Pcr ii

POLYMERASE CHAIN REACTION

SITI MARYAM

DNA : THE MOLECULE OF LIFE

SEL

DNA

DEVELOPMENT OF MOLECULAR BIOLOGY TECHNIQUES

DNA ISOLATION

PURE DNA

IN-VITRO MANIPULATION

MOLECULAR BIOLOGY TECHNIQUES

POLIMERASE CHAIN REACTION (PCR)

• Kary Mullis (1984)• PENGGANDAAN FRAGMEN SPESIFIK DNA

SECARA INVITRO JUTAAN KOPI FRAGMEN DNA SECARA CEPAT DAN AKURAT

• Meniru replikasi in vivo• Teknik amplifikasi DNA spesifik secara in

vitro

Prinsip PCR• PCR: dapat mengamplifikasi urutan DNA spesifik• Reaksi PCR: mengandung DNA target rantai ganda, dua

primer yang dapat berhibridisasi pada urutan pada DNA target yang berlawanan, 4 dNTP, dan DNA polimerase

• Karena, reaksi dipanaskan pada suhu tinggi, PCR tergantung pada DNA polimerase yang stabil terhadap panas

• Beberapa DNA polimerasi yang tahan thd panas: diisolasi dari bakteri termofilik

• Enzim pertama yang digunakan adalah Taq polimerase (dari Thermus aquaticus)

PCR terdiri dari 3 tahap: Denaturasi: campuran reaksi dipanaskan sampai

95oC (15-30 detik) untuk mendenaturasikan DNA target menjadi rantai tunggal

Penempelan primer: campuran didinginkan dengan cepat sampai suhu tertentu yang memungkinkan dua primer mengikat pada rantai tunggal DNA target

Suhu penempelan ini ditentukan dengan hati-hati untuk menjamin primer hanya mengikat pada urutan DNA yang diinginkan. Satu primer mengikat pada masing-masing rantai.

Elongasi: suhu campuran dinaikkan menjadi 72oC dan dipertahankan yang memungkinkan DNA polimerasi mengelongasi primer dengan mengkopi DNA target rantai tunggal

Pada akhir inkubasi, DNA target rantai tunggal menjadi rantai ganda.

Tiga tahap siklus PCR diulangi. Pada siklus kedua, empat rantai DNA mengalami denaturasi, kemudian primer mengikat dan diperluas. Tidak ada reaktan lain yang perlu ditambahkan.

Tiga tahap ini diulangi lebih dari sekali untuk siklus ketiga

Thermocycler otomatis sekarang ini telah digunakan untuk mensklus reaksi tanpa interfensi manual

Setelah 20 siklus, DNA target (asli) telah diamplifikasi berjuta kali lipat dan ini akan meningkat 1000 juta setelah 30 siklus

Semuanya ini memmerlukan waktu kurang dari satu jam.

Aplikasi PCR• PCR dapat mengamplifikasi molekul DNA tunggal dari campuran kompleks, menghindari penggunaan kloning DNA dalam sel untuk mendapatkan molekul DNA murni yang diinginkan.

• Penentuan urutan basa DNA dapat disederhanakan dengan PCR, dan aplikasi ini sekarang sangat umum.

• Dengan menggunakan primer yang sesuai, melalui PCR dapat dibuat mutasi titik, insersi dan/atau delesi DNA target yang dapat membantu analisis ekspresi dan fungsi gen.

• PCR sangat sensitif dan dapat mengamplifikasi DNA dalam jumlah yang sedikit. Dengan menggunakan primer yang sesuai, DNA bakteri atau virus dalam jumlah sedikit dapat dideteksi dalam jaringan. Hal ini menyebabkan PCR tidak terlalu mahal untuk diagnosa medis.

• PCR cukup murah untuk mengkarakterisasi sampel DNA secara medis. Misalnya, dalam penentuan penyakit genetik manusia. Pada penentuan penyakit genetik, PCR didasarkan pada analisis daerah microsatellites dalam DNA. Microsatellites ini merupakan urutan di, tri dan tetranukleotida berulang dalam DNA, yaitu jenis (CA)n atau (CCA)n di mana n adalah bilangan dari 10 sampai 30. Microsatellites dapat digunakan sebagai penanda, seperti pada RFLP.

• Karena sensitivitasnya, PCR sangat penting dalam forensik. PCR mengamplifikasi DNA dari rambut manusia atau tetesan darah yang tertinggal pada tindakan kriminal untuk membuktikan tersangkanya.

Komponen PCR

Templat DNATaq DNA polymerase

dNTP (dATP, dGTP, dTTP, dCTP)Sepasang primerBuffer (MgCl2)

denaturasi

annealing

polimerisasi

Waktu

Temperatur

940C

720C

420C

Tiga tahap utama dalam PCR

Step 1 : Denaturation (separation of double-stranded DNA) by Heat (95° C) Step 2 : Primer Anneals (50 - 65° C)

step 3 Primer Extension by Taq Polymerase (72° C)

End of the 1st PCR Cycle Results in 2 Copies of Target Sequence

Polymerase Chain Reaction (PCR)

View PCR

A. Double strand DNA

B. Denature96º

50º

C. Anneal primers

50º

D. Polymerase binds

72ºTaq

Taq

1

23

4

CYCLE NUMBER AND AMPLICONS

• End-Point Detection Detection of PCR product at the end of the PCR

program Gel Based – electrophoresis (agarose or

polyacrylamide gel electrophoresis)

Real-Time Detection Detection during the PCR program

Detection of PCR Product

Gel Electrophoresis Agarose gel

Pemisahan fragmen DNA berdasarkan ukuran

Makin kecil ukuran migrasi makin cepat

1-2% + ethidium bromide

Visualized using UV transilluminator

Gel Documentation

Gel stained with Ethidium bromide and viewed under UV light.

Gel Photo

Real-Time PCRMonitors the fluorescence emitted

during the reaction as an indicator of amplicon production at each PCR

cycle (in real time)

Real-time Principle

METODE DETEKSI AMPLIFIKASI1. Hydrolysis probes (TaqMan, Beacons, Scorpions) 2. Hybridisation probes (Light Cycler)3. DNA-binding agents (SYBR Green)

Jika DNA terdenaturasi (ssDNA), SYBR Green tidak berfluoerescensi

SYBR Green®

SYBR Green® dye berfluorescensi jika terikat

dengan dsDNA ada amplicon

Makin banyak terjadi amplifikasi makin banyak amplicon makin banyak

SYBR Green terikat dengan dsDNA intensitas

fluorescensi makin tinggi

Real-time DetectionEnd-Point Detection

Keunggulan PCR

Sensitivitas tinggi (amplifikasi)

Tidak perlu proses pembiakan

Spesifisitas tinggi

Cepat (dalam kurang dari 24 jam)

APLIKASI PCR

• DIAGNOSTIK– INFEKSIOUS DISEASE– GENETIC DISEASES– DETEKSI MUTASI

• RECOMBINANT TECHNOLOGY

DNA SEQUENSING PATHOGEN DETECTION

ELISA

The Birth of the Southern Blot, 1975

"Gels used for electrophoresis of nucleic acids and proteins are permeable. This obvious fact didn't dawn on me until I tried to dissolve some agarose by floating it on a solution of sodium perchlorate and noticed a bead of liquid form on the top. I reasoned that if DNA molecules were carried through with the flow it would be possible to capture them on a nitrocellulose membrane, using the setup shown in the sketch. The big thrill came when, at the first attempt, I saw genes lit up as bands after hybridizing with radiolabeled probes. The Journal of Molecular Biology [initially] rejected the first manuscript1 as a 'methods paper' and the sketch is what I sent to people who had heard of the method and wanted to get on and use it.“ -- Ed Southern, Oxford University

DNA is transferred ("blotted") to filter paper       Filter is exposed to a DNA probe       Probe - single-stranded DNA, base-complementary to gene of interest       Binds specifically to target DNA immobilized on filter      Radioactively labeled with  32P /  35S-dNTPs 

exposes X-ray film  Autoradiogram shows presence / absence & size of cloned DNA                     RFLP differences                    [click here for an animation of southern blotting]  DNA probe binds to RNA: "Northern Blot" Is a particular gene (DNA) expressed as mRNA in a particular tissue?             [Antibody probe binds to protein: "Western Blot"]