PCR en temps réel

5/14/2018 PCR en temps r el - slidepdf.com

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PCR en temps

réelJalila RAHOUI



Plan

Définitions & Principes

Technologies de détection

Les agents se liant à l’ADN double brin

Les sondes fluorescentes Hydrolyse de sondes : Taqman assay

Hybridation de 2 sondes : HybProbes

Balises moléculaires : Molecular Beacons

Amorces scorpion : Scorpion primers

Applications

Conclusion

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Plan







Amorces scorpion : Scorpion primers

Applications

Conclusion

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Polymerase C hain Reaction

Réaction en chaîne par polymérase

Méthode de biologie moléculaire d'amplification d'ADN

À partir d’une simple copie d’une séquence d’acides nucléiques,

cette séquence peut être spécifiquement amplifiée

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PCR classique



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PCR classique

Volume réduit de 20 à

50 µl :• ADN Matrice• Amorces• dNTP (les 4)• Taq polymérase

• Tampon



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Étapes d’une PCR classique

1. Dénaturation1er Cycle



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Étapes d’une PCR classique

2. Hybridation

3. Élongation



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2ème Cycle



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10n Cycle



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PCR classique

1 2 3 4 5 6 7 8



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PCR Classique



PCR en temps réel

Même principe que la PCR classique

Différence :

Permet le suivi de la fluorescence émise pendant la réaction avec un

indicateur de la production des amplicons durant chaque cycle :

À l’opposé de la PCR classique où les amplicons ne sont détectés qu’à la

fin du processus.

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Basée sur la détection et la quantification d’un «reporter» fluorescent.

L’augmentation du signal fluorescent est directement proportionnelle àla quantité d’amplicons générés durant la réaction de PCR.

En observant la quantité de fluorescence émise à chaque cycle, il

devient possible de suivre la réaction PCR durant sa phaseexponentielle où la première augmentation significative dans laquantité d’amplicons est en corrélation directe avec la quantité initialede la matrice originale cible.

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PCR en temps réel



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Cycle seuil



PCR en temps r éel VS PCR classique

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PCR classiquePCR en temps réel

++++ Spécificité

++++ Sensibilité

+++Réduit Risques decontaminations

En point finalEn continue Mesure

++++ Rapidité

QualitatifsQuantitatifs Résultats



Plan







Amorces scorpion : Scorpion primersApplications

Conclusion

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Les agents se l iant à l ’ADNdouble brin

Deux classes :

1. Les agents intercalants : Bromure d’éthidium BET

YO-PRO-1

SYBR Green I

2. Les agents se fixant au sillon mineur « minor groovebinders » : le Hoeschst 33258

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Les agents se l iant à l ’ADN double br in

Exemple



• Le SYBR Green I est l’agent le plus fréquemment utilisé.

• Ses avantages :

Économique, facile à utiliser et possède plus de sensibilité que le bromure

d’éthidium sans inhiber la réaction d’amplification.

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Le SYBR Green I présente le désavantage des faux positifs :

1. Il peut se fixer à n’importe quelle molécule d’ADN double brin

2. Mauvais appariement

3. L’émission de fluorescence peut être biaisée par la masse moléculaire del’ADN amplifié par un amplicon plus long qui fixera davantage demolécules fluorescentes par rapport à un amplicon plus court dans la mêmeréaction.

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Plan








Conclusion

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Hydrolyse de sondes : Taqman assay

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• La spécificité d’hybridation entre la sonde fluorescente et sa séquence

d’ADN cible réduit significativement l’émission de fluorescence non

spécifique due à des mauvais appariements ou des dimères d’amorces.

• Les sondes fluorescentes possèdent comme avantage par rapport aux

agents se liant à l’ADN :- Une spécificité accrue ;

- et une capacité de multiplexage.

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Hydrolyse de sondes : Taqman assay



Plan








Conclusion

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Hybridat ion de 2 sondes : HybProbes

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• Cette technologie possède une grande spécificité et permet aussi une

grande flexibilité dans le design des sondes.

• De plus, comme les sondes ne sont pas hydrolysées, elles sont

réutilisées à chacun des cycles.

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Hybridation de 2 sondes :HybProbes



Plan








Conclusion

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Bal ises moléculaires : MolecularBeacons

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Avantages :

Spécificité : permet de détecter les différences de séquences au nucléotideprès.

Technologie efficace pour la détection et le criblage à grande échelle desSNPs (single nucleotide polymorphisms).

Les sondes sont dessinées pour demeurer intactes durant la réactiond’amplification et doivent se réhybrider à la cible à chaque cycle pourmesurer le signal. Constituant ainsi un autre avantage par rapport aux sondes Taqman

hydrolysées à chaque cycle.

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Désavantages :

• Le design des sondes d’hybridation :

Un design optimal du tronc des balises moléculaires est crucial

Avec un design non adéquat, le tronc pourrait adopter une

conformation différente qui éloignerait le fluorochrome émetteur de

l’environnement immédiat du suppresseur résultant ainsi en une

population de sondes mal supprimées et un bruit de fond important.

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Plan








Conclusion

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Amorcesscorpion

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• Ses sondes présentent une grande sensibilité et une grande

spécificité.

• Ce système est préféré lors de PCR comportant des cycles

courts.

• Leur conception est délicate et leur prix élevé.

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Amorces scorpion : Scorpion pr imers



Plan








Conclusion

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Applications

• Détection et la quantification rapide d’agents pathogènes viraux,bactériens et parasitaires.

• Analyse d’expression de gènes, de mutations, de réponse cellulaire àdifférentes substances, de génotypage,

• Essais d’expression et de distribution pour la thérapie génique

• Quantification du nombre de copies dans une collection de cellules etd’évaluation d’ADN résiduel.

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Plan








Conclusion

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Conclusion

• PCR « maison » toujours présentes dans de nombreux laboratoires

mais avec une tendance rapide vers l’apparition de kits commerciaux

et l’automatisation en améliorant la standardisation et la

reproductibilité des résultats.

• Nouvelle génération de termocycleurs et robots permettant

l’application en routine.

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Références

Elyse Poitras et Alain Houde, 2002. La PCR en temps réel: principes etapplications. Reviews in Biology and Biotechnology, Vol.2, No 2, pp.2-11.

Ameziane N., Bogard M., Lamoril J. 2006. Principes de biologiemoléculaire en biologie clinique. Elsevier. ISBN : 2-84299-685-2

Morrison, T. M., Weis, J. J. and Wittwer, C. T. 1998. Quantification of low-copy transcripts by continuous SYBR green I monitoring during

amplification. Biotechniques : 24, 952-962.

http://www.ilm.pf/PCRtempsreel

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