Aspergillus et Poumon: Aspergillus et Poumon: Pathog Pathog é é nie et m nie et m é é thodes thodes diagnostiques diagnostiques Dr Laurence Delhaes Service de Parasitologie-Mycologie Département de Microbiologie - EA3609 CHRU de Lille 5 ème Congrès Francophone Pédiatrique de Pneumologie et d’Allergologie 5- 7 /11/2009 Fusarium ( Fusarium ( wikipedia) wikipedia) C. Albicans C. Albicans (ANOFEL) (ANOFEL) A. fumigatus A. fumigatus (ANOFEL) (ANOFEL) A. flavus A. flavus ( (wikipedia ) ) Zygomycose Zygomycose (ANOFEL) (ANOFEL) Scedosporium Scedosporium
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Pathog nies et m thodes diagnostiques - SP²A °°° La … et Poumon: Pathog énie et m éthodes diagnostiques Dr Laurence Delhaes Service de Parasitologie-Mycologie Département
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Aspergillus et Poumon:Aspergillus et Poumon:PathogPathog éénie et mnie et m ééthodes thodes
diagnostiquesdiagnostiques
Dr Laurence Delhaes
Service de Parasitologie-Mycologie Département de Microbiologie - EA3609
CHRU de Lille
5ème Congrès Francophone Pédiatrique de Pneumologie et d ’Allergologie 5-7 /11/2009
Fusarium (Fusarium (wikipedia)wikipedia)
C. AlbicansC. Albicans (ANOFEL)(ANOFEL)
A. fumigatusA. fumigatus (ANOFEL)(ANOFEL)
A. flavusA. flavus ((wikipedia))
ZygomycoseZygomycose (ANOFEL)(ANOFEL)
ScedosporiumScedosporium
Aspergillus et Poumon: PathogAspergillus et Poumon: Pathog éénienie
- Micromycètes = pathogènes opportunistes très répandus dans l’environnement
-Aspergillus +++ ((998%: Garcia8%: Garcia--VidalVidal, 2008, 2008))>300 espèces pathogènesA. fumigatus (80%),A. flavus (15%), A. terreus, A. nidulans, A.niger (<5%)
- Scedosporium S. apiospermum,S. aurantiacum, S. prolificans
-- Mode de contaminationMode de contaminationInhalation de spores+++ (2-4µ)
� Dans le sérum : 0.5 ng/ml2-3 fois/semaine (Oncohématologie)1 fois/semaine (greffe)
� Seuil sérique Non défini60-80 pg/ml
�� 1 GM+ dans s1 GM+ dans séérum ou LBArum ou LBA , LCR, LCR �������� 1 BG + dans le s1 BG + dans le séérumrum
= Crit= Crit èère mycologique dre mycologique d ’’AI AI (De Pauw 2008; Walsh 2008)(De Pauw 2008; Walsh 2008)
� AI (Aspergillus) � MI panfongique (Candida, P. jirovecii,Fusarium SAUF Cryptococcus et zygomycètes,Odabasi 2004, Persat 2008, Odabasi 2004, Persat 2008, Wheat L 2009 ) Wheat L 2009 )
� Sensibilité de 78-93% ; Spécificité77-92% au seuil de 80 pg/ml Pas/Peu réactions croisées avec ATB (Pickering 2005; Persat 2008; Arendrup 2009)(Pickering 2005; Persat 2008; Arendrup 2009)
Prise en Charge ThPrise en Charge Th éérapeutiquerapeutique
SensibilitSensibilit éé in vitro aux antifongiques: in vitro aux antifongiques: Antifongigramme Antifongigramme (CMI, CME (CMI, CME µµg/ml g/ml -- mmééthode des Ethode des E --TEST)TEST)
Valeurs seuils des CMI admises (ITC, VRC, POS, CAS, AMB)
Emergence of Azole Resistance in A. fumigatus and Spread of a Single Resistance Mechanism Snelders E, PLoSMed 2008Snelders E, PLoSMed 2008Harrison E, ICAAC 2009Harrison E, ICAAC 2009
A. fumigatusA. fumigatus (ANOFEL)(ANOFEL)
ITRITR
10% 10% 20082008
Homogénéité des isolats ROrigine environnementale ?Rôle des fongicides, pesticides ?
RRéésistance aux Azolsistance aux Azol éés : Epids : Epid éémiologiemiologie
�Mode d’Action des Azolés:- Inhibition spécifique de 14-α lanostérol déméthylases = Enzyme de la superfamille du CytP450
- C. albicans : gènes Erg 11; A. fumigatus : 2 gènes Cyp51 A&B
AzolAzol éés: Ms: M éécanisme dcanisme d ’’Action, de RAction, de R éésistancesistance
�Mécanismes de Résistance:- Modification des enzymes cibles CYP/ERG11 :
- Mutations ponctuelles des gènes CYP51A-B / ERG11 - Surexpression de l’enzyme cible (C. albicans et S. cerevisiae)
- Capacité de certains isolats à importer du cholestérol
(Mellado et al. 2001; Chamilos & Kontoyiannis. 2005; Howard 2006; Mellado et al. 2007; Rodrigues-Tudela 2008; Garcia-Effron 2008 Alanio et al. ICAAC 2008; Harrison et al. ICAAC 2009; Howard et al. ICAAC 2009; Howard et al. 2009)
Chez A. fumigatus ,Les mutations de Cyp51A constituent à ce jour le seul mécanisme de résistance aux azolés in vitro associé à une résistance in vivo (AI + ABPA).
G54G54
MVFHWMVFHW MEQKKMEQKK WDPHRW WDPHRW
R-ITCR-ITC / POS
PAN-AZOLE R
L98HL98H
G138G138 M220M220 Y431Y431 G448G448
TR X 2
PAN-AZOLE R
R-ITC
G432G432 G434G434
RRéésistance aux Azolsistance aux Azol éés : Donns : Donn éées moles mol ééculairesculaires
Chez Chez A. fumigatusA. fumigatus, Mutations de Cyp51A oui MAIS, Mutations de Cyp51A oui MAIS……
Harrison et al, ICAAC 2009Harrison et al, ICAAC 2009
RRéésistance aux Azolsistance aux Azol éés : Epids : Epid éémiologiemiologie
→→ Risque de rRisque de r éésistance croissistance crois éée e (Harrison, Howard, 2009)(Harrison, Howard, 2009)
→→ Tenir compte des traitements antTenir compte des traitements ant éérieurs rieurs (De Pauw; Walsh 2008)(De Pauw; Walsh 2008)
STP = Mesure de C°du médicamentAjuster la posologie en f°efficacité / toxicité
- Diminuer les échecs thérapeutiques (dose insuffisante ou mauvaise observance)
- Diminuer la fréquence des effets toxiques
RecommandRecommand éé par confpar conf éérences de consensus VRC et POS rences de consensus VRC et POS
�� Voriconazole : Voriconazole : Biodisponibilité <<< 96% adulte (à distance repas) T½ = 6hElimination hépatique (CYP+++)Cinétique linéaire chez l’enfant (4-8 mg/kg 2x/j, iv ou po)
(Kohli 2008; Blyth 2009)(Kohli 2008; Blyth 2009)
�� Dosage sDosage s éérique (HPLC)rique (HPLC)– En résiduel : 1- 5.5 mg/L , à J2-5 post-TTT– Pb d’observance (per os) à faire tous 14 j– Toxicité hépatique et hallucination = dose dépendante
Coût moyen de ttt d’une AI = 32 00032 000 €€(Jansen et al. 2006(Jansen et al. 2006--2005)2005)
ConclusionConclusion
Aspergillus et Poumon, Aspergillus et Poumon, L Delhaes: 06/11/2009L Delhaes: 06/11/2009
Dunkerque, le 22 Juin 2009
�Évaluation et prise en charge du risque fongique chez les patients atteints de mucoviscidose en France PHRC1902 :
Analyse des résultats mycologiques en fonction des données bio-cliniques des patientsEn collaboration avec les Services de Biostatistiques et d’Épidémiologie du CHRU de Lille
File active ≈ 900 patients atteints de mucoviscidose
Bilan systématique Bilan face à une dégradation de la fonction pulmonaire
NEGATIF
≈ 700 patients
Cahier d’observation
Sérum Expectoration
Recherche d’Ac vis à vis d’Af
Techniques sérologiques
complémentairesCHU d’Angers, de
Lille, de Grenoble,
de Rouen &
de Bordeaux
Identification Mycologiqueaprès examen direct et culture
Identification Moléculaire CHU d’Angers,
de Lille, & de
Bordeaux
Séro-immunologie
Critère d’inclusion =
Génotypage CHU d’Angers,
de Lille,
& de Bordeaux
POSITIF
≈ 200 patients
Tous le
s CRCM
Tous le
s Labora
toires d
e M
ycologie
Centra
lisés d
ans
certa
ins labora
toires
de M
ycologie
Labora
toires d
e
Mycologie
& CRCM
Bilan mycologique
Phénotypage : chimiosensibilité
Phénotypage: Étude de la
thermotolérance& l’activité
protéolytiqueCHU de Grenoble
& de Lille
Niche écologiqueCH de Dunkerque,
CHU d’Angers, de Lille,
& de Bordeaux
Circulation du matériel biologique grâce aux mycothèques, sérothèques, & DNAthèques
Mise en place de contrôles de qualité inter-laboratoire pour limiter l’effet centre
••Objectif principal :Objectif principal : DDééterminer les terminer les espespèèces fongiques (filamenteux) ces fongiques (filamenteux) prpréésentes dans lsentes dans l’’expectorationexpectoration
••Objectifs secondaires :Objectifs secondaires : DDééterminer les terminer les facteurs associfacteurs associéés s àà leur prleur préésence sence
Chez A. fumigatus , Relation (3D) : - Types d’azolés (Xiao et al. 2004) (Xiao et al. 2004) - Mécanisme d’action
- Localisation des mutations de Cyp51A
RRéésistance aux Azolsistance aux Azol éés : Donns : Donn éées moles mol ééculairesculaires
(Krishna G 2009; Lipp H 2008; Pascual A (Krishna G 2009; Lipp H 2008; Pascual A 2008; Sansone2008; Sansone--Parsons 2007; Padouin C Parsons 2007; Padouin C
• IDSA 2008:– Voriconazole A1– Ambisome A1– Association Non recommandée (B2)Pas de recommandation spPas de recommandation sp éécifique en Pcifique en P éédiatriediatrie
Ttt de AI chez lTtt de AI chez l ’’enfant VIH+enfant VIH+A2A2B3 B3 (Mogenson 2009)(Mogenson 2009)
Pas de recommandation spPas de recommandation sp éécifique en Pcifique en P éédiatriediatrie
Liaison avec l’ergostérol de la membrane cytoplasmique↑ perméabilité mais affinité au cholesterol des cellules
Inhibition de la synthèse de la C14-α d methylase↓ Ergosterol stérols toxiques
Inhibe la synthèse du β 1,3 D glucane� rupture de la paroi� instabilité osmotique et lyse cellulaire
Captée par la cytosine perméaseTransformée en 5 FU (cytosine désaminase)Altération de l’ARN
Thomson et al. 2009
SensibilitSensibilitéé in vitro in vitro aux ATFaux ATF
JRIH 15 /10/09 ; Schering-PloughEchec des azolEchec des azoléés : Actualits : Actualitéé
SensibilitSensibilitéé de ED/culture, GM etde ED/culture, GM etPCR en temps rPCR en temps rééel dans le LBAel dans le LBA
25%
69% 75%
25%66%
41%
GM : sensibilité la plus élevée = 66%mais spécificité +/- � réactions croisées
IntIntéérêt de la PCR rêt de la PCR en temps ren temps rééelel
Sensibilitécumulée des 3 tests = 75%
Contribution de la PCR en temps rContribution de la PCR en temps rééel auel au diagnostic ddiagnostic d’’API API : : ÉÉtude sur 32 LBA provenant de 25 patients de MDS, tude sur 32 LBA provenant de 25 patients de MDS,
atteints datteints d’’API prouvAPI prouvéée (5) ou probable (20) e (5) ou probable (20)
BETA-GLOBINE :Différence significative pour ED/culture et GM
Influence de la qualitInfluence de la qualitéé du du LBA LBA
sur lsur l’’interprinterpréétation des teststation des tests
Hyphe septé : Moisissures dématiées (noirs) ou hyalines(Asp, Scedo, Fus…)
Hyphe coenocytique(non septé) : Zygomycètes
www.cytology-asc.com/.../images/resp83li.jp
www.tolweb.org/tree/ToLimages/5.gif
Dimorphiques : Mycoses exotiques,
Histoplasma
pathmicro.med.sc.edu/mycology/hist11.jpg
Place du sérodiagnostic Dr L. Delhaes
Mise en Mise en éévidence des Acvidence des Ac
AspergillosesAspergilloses
Ac antiAc anti--aspergillaire : grande valeur diagnostic dans ABPA, aspergillaire : grande valeur diagnostic dans ABPA, AAE, aspergillome, AAE, aspergillome,
endocardite aspergillaire, endocardite aspergillaire, suivi des mucoviscidoses greffsuivi des mucoviscidoses grefféés pulmonaires pulmonaire
ELISA, Immunodiffusion Ouchterlony (+ ELISA, Immunodiffusion Ouchterlony (+ ≥≥ 3 arcs) reste un 3 arcs) reste un argumentargument
CandidosesCandidoses
ELISA, dELISA, d’’interprinterpréétation dtation déélicate licate des Ac antides Ac anti--candida (Ac anticandida (Ac anti--mananne)mananne)
car colonisation +++car colonisation ++++/+/-- couplcoupléée e àà AgAg
HistoplasmosesHistoplasmoses
Ag totaux pour immunodiffusionAg totaux pour immunodiffusionIDR IDR àà ll’’histoplasmine (+papule > 6mm histoplasmine (+papule > 6mm àà 48h) en 48h) en
zone dzone d’’endendéémie : intmie : intéérêt rêt éépidpidéémiologiquemiologique
Electrosynérèse de Stéphanie M. du 29/05/2007Présence de 4 -5 arcs de précipitine spécifiques d’ A . fumigatusActivité chymotrypsique +
Sérumdu patient
Extraits totaux d’ Agd’ A. fumigatusd’ A. flavus
ActualitActualit éés sur les IgE sps sur les IgE sp éécifiquescifiques
• Allergènes « recombinants » : nombreuses protéines identifiées et clonées
• Aspergillus fumigatus : r Asp f 1,2,3,4,6
• Profil IgEs rAspf 1 et 3 ⇔⇔⇔⇔ sujet sensibilisé , allergie ou ABPA, non discriminatif
• rAsp f 2,4 et/ou 6 ⇔⇔⇔⇔ plus discriminatif de l’ ABPA ?
• Cinétique au cours ABPA ? Persistance IgE rAspf3 ?ENCORE BEAUCOUP DE QUESTIONS SANS RENCORE BEAUCOUP DE QUESTIONS SANS R ÉÉPONSE ?PONSE ?
C. Thumerelle et L. Delhaes 2008C. Thumerelle et L. Delhaes 2008
ActualitActualit éés sur les IgE sps sur les IgE sp éécifiquescifiques• Aujourd’hui :
IgE anti- rAsp f 2 et 4 ⇔⇔⇔⇔ plus discriminatif de l’ABPAIgE anti- rAsp f 6 (MnSOD)?
Knutsen 2004 : Knutsen 2004 : IgE anti- rAsp f 3 et 4
Casulta 2005 : Casulta 2005 : IgE totale > 1000 UI/ml, IgE anti- rAsp f 4 et 6 ↑: sensibilité de 64%, spécificité de 100%, VPP 100% et VPN 94%taux éleves de rAspf 4 et 6 après 12 mois d’évolution
Kurup, 2006 : Kurup, 2006 : rAspf4 dans diagnostic d’ABPAKraemer 2006: Kraemer 2006: rAspf4 et 6 dans ABPA / rAspf1 et 3 dans sensibilisation
ISHAM Juin 2009 : ISHAM Juin 2009 : 2 travaux (équipes de Grenoble + Brésil) en faveur de l’intérêt des rAspf en particulier 4 et 6
•• Immuno allergiques Immuno allergiques : Réaction immunitaire exagérée au contact d’A. fumigatus(patient généralement atopique) :
aspergillose broncho-pulmonaire allergique (ABPA) (incidences : 5 à 15% si mucoviscidose et 2% si asthme), asthme aspergillaire, sinusite allergique aspergillaire, alvéolite allergique extrinsèque.
•• InvasivesInvasives : immunodépression intense (neutropénie +++) +/- autre pathologie pulmonaire � dissémination d’A. fumigatus vers un ou plusieurs organes :
aspergillose pulmonaire invasive (API) (incidences : 5 à 11% en hématologie, 2 à 6% si transplantation, 5% si VIH ; BPCO associée dans 2% des décès d’API), aspergillose trachéobronchique nécrosante, aspergillose pulmonaire chronique nécrosante (APCN).
Les aspergillosesLes aspergilloses
� Mortalité 70 à 90% (Balloy , 2009)
Examen direct et cultureExamen direct et culture(expectoration, aspiration
Diagnostic mycologique des aspergillosesDiagnostic mycologique des aspergilloses
PCR (ADN)PCR (ADN)
PCR aspergillaire dans le sang/serum(Cuenca(Cuenca--Estrella; TMM3 octobre 2009)Estrella; TMM3 octobre 2009)
→ Pas de kit commercialisé
→ Nécessité de standardiser→ Pour un screening: Sensibilité élevé + VPN excellente→ Pour le diagnostic: Sensibilité élevé + VPP excellente → En combinaison avec les autres tests (GM, BG)→ Pour un diagnostic précoce (ttt)
Continuer à travailler !
TDM posaconazole car:• PK linéaire mais pb absorption
• Pas de Métabolisme hépatique maisgrande variabilité individuelle
FIG. 2. Effects of C3435T polymorphism on the pharmacokinetics of posaconazole. SansoneSansone--Parsons et al. AAC 2007; Parsons et al. AAC 2007; Walsh et al. CID 2007Walsh et al. CID 2007
Polymorphisme gPolymorphisme g éénnéétique ? tique ? GGéénotypage du mdr1 ? notypage du mdr1 ? Relation non dRelation non d éémontrmontr éée e àà ce jource jour