akurasi Presisi LOD &
LOQ
Penetapan kadar kurkumin pada sediaan
obat tradisional di Kota Malang
Kurkumin(senyawa marker)
Efek Farmakologi yang tinggi
-
26
Prevalensi dari penggunaan obat tradisional meningkat pada
dekade ini, terdapat banyak ramuan obat tradisional di berbagai
etnis di
Indonesia. Salah satu pemegang jumlah ramuan terbanyak yaitu
tanaman
kunyit. Pada penelitian ini, dilakukan validasi metode analisa
kurkumin
yang terkandung dalam kunyit, sehingga metode analisa kurkumin
pada
kunyit dapat valid untuk dilakukan. Parameter validasi yang
dipertimbangkan adalah selektivitas, linieritas, akurasi,
presisi, LOD dan
LOQ. Kemudian dilakukan penetapan kadar pada sediaan herbal
mengandung kunyit di Kota Malang. Hal ini bertujuan untuk
menetapkan
kadar kurkumin pada sediaan tersebut dan menjamin efikasi,
keamanan
dan kualitas dari sediaan herbat tersebut ketika dikonsumsi oleh
pasien.
Validasi metode ini dilakukan menggunakan HPLC yang telah
dioptimasi
kondisinya, fase gerak dan fase diamnya.
-
27
BAB 4
METODE PENELITIAN
4.1. Rancangan Penelitian
Penelitian yang dilakukan mengikuti jenis penelitian
observasional,
dengan rancangan penelitian deskriptif, karena pada penelitian
ini tidak
dilakukan manipulasi pada subjek uji dan hanya
mendeskripsikan
keadaan yang ada.
4.2. Populasi dan sampel
Sampel yang digunakan pada penelitian ini adalah produk
herbal
yang mengandung kunyit (Curcuma longa). Sampel didapatkan
atau
diperoleh dari kios-kios jamu yang ada di Kota Malang. Sampel
diambil
secara purposive sampling, dapat berupa jamu, OHT atau
fitofarmaka.
Sampel yang diambil yaitu sejumlah 3 produk, masing-masing dari
merk
atau produk yang berbeda. Kriteria pemilihan sampel yaitu
sebagai
berikut :
- Mengandung tanaman Curcuma longa
- Sampel dapat berupa jamu, OHT atau fitofarmaka
- Sampel dapat berupa sediaan serbuk, kapsul atau tablet dan
sediaan cair
4.3. Lokasi dan Waktu Penelitian
4.3.1. Lokasi Penelitian
Penelitian ini dilakukan di Labolatorium Bahan Alam,
Program Studi Farmasi Universitas Brawijaya dan di
Labolatorium
-
28
Analisis Instrumen, Jurusan Teknik Kimia, Politeknik Negeri
Malang.
4.3.2. Waktu Penelitian
Penelitian ini dilakukan pada bulan Juli-Oktober 2018
4.4. Bahan dan Alat Penelitian
4.4.1. Bahan Penelitian
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah baku
standar kurkumin TCI (Tokyo Chemical Industry), sampel
produk
herbal yang diambil secara acak sejumlah 3 sampel di Kota
Malang, metanol pro HPLC, asam format 0,1% pro HPLC dalam
aquabidest pro HPLC, asam format 0,1% pro HPLC dalam
asetonitril 0,1% pro HPLC.
4.4.2. Alat / Instrumen Penelitian
Alat yang digunakan adalah UHPLC merk ACCELLA tipe
1250 buatan Thermo Scientific yang terdiri dari degasser
vakum,
pompa quartener, autosampler termostatik, MS/MS Triple Q
(quadrupole) spektrometer massa TSQ QUANTUM ACCESS MAX
dari Thermo Finnigan, Personal Computer (PC) dengan
perangkat
lunak x-calibur 2.1 dan software TSQ Tune mode ionisasi
positif,
kolom Kinetex EVO c18 100oA (50mmx2,1 mm x 1,7 µm.
disposable filter dengan ukuran pori 0,2 mikrometer, neraca
analitik Shimadzu ® AUW 220, pipet volume, labu ukur, gelas
ukur, gelas kimia, mikropipiet, neraca Metler AE® 200),
mikropipet sentrifuge Orcgon® LC-04S, sonikator DAWE®.
-
29
4.5. Prosedur Penelitian
4.5.1. Kondisi Operasional UHPLC-MS/MS
Fase gerak yang digunakan yaitu fase gerak A dan fase
gerak B. Fase gerak A terdiri dari 0,1% asam format dalam
aquabidest dan Fase gerak B terdiri dari 0,1% asam format
dalam Acetonitrile. Gradien kecepatan fase gerak yang
dipakai adalah 300 µl/menit dengan pengaturan fase gerak
sebagai berikut :
Tabel 4.1. Gradien Kecepatan Fase Gerak
No. Time A% B% µl/min 0 0.00 75.0 25.0 300.0 1 0.50 75.0 25.0
300.0 2 3.00 25.0 75.0 300.0 3 4.00 25.0 75.0 300.0 4 4.50 75.0
25.0 300.0 5 6.00 75.0 25.0 300.0
Kromatogram yang digunakan yaitu UHPLC merk
ACCELLA tipe 1250 buatan Thermo Scientific yang terdiri
dari degasser vakum, pompa quartener, autosampler
termostatik dikendalikan Personal computer melalui program
x-calibur 2.1. Kolom yang digunakan dengan spesifikasi
Kinetex EVO C18 100OA (50mm x 2.1mm x 1.7µm). Kolom
dikontrol pada suhu 30oC dan kompartemen sampel ditetapkan
pada suhu 16oC.
Sebagai pendukung data secara kuantifikasi dan kualifikasi,
digunakan MS/MS Triple Q (quadrupole) spektrometer massa
-
30
TSQ QUANTUM ACCESS MAX dari Thermo Finnigan
dengan sumber ionisasi ESI (Electrospray Ionization)
dikendalikan oleh software TSQ Tune yang dioperasikan
dengan ionisasi mode positive. Penentuan senyawa yang
ditarget dengan metode SRM (Selected Reaction
Monitoring)diatur pada Tabel 1.
Tabel 1. Optimasi parameter massa untuk Curcumin
Komponen Parent mass (m/z) Product mass (m/z)
Qualifier Quantifier
Curcumin 369 177 285
Kondisiionisasi ESIadalah sebagai berikut:
Teganganspray 3kV
Suhupenguapan275◦C
Suhukapiler, 300◦C
Nitrogensebagaisheath gas pressure 40 psi
Aux gas pressure10 psi dengan gas argon.
4.5.2. Pembuatan larutan baku kurkumin
Ditimbang baku kurkumin sebanyak 1,6; 3,3; 7,5; 15; 30 mg
Dilarutkan dengan metanol dalam labu takar 10 ml hingga
tanda sehingga diperoleh konsentrasi 0,16; 0,33; 0,75; 1,5;
3
mg/ml sebagai larutan baku kurkumin
Semua larutan baku tersebut disonikasi selama 10 menit
Larutan disentrifuse dengan kecepatan 5000 rpm selama 10
menit
-
31
Supernatan dipipet, kemudian larutan diencerkan kembali
dengan metanol pro HPLC
Larutan kemudian disaring dengan disposable filter berukuran
0,2 µm
Setiap konsentrasi diinjek pada UHPLC dengan volume 2µl,
dengan replikasi pada masing-masing injeksi yaitu 3 kali
4.5.3. Preparasi Sampel
Terdapat 3 sampel yang digunakan yaitu sampel sediaan cair,
sediaan kapsul dan sediaan serbuk.
4.5.3.1. Sediaan Cair
Ditimbang sampel sediaan cair sebanyak 1,0882 g
Dilarutkan dengan metanol pro HPLC dalam labu
takar 10 ml hingga tanda
Disonikasi selama 10 menit
Larutan disentrifuse dengan kecepatan 5000 rpm
selama 10 menit
Supernatan dipipet sebanyak 100 µl kemudian
ditambahkan dengan 1000 µl metanol. Larutan
tersebut dipipet sebanyak 200 µl kemudian
ditambahkan dengan 1000 µl metanol sehingga
diperoleh faktor pengenceran sebanyak 660 ml
Larutan kemudian disaring dengan disposable filter
berukuran 0,2 µm
-
32
Setiap konsentrasi diinjek pada UHPLC dengan
volume 2µl, dengan replikasi pada masing-masing
injeksi yaitu 5 kali
4.5.3.2. Sediaan Serbuk
Ditimbang sampel sediaan serbuk sebanyak 0,1203 g
Dilarutkan dengan metanol pro HPLC dalam labu
takar 10 ml hingga tanda
Disonikasi selama 10 menit
Larutan disentrifuse dengan kecepatan 5000 rpm
selama 10 menit
Supernatan dipipet sebanyak 200 µl kemudian
ditambahkan dengan 1000 µl metanol. Sehingga
diperoleh faktor pengenceran sebanyak 60 ml
Larutan kemudian disaring dengan disposable filter
berukuran 0,2 µm
Setiap konsentrasi diinjek pada UHPLC dengan
volume 2µl, dengan replikasi pada masing-masing
injeksi yaitu 5 kali
4.5.3.3. Sediaan Kapsul
Diambil sejumlah 20 kapsul, serbuk kapsul
dikeluarkan dari cangkang kapsul
Ditimbang serbuk dari 20 kapsul sehingga diperoleh
9,84 g
Ditimbang sampel serbuk kapsul sebanyak 0,1095 g
-
33
Dilarutkan dengan metanol pro HPLC dalam labu
takar 10 ml hingga tanda
Disonikasi selama 10 menit
Larutan disentrifuse dengan kecepatan 5000 rpm
selama 10 menit
Supernatan dipipet sebanyak 100 µl kemudian
ditambahkan dengan 1000 µl metanol. Larutan
tersebut dipipet sebanyak 100 µl kemudian
ditambahkan dengan 1000 µl metanol. Larutan
tersebut dipipet kembali sebanyak 100 µl kemudian
ditambahkan dengan 1000 µl metanol Sehingga
diperoleh faktor pengenceran sebanyak 13.310 ml
Larutan kemudian disaring dengan disposable filter
berukuran 0,2 µm
Setiap konsentrasi diinjek pada UHPLC dengan
volume 2µl, dengan replikasi pada masing-masing
injeksi yaitu 5 kali
4.5.4. Validasi metode analisis
4.5.4.1. Uji Selektivitas
Sebanyak 2 µl larutan sampel cair, sampel kapsul dan
sampel sediaan serbuk serta larutan baku diinjeksikan
ke UHPLC
Dilakukan pengamatan terhadap waktu retensi,
resolusi, dan match factor antara larutan baku dan
masing-masing larutan sampel
-
34
4.5.4.2. Uji Linieritas
Sebanyak 2 µl larutan baku kurkumin dengan
konsentrasi 0,16; 0,33; 0,75; 1,5; 3 mg/ml diinjeksikan
pada sistem HPLC
Dilakukan 3 kali injeksi pada setiap larutan baku
kurkumin
Diamati luas area pada masing-masing konsentrasi
dan replikasi.
Persamaan kurva baku dari setiap replikasi ditetapkan
dari hasil analisis regresi linear antara konsentrasi
terhadap luas area yang diperoleh.
Kemudian dipilih kurva terbaik dengan nilai koefisien
korelasi (r) >0,999.
4.5.4.3. Penentuan Akurasi dan Presisi Baku Kurkumin
Sebanyak 2 µl larutan baku kurkumin dengan
konsentrasi 0,16; 0,33; 0,75; 1,5; 3 mg/ml diinjeksikan
pada sistem HPLC
Dilakukan 3 kali injeksi pada setiap larutan baku
kurkumin
Diamati luas area pada masing-masing konsentrasi
dan replikasi.
Luas area yang didapatkan, dimasukkan kembali ke
dalam persamaan linear yang telah dipilih pada uji
linieritas
Hitung perolehan kembali konsentrasi dan %RSD
-
35
4.5.4.4. Penentuan Limit of Detection (LOD) dan Limit of
Quantification (LOQ)
Sebanyak 2 µl larutan baku konsentrasi 0,16; 0,33;
0,75; 1,5; 3 mg/ml ke sistem HPLC
Dilakukan pengamatan terhadap luas area yang
muncul pada detektor
Dihitung nilai LOD dan LOQ
4.5.5. Analisis data
4.5.5.1. Selektivitas
Selstivitas ditentukan dengan parameter resolusi (Rs)
(Harmita, 2004). Rumus perhitungan resolusi :
𝑟𝑒𝑠𝑜𝑙𝑢𝑠𝑖 𝑅𝑠 = (𝑡𝑅1 − 𝑡𝑅2)
12 (𝑊1 + 𝑊2)
Keterangan : Rs = resolusi
tR1 = waktu retensi puncak analit
pertama
tR2 = waktu retensi puncak
analit kedua
W1 = lebar dasar puncak
pertama
W2 = lebar dasar puncak
kedua
-
36
4.5.5.2. Linieritas
Linieritas dinyatakan dengan koefisien korelasi (r) yang
didapatkan dari persamaan regresi y=bx+a. (b)
merupakan nilai slope dari persamaan dan (a)
merupakan nilai intersep dari persamaan. Persamaan
regersi didapatkan dari hasil plot konsentrasi larutan
baku kurkumin terhadap luas area (AUC) pada
kromatogram.
4.5.5.3. Akurasi
Akurasi dinyatakan dalam persen perolehan kembali
(% recovery). Rumus menghitung % recovery:
%𝑅𝑒𝑐𝑜𝑣𝑒𝑟𝑦 =𝑘𝑜𝑛𝑠𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑠𝑖 𝑡𝑒𝑟𝑢𝑘𝑢𝑟
𝑘𝑜𝑛𝑠𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑠𝑖 𝑠𝑒𝑏𝑒𝑛𝑎𝑟𝑛𝑦𝑎 𝑥 100%
4.5.5.4. Presisi
Presisi dihitung sebagai simpangan deviasi relatif
(RSD) atau koefisien variasi (KV). Rumus perhitungan
KV:
𝐾𝑉 = 𝑠𝑖𝑚𝑝𝑎𝑛𝑔𝑎𝑛 𝑑𝑒𝑣𝑖𝑎𝑠𝑖 (𝑆𝐷)
𝑟𝑎𝑡𝑎 − 𝑟𝑎𝑡𝑎 (𝑥) 𝑥 100%
4.5.5.5. LOD dan LOQ
Penentuan LOD dan LOQ dapat dilakukan melalui
penghitungan rumus sebagai berikut:
𝐿𝑂𝐷 =3.
𝑆𝑖𝑚𝑝𝑎𝑛𝑔𝑎𝑛 𝑏𝑎𝑘𝑢 𝑦 𝑆𝑦
𝑟𝑎𝑡𝑎 −𝑟𝑎𝑡𝑎 (𝑥)
𝑠𝑙𝑜𝑝𝑒
𝐿𝑂𝑄 =10.
𝑆𝑖𝑚𝑝𝑎𝑛𝑔𝑎𝑛 𝑏𝑎𝑘𝑢 𝑦 𝑆𝑦
𝑟𝑎𝑡𝑎 −𝑟𝑎𝑡𝑎 (𝑥)
𝑠𝑙𝑜𝑝𝑒
-
37
4.5.5.6. Perhitungan Kadar Sampel
Kadar sampel dapat diketahui dengan memasukkan
nilai luas area ke dalam rumus persamaan linier
y=bx+a. Rumus perhitungan kadar sampel yaitu:
𝑘𝑎𝑑𝑎𝑟 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙 % =𝑘𝑜𝑛𝑠𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑠𝑖 𝑡𝑒𝑟𝑢𝑘𝑢𝑟 µg/ml 𝑥 𝑓𝑎𝑘𝑡𝑜𝑟 𝑝𝑒𝑛𝑔𝑒𝑛𝑐𝑒𝑟𝑎𝑛
(𝑚𝑙)
𝑏𝑒𝑟𝑎𝑡 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙 𝑔 𝑥 1000000𝑥100%
-
38
BAB 5
HASIL DAN ANALISA DATA
5.1. Kondisi Operasional UHPLC-MS/MS
Validasi metode analisa dilakukan dengan kondisi fase gerak
yang
digunakan yaitu fase gerak A dan fase gerak B. Fase gerak A
terdiri dari
0,1% asam format dalam aquabidest dan Fase gerak B teridiri dari
0,1%
asam format dalam Acetonitrile. Gradien kecepatan fase gerak
yang
dipakai adalah 300 µl/menit dengan pengaturan fase gerak
sebagai
berikut :
Tabel 5.1. Gradien Kecepatan Fase Gerak
Waktu
(menit) A% B% µl/menit
0 75 25 300
0,5 75 25 300
3 25 75 300
4 25 75 300
4,5 75 25 300
6 75 25 300
Kromatogram yang digunakan yaitu UHPLC merk ACCELLA tipe
1250 buatan Thermo Scientific yang terdiri dari degasser vakum,
pompa
quartener, autosampler termostatik dikendalikan Personal
Computer
melalui program X-Calibur 2.1. Kolom yang digunakan dengan
spesifikasi
Kinetex EVO C18 100OA (50mm x 2.1mm x 1.7µm). Kolom dikontrol
pada
suhu 30oC dan kompartemen sampel ditetapkan pada suhu 16oC.
-
39
Sebagai pendukung data secara kuantifikasi dan kualifikasi,
digunakan MS/MS Triple Q (quadrupole) spektrometer massa TSQ
QUANTUM ACCESS MAX dari Thermo Finnigan® dengan sumber
ionisasi ESI (Electrospray Ionization) dikendalikan oleh
software TSQ
Tune yang dioperasikan dengan ionisasi mode positive.
Penentuan
senyawa yang ditarget dengan metode SRM (Selected Reaction
Monitoring) diatur pada Tabel 1.
Tabel 5.2. Optimasi Parameter Massa untuk Curcumin
Komponen Parent mass (m/z) Product mass (m/z)
Qualifier Quantifier
Curcumin 369 177 285
Kondisi ionisasi ESIadalah sebagai berikut:
Teganganspray 3kV
Suhupenguapan275◦C
Suhukapiler, 300◦CN
Nitrogensebagaisheath gas pressure 40 psi
Aux gas pressure10 psi dengan gas argon.
5.2. Validasi Metode Analisa
5.2.1. Selektivitas
Selektivitas dinyatakan dengan waktu retensi dan match
factor
antara baku kurkumin dengan sampel sediaan herbal yang
mengandung kurkumin. Uji selektivitas bertujuan untuk
menganalisis
dan memastikan adanya senyawa target pada sampel
dibandingkan
dengan standar.
-
40
Tabel 5.3. Tabel Hasil Selektivitas Berdasarkan Waktu
Retensi
Jenis Sediaan
Waktu Retensi Rata-rata (menit)
Sediaan serbuk
3,19
Sediaan Kapsul
3,32
Sediaan Cair
3,22
Baku Kurkumin
3,20
Gambar 5.1. Hasil Waktu Retensi antara Standar (a) dan Sampel
Serbuk (b)
Waktu retensi pada tabel diatas menunjukkan bahwa sampel
mengandung kurkumin ditunjukkan dengan waktu retensi yang
sama
yaitu sekitar 3,2-3,3 menit. Dapat diamati pada gambar 5.1
bahwa
(a)
(b)
-
41
waktu retensi antara standar dan sampel serbuk menunjukkan
TR
yang sama yaitu 3,2 dan 3,22 menit. Dari data tabel dan
gambar
tersebut bermakna bahwa sampel mengandung kurkumin
ditunjukkan
dengan waktu retensi yang sama. Sehingga selektivitas
kurkumin
dapat dinyatakan memenuhi syarat berdasarkan kesamaan waktu
retensi.
Tabel 5.4. Tabel Hasil Selektivitas Berdasarkan Detektor
MS/MS
Gambar 5.2. Hasil Detektor MS/MS antara Standar (a) dan Sampel
Serbuk (b)
Jenis Sediaan
Product mass (m/z) Sampel
Product mass (m/z) Baku %
Qualifier Quantifier Qualifier Quantifier
Sediaan serbuk
177 285 177 285 100
Sediaan Kapsul
177 285 177 285 100
Sediaan Cair
177 285 177 285 100
(b) (a)
-
42
Detektor MS akan mendeteksi setiap bagian yang terpecah
menjadi bentuk ion dari senyawa kurkumin. Dari tabel diatas
dapat
diamati bahwa sampel sediaan herbal mengandung kurkumin
ditunjukkan dengan berat molekul pecahan senyawa kurkumin
yang
sama dengan standar yaitu 285 m/z sebagai berat molekul
kuantifier
dan 177 m/z sebagai kualifier, sehingga dapat dinyatakan
selektivitas
memenuhi syarat berdasarkan waktu retensi yang sama dan
pecahan
ion tertarget yang muncul pada detektor.
5.2.2. Linieritas
Linieritas bertujuan untuk mengetahui korelasi antara
perubahan konsentrasi terhadapat luas area yang muncul pada
sistem UHPLC. Linieritas yang baik ditunjukkan dengan nilai
koefisien
korelasi (r2) yaitu lebih dari 0,999 (AOAC, 2002)
Linieritas diperoleh dengan menginjeksi 5 konsentrasi
larutan
baku yang berbeda yaitu 0,16; 0,33; 0,75; 1,5 dan 3
mg/mlkemudian
didapatkan persamaan linear yaitu y=59.563,83x+638,72 dengan
nilai
koefisien korelasi yaitu 0,9997, yang bermakna perubahan luas
area
yang muncul berbanding lurus terhadap perubahan konsentrasi
larutan baku. Nilai Vxo atau relatif standar deviasi yaitu
2,93%dinyatakan memenuhi persyaratan yaitu dibawah 5%
(Yuwono
& Indrayanto, 2005). Sehingga dapat dinyatakan uji
linieritas
memenuhi persyaratan.
𝑆𝑥𝑜 = 𝑆𝑦
𝑏 𝑉𝑥𝑜 =
𝑆𝑥𝑜
𝑥 𝑥 100%
-
43
𝑆𝑥𝑜 = 2.005,25
59.563,83= 0,03 𝑉𝑥𝑜 =
0,03
1,15𝑥100% = 2,93%
Gambar 5.3. Grafik Linieritas Larutan Standar Kurkumin dengan
Konsentrasi
0,16; 0,33; 0,75; 1,5 dan 3 mg/ml
5.2.3. Akurasi dan Presisi
Akurasi dapat didefinisikan sebagai kedekatan nilai antara
nilai
hasil uji terhadap nilai yang sebenarnya. Akurasi dinyatakan
dengandinyatakan dengan persen perolehan kembali analit.
Terdapat
3 konsetrasi larutan yang diinjeksi yaitu 0,75; 1,5 dan 3 mg/ml
dengan
3 kali replikasi di setiap konsentrasinya. Merujuk pada tabel
5.7, hasil
perolehan kembali yang didapatkan dari uji parameter akurasi
metode
analisis kurkumin yaitu 98,63% pada konsentrasi 0,75 mg/ml,
101,06% pada konsentrasi 1,5 mg/ml dan 101,76% pada
konsentrasi
3 mg/ml. Rentang hasil %perolehan kembali yang didapatkan
yaitu
98,63%-101,76%. Dari tabel 5.5 dapat diamati bahwa akurasi
dari
setiap % perolehan kembali konsentrasi memenuhi persyaratan
merujuk pada tabel 5.5 yaitu di dalam rentang 75-120%.
y = 59.563,83x + 638,72R² = 0,9997
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
140000
160000
180000
200000
- 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 3,00 3,50
Lu
as A
rea
Konsentrasi (mg/ml)
Linieritas
-
44
Tabel 5.5. Kriteria Batas Perolehan Kembali yang Dapat
Diterima
(AOAC, 2002)
Konsentrasi Batas Perolehan Kembali
100% 98-101%
10% 95-102%
1% 92-105%
0,1% 90-108%
0,01% 85-110%
10 µg/g (ppm) 80-115%
1 µg/g 75-120%
10 µg/kg (ppb) 70-125%
Presisi merupakan kedekatan antar nilai dalam pengukuran
secara berulang. Presisi dinyatakan dengan simpangan baku
(SD)
atau simpangan baku relatif (RSD). Pesisi yang baik dari
suatu
analisis ditandai dengan nilai %RSD dibawah persyaratan
sesuai
dengan kondisi analisis. Hasil %RSD yang diperoleh dari uji
presisi
metode analisis kurkumin yaitu 0,38-5,7%. Dari tabel 5.6
dapat
diamati bahwa %RSD dari setiap konsentrasi larutan baku
memenuhi
persyaratan merujuk pada tabel 5.6 yaitu kurang dari 8%.
Tabel 5.6. Kriteria Batas %RSD yang Dapat Diterima (AOAC,
2002)
Konsentrasi Batas %RSD
100% 1%
10% 1,5%
1% 2%
0,1% 3%
0,01% 4%
10 µg/g (ppm) 6%
1 µg/g 8%
10 µg/kg (ppb) 15%
-
45
Tabel 5.7. Tabel Hasil Akurasi dan Presisi
No Kons.
(mg/mL) Area
KONS. THT
(mg/mL)
%Perolehan kembali
Rata-rata%perolehan
kembali
Deviasi Standart
%Deviasi Standart Relatif
1
0,16 10.483,93 0,165 101,40
99,04 2,15 2,17 0,16 10.203,98 0,161 98,52
0,16 10.076,62 0,158 97,21
2
0,33 23.014,25 0,376 115,59
114,11 2,52 2,21 0,33 22.165,10 0,361 111,20
0,33 23.003,60 0,375 115,53
3
0,75 44.588,03 0,738 98,38
98,63 0,38 0,38 0,75 44.618,92 0,738 98,45
0,75 44.893,26 0,743 99,06
4
1,50 96.862,08 1,615 107,70
101,06 5,76 5,70 1,50 88.294,71 1,472 98,11
1,50 87.627,88 1,460 97,36
5
3,00 183.015,70 3,062 102,06
101,76 1,01 0,99 3,00 180474,04 3,019 100,64
3,00 183.954,39 3,078 102,59
5.2.4. LOD dan LOQ
LOD bertujuan untuk mengetahui jumlah terkecil analit pada
suatu sampel yang memberikan respon yang signifikan
dibandingkan dengan blanko sedangkan LOQ bertujuan untuk
mengetahui nilai analit dalam sampel minimal yang terhitung
oleh
sistem kromatogram. LOD dan LOQ didapatkan dengan
menggunakan persamaan:
SD = (𝑦 − 𝑦𝑖)2
𝑁 − 2
SD = 12.063.112,71
3
-
46
SD = 2005,25
𝐿𝑂𝐷 =3. 𝑆𝐷
𝑠𝑙𝑜𝑝𝑒𝐿𝑂𝑄 =
10.𝑆𝐷
𝑠𝑙𝑜𝑝𝑒
𝐿𝑂𝐷 =3.2005,25
59.563,83𝐿𝑂𝑄 =
10.2005,25
59,563,83
𝐿𝑂𝐷 = 0,11 µ𝑔/𝑚𝑙𝐿𝑂𝑄 = 0,34 µ𝑔/𝑚𝑙
Sehingga didapatkan nilai LOD 0,11µg/ml dan LOQ yaitu 0,34
µg/ml.
5.3. Penetapan Kadar Kurkumin pada Sediaan Herbal
Penetapan kadar kurkumin dilakukan untuk mengetahui kadar
kurkumin pada sediaan herbal mengandung kunyit. Sampel
serbuk
ditimbang sebanyak 0,1203 gram, sampel kapsul ditimbang
sebanyak
0,1095 gram dan sampel cair ditimbang sebanyak 1,088 gram,
ketiga
sampel masing-masing dilarutkan dalam 10 ml metanol.
Dilakukan
sonikasi selama 10 menit dan kemudian dilakukan sentrifuse
dengan
kecepatan 5000 rpm selama 10 menit. Analisis dilakukan
menggunakan
UHPLC-MS/MS sehingga diperoleh kadar kurkumin dari setiap
sampel
yaitu 0,03% kurkumin terkandung pada sampel serbuk, 4,78%
kurkumin
terkandung dalam sediaan kapsul dan 0,03% sediaan cair.
Tabel 5.8. Tabel Hasil Penetapan Kadar Kurkumin dalam Sampel
No Jenis Sediaan Persamaan
Linear Kadar
Kurkumin(µg/g)
Rata-rata Kadar
Kurkumin (%)
1 Sediaan Serbuk 25 mg
(mengandung 5 gram ekstrak kunyit)
y=58.350,2x-1.080,65
299,71 0,03
2 Sediaan Kapsul 500 mg
(mengandung 500 mg ekstrak y=59563,83x+638,72
47.835,10
4,78
-
47
kunyit)
3 Sediaan Cair150 ml
(mengandung 30 gram rimpang kunyit)
y=58.350,2x-1.080,65
295,58 0,03
-
48
BAB 6
PEMBAHASAN
6.1 Pembahasan
Konsumsi sediaan herbal oleh masyarakat semakin meningkat,
terutama sediaan herbal mengandung kunyit. Sediaan herbal itu
sendiri
terbagi menjadi 3 kategori yaitu jamu, OHT dan fitofarmaka.
Kunyit memiliki
banyak efikasi yang diperlihatkan oleh beberapa ramuan
tradisional kunyit di
beberapa daerah di Indonesia. Pada Etnis Jawa di Yogyakarta
terdapat 50
ramuan mengandung kunyit yang digunakan untuk terapi pasca
persalinan.
Pada Etnis Jawa daerah Jawa Tengah terdapat 29 ramuan
mengandung
kunyit untuk mengatasi penyakit jaundiceatau gangguan pada organ
hati.
Pada Etnis Simalungun daerah Sumatera terdapat satu ramuan
untuk
pengobatan HIV/AIDS, dan 26 ramuan untuk pengobatan kanker pada
Etnis
Suku Hutan Provinsi Riau (Kemenkes RI, 2015). Kunyit memiliki
efek
farmakologis yang paling populer yaitu sebagai anti-inflamasi.
Efek
farmakologi lain dari kunyit yaitu sebagai agen hipotensi, anti
kanker, anti
koagulan dan hepatoprotektor (Simanjutak, 2012).
Tujuan dilakukan penelitian ini yaitu mengetahui validitas
metode
analisis kurkumin dalam kunyit dengan metode UHPLC-MS/MS dan
mengetahui kadar kurkumin dalam sediaan herbal mengandung
kunyit.
Seiring dengan meningkatnya konsumsi produk herbal terutama
jamu
mengandung kunyit, maka monitoring kualitas sediaan tersebut
juga menjadi
sangat penting demi menjaga keamanan produk, kualitas produk dan
efikasi
dari produk yang terdapat di pasaran. Monitoring kualitas sangat
diperlukan
-
49
guna menjamin produk dapat tepat indikasi dan memiliki efikasi
yang
maksimal ketika dikonsumsi oleh pasien (Oka, 2017). Monitoring
kualitas
sediaan tersebut dilakukan dengan validasi metode analisis
kurkumin
dengan parameter uji selektivitas, linieritas, akurasi presisi,
LOD dan LOQ.
Kemudian dilakukan penetapan kadar kurkurmin pada beberapa
sampel
sediaan herbal mengandung kunyit menggunakan UHPLC-MS/MS.
Sampel
diambil dengan metode Purposive Sampling karena terdapat
beberapa
kriteria pemilihan sampel yaitu sediaan herbal mengandung
Curcuma longa,
sediaan herbal yang digunakan dapat dalam bentuk sediaan serbuk,
kapsul
atau tablet dan dapat berupa jamu, OHT dan fitofarmaka, serta
memiliki label
lengkap yang berisi kandungan ekstrak atau rimpang kunyit yang
digunakan
dan indikasi sediaan herbal tersebut. Sampel yang dipilih adalah
jamu
mengandung kunyit dalam sediaan serbuk, jamu mengandung kunyit
dalam
sediaan kapsul dan OHT mengandung kunyit dalam sediaan cair.
Optimasi kondisi UHPLC-MS/MS perlu dilakukan untuk menunjang
efektifitas analisis. Sistem kromatografi yang digunakan yaitu
fase terbalik,
yang memiliki fase diam yang non polar dan fase gerak yang lebih
polar.
Optimasi yang dilakukan pada sistem UHPLC salah satunya yaitu
fase
gerak. Beberapa pertimbangan diberikan pada pemilihan fase
gerak
berdasarkan polaritas fase gerak. Kepolaran analit, fase gerak
dan fase diam
akan mempengaruhi adanya perbedaan kecepatan migrasi
masing-masing
senyawa akibat perbedaan distribusi atau afinitas relatif
senyawa analit
tersebut pada fase diam dan fase gerak. Sifat senyawa yang polar
akan
cenderung terdistribusi pada fase yang polar, sedangkan senyawa
analit
yang non polar akan cenderung terdistribusi pada fase yang
non-
-
50
polar.Pelarut A adalah pelarut air dengan 0,1% asam dan pelarut
B adalah
pelarut organik seperti asetonitril, metanol dan propanol dengan
0,1% asam
(Jiang, 2012).
Fase gerak A terdiri dari 0,1% asam format dalam aquabidest,
fase B
terdiri dari 0,1% asam format dalam Acetonitrile. Terdapat
penambahan
asam format pada kedua tipe larutan yang memiliki fungsi
untuk
memperjelas bentuk puncak pada kromatogram dan untuk menjadi
sumber
proton dalam LC/MS fase terbalik. Asam format akan membuat
larutan
memiliki pH yang rendah. Kondisi pH yang rendah ini akan menjaga
residu
silanol dalam kondisi yang tidak terpisahkan, sehingga akan
menghindarkan
adanya adsorpsi serta tidak terjadinya tailing. Selain itu, asam
format
memiliki tingkat kontaminasi yang paling rendah, sehingga tidak
menggaggu
proses analisis yang memiliki tingkat sensitivitas yang tinggi
(Ayuchecaria,
2016).
Gambar 6.1. Residual Silanol Pada Kolom UHPLC (Crawford,
2016)
Pada larutan B dipilih Asetonitril karena bersifat polar. Gugus
nitrogen
terpolarisasi akibat perbedaan elektronegativitas antara atom
karbon dan
nitrogen, sehingga menghasilkan 3 ikatan dari 2 atom tersebut.
Oleh karena
itu asetonitril memiliki ikatan dipol yang kuat. Asetonitile
juga memiliki jumlah
2 elektron bebas pada atom nitrogen yang dapat mengikat hidrogen
atau
-
51
oksigen sekalipun. Selain kepolaran asetonitril, tingkat
viskositas dari
astonitril lebih baik daripada metanol, sehingga dapat
memproduksi droplet
yang lebih baik pula ada analisis menggunakan MS.Terdapat proses
re-
equilibrasi pada menit akhir yaitu menit 4.5 dan 6.
Re-equilibrasi dilakukan
dengan inisiasi komposisi larutan A (0,1% asam format dalam
aquabidest)
sebelum analisis berikutnya. Fungsinya yaitu untuk
menghasilkan
reprodusibilitas analisis yang tinggi.
Optimasi berikutnya yaitu pada MS/MS. Jenis yang digunakan
adalahTriple Q (quadrupole) Spektrometer Massa TSQ QUANTUM
ACCESS
MAX dari Thermo Finnigan® dengan sumber ionisasi ESI
(Electrospray
Ionization) yang dioperasikan dengan ionisasi mode positif. TSQ
Quantum
secara primer didesain untuk mendapatkan hasil a