66 PARTIE III : RESULTATS A/ ETUDE DES REPONSES ANTICORPS LIEES AUX CANDIDATS VACCINS (TESTS ELISA) 1) Prévalence des candidats vaccins : MSP1p19, MSP4p20, MSP5 et R23 L’objectif de cette thèse est d’étudier la fonctionnalité dans la réponse immunitaire des Ac associées aux différents candidats vaccins. Cependant, au préalable, il est essentiel d’analyser la prévalence et les caractéristiques de leurs réponses Ac associées. Ces analyses sont réalisées pour les sérums de tous les villageois prélevés lors de la série en double transversale. La répartition des Ac ayant pour cibles les candidats vaccins étudiés doit être analysée en fonction des paramètres qui seront étudiés dans les tests de fonctionnalité. Il s’agit de l’influence de la zone d’endémie, l’âge, la parasitémie circulante, l’hémoglobine mais également la relation avec la protection clinique observée sur le terrain. Tous les résultats présentés ici sont donc des compléments d’analyses sérologiques approfondies. 1.1) Prévalence pour toute la population d’étude La première des observations à faire concerne la validation des densités optiques (DO) observées et donc des tests ELISA réalisés. Il est usuellement reconnu que pour tester les réponses Ac contre les candidats vaccins en zone d’endémie, la dilution 1/200 est la plus appropriée (Aribot, 1996) (Perraut, 2005 A). Cette dilution a donc été utilisée et les DO ainsi obtenues sont comprises entre 0 et 1,962 pour MSP1p19, 0 et 2,378 pour MSP4p20, 0 et 1,696 pour MSP5 et 0 et 2,112 pour R23. Ces DO sont donc toutes inclues dans une même gamme de réponse, gamme validant l’utilisation de cette dilution car étant suffisamment large tout en n’atteignant pas le seuil maximal de détection de 3,5. Les 221 sérums issus des habitants de Ndiop et les 186 issus de ceux de Dielmo ont été testés en duplicata à cette
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66
PARTIE III : RESULTATS
A/ ETUDE DES REPONSES ANTICORPS LIEES
AUX CANDIDATS VACCINS (TESTS ELISA)
1) Prévalence des candidats vaccins : MSP1p19, MSP4p20, MSP5 et R23
L’objectif de cette thèse est d’étudier la fonctionnalité dans la réponse immunitaire des Ac
associées aux différents candidats vaccins. Cependant, au préalable, il est essentiel d’analyser
la prévalence et les caractéristiques de leurs réponses Ac associées. Ces analyses sont
réalisées pour les sérums de tous les villageois prélevés lors de la série en double transversale.
La répartition des Ac ayant pour cibles les candidats vaccins étudiés doit être analysée en
fonction des paramètres qui seront étudiés dans les tests de fonctionnalité. Il s’agit de
l’influence de la zone d’endémie, l’âge, la parasitémie circulante, l’hémoglobine mais
également la relation avec la protection clinique observée sur le terrain.
Tous les résultats présentés ici sont donc des compléments d’analyses sérologiques
approfondies.
1.1) Prévalence pour toute la population d’étude
La première des observations à faire concerne la validation des densités optiques (DO)
observées et donc des tests ELISA réalisés. Il est usuellement reconnu que pour tester les
réponses Ac contre les candidats vaccins en zone d’endémie, la dilution 1/200 est la plus
appropriée (Aribot, 1996) (Perraut, 2005 A). Cette dilution a donc été utilisée et les DO ainsi
obtenues sont comprises entre 0 et 1,962 pour MSP1p19, 0 et 2,378 pour MSP4p20, 0 et
1,696 pour MSP5 et 0 et 2,112 pour R23. Ces DO sont donc toutes inclues dans une même
gamme de réponse, gamme validant l’utilisation de cette dilution car étant suffisamment large
tout en n’atteignant pas le seuil maximal de détection de 3,5. Les 221 sérums issus des
habitants de Ndiop et les 186 issus de ceux de Dielmo ont été testés en duplicata à cette
67
dilution pour ces quatre Ag. Ils ont été également testés contre la GST, les DO obtenues étant
à soustraire à celles de la protéine recombinante R23 afin d’analyser uniquement les réponses
inhérentes au fragment R23 de la construction vaccinale.
Les DO n’étant pas des données standardisées et pouvant fluctuer d’une plaque à l’autre et
d’une série de tests à l’autre, elles sont difficilement analysables en tant que telles. Aussi,
nous avons utilisé des unités basées sur des calculs d’unités arbitraires et de ratios de DO. Les
unités arbitraires permettent de travailler par rapport à une référence positive fixée
arbitrairement à 100 - contrôle positif SHI -. Les ratios de DO (rDO) permettent quant à eux
de standardiser les réponses par rapport à des contrôles négatifs. Cette dernière technique de
standardisation des résultats est largement utilisée sur le plan international et reconnue comme
fiable.
Les résultats globaux obtenus - minimum, maximum, médiane, moyenne - pour les DO, unités
et rDO sont présentés dans le tableau V, ainsi que la prévalence observée et l’analyse
statistique des différences entre les deux villages.
Les unités arbitraires utilisées permettent de pouvoir visualiser le niveau de réponse des
sérums et les classer selon ce critère. On peut constater que, pour chaque candidat vaccin
étudié, on trouve des sérums présentant des taux d’Ac plus élevés que le standard positif SHI.
Un maximum de 130,2 unités arbitraires est observé pour MSP1p19, 131,5 pour MSP4p20,
123,9 pour MSP5 et 166,3 pour R23. Ces unités ont été utilisées, entre autre, pour
sélectionner rapidement les sérums à dépléter : valeur supérieure à 80 et si possible à 100.
Cependant, elles présentent également des inconvénients. Le standard positif n’ayant pas
initialement la même valeur pour les différents candidats vaccins, les unités sont relatives et
ne sont pas comparables d’un Ag à l’autre. Ce phénomène est moins visible avec des ratios de
DO. De plus, l’utilisation d’un contrôle « positif » trop bas par rapport à l’Ag étudié - le SHI a
un taux relativement faible en Ac contre R23 et MSP5 - peut entraîner des résultats d’analyses
statistiques contradictoires avec ceux calculés en rDO. C’est le cas par exemple pour MSP5.
Les moyennes observées dans les 2 villages sont de 24,8 et 32,2 unités et les valeurs obtenues
en unités pour les 2 villages sont statistiquement différentes par le test de Mann Withney -
P <0,0001 -. A l’inverse, les rDO calculés ont une moyenne très proche - 4,31 et 4,30 -, avec
toutefois une médiane différente - 2,71 et 3,31 -. La différence de réponses entre les 2 villages
déterminer l’effet conjugué des deux. Une perte de la réponse en ADPm de l’ordre des 2/3 est
alors observable, la moyenne diminuant de 652 à 198 - P = 0,005 -. Cette dernière valeur est
encore une fois inférieure au seuil défini par rapport à la clinique de 250.
Cependant, bien que cette méthode d’étude par déplétion des Ac liés aux candidats vaccins
soit correcte, les procédures avec des déplétions multiples le sont nettement moins, voire
impossibles pour trois déplétions ou plus. En effet, une déplétion excessive en Ac contre des
cibles différentes fait que nous n’observons plus aucune réponse en chimiluminescence.
4.2) Etude en chimiluminescence des mérozoïtes transgéniques D10-PcMEGF
Pour tester l’impact des Ac anti-MSP1p19, les mérozoïtes issus de la souche transgénique
D10-PcMEGF ont également été utilisés. Ces parasites, comme nous l’avons vu
précédemment (cf Partie I § 5.1.1), ont la particularité de ne pas être affectés par les Ac anti-
PfMSP1p19. Leur emploi nous permet donc, en les comparant avec la souche contrôle - D10-
PfM3’ -, de déterminer l’impact de ces Ac sur la chimiluminescence. Nous réalisons donc
ainsi une approche parallèle de l’expérience précédente utilisant les sérums déplétés. Sans
avoir à extraire les Ac du sérum, c’est l’Ag PfMSP1p19 qui est masqué.
22 sérums ayant une réponse en ELISA supérieure à 100 unités arbitraires du point de vue de
la réponse anti-MSP1p19 ont alors été étudiés. Ils ont quasiment tous induit une baisse
significative de leur réponse, comme nous pouvons le visualiser à la figure 48.
Globalement, cette diminution hautement significative de la poussée respiratoire - P < 0,0001
- correspond à une perte de 32% de la réponse. Nous retrouvons donc une réponse similaire à
celle des sérums déplétés. De plus, le contrôle négatif testé est quant à lui resté inchangé, bien
que n’étant pas noyé dans le bruit de fond.
121
Figure 48 : Comparaison des valeurs d’ADPm obtenues avec des sérums possédant un taux
important d’anticorps anti-MSP1p19 pour deux souches transgéniques de mérozoïtes,
exprimant (D10-PfM3’) ou non (D10-PcMEGF) l’antigène PfMSP1p19.
4.3) Effet de la surcharge des sérums en Ac anti-MSP4p20
Les IgG anti-MSP4p20 purifiées ne fournissant pas de réponse directe en chimiluminescence
mais étant impliquées significativement dans ce phénomène, nous avons testé l’effet de leur
addition dans divers types de sérums calibrés. Nous avons sélectionné des sérums d’individus
avec différents profils: i) ADPm nulle et pas d’Ac anti-MSP4p20, ii) ADPm moyenne mais
toujours sans Ac anti-MSP4p20, iii) ADPm nulle avec cette fois des Ac anti-MSP4p20 et iv)
ADPm bonne avec peu d’Ac anti-MSP4p20 - 2 individus différents pour chaque cas -.
Nous avons préalablement vérifié avec des sérums forts répondeurs que la quantité de sérum
pouvait être diminuée à 5 µL sans modification notable de la valeur d’ADPm.
Nous avons donc ensuite pu tester les sérums sélectionnés dans les conditions : i) contrôle : 5
µL de sérum + 5 µL de PBS 1x, ii) « vaccination » : 5 µL de sérum + 5 µL d’Ac spécifiques
anti-MSP4p20 issus d’habitants de Dielmo. Point important, ces Ac ont toujours été conservés
à +4°C afin de ne pas risquer une dénaturation possible des IgG en cas de décongélation au vu
de leur relativement faible concentration.
Cependant, cette supplémentation en Ac n’a eu aucun impact sur le taux d’ADPm dans les
différentes configurations.
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
AD
Pm
1
D10-PfM3'
D10-PcMEGF
0
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800
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1400
AD
Pm
1
D10-PfM3'
D10-PcMEGF
122
TOUS 2-14 ans 15-29 ans ≥ 30 ans TOUS 2-6 ans 7-14 ans ≥ 15 ans
MSP1p19 vs ADPmrho=0,68 P <0,0001
rho=0,53 P =0,0003
rho=0,67 P =0,0002
rho=0,62 P =0,0004
rho=0,71 P <0,0001
NSrho=0,57 P =0,002
rho=0,67 P <0,0001
MSP4p20 vs ADPmrho=0,53 P <0,0001
rho=0,39 P =0,007
rho=0,73 P <0,0001
NSrho=0,40 P <0,0001
rho=0,73 P =0,002
NSrho=0,42 P =0,0005
MSP5 vs ADPmrho=0,40 P <0,0001
NS NS NSrho=0,33 P =0,0003
NS NSrho=0,34 P =0,006
R23 vs ADPmrho=0,50 P <0,0001
rho=0,37 P =0,0112
NSrho=0,52 P =0,003
rho=0,30 P =0,0013
NS NS NS
NDIOP DIELMO
4.4) Corrélations entre les réponses obtenues en ELISA et celles en chimiluminescence
Nous avons, en dernière analyse, étudié les corrélations entre les résultats ELISA concernant
les réponses Ac contre les différents candidats vaccins - exprimés en ratio de densité optique -
et les réponses obtenues en chimiluminescence - analysées en ADPm -. En tenant compte des
corrections de Bonferroni pour cette étude, le seuil de signification est abaissé à 0,0125. Les
résultats obtenus, par village et par classe d’âge, sont présentés dans le tableau XIX.
Tableau XIX : corrélations de Spearman entre les réponses anticorps visant les candidats
vaccins et l’ADPm, en prenant compte des corrections de Bonferroni.
Si, dans un premier temps, nous ne tenons pas compte des groupes d’âge et observons la
relation globale, nous notons que tous les candidats vaccins étudiés, qu’ils soient ou non liés
au mérozoïtes, engendrent une réponse Ac reliée à la réponse en ADPm. Ces corrélations sont
toutes hautement significatives - P ≤ 0,0013 -.
Excepté pour les Ac anti-MSP1p19 qui sont reliés plus fortement avec l’ADPm à Dielmo -
71% contre 68% à Ndiop -, les trois autres constructions vaccinales induisent des Ac mieux
reliés à la chimiluminescence à Ndiop qu’à Dielmo, avec respectivement : 53% et 40% pour
les Ac anti-MSP4p20, 40% et 33% pour les anti-MSP5, 50% et 30% pour les anti-R23.
Notons que :
� la réponse anti-MSP1p19 apparaît comme mieux reliée à l’ADPm que la réponse anti-
MSP4p20, résultat allant en sens inverse de celui obtenu à partir de l’étude avec les sérums
déplétés ;
� la réponse anti-R23 apparaît de façon globale comme mieux associée au résultat
d’ADPm que MSP5, qui est pourtant un Ag du mérozoïte. Ce résultat tend à confirmer la non
123
dépendance de la chimiluminescence aux Ac anti-MSP5, résultat trouvé avec l’analyse des
sérums déplétés.
Afin de s’affranchir de l’impact de l’âge sur le statut immun et donc sur l’importance de la
poussée respiratoire, les corrélations sont analysées par groupe d’âge. Nous obtenons alors
des corrélations avec des significations généralement plus faibles, voire même inexistantes.
Les absences de relation liées à MSP4p20 dans les deux villages ou à MSP5 à Ndiop le sont
en prenant compte des corrections de Bonferroni - 0,04 ≤ P ≤ 0,0127. Il pourrait donc suffire
de peu d’individus supplémentaires pour éventuellement observer des relations significatives.
Ces résultats sont donc à interpréter avec prudence. Cependant, concernant la relation non
significative observée pour la classe d’âge 1 à Dielmo avec les Ac anti-MSP1p19 ou celles
liées à MSP5 à Dielmo ou à R23 dans les deux villages, celles-ci sont relativement plus fortes,
donc plus fiables.
124
PARTIE III : RESULTATS
C/ ANALYSE DE L’INHIBITION DE
CULTURE DEPENDANTE DES ANTICORPS
Nous souhaitions comparer les résultats obtenus pour deux types de fonctionnalités différentes
des Ac : avec coopération ou directe. Il fallait donc étudier un autre test en plus de celui de
chimiluminescence précédemment développé.
Dans le test d’inhibition de culture, qui est devenu une référence internationale en terme
d’étude de fonctionnalité des Ac, ceux-ci jouent un rôle direct bloquant. Nous avons donc
souhaité approfondir l’étude de ce test également.
Des analyses précédentes réalisées au laboratoire avaient défini l’hématocrite et le
pourcentage de sérum à utiliser pour la réalisation de ce type de test en macro méthode
(Diouf, 2002). Des études en cytofluorométrie avaient déjà été initiées dans ces conditions
(Diatta, 2004). Nous les avons donc reprises afin de pouvoir les adapter en micro méthode
automatisable.
1) Lecture par cytométrie en flux
La cytofluorométrie en flux est une technique permettant d’analyser, en moins d’une minute,
plusieurs milliers de GR - généralement entre 50 000 et 100 000 -. Une bonne estimation de la
parasitémie est ainsi obtenue, en un temps très court. De plus, l’Institut Pasteur de Dakar
possède un FACScalibur équipé d’un système HTS, permettant une analyse automatisée en
micro méthode. La cytométrie en flux nous a donc semblé la technique la plus adaptée à la
lecture des tests d’inhibition de culture. Aussi, nous avons repris les études d’inhibition
précédemment réalisées. L’hématocrite et le pourcentage de sérum prédéfinis ont été
conservés tout en étant ramenés au volume adéquat pour une étude en plaque de 96 puits - 2
µL de GRp et 20 µL de sérum suffisent -.
125
A B
1.1) Le choix du marqueur de fluorescence : HE à la place de TO
Les études réalisées en cytofluorométrie au laboratoire l’étaient jusqu’à présent avec détection
par thiazole orange (TO). Or, ce fluorochrome présente l’inconvénient de ne pas distinguer les
formes parasitaires jeunes des GR sains. Seules les formes âgées sont clairement identifiées,
comme le montrent les analyses de la figure 49 (M2 et R2).
Figure 49 : Détection par thiazole orange avec analyse en histogramme (A) et dot plot (B).
M1 et R1 correspondent à des érythrocytes parasités par des formes trophozoïtes,
M2 et R2 par des formes schizontes.
Cette figure représente deux des différents types d’analyse possibles : l’analyse par
histogramme (49A) et celle par dot plot (49B). Ce sont les deux types d’analyse les plus
fréquemment utilisés.
Le dot plot permet de distinguer les GR en quantité moindre, moins aisément détectables avec
un histogramme. De plus la qualité du réglage - voltages utilisés et compensations réalisées -
est plus aisée à vérifier par dot plot que par histogramme, car nous avons des « taches » de
réponses et non pas des pics plus ou moins larges.
Dans un premier temps, pour résoudre le problème de détection partielle, nous avons souhaité
tester un autre fluorochrome. L’utilisation de l’hydroéthidine (HE) en lieu et place du TO a
alors été étudiée. Ce marqueur est décrit comme permettant la détection de toutes les formes
parasitaires, quel que soit leur âge (Jouin, 2004). De plus, c’est un marqueur de viabilité :
seuls les parasites toujours vivants sont détectés. La figure 50 représente exactement la même
population parasitaire que la figure 49, mais avec une détection par HE. Nous notons alors
que, même sous la forme histogramme, les formes trophozoïtes peuvent clairement être
observées. La résolution est donc augmentée et la parasitémie a été trouvée grandement
126
B A
diminuée, de 10% à 7% environ, ce qui s’explique en grande partie par la meilleure séparation
d’avec les GR non parasités.
Figure 50 : Détection par hydroéthidine. M1 et R1 correspondent à des érythrocytes parasités
par des formes trophozoïtes, M2 et R2 par des formes schizontes.
Souhaitant également tester l’impact de l’HE sur les formes parasitaires jeunes, nous avons
marqué une autre culture composée au moment de l’étude de formes anneaux et trophozoïtes.
Bien que ces deux populations ne soient pas distinguables des formes saines en TO (figure
51A), elles sont bien distinctes en HE (figure 51B).
Figure 51 : Détection d’une culture parasitaire composée d’anneaux et trophozoïtes
par TO (A) ou HE (B).
Enfin, si nous comparons le bruit de fond inhérent à chaque type de marquage, l’usage de
l’HE apparaît encore comme préférable. Le bruit de fond obtenu avec ce dernier marqueur
correspondant aux faux positifs obtenus, c’est-à-dire à un pourcentage de parasitémie pour
une étude de GR sains, est de 0,13% alors qu’avec le TO nous obtenons 0,4%. Le bruit de
fond est donc diminué de plus de moitié en utilisant l’HE. C’est un résultat non négligeable,
d’autant plus qu’il n’est pas déductible des pourcentages obtenus, la règle de base en
cytofluorométrie étant de ne jamais rien soustraire.
B A
127
Il est ainsi plus intéressant d’utiliser l’HE au détriment du TO. L’HE permet d’identifier
clairement les différentes populations parasitaires, de les isoler en fonction de leur âge et donc
d’obtenir une meilleure précision de lecture.
1.2) Des problèmes de reproductibilité
Nous n’avons pas pu continuer l’étude en testant l’inhibition due à nos différents sérums
immuns à cause de nombreux problèmes lors des réglages et lectures automatisées des
plaques par HTS.
1.2.1) Des doubles marquages impossibles
La première incohérence notée a été le décalage des populations saines d’un marqueur à
l’autre. Normalement, les populations saines doivent être positionnées par réglages des
voltages afin d’être comprises dans le carré de fluorescence négative - valeurs inférieures à
101 dans les différents canaux -. Une fois ce réglage défini, il ne doit plus être modifié selon
les marqueurs, et seules des compensations de fluorescence doivent être réalisées. Ainsi, des
marquages multiples peuvent être effectués afin de mieux définir la population étudiée. Ceci
a pu être réalisé sur le FACScalibur de l’Institut Pasteur de Paris. Or, réaliser des doubles
marquages TO/HE s’est révélé impossible sur l’appareil de l’Institut Pasteur de Dakar, les
populations saines étant complètement décalées lorsque le marqueur est modifié. Si les
réglages du négatif sont définis à partir du TO (figure 52A), lors du passage à un marquage à
l’HE, les formes saines se retrouvent en lieu et place des formes parasitées (figure 52B). Si
l’on effectue à l’inverse le réglage du négatif à partir d’un marquage des formes saines à l’HE
(figure 52C), lorsque l’on se trouve en présence d’un marquage par TO, les formes saines
« disparaissent » (figure 52D).
128
Figure 52 : Visualisation de globules rouges sains marqués par TO (A-D) et HE (B-C), en
fonction que les réglages aient été réalisés à partir de la solution contenant TO (A) ou HE (C).
Ces déplacements de populations neutres en fonction des marquages ne devraient pas exister
et nous ont amené à nous poser les premières questions sur le FACScalibur utilisé. Des billes
CaliBRITE et le logiciel FACScomp ont donc été utilisés afin de recalibrer l’appareil si
besoin. Mais bien qu’ayant eu un rapport FACScomp tout a fait normal, le problème a
subsisté. L’alignement des lasers a également été vérifié et celui-ci s’est également révélé
normal. Nous avons donc repris nos études en considérant que tout double marquage se
révélait impossible pour une raison inconnue et avons fixé nos réglages à partir de l’HE pour
une analyse par HE.
1.2.2) Une autofluorescence qui n’en est pas une
Nous avons commencé des tests de reproductibilité de lecture avec l’HE par le système HTS.
La lecture par HTS repose sur des réglages préalables de l’appareil. Ceux-ci sont
obligatoirement réalisés en tube et sauvegardés avant d’être paramétrés dans le programme
Plate Manager qui gère la lecture par HTS. Par la suite, la lecture se fait donc de façon
entièrement automatisée et aucune ingérence de l’expérimentateur n’est tolérée par l’appareil.
Nous avons alors constaté un deuxième problème ressemblant à un phénomène
d’ « autofluorescence », à savoir une fluorescence non compensable n’ayant pas de raison
d’être. Celui-ci est visible à l’intersection des canaux FL1-FL2 et FL2-FL3. Une véritable
autofluorescence devant être visible sur tous les canaux, nous avons testé le canal FL4 dans
lequel nous n’avons observé aucune fluorescence. Cette hypothèse s’est par conséquent
révélée infondée.
Ce phénomène aurait pu être dû à une « fuite » du marqueur sur plusieurs canaux, phénomène
observable avec certains fluorochromes comme l’iodure de propidium qui fluoresce en FL2 et
A B
C D
129
FL3. Cette supposition était confortée par le fait que les compensations sont inutiles. Mais
dans ce cas comment expliquer qu’elle n’apparaisse pas systématiquement et ne soit pas
visible lors des tests en tubes réalisés sur l’appareil de l’Institut Pasteur de Paris ?
Pour un même sérum testé dans différents puits, ce phénomène est plus ou moins marqué
comme le montre la figure 53.
Figure 53 : « Fuite » de fluorescence plus ou moins importante sur la diagonale visualisée
pour une expérience en triplicata (sérum de personne immunisée)
Dans le cas représenté ici, nous notons clairement trois profils différents alors qu’il s’agit d’un
triplicata, et cela à cause de cette « fuite » le long de la diagonale. Si nous considérons comme
pourcentage de parasitémie tout ce qui fluoresce (R1), nous avons alors des pourcentages très
variés - 0,09%, 0,30% et 0,17% dans le cas présent -. Néanmoins, en faisant abstraction des
populations sur la diagonale (R2), nous obtenons une meilleure reproductibilité - 0,03%,
0,04% et 0,09 % -. Cependant l’apparition aléatoire de ce phénomène n’est pas « normale » et
ne devrait pas être observée.
1.2.3) Un écrasement qui ne correspond pourtant pas à une mort cellulaire
Nous avons également rencontré un troisième problème : la survenue d’un écrasement de la
réponse. Celui-ci se produit également de façon aléatoire, et non pas dans les derniers puits
d’étude. Dans l’exemple choisi à la figure 54, il a été observé au puits D09 alors qu’en E09
nous avons retrouvé un profil des cellules neutres relativement correct. Il ne s’agit donc pas
130
d’un phénomène de mort cellulaire car la composition des puits étant identique, il devrait
s’intensifier au fur et à mesure de l’étude, les puits étant lus ligne par ligne.
Figure 54 : Tassement de la réponse en FL2 (sérum humain passé en triplicata)
Le gros problème de ce phénomène est que les populations neutres « disparaissant »
partiellement du cadre de lecture, les populations parasitées se retrouvent en grande partie en
lieu et place des populations saines. Elles ne sont donc plus comptabilisées comme parasitées.
Ceci entraîne un gros problème du point de vue de la reproductibilité. L’étude étant
entièrement automatisée, ce phénomène n’est absolument pas contrôlable.
1.2.4) Remarques générales sur ces difficultés
Ces différentes difficultés ont été rencontrées essentiellement lors de l’utilisation du passeur
de plaque. Elles sont parfois observables lors de l’analyse en tube mais de façon généralement
atténuée et uniquement en travaillant sur le même appareil. Il semblerait que ces phénomènes
soient dus à des problèmes de pression. Ceux-ci sont bien entendu amplifiés lorsque les
quantités prélevées sont moindres.
Des microfuites et microfissures observables sur le système de pompage du FACScalibur
pourraient être à l’origine de ces problèmes.
L’appareil n’ayant pas été réparé sur ce point durant la période de cette thèse et l’Institut
Pasteur de Paris n’étant pas équipé d’un système HTS, nous n’avons pas pu continuer à
explorer cette voie, pourtant prometteuse.
131
0
,05
,1
,15
,2
,25
,3
Moy
. des
cel
lule
s
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san
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Col
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Plaq F
Maxisorp
Culture
Diag. en bâtonsEclaté par : plaqueBarres d’erreurs : ± 1 Erreur(s) standard(s)Critère d’inclusion : Concentré de GIA plaque.xls ( importé)
0
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c
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blan
c
Plaq F
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Culture
Diag. en bâtonsEclaté par : plaqueBarres d’erreurs : ± 1 Erreur(s) standard(s)Critère d’inclusion : dilué de GIA plaque 060609.xl s (importé).svd
**
*
2% 1% 0,5% 0,25% 2% 1% 0,5% 0,25%Dépôt des GRp concentré Dépôt des GRp dilué
*Plaque culture
Plaque Maxisorp
Plaque ELISA F
0,3
0,2
0,1
0
0,3
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00
,05
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lule
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'1%
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Diag. en bâtonsEclaté par : plaqueBarres d’erreurs : ± 1 Erreur(s) standard(s)Critère d’inclusion : Concentré de GIA plaque.xls ( importé)
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,3
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san
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c
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blan
c
Plaq F
Maxisorp
Culture
Diag. en bâtonsEclaté par : plaqueBarres d’erreurs : ± 1 Erreur(s) standard(s)Critère d’inclusion : dilué de GIA plaque 060609.xl s (importé).svd
**
*
2% 1% 0,5% 0,25% 2% 1% 0,5% 0,25%Dépôt des GRp concentré Dépôt des GRp dilué
*Plaque culture
Plaque Maxisorp
Plaque ELISA F
0,3
0,2
0,1
0
0,3
0,2
0,1
0
0,3
0,2
0,1
0
0,3
0,2
0,1
0
2) Lecture par absorbance : détection de la pLDH
En raison des dysfonctionnements réitérés du cytofluoromètre, nous avons continué l’étude
avec une autre technique pour tenter d’obtenir des résultats plus reproductibles. Nous avons
alors testé les conditions standardisées par le NIH reposant sur une détection de la pLDH
(Zhou, 2005).
2.1) Domaine de définition du test et conditions de réalisation
En étudiant le protocole SOP décrivant cette méthode, nous nous sommes rendus compte
qu’elle avait été standardisée dans des conditions de travail et avec du matériel différent des
nôtres. Les cultures parasitaires sont réalisées dans des conditions gazées avec un milieu
composé de sérum humain, et la lecture du test est réalisée sur plaques Polysorp - plaques
particulières fixant les résidus hydrophobiques -. A l’Institut Pasteur de Dakar, nous utilisons
des plaques Immulon 4HBX, qui sont un équivalent des Polysorp. Cependant, cette étude a
été commencée à l’Institut Pasteur de Paris où nous n’avions que trois types de plaques à
notre disposition : des plaques de culture cellulaire, des plaques ELISA Nunc F - dont nous ne
connaissons pas le caractère hydrophile/hydrophobe - et des plaques Maxisorp qui fixent les
domaines hydrophobes et hydrophiles. Nous avons donc, dans un premier temps, souhaité
mesurer l’impact que pouvait avoir la plaque sur la révélation. Nous avons alors constaté que
selon le type de dépôt des GRp - en condition concentrée ou diluée -, l’utilisation d’une
plaque fixant ou non les résidus hydrophobiques pouvait avoir une influence.
� En condition de dépôt dilué, le type de plaque ne semble jouer qu’un rôle très mineur
� En condition de dépôt concentré, son rôle est beaucoup plus significatif et une plaque
Maxisorp semble souhaitable pour obtenir une plus grande échelle de réponse (cf figure 55).
Figure 55 : Impact du type de plaque et de dépôt sur les résultats du dosage de la pLDH
132
Nous avons donc par la suite préféré utiliser des plaques Maxisorp ou Immulon 4HBX, selon
nos possibilités.
Dans la standardisation des résultats, une limite supérieure de parasitémie de 4% est stipulée
pour la validité du test. Mais aucune limite inférieure n’est mentionnée. Or si l’on étudie les
ratios de parasitémie observés pour les plaques Maxisorp, on se rend compte qu’ils sont
globalement valables pour la dilution de 2% à 1% - 0,6 en dépôt concentré, 0,4 en dépôt dilué
- et entre 1% et 0,5% - 0,5 et 0,4 respectivement -. Cependant, le ratio n’est plus du tout
correct si l’on diminue à moins de 0,5% de parasitémie - entre 0,5% et 0,25%, ratios de 0,08
et 0,7 -.
Cette impossibilité de détecter de manière fiable des parasitémies de moins de 0,5% a été
retrouvée une fois à Dakar avec l’étude sur plaque Immulon 4HBX. L’étude a cette fois pris
en compte des parasitémies de 3%, 1,5%, 0,75% et 0,375%. En utilisant une quantité de GRp
de 1 µL comme définie dans les conditions standardisées et avec un dépôt en solution, nous
avons trouvé des ratios de dilution respectifs de 0,5 , 0,4 et seulement 0,2 pour la dernière
dilution. En revanche, si nous utilisons 2 µL de GRp, comme nous le faisions précédemment
pour le test en cytofluorométrie, nous obtenons un ratio correct pour les trois dilutions - 0,4,
0,5 et 0,4 respectivement -. Augmenter la quantité de GRp pourrait donc éventuellement
permettre une augmentation de la résolution du test.
2.2) Impact du Complément
Ayant développé précédemment un test ne dépendant pas du Complément, nous avons
également étudié l’impact de celui-ci sur ce test d’inhibition. Ce dernier est connu comme
nécessitant des sérums sans Complément.
Les sérums étudiés ont été décomplémentés par chauffage à 56°C et les inhibitions obtenues
avec ou sans la présence du Complément ont été comparées. Nous avons alors observé un rôle
majeur pour ce dernier, tous les sérums testés perdant globalement leur effet inhibiteur en
absence de Complément (cf figure 56).
133
-400
-350
-300
-250
-200
-150
-100
-50
0
50
100
Moy
. des
cel
lule
s
SH
I
SH
I déc
ompl
'346
63
'346
63 d
écom
pl.
'346
60
'346
60 d
écom
pl.
'346
61
'346
61 d
écom
pl.
'346
59
'346
59 d
écom
pl.
Diag. en bâtonsBarres d’erreurs : ± 1 Erreur(s) standard(s)
C D C D C D C D C D
Sérums 1 2 3 4 5
-400
-350
-300
-250
-200
-150
-100
-50
0
50
100
Moy
. des
cel
lule
s
SH
I
SH
I déc
ompl
'346
63
'346
63 d
écom
pl.
'346
60
'346
60 d
écom
pl.
'346
61
'346
61 d
écom
pl.
'346
59
'346
59 d
écom
pl.
Diag. en bâtonsBarres d’erreurs : ± 1 Erreur(s) standard(s)
C D C D C D C D C D
Sérums 1 2 3 4 5
C D C D C D C D C D
Sérums 1 2 3 4 5
Figure 56 : pourcentages d’inhibition de culture parasitaire suivant que
les sérums soient intactes (C) ou décomplémentés (D)
Cependant, nous n’avons pas obtenu de reproductibilité dans les pourcentages d’inhibitions
d’une ligne à l’autre des plaques d’étude. Nous avons en effet observé cette diminution de
l’effet inhibiteur de façon systématique mais avec une variation de valeur très importante.
Pour exemple, le sérum 1 a varié de 24% à 109% d’inhibition en présence du Complément, et
de 16% à -46% en absence de ce dernier. Ces résultats sont donc à prendre avec précaution,
n’ayant pas pu observer de reproductibilité suffisante.
2.3) Des conditions standardisées non applicables dans nos conditions de croissance
parasitaire
L’origine du problème que nous avons rencontré avec ce test est due en grande partie aux
conditions de croissance parasitaire différentes entre la standardisation et la réalisation. En
effet, avec 1 µL de GRp à 0,3%, après un cycle et dans les conditions utilisées pour la
standardisation, la parasitémie finale obtenue est de 2-3%. En albumax et candle-jar, la
parasitémie augmente bien plus lentement quand les GR sont en faible quantité. Nous
n’atteignons généralement qu’une parasitémie de l’ordre de 0,5% après un cycle, or nous
avons vu que ce résultat est trop faible pour la détection par pLDH.
De plus, tous les puits d’étude ne sont pas réenvahis au même moment, un décalage a en effet
pu être visible par microscopie selon les sérums. Certains puits contenaient des parasites sous
forme anneaux exclusivement alors que pour d’autres, les parasites étaient toujours en
rosaces. Nous avions donc des puits ayant subi deux invasions alors que les autres n’en
avaient eu qu’une seule et cela pour une même durée de test. Cela rend l’étude très difficile,
134
voir impossible. Cette différence a été visible pour un test lancé 27H après la synchronisation
et un temps de GIA de 40H - analyse de 3D7 -. Il semblerait qu’un temps intermédiaire de
24H soit souhaitable, la durée standardisée de 23H ayant été à l’inverse trouvée trop courte.
La croissance parasitaire étant variable, la présence de formes trophozoïtes âgés est préférable
à une nouvelle réinvasion.
Le problème majeur dont nous n’avons pas pu nous affranchir est l’observation, dans nos
conditions, d’effets de croissance pour les sérums immuns supérieurs aux contrôles négatifs.
Cela s’explique par la richesse des sérums qui l’emporte sur l’action des Ac, la quantité des
parasites étant trop faible. Cela a été vérifié pour deux souches parasitaires : PA FCR3 et 3D7.
La méthode GIA, bien que standardisée, est valable pour des conditions de culture qui ne sont
pas les nôtres et la standardisation réalisée n’est pas utilisable dans notre cas. D’autres mises
au point sont nécessaires.
135
PARTIE IV : DISCUSSION
La problématique de base de ce travail était axée sur la validation d’un test fonctionnel. Celui-
ci devait être un reflet, éventuellement plus révélateur que d’autres, de l’immunité. Il devait
pouvoir servir de référence dans l’analyse des candidats vaccins. Le test de
chimiluminescence a répondu à ces exigences.
Cependant, nous ne pouvions étudier les candidats vaccins dans un test fonctionnel sans les
avoir au préalable analysés selon des méthodes plus « classiques » : réponses immunologiques
associées - tests ELISA - et relations avec différents facteurs épidémiologiques tels que l’âge
ou la protection clinique.
Il est important de souligner que le terme « protection » recouvre en réalité différents critères
d’étude. Les études de relation à la protection analysent généralement de façon prospective le
taux d’Ac vis-à-vis de la survenue d’évènements ultérieurs sur une durée plus ou moins
longue. Ces évènements étudiés peuvent être une protection contre la mort, contre les cas
graves, contre la survenue d’accès cliniques, contre l’apparition d’une parasitémie
circulante,… Aussi, lorsque différentes études de protection clinique sont comparées, il est
important de savoir si elles correspondent à l’analyse des mêmes facteurs sur une même
durée. Dans ce travail, nous avons étudié la survenue d’accès cliniques pendant 5,5 mois
suivant les prélèvements sanguins.
Le même type de question se pose lors de l’analyse des corrélations avec l’âge. Les cohortes
étudiées correspondent-elles à un même éventail d’âge et donc étudie-t-on réellement la
même chose? Nous avons travaillé sur une population dont l’âge est distribué entre 3 et 80
ans, en est-il de même pour les autres analyses de corrélation à l’âge avec lesquels nous
pourrions comparer nos résultats ?
Les divers points de cette étude sont discutés dans la suite de ce document : i) les réponses
immuno-épidémiologiques associés aux candidats vaccins étudiés à savoir MSP1p19,
MSP4p20, MSP5 et R23, ii) les tests fonctionnels et l’importance du test de
chimiluminescence développé, et iii) l’impact des Ac liés à certains candidats vaccins dans le
test de chimiluminescence.
136
1) Les taux d’anticorps contre certains candidats vaccins et leur corrélation avec la
protection
1.1) MSP1p19 : confirmation de son caractère majeur
Concernant la construction vaccinale MSP1p19 exprimée par le Baculovirus dans les cellules
d’insectes (BvMSP1p19), une réponse Ac supérieure à un ratio de DO de 7 est apparue
comme extrêmement importante d’un point de vue clinique. En effet, nous avons observé
dans les deux zones d’endémie étudiées, une protection clinique significativement plus élevée
chez les individus ayant atteint ou dépassé ce taux et ce, quelque soit l’âge. Nous avons
également remarqué que ce seuil de 7 est difficilement atteint chez les jeunes enfants. Le
challenge vaccinal pourrait donc être de permettre, dès le plus jeune âge, l’acquisition d’une
réponse Ac contre MSP1p19 suffisamment forte pour permettre une bonne protection
clinique.
Cette valeur de seuil est remarquablement constante. Elle a déjà été trouvé à plusieurs reprises
dans des études menées de manière totalement indépendantes, sur des séries de prélèvements
différents et par des manipulateurs distincts.
� A Ndiop, pour la saison de transmission de l’année 2000, un rDO inférieur à 7
entraînait un risque relatif de faire un accès clinique de 1,30 - P = 0,047, régression de
Poisson -. L’étude avait été réalisée à partir de sérums prélevés en juillet 2000 sur 205
volontaires de tout âge suivis cliniquement pendant cinq mois. Une moyenne de réponse Ac
de 8,1 rDO avait été obtenue (Perraut, 2005 A), résultat inférieur mais globalement similaire
à celui de notre étude pour le même village (9,3).
� En 1997, une étude de repositivation menée à Ndiop sur 110 volontaires a également
mis en relief ce seuil à 7 - moyenne de rDO de 8 -. Une relation significative a pu être établie
avec la durée comprise entre le traitement curatif par antipaludéen et la réapparition d’une
parasitémie - P < 0,01 -. Cependant, cette relation disparaissait quand l’âge était pris en
compte dans le modèle (Perraut, 2003). Ce phénomène peut être expliqué par un effectif
réduit de villageois analysés, fournissant moins de puissance aux tests statistiques.
L’association d’une réponse Ac anti-MSP1p19 supérieure ou égale à 7 rDO avec la
protection clinique est donc particulièrement pertinente, car ayant été retrouvée sur plusieurs
années et pour deux zones d’endémie différentes.
137
La qualité de cette réponse protectrice a pu être montrée par des tests immunologiques
(Garraud, 2002). BvMSP1p19 conduit in vitro, en présence de PBMC, à la production
essentiellement d’IgG1, accompagnées ou non d’IgG3. Ces deux sous-classes cytophiles sont
connues pour leurs effets protecteurs dans le cas du paludisme (Garraud, 2003). A l’inverse,
les IgG non cytophiles, IgG2 et IgG4, sont neutres ou bloquantes et donc potentiellement
impliquées dans les cas de paludisme aggravé (Soe, 2004). Or celles-ci ne sont jamais
retrouvées contre BvMSP1p19 in vivo dans les plasmas. In vitro, l’étude a montré la
production dans quelques rares cas d’IgG2 mais jamais d’IgG4.
Il est cependant important de bien considérer tous ces résultats dans le contexte de la
construction particulière de BvMSP1p19, à savoir l’expression de la construction vaccinale
par le Baculovirus dans les cellules d’insectes. En effet, l’analyse des résultats immuno-
épidémiologiques obtenus à partir de la construction MSP1p19 exprimée dans E. coli
(EcMSP1p19) donne des résultats différents.
� Lors d’une étude menée au Kenya, avant la saison des pluies 2004, sur 72 volontaires,
aucune relation entre l’âge et le niveau de réponse Ac anti-MSP1p19 n’a pu être établie
(Dorfman, 2005).
� De même, une étude menée sur 112 individus au Vietnam, prélevés en juin 1994 et
suivis cliniquement pendant six mois n’a pas permis d’établir une relation entre la protection
clinique ou le délai avant repositivation et la réponse Ac anti-EcMSP1p19 chez les 47
personnes de l’étude considérées comme non prémunies (Wang, 2001).
Plusieurs facteurs semblent pouvoir expliquer ces différences.
� Le premier porte sur l’effectif des sujets participant à ces études. Dans les deux cas
précédents, les cohortes sont plus réduites en nombre d’individus que celles impliquées dans
les études avec la construction BvMSP1p19. Elles sont donc moins significatives du point de
vue de la validité des conclusions.
� Le deuxième facteur porte sur les différences d’étude de corrélation à l’âge ou à la
protection clinique, dont nous avons commencé à discuter dans l’introduction de cette partie.
* Concernant l’étude menée par Dorfman et al., la relation entre le taux d’Ac et l’âge est
biaisée : sur les 72 volontaires, 57 ont entre 5 et 9 ans. La population étudiée est donc très
spécifique d’une classe d’âge pour laquelle l’immunité est en cours d’acquisition. Elle n’est
donc pas le reflet de toute une population comme a pu l’être notre étude. De plus, ils précisent
que néanmoins, ils ont observé une différence significative pour la reconnaissance de
138
EcMSP1p19 : 54% des adultes testés, contre 23% des enfants de la cohorte, sont positifs
contre EcMSP1p19 - P = 0,036 - (Dorfman, 2005). Si la population d’étude avait une
distribution en âge mieux répartie, une relation entre le taux d’Ac anti-EcMSP1p19 et l’âge
serait donc envisageable.
* De même, pour l’étude menée par Wang et al., les 112 personnes ont un âge compris entre 9
et 55 ans. Il n’y a donc pas de jeunes enfants naïfs. De plus, une sélection est réalisée et
l’étude de protection n’est menée en réalité que sur 47 personnes susceptibles de faire un
accès palustre (Wang, 2001). Ils ne spécifient pas la distribution en âge de cette sous cohorte
mais il s’agit à priori d’une sous population plus jeune. Ils cherchent donc à montrer une
éventuelle corrélation avec la protection clinique chez une population qui a été sélectionnée
pour son absence de prémunition. Il ne s’agit donc pas du même type d’étude que la nôtre qui
prenait en compte toute une population, quelque soit son statut immun.
� Le troisième facteur concerne la construction vaccinale en elle-même. Il a été montré
que les structures secondaire et tertiaire de l’Ag sont essentielles pour le caractère protecteur
vis-à-vis de l’infection. Or, le repliement et la formation des ponts disulfures sont plus
délicats à réaliser avec un vecteur tel qu’E. coli (Planson, 2003), comparativement à un
vecteur de type Baculovirus (Pizarro, 2003). Ces résultats pourraient donc suggérer que la
construction BvMSP1p19 présente une meilleure antigénicité qu’EcMSP1p19, car mieux
conformée par rapport à l’Ag natif.
* Cette dernière suggestion est appuyée par une étude comparative multicentrique menée par
l’OMS - programme EuroMalVac - utilisant des lapins vaccinés avec différentes constructions
MSP1 candidat vaccin pour le terrain. Les sérums de lapins ont été testés en aveugle en GIA,
en ELISA, et avec les parasites transgéniques D10-PcMEGF. Les résultats obtenus à partir
d’une vaccination avec BvMSP1p19 ont été meilleurs que ceux dus à EcMSP1p19. Cela a été
vérifié pour les différentes études réalisées (article en préparation). Le caractère plus
immunogène de BvMSP1p19 semblerait donc être plus qu’une supposition.
1.2) MSP4p20 : des études à approfondir
Concernant MSP4p20, les résultats sont moins tranchés et nécessitent d’autres études
complémentaires.
Nous n’avons pas obtenu dans cette étude de relation entre la réponse Ac anti-MSP4p20 et la
protection clinique, et cela aussi bien en zone de méso- que d’holo-endémie. Cependant, une
139
corrélation entre la réponse anti-MSP4p20 et la protection clinique avait été trouvée lors du
suivi clinique sur cinq mois des 205 individus de tout âge prélevés en juillet 2000 à Ndiop.
Pour cette étude, une médiane de ratio de DO de 17,3 avait été obtenue. Une dichotomie basée
sur cette valeur entraînait un risque relatif de 1,33 pour les personnes ayant une réponse en
ELISA inférieure, et cela indépendamment de l’âge - P = 0,018, régression de Poisson -
(Perraut, 2004). Ce seuil n’a pas pu être testé dans nos études, les rDO maximales obtenues
contre BvMSP4p20 pour juillet 2002 étant de 14,7 et 15, respectivement pour Ndiop et
Dielmo. Comment expliquer de telles variations d’amplitude ? Correspondent-elles à des
titres similaires ou bien sont-elles le reflet d’une véritable différence de réponses entre ces
deux années ? Ce type de résultats permet de souligner l’intérêt de l’étude des candidats
vaccins en ELISA par la méthode du Dr Remarque qui permet de définir un « titre ».
Cependant cette méthode est lourde car elle nécessite de tester au moins 3 dilutions de chaque
sérum et d’inclure une gamme complète de titration du standard positif par plaque. Nous
aurions dû multiplier par 4 à 6 le nombre de plaques ELISA dans nos études.
Une autre étude basée sur le suivi clinique pendant six mois de 112 Vietnamiens prélevés en
juin 1994 et menée sur EcMSP4 ou ScMSP4 (MSP4 exprimé par Saccharomyces cerevisiae)
n’a pas donné de résultat concluant. Aucune relation avec l’âge ou la protection clinique n’a
pu être observée, et cela quelque soit le vecteur d’expression utilisé et pour les 47 personnes
considérées « à risque » (Wang, 2001).
Cependant, bien qu’étudiant dans cette étude et dans notre travail les réponses liées à l’Ag
MSP4 d’un point de vue immuno-épidémiologique, de nombreuses restrictions sont à faire
concernant la comparaison de ces deux travaux.
� Comme nous l’avons vu précédemment (cf §1.1), cette étude n’a été réalisée que sur
une sous population sélectionnée pour son risque de faire un accès palustre. Il ne s’agit donc
pas du même type de relation à l’âge ou à la protection clinique que dans notre étude. De plus
l’échantillon est nettement plus réduit, aussi bien en nombre qu’en différence de statut
immun, limitant la puissance des analyses statistiques.
� Outre le fait que MSP4 soit exprimé dans des vecteurs différents, l’étude implique la
protéine entière et non uniquement son fragment terminal MSP4p20.
� Enfin, comme pour MSP1p19, la protéine comporte des ponts disulfures. Des
structures secondaires et tertiaires similaires à celles de la protéine native semblent
indispensables à une fonctionnalité (Wang, 1999). Les constructions issues de différents
vecteurs peuvent donc également présenter des différences d’antigénicité.
140
Il semble donc important de pouvoir de nouveau analyser les réponses Ac anti-PfMSP4 de
cette transversale 2002, en particulier en y incluant les divers fragments de MSP4, pour
exploiter l’ensemble des données
1.3) MSP5 : un « nouveau » candidat vaccin prometteur
Concernant la construction vaccinale BvMSP5, nous avons trouvé une corrélation entre la
réponse Ac qui lui est liée et la protection clinique pour les deux zones d’endémie testées. Ces
résultats positifs viennent conforter un précédent résultat, obtenu à partir de la cohorte de
Ndiop de juillet 2000 et étudiée de façon similaire. Les études ELISA avaient fait ressortir
une médiane de réponses de 2,4 rDO. Celle-ci, prise comme seuil pour la dichotomie des
réponses Ac, engendrait une relation avec la protection clinique. Le risque relatif de faire un
accès palustre pour les individus ayant une réponse ELISA moindre, et ce quelque soit l’âge, a
été trouvé égal à 1,45 - P = 0,003, régression de Poisson - (Polson, 2005 A). Ce seuil est
similaire à celui trouvé par l’analyse menée à Dielmo pour l’année 2002. Concernant
l’analyse menée à Ndiop en 2002, aucun seuil n’avait été défini, les rDO devant être étudiés
en continu. Trois analyses, portant sur des années et des villages différents, ont donc permis
d’établir pour ce candidat vaccin une relation avec la protection clinique (article en
préparation). Ces résultats soulignent l’intérêt de cette construction pour un développement
vaccinale ultérieur, d’autant qu’elle ne présente pas de variabilité en fonction des souches
parasitaires (Polson, 2005 A) (Polson, 2005 B).
La construction BvMSP5 présente une particularité atypique : elle est doublement myristilée,
par la présence de deux acides gras à 14 carbones sur la construction vaccinale. Cette
particularité a été mise en évidence suite à une analyse par spectrométrie de masse puis
confirmée via l’injection dans les cultures d’acide myristilé marqué au tritium (Longacre et
al., données non publiées).
Une étude complémentaire substantielle devra être menée afin de déterminer le rôle éventuel
des acides gras comme cofacteur d’expression de MSP5, et cela à différents niveaux.
� Validité des mesures des réponses Ac obtenues en ELISA ?
� In vivo, quel est le rôle des groupements myristiles dans la protection clinique ?
� Possibilité de produire le candidat vaccin avec les groupements myristiles ?
141
Ces questions sont importantes dans la mesure où nos connaissances actuelles sur l’Ag natif
ne nous permettent pas de savoir si il est ou non myristilé à un moment ou un autre du
processus d’invasion.
La présence de ces groupements myristiles apporte un doute sur la validité des réponses
ELISA obtenues avec cette construction.
� Les analyses contrôlant l’efficacité des déplétions pourraient laisser supposer
qu’environ 25% de la réponse Ac détectée contre BvMSP5 seraient non spécifiques. En effet,
pourquoi ces déplétions seraient-elles quasi-totales pour BvMSP1p19 et BvMSP4p20 et de
seulement 74% pour BvMSP5 ? Une reconnaissance Ac des groupements myristiles pourrait
être à l’origine du phénomène.
� Inversement, on pourrait émettre l’hypothèse que les groupements myristiles masquent
partiellement MSP5. La conséquence en serait une moins bonne reconnaissance de la
construction vaccinale par les Ac. Cela expliquerait le pourcentage plus faible de répondeurs
obtenu par rapport aux autres MSP testées.
Concernant l’effet éventuel des groupements myristiles dans la protection clinique, nous
pouvons citer une étude menée par Kumaratilake et al. (Kumaratilake, 1997). Elle a montré
qu’in vitro les acides gras influencent l’activité des PNN - qu’en est il in vivo ? -. Suivant le
nombre de carbones (C) constituant les acides gras utilisés, on observe une augmentation (de
20 à 22 C), une diminution (> 28 C) ou un effet neutre (18 C) par rapport à l’activité
antiparasitaire des PNN. Nous n’avons pas trouvé d’étude portant sur l’impact des acides gras
à 14 C. Toutes les hypothèses doivent donc être envisageables.
Les groupements myristiles présents sur MSP5 représentent-ils pour le candidat vaccin une
force, un désavantage, ou bien n’ont-ils aucun impact ?
1.4) R23 : des variabilités importantes
Concernant les études immuno-épidémiologiques de R23, nous avons, comme pour
BvMSP4p20, des résultats différents d’une année à l’autre.
� Dans notre étude, concernant les deux zones d’endémie, nous n’avons trouvé aucune
corrélation entre la réponse Ac anti-R23 et la protection clinique.
142
� Pour l’étude de repositivation de 1997 menée sur 110 habitants de Ndiop, une telle
corrélation ajustée sur l’âge avait pu être déterminée. Le facteur risque trouvé était de 1,25
pour les individus n’étant pas répondeurs en Ac anti-R23 - P = 0,04, régression de Poisson -.
Cependant, lors de cette même étude, il n’y avait pas de relation entre les réponses Ac anti-
R23 et la durée de repositivation, le temps de portage asymptomatique ou le moment
d’apparition du 1er épisode clinique (Perraut, 2003). Aucune relation avec ces trois facteurs
n’ayant été obtenue, comment expliquer le lien avec le nombre d’accès palustres? Quel est le
rôle de ces Ac ?
� Lors d’une étude menée à Ndiop et Dielmo en mars et décembre 1996, aucune relation
entre les Ac anti-R23 et la protection clinique n’a pu être détectée. Néanmoins, des niveaux
d’Ac significativement plus faibles ont été relevés en décembre, soit en fin de saison de
transmission intense (Perraut, 2000). Ce dernier résultat suggère que, lors des accès palustres,
ces Ac ont été consommés et que cette consommation n’a pas été compensée par une
production suffisante.
Afin de mieux comprendre la réponse Ac liée à R23, une étude visant à déterminer la qualité
de la réponse protectrice a été menée (Garraud, 2002). In vitro, la construction vaccinale R23,
en présence de PBMC, induit la formation des quatre sous-classes d’IgG possibles. Les sous-
classes d’IgG les plus fréquemment retrouvées ont été les IgG1 et IgG2. Des IgG2 et IgG4 ont
parfois été décelées comme seuls Ac spécifiques formés, réponses allant habituellement à
l’encontre d’une protection anti-palustre (Schreiber, 2006). Cette non spécificité de réponse
pourrait être à l’origine des différences de protection retrouvées selon les études. Elles
pourraient dépendre de la sous-classe d’IgG majoritairement présente au moment de l’étude.
Mais comment expliquer une telle différence de réponse Ac selon les individus ou les
périodes ? Quel(s) facteur(s) influence (nt) le type d’isotype des Ac se liant à R23 ?
R23 induit une réponse majoritairement IgG1 et IgG2, deux types d’Immunoglobulines
généralement considérées comme très différentes, l’une étant cytophile et l’autre non.
Néanmoins, une étude a montré que dans certains cas de polymorphisme, les IgG2 pouvaient
être considérées par les récepteurs Fc comme des IgG1 cytophiles (Chappel, 1993). Ce
polymorphisme spécifique serait-il plus fréquemment présent pour les IgG2 visant R23 et
cette caractéristique expliquerait-elle alors les résultats trouvés par Garraut et al. ?
Cela n’est pas la seule interrogation que suscite cette construction vaccinale. Des analyses par
microscopie de fluorescence ont montré que l’Ag natif correspondant à R23 n’est pas toujours
143
présenté à la surface du GRp. Ce phénomène de présentation ou non de l’Ag a été étudié par
Mercereau-Puijalon et al.. Ils ont montré que l’Ag est systématiquement surestimé en
condition de stress (O. Mercereau-Puijalon - communication personnelle).
Cette présentation non systématique de l’Ag pourrait intervenir dans l’intensité des réponses
Ac détectées et les différences de corrélation observées entre les réponses Ac et la protection
clinique. Il serait intéressant d’étudier ce phénomène en le rapprochant des résultats issus de
ce travail pour les personnes à profil drépanocytaire hétérozygote AS. Leurs réponses Ac sont
significativement plus élevées en ELISA vis à vis de la construction R23. Cela est-il
simplement dû à la forme des GR de type AS, qui permettrait une meilleure présentation de
l’Ag ? Ou bien à une présentation plus systématique de celui-ci à la surface du GR qui serait
due au « stress » des parasites lié à un manque d’oxygène dans les GR de type AS ou bien à
un métabolisme intracellulaire légèrement différent à l’intérieur de ceux-ci ?
2) Les tests fonctionnels : des références à définir
La plupart des études immuno-épidémiologiques ont été menées à partir de résultats ELISA.
Or, ce test quantifie tous les Ac sans lien avec leur fonctionnalité réelle dans la protection.
C’est la raison pour laquelle des tests fonctionnels de référence doivent également être définis
et normalisés (Miller, 1997).
2.1) Le test d’inhibition de culture : un test de référence difficile à adapter
Parmi les tests fonctionnels existants, un a déjà acquis ce statut de test de référence. Il s’agit
de l’inhibition de culture, réalisé avec une lecture par dosage de la pLDH. Un protocole de
type « Standard Operating Procedure » a été validé par une commission de standardisation des
bio-essais de l’OMS (Zhou, 2005).
Plusieurs articles sont parus à ce sujet au cours de ces deux dernières années. Ils avaient
comme objectif une optimisation des tests d’inhibition de culture et la définition du meilleur
protocole de lecture (Persson, 2006) (Bergmann-Leitner, 2006) (Miura, 2007).
Les deux méthodes qui apparaissent comme les plus fiables sont les lectures par dosage de la
pLDH ou par cytofluorométrie. Persson et al. arrivent à la conclusion que la cytofluorométrie
est la méthode la plus précise, résultat qui nous semble probant dans le cadre de nos essais
144
partiels. En effet, si le fluorochrome est bien choisi et l’appareil en parfait état, toutes les
formes parasitaires peuvent être détectées et quantifiées. Le dosage de la pLDH quant à lui
nécessite des trophozoïtes âgés ou des schizontes. Ceci peut engendrer une moins bonne
précision. Pourtant Bergmann-Leitner et al. ont jugé cette méthode comme la plus
satisfaisante.
Bien que standardisé, ce test nous a posé de nombreuses difficultés. Nos conditions de travail
ne nous ont pas permis d’obtenir les résultats escomptés. Des difficultés dues à des problèmes
d’appareillage ou à des conditions induisant une croissance parasitaire insuffisante nous ont
finalement bloqués.
Les tests d’inhibition de culture avaient pu être réalisés à l’Institut Pasteur de Dakar avec des
cultures en albumax de la souche FUP via une lecture par hypoxanthine tritiée, après de
nombreuses mises au point (Diouf, 2002). Ces mises au point ne sont plus applicables dès
qu’un facteur est modifié, de même que les conditions standardisées réalisées aux Etats-Unis
ne sont pas directement applicables pour un laboratoire du Sud, les conditions étant
différentes. Toute technique doit donc être validée et restandardisée au Sud avant de pouvoir y
être utilisée.
2.2) L’ADCI : un test difficile à reproduire ne pouvant pas encore devenir une référence
L’ADCI est un autre test fonctionnel basé sur la réponse Ac. Il a été très utilisé par l’équipe de
P. Druilhe et très largement décrit (Bouharoun-Tayoun, 1990) (Bouharoun-Tayoun, 1995)
(Druilhe, 1997) (Jafarshad, 2007). Ce test a permis l’identification d’un nouveau candidat
vaccin prometteur, l’Ag MSP3 (Oeuvray, 1994).
Cependant, bien que présentant un réel intérêt, ce test fonctionnel a été très peu utilisé par des
laboratoires extérieurs. Peu d’équipes ont publié sur ce sujet (Shi, 1999) (Tebo, 2001) ou sur
l’utilisation de ce test (Zhou, 2006). L’explication tient dans la difficulté qu’il représente en
terme de variables à maîtriser et de reproductibilité. Un travail fait état de l’impossibilité de
reproduire les résultats précédemment établis, malgré tous les efforts fournis pour y arriver.
Sur 17 sérums de personnes vivant en zone d’hyperendémie, aucune ADCI n’a pu être
détectée (Rzepczyk, 1988).
145
Il est clair que les tests fonctionnels de destruction parasitaire par des cellules et dépendant
des Ac sont complexes car impliquant un système multifactoriel variable avec les cellules
« naturelles » humaines. Dans le cadre de l’ADCI, cette difficulté a été décrite dans le détail et
de manière quantitative récemment (Zhou, 2006). L’ADCI y permet une évaluation de
l’efficacité d’un candidat vaccin, le FALVAC-1A. Pour cela, des IgG de lapins vaccinés ont
été testés avec des monocytes humains. Les résultats sont présentés comme positifs : des
résultats similaires auraient été obtenus avec les sérums de lapins vaccinés et les personnes
immunisées. Cependant, si l’on analyse plus précisément les données rapportées, on note des
problèmes de reproductibilité majeurs. En effet, toutes les expériences réalisées ne sont pas
prises en compte dans les résultats finaux. Plus de 30% des essais n’ont pas été retenus dans
l’analyse, les contrôles positifs donnant des résultats inférieurs à 10% d’inhibition. Si on
examine la figure résumant les données des expériences retenues, on note que pour un même
sérum les pourcentages d’inhibitions oscillent de plus de 50% entre les différentes
expériences - lapin R3123 oscillant de 0 à 53% d’ADCI, contrôle positif humain oscillant de
12% à 68% d’ADCI, pour ne citer que deux exemples -. Le problème de reproductibilité a été
contourné dans l’étude en travaillant non pas directement sur les résultats mais sur les
moyennes des réponses valides obtenues. Cela n’est pas acceptable pour un test standardisé de
référence. C’est donc la raison pour laquelle, à l’heure actuelle, il nous semble difficile de
classer ce test comme un test de référence pour l’évaluation des candidats vaccins.
2.3) La phagocytose des mérozoïtes en chimiluminescence : une variante simplifiée de
l’ADCI ?
L’ADCI est donc difficile à mettre en œuvre de façon réellement reproductible. De plus, son
mécanisme n’est à l’heure actuelle toujours pas élucidé. L’intermédiaire fonctionnel dans la
destruction parasitaire n’a pas été clairement identifié (Druilhe, 1997). Cependant, comme
nous l’avons décrit de façon approfondie dans la discussion de l’article portant sur le
développement du test de chimiluminescence (cf annexe), nous faisons l’hypothèse que les
deux tests reposent sur le même processus. En effet, les expériences réalisées par l’équipe de
P. Druilhe pour invalider le rôle des ROS (Lunel, 1989) (Bouharoun-Tayoun, 1995) ne
semblent pas totalement concluantes. La durée de vie des PNN ne permet pas d’étudier leur
action pendant 24h et leur technique de purification est très agressive et longue - ficoll,
sédimentation, lyse et lavages -. De même, le choix de l’utilisation de la superoxyde
dismutase et de la catalase comme seuls inhibiteurs de ROS est discutable et n’est pas
146
exhaustif pour tester l’hypothèse d’action des ROS car elles n’ont pas d’effet sur le singulet
de l’oxygène. Quant au TNFα, médiateur associé à l’ADCI, il est connu pour être un
activateur de la poussée respiratoire.
A ces arguments développés dans l’article (cf annexe), nous pouvons en ajouter d’autres
portant sur des similitudes observées. Concernant les Ac, il a été montré qu’en ADCI un fort
taux d’IgG1 ne suffit pas. Il est nécessaire qu’il y ait un équilibre entre les taux d’IgG1 et
d’IgG3 comportant un excès d’IgG1 (Shi, 1999). Ce résultat a également été trouvé pour
l’analyse de la chimiluminescence. De plus, cette même étude a montré que le récepteur des
IgG des monocytes important pour ce test est FcγRIIA - comme pour la chimiluminescence -,
et que les mérozoïtes jouent un rôle crucial dans le déclenchement de la coopération
monocyte/Ac. Enfin, il a également été montré que les IgG non cytophiles gênaient le
phénomène d’ADCI et impliquaient une baisse de réponse (Druilhe, 1997) (Bouharoun-
Tayoun, 1995), phénomène également vrai pour la phagocytose immune (Groux, 1990).
Concernant la chimiluminescence, des résultats similaires ont été obtenus lors d’une étude
portant sur les personnes atteintes de neuropaludisme. Lorsque la gravité de la maladie
augmente, le taux d’IgG4 augmente - P < 0,001 -. Or, les personnes décédant des suites de la
maladie ont présenté des réponses en chimiluminescence significativement plus faibles que
les personnes ayant eu une issue favorable - P = 0,003 - (Mbengue, 2007).
Beaucoup de similitudes peuvent donc être notées entre ces deux tests. Reposent-ils en réalité
sur le même phénomène de poussée respiratoire ? Dans ce cas, notre test présenterait des
avantages majeurs sur l’ADCI. Il est reproductible et moins long dans sa réalisation car ne
s’intéressant qu’à l’étape du test impliquant les mérozoïtes. Il est également plus facilement
maîtrisable, le nombre de paramètres et variables étant réduits.
Le test de chimiluminescence nous semble être un test pouvant servir de référence afin de
compléter les tests d’inhibition de culture pour évaluer l’antigénicité des candidats vaccins.
Nous allons maintenant discuter du test en lui-même et des avantages qu’il présente.
147
3) La chimiluminescence, un test fonctionnel reflet de l’immunité naturelle
3.1) Un test ne dépendant pas exclusivement de la quantité d’anticorps
Le test de phagocytose via détection de la poussée respiratoire par chimiluminescence est un
test dépendant des Ac, ou plus exactement de leur capacité fonctionnelle. En effet, ce n’est
pas la seule présence des Ac qui permet de détecter une réponse positive en ADPm. Il
semblerait qu’un certain équilibre IgG1/IgG3 doive être respecté à l’avantage des IgG1. Mais
il ne permet pas à lui seul d’expliquer la totalité de la réponse.
De plus, il est important de noter que le taux d’IgG totales dirigées contre les Ag du mérozoïte
n’est pas lié à la protection clinique si l’on tient compte de l’âge - cohorte Ndiop Non Parasité
-. Ce résultat avait déjà été trouvé avec l’étude sur 5 mois des sérums prélevés en 2000 à
Ndiop - P = 0,97 - (Perraut, 2005 A).
Aussi, le test de chimiluminescence étant quant à lui associé à la protection clinique, il ne peut
pas être expliqué par une action due à la seule quantité d’IgG anti-mérozoïtes. Leur spécificité
et leur cytophilie sont cruciales.
Nous pouvons également souligner que la présence ou non du Complément n’est pas critique.
Ce résultat avait déjà été montré (Kumaratilake, 1992).
3.2) Amélioration de la méthode par utilisation de cytokines ?
Le test de suivi de la poussée respiratoire par chimiluminescence a été étudié dans ce travail
de façon la plus exhaustive possible. Cependant, il manque à cette étude l’analyse de
l’utilisation des cytokines comme facteur d’activation. Leur usage est une perspective qui
permettrait éventuellement d’améliorer la méthode.
L’activation préalable des PNN par des cytokines issues de cellules Th1, comme le TNF,
l’IFN γ, etc., permet d’augmenter la capacité de poussée respiratoire des PNN (Kumaratilake,
1994) et donc d’intensifier le signal de chimiluminescence observé (Kumaratilake, 1992).
Nous pouvons supposer qu’une réponse trop faible des PNN pour être analysable pourrait être
contournée par l’activation préalable. Si cette hypothèse venait à être confirmée, cela
résoudrait une des deux difficultés liées à cette méthode, la deuxième étant l’absence de
lignée cellulaire cultivable in vitro.
148
Cependant, les études de corrélation de l’ADPm avec la protection clinique seraient à
reprendre intégralement. Cette activation a été montrée comme variable selon les individus et
comme faisant perdre de la spécificité dans la réponse dépendante des Ac (Ferrante, 1988)
(Kumaratilake, 1994). Il faudra étudier si cette perte de spécificité est similaire pour chaque
sérum, n’entraînant qu’une hausse du bruit de fond compensée par une augmentation plus
importante de la réponse spécifique. Ou inversement, si cette activation venait à entraîner une
perte complète du caractère spécifique de ce test.
Cette activation, en plus de rendre le test beaucoup plus onéreux, permettrait-elle réellement
d’améliorer la méthode ou au contraire lui ferait-elle perdre toute spécificité ? La corrélation
obtenue de l’ADPm avec la protection clinique serait elle toujours vérifiée? La question reste
largement ouverte.
3.3) Un test fonctionnel associé à la protection clinique
De nombreux rapports et articles font état de l’absence de tests fonctionnels standardisés
permettant d’appuyer les tests précliniques et cliniques. Ceux-ci sont vivement attendus par la
communauté scientifique car ils permettraient de réduire les coûts des essais cliniques et
d’augmenter l’efficacité de leur pouvoir prédictif (OMS, 1997) (Giersing, 2006). Jusqu'à
présent, aucun test n’avait permis d’avoir une corrélation satisfaisante entre ses résultats et la
protection clinique (Snounou, 2007).
La problématique de ce travail était d’atteindre cet objectif : définir un ou plusieurs tests de
référence pour l’évaluation des candidats vaccins. La chimiluminescence est apparue comme
remplissant les critères requis.
Ce test présente plusieurs avantages par rapport au test d’inhibition de culture. En effet, bien
qu’étant un test de référence, les pourcentages d’inhibition de culture observés ne sont pas liés
à l’âge et aucune différence de réponse n’est observée lors des accès cliniques (Perraut, 2005
B), à la différence de la chimiluminescence. De plus, les résultats du test d’inhibition de
culture n’ont jamais pu être associés à la protection clinique (Mahanty, 2003), y compris lors
d’une étude menée dans le village de Ndiop (Perraut, 2005 A). Cependant, ce test fonctionnel
est déjà utilisé pour le suivi d’essai clinique d’AMA-1. (Malkin, 2005). Des études
précliniques menées chez la souris, le lapin et le singe ont montré que le taux d’Ac était lié à
149
l’inhibition de la croissance parasitaire. Partant de ces conclusions, il a été supposé que ce test
permettait de juger l’impact de la vaccination in vivo. Cependant, il peut conduire à des
conclusions qui se révéleraient par la suite infondées. L’utilisation d’un test, dont la réponse
est statistiquement associée à la protection chez l’homme comme l’est la chimiluminescence,
représente un atout supplémentaire pour une meilleure analyse des effets des candidats
vaccins.
En effet, la chimiluminescence est associée à la protection clinique comme le montre cette
étude. Cela a été vérifié pour les deux zones d’endémie testées malgré des conditions
totalement différentes en terme de population immunes et d’effectifs à risque d’épisodes
fébriles. On obtient une même dichotomie à une valeur d’ADPm de 250 pour l’étude du
nombre d’accès palustres, et cela malgré des réponses statistiquement différentes dans les
deux villages. En zone d’holoendémie, sa réponse prise en analyse continue a également été
trouvée comme étant reliée à la protection clinique. Ces résultats fournissent un argument
important pour la validité et l’originalité de ce test.
Cette relation avec la prémunition avait déjà été soupçonnée par l’équipe de P. Druilhe dans
les années 1990. Son équipe étudiait la chimiluminescence obtenue avec des mérozoïtes
purifiés par simple centrifugation. Ils avaient observé que les réponses étaient statistiquement
plus élevées pour les sérums immuns que non immuns. De même, en zone d’endémie, les
adultes répondaient mieux que les enfants. Ils avaient donc suggéré que le test était prédictif
du statut de protection des individus (Lunel, 1990).
Il est important de noter que les relations avec la protection clinique sont généralement
étudiées sur des animaux, dans des conditions expérimentales ne reflétant pas la réalité. Les
différences avec les réponses in vivo sont dues à l’utilisation de souches adaptées, à la
purification d’IgG dénaturant leurs effets, à la complexité des tests entraînant des sources de
variabilité, ou encore à la non considération de la cascade complexe d’évènements
physiologiques qui provoquent la destruction parasitaire chez l’homme. Les résultats ainsi
obtenus n’ont qu’une fiabilité relative pour juger une éventuelle représentativité chez
l’homme (Mahanty, 2003) (Perraut, 2005 B). Or la relation observée dans notre étude repose
sur une analyse statistique basée sur un suivi clinique objectif et précis des populations. La
corrélation obtenue entre l’ADPm et la protection observée in vivo chez l’homme est donc
particulièrement intéressante. Elle est très différente des études positives ou négatives menées
150
chez les modèles animaux - y compris les primates - car potentiellement bien plus
représentative.
4) Application directe de la chimiluminescence pour la sélection de candidats vaccins
Une application directe de la chimiluminescence en vaccinologie a pu être réalisée grâce à
l’étude des mérozoïtes transgéniques ou des sérums déplétés. Ces deux méthodes nous ont
permis de réaliser des études portant spécifiquement sur le déclenchement de la poussée
respiratoire. Nous avons noté un impact important des Ac réagissant avec BvMSP1p19 et
BvMSP4p20 dans ce phénomène. Leur implication dans le test ayant été mise en évidence,
nous savons qu’au moins une de leur fonctionnalité réside dans l’activation de ce phénomène.
Enfin, concernant les Ac anti-MSP1p19, l’étude à partir des mérozoïtes transgéniques D10-
PcMEGF a mis en relief la diversité de leur fonctionnalité. Nous avons vu qu’ils étaient
impliqués dans une coopération avec les effecteurs cellulaires. Environ 30% de la réponse en
ADPm peut leur être attribuée - 32% de diminution obtenue avec D10-PcMEGF, 29% avec
les sérums déplétés -. De plus, ils ont également une action directe. En inhibition de culture,
25% de l’inhibition est perdue lors de l’utilisation des parasites transgéniques (O'Donnell,
2001). Ces résultats issus de tests fonctionnels confirment ainsi l’importance de ce candidat
vaccin. Les Ac qui lui sont associés semblent agir de diverses façons du point de vue du
système immunitaire.
151
CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES
Dans ce travail de thèse, nous avons eu l’occasion d’évaluer in vitro l’efficacité de différents
candidats vaccins via des analyses immuno-épidémiologiques ou via le test fonctionnel de
chimiluminescence. Nous avons également étudié le test fonctionnel d’inhibition de culture,
avec différents modes de lecture. Ces résultats, assortis de la confrontation avec les données
de la littérature, nous ont permis de répondre à notre problématique. Celle-ci revenait à
déterminer et standardiser un test fonctionnel reflet de l’immunité.
Nous avons pu aboutir à la conclusion que le test de chimiluminescence est un test
reproductible qui est surtout associé à la protection clinique en zone d’endémie. Nous avons
donc, après de nombreuses mises au point, abouti à la standardisation d’un test fonctionnel,
reflet d’un type de l’immunité palustre. Cette dernière étant multiple, un seul test ne peut pas
en être un reflet complet.
Concernant les candidats vaccins testés, nos conclusions et perspectives sont multiples.
� Concernant BvMSP1p19, nos résultats ont tous conforté l’impact majeur de ce
candidat vaccin dans la protection clinique. Nous l’avons de nouveau retrouvé relié à la
protection clinique, et cela pour les deux villages étudiés et avec le même seuil à 7 rDO. Les
Ac qui lui sont associés sont donc protecteurs, mais un taux élevé est nécessaire pour ce faire.
Ils sont de plus très efficaces d’un point de vu fonctionnel comme cela avait été montré en
inhibition de culture et comme nous l’avons observé dans le test de phagocytose. Il semblerait
donc que ce candidat vaccin ait sa place en essais cliniques. � Concernant BvMSP4p20, les résultats sont controversés. Les Ac qui lui sont associés
n’ont pas été trouvés comme reliés à la protection clinique. Cependant, ils sont fonctionnels
dans le test de phagocytose. Il est donc nécessaire d’approfondir les études sur ce candidat
vaccin, sachant que dans le passé, son caractère protecteur avait été montré. � S’agissant de BvMSP5, bien que non fonctionnel en chimiluminescence, les Ac qui lui
sont liés ont été retrouvés pour la deuxième fois comme associés à la protection clinique. Sa
fonctionnalité ne serait pas reliée au déclenchement de la poussée respiratoire comme
MSP1p19 ou MSP4p20 mais serait bien réelle. Il faudrait l’étudier dans un autre type de test,
comme par exemple les inhibitions de culture, afin de déterminer quel type de fonctionnalité
lui est associé. Il est également primordial d’étudier l’effet des deux groupements myristiles
qui lui sont liés, afin de connaître leur éventuel impact sur la protection - positif ou négatif -.
152
� EcR23 n’a pas fourni de résultats concluants dans cette étude. Seul son impact chez les
personnes drépanocytaires hétérozygotes AS pourrait ouvrir de nouveaux champs
d’investigation afin de mieux comprendre son mode de présentation et donc son rôle.
Concernant les tests fonctionnels, nous n’avons pas pu, pour diverses raisons, réaliser le test
d’inhibition de culture. Il nécessiterait un travail plus approfondi que nous n’avons pas pu
réaliser dans cette étude.
Cependant, le test de chimiluminescence a pu être développé, optimisé et standardisé. Son
mode de fonctionnement nous a semblé élucider des incompréhensions sur celui de l’ADCI :
les ROS seraient des effecteurs majeurs dans les deux tests. Nous avons également pu, via le
calcul d’ADPm, permettre la standardisation des résultats et leur conférer une bonne
reproductibilité. Les résultats obtenus nous ont permis de montrer l’impact des Ac anti-
MSP4p20 et anti-MSP1p19 dans le déclenchement de la poussée respiratoire, via l’utilisation
de sérums déplétés et/ou de mérozoïtes transgéniques. Cependant cela n’a pas pu être obtenu
pour MSP5, montrant ainsi la spécificité du test dans la validation de candidats vaccins. Des
corrélations entre l’ADPm et la protection clinique en zone de méso- et d’holo-endémie ont
également pu être définies, avec le même seuil de réponses dans les deux cas. Il semble donc
important, au vu de tous ces résultats concluants, que ce test soit repris par d’autres équipes.
Si, en utilisant la méthodologie développée dans ce travail, des résultats similaires sont
retrouvés, alors ce test pourrait devenir un test de référence. Il pourrait être utilisé non
seulement pour les tests précliniques, mais également pour les essais cliniques en phase I, but
ultime de ce travail.
153
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
ALONSO P.L., SACARLAL J., APONTE J.J., et al. (2004). "Efficacy of the RTS,S/ASO2A
vaccine against Plamsodium falciparum infection and disease in young African children: