PARTE 4: HIPOTIROIDISMO · agenesia, hipoplasia) que representan el 85 % de los casos (2,3). ... la hormonogénesis tiroidea y como la proteína de reserva de hormonas tiroideas y

PARTE 4: HIPOTIROIDISMO

SECCIÓN II: CAUSAS DE HIPOTIROIDISMO


SECCIÓN II: CAUSAS DE HIPOTIROIDISMO

Uno de los avances más importantes en el manejo del hipotiroidismo congénito ha sido la puesta en marcha de los programas de screening neonatal para el hipotiroidismo primario (1), a partir de la segunda mitad de la década de los ‘70, ya que está permitiendo instaurar el tratamiento precozmente y evitar el retraso mental de los niños detectados (ver Capítulo 29).El otro avance experimentado en los últimos años lo está aportando la biología molecular, ya que está identificando la base de los transtornos genéticos causantes del hipotiroidismo. La acumulación de informes de casos, presentando mutaciones específicas, ha conducido a la observación de amplias variaciones fenotípicas para una misma mutación. El diagnóstico genético apropiado debería ser considerado en todos los casos de hipotiroidismo congénito. La causa más frecuente del hipotiroidismo permanente corresponde a las disgenesias tiroideas (ectopía, agenesia, hipoplasia) que representan el 85 % de los casos (2,3). Dichas disgenesias son habitualmente esporádicas, pero recientemente se está descubriendo que algunos casos tienen una causa genética, por mutaciones de genes que codifican factores de transcripción tiroideos como Pax 8, factor de transcripción tiroideo 2 (TTF2), factor de transcripción tiroideo 1 (TTF1) y NKX2-5. El 15 % restante de los hipotiroidismos congénitos primarios permanentes corresponden a dishormonogénesis, que es un grupo heterogéneo de errores congénitos que resultan del bloqueo total o parcial de cualquiera de los procesos bioquímicos implicados en la síntesis y secreción de hormonas tiroideas, y que siempre tienen una causa genética. En la actualidad, ya se ha identificado una vasta cantidad de genes responsables. Los defectos afectan a los genes que codifican para el receptor de TSH (TSHR), transportador Sodio-Yodo (NIS), tiroperoxidasa (TPO), tiroglobulina (TG), dual oxidasa 2 (DUOX2), factor 2 de maduración de DUOX (DUOXA2), pendrina (SLC26A4) y yodotirosina deiodinasa tipo 1 (DEHAL 1). En cuanto al hipotiroidismo transitorio se ha considerado clásicamente una variedad de hipotiroidismo con base ambiental (falta de yodo), inmunológica (paso trasplacentario de anticuerpos antitiroideos maternos al feto) o iatrogénica (intoxicación de yodo con povidona yodada utilizada como antiséptico en el período neonatal). Pero en la mayoría de las grandes series de hipotiroidismo, en distintos países, un porcentaje variable de hipotiroidismo congénito transitorio no se puede encasillar en ninguna de las causas conocidas, etiquetándose entonces como idiopático. Recientemente, Moreno y colaboradores han caracterizado mutaciones heterocigotas inactivantes de la proteína DUOX2 en pacientes con hipotiroidismo congénito transitorio con un defecto parcial de organificación del yodo. Dicho estudio demuestra el carácter genético de los casos de hipotiroidismo congénito transitorio que eran catalogados anteriormente de idiopáticos. En este capítulo se brinda una actualización sobre la genética y fenómica del hipotiroidismo congénito que surge como consecuencia de la dishormonogénesis, el diagnóstico molecular y su integración con la medicina clínica.

TiroglobulinaLa TG es la proteína con mayor expresión cuantitativa en la glándula tiroides (4). Funciona como un esqueleto para la hormonogénesis tiroidea y como la proteína de reserva de hormonas tiroideas y yoduro. Los defectos génicos, debidos a mutaciones en la TG, tienen una prevalencia estimada de aproximadamente 1 en 100.000 nacidos vivos. Se presentan con una gran variación de fenotipo. Se han reportado mutaciones en TG asociadas con bocio congénito (5) y bocio simple endémico o no endémico (6-8). Los defectos génicos en TG son heredados en forma autosómica recesiva y los individuos afectados son homocigotas o compuestos heterocigotas para las mutaciones. Hasta el momento, han sido identificadas y caracterizadas 51 mutaciones en TG humana: 23 mutaciones con cambio de sentido, 11 mutaciones en sitios de

Bases moleculares de los errores congénitos de la Hormonogénesis Tiroidea

María Cecilia Olcese, Cintia E. Citterio, Fiorella S. Belforte, Héctor M. Targovnik y Carina M. Rivolta

CAPÍTULO 38


Cap 38/3

CAPÍTULO 38: Bases moleculares de los errores congénitos de la Hormonogénesis Tiroidea

“splicing”, 10 mutaciones sin sentido, 5 deleciones de una base, 1 deleción de nucleótidos extensa y 1 inserción de un nucleótido (Tabla 1) (9-33). El perfil bioquímico de los pacientes, por lo general, se caracteriza por una alta captación de 131-I, descarga de perclorato negativa, baja TG sérica y elevada TSH con T4 baja y T3 normal o alta.

Tabla 1. Mutaciones en el gen de tiroglobulina.

Posición Exón/Intrón Posición nucleotídica Posición aminoacídica ReferenciasDeleción en la región 5´ del gen involucrando el promotor y los primeros 11 exones.Exón 2Intrón 3

Intrón 3Exón 5Exón 5Intrón 5

Exón 7Exón 7

Exón 8Exón 9Exón 9Exón 9Exón 9Exón 9Exón 10

Intrón 10Exón 11Exón 12Exón 12Exón 14

Exón 17

Exón 20Exón 21Exón 22

c.113G>Ag.IVS3+2T>G

g.IVS3-3C>Gc.548G>Ac.580T>G g.IVS5+1G>A

c.759–760insAc.886C>T

c.986A>C c.1143delCc.1348delTc.1351C>Tc.1712delTc.2131C>T c.2610G>T

g.IVS10-1G>A c.2969G>A c.3022C>Tc.3035C>Tc.3229T>C

c.3790T>C

c.4310G>Ac.4397G>A c.4588C>T

p.R19KPérdida del exón 3 y codón stop en exón 4Pérdida de exón 4p.C164Yp.C175GPérdida de exón 5 y codón stop en exón 6p.L234fsX237p.R277X

p.Q310Pp.G362fsX382p.S431fsX459p.R432Xp.L552fsX576p.Q692Xp.Q851H

Pérdida de exón 11p.S971Ip.R989Cp.P993Lp.C1058R

p.C1245R

p.W1418Xp.S1447Np.R1511X Pérdida del exón 22

Gonzalez Sarmiento, 2001Kim et al., 2008Niu et al., 2009

Ieiri et al., 1991Caputo et al., 2007aHishinuma et al., 2006Alzahrani et al., 2006

Caputo et al., 2007avan de Graaf et al., 1999; Gutnisky et al., 2004; Rivolta et al., 2005; Caputo et al., 2007a; Caputo et al., 2007b; Pardo et al., 2009; Machiavelli et al., 2010 Hishinuma et al., 2006Caron et al., 2003Niu et al., 2009Niu et al., 2009Niu et al., 2009Hishinuma et al., 2006Corral et al., 1993; Pérez-Centeno et al., 1996Hishinuma et al., 2006Hishinuma et al., 2006Hishinuma et al., 2006Hishinuma et al., 2006Hishinuma et al., 2005; Hishinuma et al., 2006Hishinuma et al., 1999; Baryshev et al., 2004 ; Hishinuma et al., 2005; Hishinuma et al., 2006; Kanou et al., 2007 Hishinuma et al., 2006Hishinuma et al., 2006Targovnik et al., 1993; Gutnisky et al., 2004; Mendive et al., 2005; Caputo et al., 2007b, Targovnik et al. 2009 Targovnik et al. 2010

Cap 38/4


En 1991 se registró la primera familia con una mutación génica en TG. La mujer afectada, de 33 años de origen japonés era una de los seis hijos de un matrimonio consanguíneo. La paciente de baja estatura, con una edad mental de 13 años y examen físico normal presentaba un bocio grande asimétrico y multinodular, fácilmente visible y palpable. El análisis bioquímico indicó hipotiroidismo severo con niveles bajos de TG. El análisis molecular mostró una síntesis defectuosa de TG, debido a la ausencia del exón 4 en el transcripto, como consecuencia de una transversión homocigota de citosina a guanina en la posición -3 del sitio aceptor de splicing del intrón 3 (la g. IVS3-3C> G) (11). Aunque esta deleción no modifica el marco de lectura, la proteína TG anormal carece de 68 residuos, incluyendo la tirosina hormonogénica dadora del exón 4. La mutación más frecuente reportada en TG se aloja en el exón 7 y es la p.R277X (c.886C>T) (Tabla 1) (12,15-20). El fenotipo clínico de los pacientes homocigotas, con la mutación p.R277X, va desde hipotiroidismo moderado

Exón 24Exón 22Exón 24Intrón 24

Exón 27Exón 27Intrón 30

Intrón 30Exón 31

Exón 31Exón 33

Exón 33Intrón 34Intrón 35


Exón 38


Exón 41Exón 41

Intrón 45Exón 46Intrón 46

c.4820G>T c.4537delGc.4820G>T g.IVS24+1G>C

c.5350C>Tc.5386C>Tg.IVS30+1G>T

g.IVS30+1G>Ac.5690G>A

c.5791A>Gc.5986T>A

c.6047delAg.IVS34-1G>Cg.IVS35+1delG

c.6461G>A c.6481C>Tc.6701C>A

c.6725G>A

c.6956G>Ac.7006C>Tc.7007G>A

c.7121G>Tc.7123G>A

g.IVS45+2T>Ac.7969C>Tg.IVS46-1G>A

p.C1588Fp.D1494fsX1547p.C1588FPérdida de exón 24 ystop codon en exón 26p.Q1765Xp.Q1777XPérdida de exón 30

Pérdida de exón 30p.C1878Y

p.I1912Vp.C1977S

p.Q1997fsX1998Pérdida de exón 35Pérdida del exón 35

p.C2135Yp.Q2142Xp.A2215D

p.R2223H

p.G2300Dp.R2317Xp.R2317Q

p.G2355Vp.G2356R

Pérdida de exón 45p.Q2638XPérdida de exón 46

Hishinuma et al., 2006Hishinuma et al., 2006Hishinuma et al., 2006Hishinuma et al., 2006

Niu et al., 2009Targovnik et al. 2010Targovnik et al., 1995; Targovnik et al., 2001; Pardo et al. 2008; Pardo et al. 2009Hishinuma et al., 2006Kitanaka et al., 2006; Hishinuma et al., 2006Hishinuma et al., 2006Hishinuma et al., 1999; Baryshev et al., 2004; Hishinuma et al., 2005; Hishinuma et al., 2006 Niu et al., 2009Gutnisky et al., 2004Peteiro-González et al., 2010Hishinuma et al., 2006Pardo et al. 2009Caputo et al., 2007a; Pardo et al. 2008; Pardo et al. 2009; Machiavelli et al., 2010 Caron et al., 2003; Machiavelli et al., 2010Hishinuma et al., 2006Machiavelli et al., 2010Kitanaka et al., 2006 ; Hishinuma et al., 2006Hishinuma et al., 2006Hishinuma et al., 2005; Hishinuma et al., 2006Hishinuma et al., 2006Hishinuma et al., 2006Pardo et al., 2009

Cap 38/5


a severo. El codón “stop” prematuro permite conservar el sitio hormonogénico aceptor del exón 2 y dador del exón 4, pero conduce a la pérdida de los demás sitios hormonogénicos, causando una disminución en la formación de hormonas tiroideas. La expresión in vitro del ADNc de TG, conteniendo la mutación, mostró que la proteína truncada puede ser glicosilada, indicando su posible exportación a la superficie apical de los tirocitos (15). Recientemente, se demostró que la introducción de un codón “stop” en la posición 175 de TG de ratón permite la secreción de la proteína truncada (9). Un resultado que contradice lo anterior, se observa en un trabajo del 2008, en el cual se demuestra que el dominio de homología con la ACHE funciona como un acompañante de TG y, si éste no se expresa, la TG no es exportada (34). Por otro lado, en el análisis de RT-PCR no encontraron pruebas de que se pueda restaurar el marco de lectura normal que se pierde por la mutación (15). La explicación de esta observación es que la p.R277X no interrumpe elementos “enhancers” de “splicing” exónicos (ESE) (20).No está esclarecido si la mutación p.R277X se genera por un mecanismo “hot spot” mutacional o es heredada de un cromosoma común ancestral. La comparación de los marcadores polimórficos de TG en un paciente homocigota argentino, con un miembro de una familia brasileña portando también la p.R277X como un compuesto heterocigota (17), reveló que los dos individuos afectados no comparten el alelo común de TG, avalando que un mecanismo “hot spot” mutacional es responsable de la mutación p.R277X. Sin embargo, el análisis comparativo entre haplotipos, con la mutación p.R277X de dos familias argentinas, sugiere la posibilidad de que esta mutación sea heredada de un cromosoma común ancestral (18).La mutación p.R1511X (c.4588C>T) conduce a la eliminación del exón 22 de los transcriptos (Tabla 1) (16, 18, 26, 27) y a la acumulación preferencial en el bocio de un ARNm de TG que carece del exón 22. El preARNm restaura el marco de lectura, lo que permite la traducción hasta alcanzar el codón “stop” normal. Este “splicing” alternativo ocurre también en tejido tiroideo normal, representando la fracción minoritaria de los transcriptos totales de TG (35). La deleción del exón 22 en el ARNm de TG causa la pérdida de 57 aminoácidos localizados en el dominio repetitivo Tipo 1 de TG. Las consecuencias funcionales de dicha deleción podrían ser cambios estructurales de la proteína con la retención de la molécula dentro de la célula. O bien, es posible que la eliminación de exones que contienen motivos repetitivos por “splicing” alternativo cause una disminuida capacidad de transferir un grupo iodofenoxilo del sitio de donante al aceptor de yodotirosina (16). Se cree que los residuos de cisteína juegan un importante rol en la estructura terciaria de la TG, 5 de los cuales están localizados en el exón 22 (16, 26, 35). Análisis de haplotipos demostraron ausencia de efecto fundador para la mutación p.R1511X para las poblaciones argentina y brasileña (18).En una familia Brasileña no consanguínea, dos hermanos y un primo con hipotiroidismo con bocio resultaron ser compuestos heterocigotas para las mutaciones c.886C> T/c.4588C> T (p. R277X/p. R1511X) o c.886C> T/g. IVS34-1G> C (Tabla 1) (16, 26). Ambos hermanos tenían facies de cretinismo, reflejos lentos, baja estatura, dificultad en la coordinación y habla, y bocio multinodular. El mismo compuesto heterocigota también fue identificado en dos miembros de una familia argentina (Tabla 1) (18). Targovnik y colaboradores identificaron la mutación p.R1511X asociada con la mutación c.5386C> T [p.Q1777X] en un miembro de una familia francesa (Tabla 1) (28). El codón CGA codifica para una arginina y es considerado un hot spot para mutaciones en el ADN de mamíferos. Las mutaciones sin sentido c.886C>T y c.4588C>T ocurren en secuencias CpG y podrían ser causadas por desaminación de una citosina metilada llevando a la formación de una timina (5).Otro “splicing” aberrante homocigota, debido a una transversión de guanina a timina en la posición +1 en el sitio donante de “splicing” del intrón 30 (g.IVS30 +1 G> T), fue identificado en dos miembros de una familia brasileña cosanguínea con antecedentes de bocio congénito (Tabla 1) (29, 30). Los dos pacientes afectados estudiados presentaban bocio e hipotiroidismo grave. La gammagrafía tiroidea era compatible con bocio multinodular y la ecografía con grandes nódulos. La TG sérica se encontraba por debajo del límite de detección. La mutación condujo a la eliminación de 138 nucleótidos del exón 30, lo cual no afecta el marco de lectura del ARNm sintetizándose luego una TG con 46 residuos menos (29, 30). Las consecuencias funcionales de la deleción están relacionadas con cambios estructurales en la molécula proteica, que pueden modificar la ruta normal del producto a través del sistema de membranas de la célula o pueden interferir en el acople de residuos iodinados (36). La deleción causa la pérdida de un sitio de N-glicosilación putativo. Una deleción monoalélica en la región 5´ del gen de TG se observó asociada al bocio simple no endémico (8). Dicha mutación afecta la región del promotor y los 11 primeros exones del gen de TG aproximadamente (Tabla 1). Algunos casos de bocio endémico y bocio no endémico simple eutiroideo se asocian con una mutación en la posición Cap 38/6


2610 del exón 10, que implica una sustitución de G por T (c.2610G>T). Este único cambio de base resulta en la sustitución de glutamina por histidina (P.Q851H) (Tabla 1) (6,7). Dos nuevas mutaciones con cambio de sentido en los exones 17 y 33 fueron identificadas en dos pacientes no relacionados con bocio congénito y en dos hermanos con la variante de bocio adenomatoso. El fenotipo clínico de estos cuatro pacientes varió de eutiroidismo a hipotiroidismo leve. En los pacientes con bocio congénito se detectó una transición homocigota c.3790C>T que produjo la sustitución del aminoácido cisteína por arginina en el codón 1245 (p.C1245R) (Tabla 1). En los hermanos con la variante de bocio adenomatoso se encontró una transversión homocigota timina por adenina en la posición 5986 (c.5986T>A) que causó la sustitución de un aminoácido cisteína por serina en el codón 1977 (p.C1977S) (Tabla 1). Se cree que las mutaciones con cambio de sentido, que llevan a la sustitución de cisteína, causan una anormalidad en el transporte intracelular debido a la alteración de la estructura tridimensional de TG (24). Por otro lado, se demostró que las mutaciones p.C1245R y p.C1977S en el ser humano, así como p.G2300R en ratas rdw inducen una respuesta a proteínas mal plegadas (unfolded protein response, UPR). UPR es una reacción adaptativa celular que regula la capacidad de plegamiento de proteínas del RE que es perturbada por la acumulación excesiva de las proteínas secretoras mutantes. Dicha respuesta incluye la inducción de chaperonas (22).La primera mutación identificada en el dominio de homología con ACHE fue una sustitución de guanina por adenina en la posición 6725 en el exón 38 (c.6725G>A) que produce un cambio de sentido p.R2223H. La familia estudiada era francesa con dos hermanos afectados con hipotiroidismo congénito con bocio. El mismo se diagnosticó en ambos pacientes por ultrasonido en el sexto mes de gestación y las determinaciones bioquímicas prenatales evidenciaron hipotiroidismo grave. La mutación en el dominio de homología con ACHE se encontró asociada con una mutación en el exón 9 (Tabla 1). La mutación paterna resultó en una deleción de citosina en la posición 1143 en el exón 9 (c.1143delC) la cual produce un corrimiento en el marco de lectura en el aminoácido 362 y genera un codón “stop” en la posición 382 (p.362fsX382). La mutación materna era la p.R2223H. Dado que el aminoácido arginina se conserva estrictamente en la posición 2223, en todas las especies para las que se tiene la secuencia certera de TG y de ACHE (21), se cree que el residuo de arginina en esta posición juega un papel estructural crítico en la proteína TG. Las consecuencias funcionales de esta mutación podrían ser la retención de la proteína dentro del RE de la TG, debido a las alteraciones estructurales, como ya se observó en otras mutaciones con cambio de sentido localizadas en el dominio de homología con la ACHE en ratones cog/cog (c.6848T> C [p.L2263P]) y ratas rdw/rdw (c.6958G> C [p.G2300R]) (37-39).Hishinuma y colaboradores han estudiado 41 familias japonesas con bocios congénitos eutiroideos o con hipotiroidismo leve, reportándose así 26 mutaciones inactivantes en el gen de TG. De las mismas, 22 resultaron ser nuevas mutaciones: 14 mutaciones sin sentido (C.580T>G [p.C175G], c.986A>C [p.Q310P], c.2969G>A [p.S971I], c.3022C>T [p.R989C], c.3035C>T [p.P993L], c.4397G>A [p.S1447N], c.4280G>T [p.C1588F], c.5690G>A [p.C1878Y], c.5791A>G [P.I1912V], c.6017G>A [p.C1987Y], c.6461G>A [p.C2135Y], c.6956G>A [p.G2300D], c.7007G>A [p.R2317Q] y c.7121G>T [P.G2355V]), 4 mutaciones en sitios de “splicing” (g.IVS10-1G>A, g.IVS24 +1 G>C, g.IVS30 + 1G>A y g.IVS45 + 2T>A), 3 mutaciones sin sentido (C.2131C>T [p.Q692X], c.4310G>A [p.W1418X] y c.7969C>T[P.Q2638X]) y una deleción de un solo nucleótido (c.4537delG [P.D1494fsX1547]) (Tabla 1) (13). Las otras cuatro mutaciones previamente reportadas fueron: p.C1058R, p.C1245R, p.C1977S y p.G2356R (Tabla 1) (22-24). Treinta y cinco pacientes eran homocigotas, mientras que 17 resultaron heterocigotas compuestos. Los pacientes portadores de las mutaciones p.C1058R y p.C1977S mostraron la misma combinación de los polimorfismos de nucleótido único en la región codificante del gen TG. Estos hallazgos sugieren que la aparición de estas mutaciones se debe a un efecto fundador. El paciente heterocigota, para las mutaciones p.C1878Y/p.R2317Q, presentó una concentración sérica de T3 desproporcionadamente más alta en comparación con la T4 (32). La secuenciación directa del gen de TG en ocho pacientes de seis familias argentinas, no consanguíneas y con hipotiroidismo congénito, puso de manifiesto cuatro nuevas mutaciones (C.548G>A [p.C164Y], c.759-760insA [p.L234fsX237], c.6701C>A [P.A2215D] y c.7006C>T [p.R2317X]) y tres mutaciones descriptas con anterioridad (p.R277X, p.R1511X y p.R2223H), constituyendo cuatro compuestos heterocigotas para las mutaciones p.C164Y/p.L234fsX237, p.R277X/p.A2215D, p.R277X/p.R1511X y p.R2223H/p.R2317X y dos homocigotas para las mutaciones p.R277X y p.A2215D (Tabla 1) (12, 20). Dos hermanos tuvieron la mutación homocigota p.A2215D y otros dos resultaron compuestos heterocigotas para las mutaciones p.R277X/p.R1511X. Además,

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tres pacientes de dos familias no relacionadas, que también fueron estudiados por presentar hipotiroidismo congénito, portaban un solo alelo mutado p.R277X (20). No está claro en el último caso si el fenotipo es causado por un defecto monoalélico o por mutaciones en las regiones reguladoras lejanas del gen de la TG o en las regiones intrónicas no secuenciadas. En un estudio genético de 17 pacientes de 11 familias brasileñas no relacionadas, con hipotiroidismo congénito debido a deficiencia de TG, se encontraron 5 mutaciones de las cuales dos eran nuevas (c.6481C T> [p.Q2142X] y g.IVS46-1G>A) y tres estaban descriptas previamente (p.R227X, g.IVS30+1 G>T y p.A2215D) (Tabla 1). Seis pacientes resultaron homocigotas para la mutación p.A2215D. Tres pacientes resultaron ser compuestos heterocigotas, uno para g.IVS30+1 G>T/p.A2215D, otro para p.R277X/p.A2215D y otro para g.IVS46-1G> A/p.R277X. Las mutaciones p.R277X y g.IVS30+1G>T se encontraron en homocigosis en 3 y 2 pacientes, respectivamente. Se identificaron dos hermanos homocigotas para la nueva mutación p.Q2142X. Es interesante observar que los pacientes homocigotas para la mutación p.A2215D presentaron eutiroidismo o hipotiroidismo leve; por el contrario, los pacientes homocigotas con la p.R277X, g.IVS30+1G>T o p.Q2142X presentaron hipotiroidismos severos (19,31). Sin embargo, el análisis funcional sugiere que la mutación p.A2215D da lugar a la retención en el RE. Una posible explicación es que la presencia del abastecimiento suficiente de yodo, en algunos pacientes con mutación homocigota p.A2215D, es capaz de compensar la dishormonogénesis. Una explicación alternativa es que algunas moléculas de TG p.A2215D escapan del RE (19). Niu y colaboradores han reportado seis nuevas mutaciones del gen de la TG en 7 pacientes de 6 familias taiwanesas con hipotiroidismo severo, incluyendo 3 deleciones de un solo nucleótido (c.1348delT [p.S431fsX459], c.1712delT [P.L552fsX576] y c.6047delA [p.Q1997fsX1998]), 2 mutaciones sin sentido (c.1351C T> [p.R432X] y c.5350C>T [p.Q1765X]) y 1 mutación en sitio de “splicing” (g.IVS3 +2 T>G), (Tabla 1). La mutación g.IVS3+2 T>G lleva a la exclusión del exón 3, cambiando el marco de lectura y generando un codón “stop” prematuro. Los pacientes homocigotas para la mutación p.S431fsX459 y los compuestos heterocigotas g.IVS3+2T>G/p.Q1765X y IVS3+2T>G/p.Q1997fsX1998 no tenían bocio. El análisis de haplotipos reveló que la mutación p.S431fsX459 se debe a un efecto fundador. Los pacientes compuestos heterocigotas portadores de las mutaciones p.R432X/p.L552fsX576 presentaban bocio detectable solamente por palpación. La ausencia de evidencia de bocio puede deberse a que los pacientes fueron detectados y tratados desde recién nacidos. La mutación p.R432X parece ser una mutación de novo (10).En 2010, Peteiro-González publicó un estudio en una familia de Galicia, en la que había integrantes con hipotiroidismo con bocio causado por dos mutaciones diferentes en el gen de TG. Los miembros de la familia que tenían hipotiroidismo congénito, retraso mental y bocio, eran compuestos heterocigotas para dos mutaciones en el gen de TG. Una de ellas resultó ser una mutación descripta, c.886C>T [p.R277X] y la otra, una nueva mutación g.IVS35 + 1delG, que causa la deleción del exón 35, manteniéndose el marco de lectura (Tabla 1). La TG pierde 21 aminoácidos con respecto a la proteína normal y se introduce una metionina en la posición 2067. La TG más corta, resultado de la mutación nueva, fue retenida en el retículo endoplásmico. Esto también sucede con la mutación p.R277X. La combinación de g.IVS35+1delG y p.R277X causó hipotiroidismo severo con bocio (33).

Mutaciones en TG se asocian también con el desarrollo de carcinoma papilar y folicular de tiroides. Se hallaron dos mutaciones nuevas (c.3229T>C [p.C1058R] y c.7123G>A [p.G2356R]) y dos descriptas anteriormente (p.C1245R y p.C1977S). Los pacientes eran homocigotas para p.C1058R, p.C1245R y p.C1977S o compuestos heterocigotas para p.C1245R/p.G2356R (Tabla 1). Adicionalmente, en el tejido canceroso, el gen BRAF, reveló dos mutaciones heterocigotas activantes en el exón 15 (p.V599E y p.K600E) presentes en dos de estos pacientes (23). En dos hermanos con bocios recurrentes enormes e hipotiroidismo severo, pertenecientes a una familia endogámica, se identificó una transición guanina a adenina homocigota en la posición +1 del sitio dador de “splicing” del intrón 5 (G.IVS5 +1 G>A) en el gen de TG (Tabla 1). Uno de ellos desarrolló un carcinoma tiroideo folicular metastático. Los padres resultaron heterocigotas para la misma mutación, y la misma no se identificó en su hermano no afectado. La pérdida del exón 5 y la fusión de los exones 4 y 6 produce un cambio del marco de lectura y la aparición de un “stop” prematuro en la posición 147, en el exón 6 (14). Esta forma truncada de TG conserva dos supuestos sitios de N-glicosilación, la tirosina 5 (exón 2) aceptora y la tirosina 130 (exón 4) donante.

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TiroperoxidasaLa actividad de la hemoproteína TPO, unida a membrana, es esencial para la síntesis de hormonas tiroideas en la membrana apical del tirocito. Los defectos de organificación del yodo son un grupo particular entre los casos de bocio congénito, en los cuales se observan niveles de Tiroglobulina (TG) elevados y T3 y T4 disminuidos. En pacientes con sospecha de deficiencia de TPO, completa o parcial, la actividad enzimática es evaluada en vivo por captación de radioiodo y el test de descarga de perclorato (ClO4-). Sin embargo, y como antecedente histórico, es dable mencionar que el primer trabajo donde se demostró en forma directa, por estudios enzimáticos “in vitro”, que la tiroperoxidasa de una paciente operada por un bocio congénito era defectuosa, fue realizado hace 4 décadas en la Universidad de Chicago y liderado por el Dr. Hugo Niepomniszcze, cuando él era becario del NIH para trabajar con el Dr. Leslie J. DeGroot. Dicho estudio, que fue pionero en la identificación de una falla enzimática en la biosíntesis hormonal tiroidea, fue publicado, por su complejidad, en dos artículos sucesivos (N Engl J Med. 285:1394-8; 1971 y J Clin Endocrinol Metab. 34:607-16; 1972).Debido a los niveles elevados de TSH, los pacientes con defectos en la TPO muestran una captación inicial muy rápida de radioiodo, la cual alcanza un máximo dentro de los 30 minutos. La administración de ClO4- inhibe competitivamente la captación de yodo tiroideo por el transportador sodio/yodo SLC5A5. En el caso que los procesos de yodinación y acoplamiento no se vean afectados, el radioiodo captado por la tiroides es organificado y menos del 10% es lavado. En caso de un defecto de organificación de yodo total (TIOD), más del 90% es descargado desde el pool de yodo intratiroideo, indicando que el yodo tomado no fue incorporado a proteína. Niveles de descarga entre el 10 y el 90% son denominados defectos de organificación pacial de yodo (PIOD) (40). En un estudio reciente de 183 niños con hipotiroidismo congénito, el 13.7% de los pacientes fue diagnosticado con un defecto de organificación del yodo (41).Las bases moleculares de TIOD son mutaciones inactivantes bialélicas, en el gen de TPO, o mutaciones inactivantes bialélicas en el gen de DUOX, siendo la primeras mucho más frecuentes que las segundas alteraciones. La base genética para un defecto de organificación parcial es a la inversa, se han descripto varias mutaciones en el gen DUOX2 (42) y solo unas esporádicas mutaciones en TPO. Mutaciones inactivantes monoalélicas en DUOX2 han sido reportadas en relación a formas transientes de hipotiroidismo relativamente leve (43). Adicionalmente, mutaciones en DUOXA2 (44) y SLC26A4 han sido reportadas como la base molecular del PIOD. Mutaciones en SLC26A4 causan Síndrome de Pendred, una combinación de pérdida de audición y un PIOD, con grados variables en ambas características clínicas.Los defectos en TPO se heredan comúnmente de manera autosómica recesiva, dado que los pacientes presentan alelos afectados provenientes de ambos progenitores. Dichas mutaciones pueden presentarse en forma homocigota, o bien identificarse como variantes heterocigotas, que conforman individuos compuestos heterocigotas (2). La primera mutación identificada en el gen de TPO fue una inserción-duplicación de GGCC homocigota en la posición 1277 en el octavo exón del gen de TPO (45). El cambio de marco de lectura genera un codón prematuro de terminación en el exón 9, originando, en consecuencia, una proteína truncada sin actividad biológica. Un “splicing” alternativo por un sitio aceptor críptico, en el exón 9, restablece el marco de lectura normal interrumpido por la mutación, y elimina el codón de terminación de la traducción. Hasta el momento, se han identificado 61 mutaciones en el gen de TPO. La mayoría corresponde a mutaciones localizadas en los exones 7, 8 y 9, que codifican el dominio catalítico de la enzima, correspondiente al sitio de unión al hemo de la proteína. Del total de mutaciones encontradas, 13 corresponden a variantes que generan un corrimiento en el marco de lectura (“frameshift”), generando 12 de ellas, mensajeros con codones stop prematuros (46). Otras tres mutaciones afectan el “splicing”, dos porque involucran el sitio consenso dador o aceptor, y otra que, según evidencia su análisis in sílico, también afecta el procesamiento del mensajero. Se reportaron, a su vez, seis mutaciones sin sentido (nonsense) como así también dos pequeñas deleciones que conservan el marco de lectura. La mayoría de las mutaciones descriptas (37 de 61) son mutaciones con cambio de sentido (missense). Bikker ha reportado que la expresión de una TPO portadora de un codón stop prematuro se encuentra reducida, estimando que la presencia de una mutación sin sentido causaría inestabilidad en el mensajero (47). Existen antecedentes que explicarían cómo proteínas mal plegadas, expresadas a partir de mensajeros portadores de este tipo de mutaciones, intentan repetidamente ser replegadas de manera adecuada o bien son degradadas por mecanismos de control del retículo endoplásmico (RE), de manera tal de prevenir la retención intracelular de

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las proteínas anormales o su secreción anómala (48, 49). Se ha reportado que la clanexina y la calreticulina son chaperonas moleculares necesarias para los pasos iniciales de plegamiento de la TPO (50). Si bien se conoce que el modo de herencia de este desorden primario es autosómico recesivo, existen antecedentes de mutaciones en un único alelo de la TPO, en pacientes con defecto total de organificación de yodo. Fugazzola reportó el caso de una familia en la cual los tres hermanos afectados tenían una mutación simple en el gen de TPO (c.2167C>T, p.R693W) heredada a partir de su padre no afectado (51). El fenotipo del defecto de organificación en esta familia fue el resultado de la expresión del alelo paterno mutado, asociado con la pérdida de transcriptos del alelo materno. El defecto materno no pudo ser identificado, pero se confirmó la falta de expresión del alelo materno por análisis de polimorfismos a nivel de ARNm de la TPO. Se desconoce la causa de la falta de expresión del alelo materno en este caso y no se descarta la posible presencia de mutaciones en regiones alejadas del promotor que alteren la expresión. Se han reportado, posteriormente, otros casos en los que se identifica una mutación monoalélica en TPO en pacientes con defecto total de organificación. La aparente ausencia de la segunda mutación podría, probablemente, ser explicada por limitaciones técnicas del secuenciamiento directo y análisis de haplotipos (deleción de un exón simple que no contiene polimorfismos informativos, pequeñas deleciones entre sitios polimórficos o mutaciones en regiones no codificantes, o bien regulatorias distantes del gen de TPO, o en regiones intrónicas alejadas). Podría especularse, también, la posibilidad de encontrar mutaciones en genes que codifican para proteínas relacionadas con la síntesis de hormonas tiroideas, determinando una combinación de variantes en genes diferentes pero metabólicamente relacionados, como ser por ejemplo genes del Sistema DUOX. Tener en cuenta estas alternativas podría esclarecer las bases moleculares de los defectos de organificación del yodo en pacientes afectados, favoreciendo así la interpretación diagnóstica de los mismos.Se presenta, en la Tabla 2, un resumen de las mutaciones encontradas hasta la fecha en el gen de TPO (45, 52-78).

Tabla 2. Mutaciones en el gen de tiroglobulina.

Posición Exón/Intrón Posición nucleotídica Posición aminoacídica ReferenciasExón 2Exón 3Exón 4Exón 4Exón 5

Exón 5Exón 6

Exón 6Exón 7Exón 7Exón 8Exón 8Exón 8Exón 8Exón 8Exón 8Exón 8Exón 8Exón 8

Exón 8Exón 8

c.31_50dupc.157G>Cc.215delAc.349G>Cc.387delC

c.391T>Cc.524G>A

c.523C>Tc.703C>Tc.718G>Ac.843delCc.875C>Tc.920A>Cc.940C>Tc.976G>Ac.1132G>Ac.1152G>Tc.1159G>Ac.1186_1187insGGCC

c.1274A>Gc.1297G>A

p.E17fsX93p.A53Pp.Q72fsX86p.D117Hp.N129fsX208

p.S131Pp.R175Q

p.R175Xp.Q235Xp.D240Np.A282fsX317p.S292Fp.N307Tp.R314Wp.A326Tp.E378Kp.E384Dp.G387Rp.A396fsX472

p.N425Sp.V433M

Bikker et al., 1994Niu et al., 2002Rivolta et al., 2007Bakker et al., 2000Rivolta et al., 2003Rivolta et al., 2007Rodrigues et al., 2005Kotani et al., 2003Umeki et al., 2004Avbelj et al., 2007Pfarr et al., 2006Kotani et al., 1999Wu et al., 2002Tenenbaum et al., 2007Rivolta et a., 2003Fuchs et al., 2008Bakker et al., 2000Tajima et al., 2005Nascimento et al., 2003Rivolta et al., 2007Abramowicz et al., 1992Bikker et al., 1995Nascimento et al., 2003Rivolta et al., 2003Rodrigues et al., 2005Rivolta et a.,l 2003

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Exón 9

Exón 9Exón 9Exón 9Exón 9Exón 9

Exón 9

Exón 9

Exón 10

Exón 10Exón 10Exón 10intron 10Exón 11Exón 11Exón 11



Exón 14Exón 14Exón 14Exón 14Exón 14Exón 14Exón 15Intrón15/ Exón 16Exón 16Exón 16

c.1335delCc.1338G>Cc.1339A>T

c.1357T>G

c.1373T>Cc.1430_1450delc.1472G>Ac.1477G>Ac.1496C>T

c.1581G>T

c.1597G>T

c.1618C>T

c.1690C>Ac.1718_1723delc.1768G>Ac.1768+1G>Ac.1943G>Ac.1955dupTc.1978C>G

c.1993C>T1994G>Ac.1999G>Ac.2077C>Tc.2153_2154delTc.2243delTc.2268_2269insT

c.2311G>Ac.2386G>Tc.2395G>A

c.2413delCc.2415-2421insCc.2422delTc.2422T>Cc.2512T>Ac.2578G>Ac.2619G>Ac.2619-6_2622delc.2722_2731delc.2748G>A

p.Q446fsX450p.Q446Hp.I447F

p.Y453D

p.L458Pp.A477_N483delp.R491Hp.G493Sp.P499L

p.W527C

p.G533C

p.R540X

p.L564Ip.D574_Leu575delp.G590SAfecta el splicing?p.R648Qp.F653fsX668p.Q660E

p.R665Wp.R665Qp.G667Sp.R693Wp.F718Xp.V748fsX797p.E757X

p.G771Rp.D796Yp.E799K

p.H805fsX831p.C808fsX879p.C808fsX831p.C808Rp.C838Sp.G860Rp.W873XAfecta el splicing?p.R908fsX970p.Q916Q

Bakker et al., 2000Simm et al., 2009Bikker et al., 1997Bakker et al., 2000Bikker et al., 1995Bakker et al., 2000Borgel et al., 2005Pfarr et al., 2006aAmgrugger et al., 2001Avbelj et al., 2007Ambrugger et al., 2001Wu et al., 2002Rivolta et al., 2003Tenenbaum et al., 2007Bakker et al., 2000Simm et al., 2009Kotani et al., 2003Nascimento et al., 2003Bikker et al., 1995Umeki et al., 2004Tenenbaum et al., 2007Nascimento et al., 2003Kotani et al., 2003Bikker et al., 1995Bakker et al., 2000Pannain et al., 1999Deladoey et al., 2008Santos et al., 1999Deladoey et al., 2008Umeki et al., 2002Nascimento et al., 2003Avbelj et al., 2007Avbelj et al., 2007Bakker et al., 2000Niu et al., 2002Wu et al., 2002Niu et al., 2002Niu et al., 2005Umeki et al., 2004Wu et al., 2002Bikker et al., 1995Pannain et al., 1999Bakker et al., 2000Wu et al., 2002Bikker et al., 1995Bakker et al., 2000Rivolta et al., 2003Rodrigues et al., 2005Avbelj et al., 2007Simm et al., 2009Tajima et al., 2005Pfarr et al., 2006bRodrigues et al., 2005

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Sistema DUOXUna vez caracterizados y estudiados, desde el punto de vista estructural y funcional, los componentes del sistema DUOX se convirtieron en genes candidatos para ser estudiados ante la presencia de defectos en la hormonogénesis tiroidea. Dado que los defectos de organificación suelen deberse con mayor frecuencia a mutaciones en la peroxidasa tiroidea (TPO), el estudio molecular de los componentes del Sistema DUOX se lleva a cabo siempre en casos con hipotiroidismo congénito con elevados valores de TSH, niveles séricos bajos de hormonas tiroideas (T3 y T4) y elevados de tiroglobulina (TG), Test de Descarga de Perclorato positiva y ausencia de mutaciones en el gen de TPO. Estas características bioquímicas suelen acompañarse de una glándula tiroidea hiperplásica, con o sin bocio clínicamente manifiesto, o bien que la tiroides recién desarrolle el bocio en el período postnatal, especialmente cuando existe una demora en el diagnóstico y tratamiento con levotiroxina. Defectos genéticos en DUOX2 y DUOXA2 se asocian al hipotiroidismo congénito. En la glándula tiroides, la expresión de ARNm de DUOX2 y DUOXA2 es cinco veces mayor que la de DUOX1 y DUOXA1, respectivamente

(79,42). La inexistencia de mutaciones DUOX1, reportadas en el hipotiroidismo congénito, se debe aparentemente a la compensación ejercida por la DUOX2.Desde el año 2002, en el cual fue descripta la primera mutación en DUOX2, se han reportado 22 mutaciones diferentes. En ese mismo año, Moreno y colaboradores realizaron el “screening” de mutaciones en DUOX2 y DUOX1 en pacientes con hipotiroidismo congénito y descarga de perclorato positiva (> 10%) (43). En ese grupo ningún paciente presentó mutaciones en DUOX1. Doce pacientes tenían defecto parcial de organificación del yodo (PIOD) e hipotiroidismo congénito al momento de “screening”. Dentro del grupo evaluado, se identificaron tres pacientes heterocigotas para mutaciones sin sentido o con cambio en el marco de lectura en DUOX2 (Q686X, R701X, S965fsX29). Las proteínas truncas predichas perdían el dominio de homología con NOX2. Así, en contraste a otros defectos dishormonogénicos conocidos (ej. en TPO, TG, SLCA5, SLC26A4 o DEHAL1), los cuales son heredados de modo autosómico recesivo, un simple alelo DUOX2 defectivo puede causar haploinsuficiencia, resultando en una clase de hipotiroidismo congénito conocida como transiente. Ésta característica molecular implica que la proteína producida por una sola copia del gen normal no es suficiente para garantizar la función normal de la misma. Las manifestaciones clínicas en este caso suelen limitarse al período neonatal, cuando los niveles de requerimiento de síntesis de hormonas tiroideas son mayores (desde alrededor de 10µg T4/kg peso/día, que gradualmente decrece a valores de 2µg T4/kg peso/día luego del primer año de vida) (80). Los 12 pacientes evaluados con defecto parcial de organificación del yodo (PIOD) e hipotiroidismo congénito, al momento del “screening”, resultaron ser transientes durante el seguimiento. En coherencia con la manifestación transiente del hipotiroidismo congénito, los adultos heterocigotas, en estas familias, presentaban niveles séricos de TSH normales. Los mismos autores realizaron un estudio en un grupo de 45 pacientes con hipotiroidismo congénito severo y defecto de organificación del yodo completo (>90%), identificando mutaciones bialélicas en TPO en 44 pacientes y mutaciones bialélicas en DUOX2 en un único paciente. Este último era homocigota para la mutación sin sentido (R434X). Este paciente con hipotiroidismo severo y defecto completo de organificación, del 100%, refleja la incapacidad total para sintetizar hormonas tiroideas en ausencia de DUOX2.Varios estudios posteriores han ligado defectos bialélicos de DUOX2 a PIOD. Vigone y colaboradores estudiaron, en el año 2005, dos hermanos con hipotiroidismo congénito, PIOD e hipertirotropinemia permanente leve después del período neonatal (81). Los pacientes eran compuestos heterocigotas para una mutación sin sentido (p.R842X) y una mutación de cambio de sentido (p.R376W). La mutación p.R376W provoca la retención intracelular de la proteína, in vitro, por completo (82). Los pacientes portadores de la misma tuvieron pérdida completa de actividad DUOX2. Se podría pensar que DUOX1 estaría compensando parcialmente el defecto de DUOX2. Los padres heterocigotas tuvieron test de función tiroidea normal y un test de descarga de perclorato que reveló un daño ligero, pero permanente, en la eficiencia de la organificación del yodo.Nuestro grupo de investigación realizó un “screening” de mutaciones en TPO y DUOX2 a partir de 17 pacientes no relacionados con defecto de organificación de yodo (test de descarga de perclorato >30%) empleando la técnica de “Single Strand Conformational Polymorphism” (83). Dos pacientes con hipotiroidismo congénito permanente resultaron ser compuestos heterocigotas para mutaciones en DUOX2. Uno de ellos presentó una mutación de cambio de sentido (p.Q36H) y una deleción de 4 nucleótidos (c.2895-2898delGTTC), la cual causa un cambio de marco de lectura con la aparición de un codón de terminación prematuro de la traducción en Cap 38/12


la posición 994 (p.S965fsX29). La mutación Q36H suprime la función de DUOX2 cuando se expresa en un sistema heterólogo reconstituído con DUOXA2 (82), sugiriendo pérdida completa de la actividad DUOX2 en un paciente compuesto heterocigota. La mutación p.S965fsX29 fue identificada en uno de 200 cromosomas a partir de población sud americana. Esta mutación ha sido también identificada en otros pacientes no relacionados de Holanda (43) y presumiblemente de origen italiano. El segundo paciente fue un compuesto heterocigota con una deleción nucleotídica simple (c.1253delG), produciendo un cambio de marco de lectura en el codón 418 (p.G418fsX64) y una mutación en la posición -2 del sitio aceptor de “splicing” en el intrón 19 (g.IV19-2A>C), conduciendo a la eliminación del exón 20 de un minigen mutado expresado in vitro, lo cual resultó en un cambio de marco (p.R886YfsX2).Dados los casos reportados de Europa y Latinoamérica, parece que las lesiones bialélicas en DUOX2 producen hipotiroidismo congénito permanente, mientras que los portadores de mutaciones heterocigotas tienen hipotiroidismo congénito limitado al período neonatal. En contraste a tal correlación genotipo-fenotipo, están los resultados de un estudio reciente en pacientes japoneses (84). En una de las familias investigadas, cuatro hijos fueron compuestos heterocigotas para mutaciones de cambio de marco de lectura (p.L479SfsX2 y p.K628RfsX10) indicando pérdida completa de DUOX2. Tres de ellos tenían bajo nivel de hormonas tiroideas al nacimiento, leve agrandamiento de la glándula tiroides y TG sérica marcadamente elevada, en coherencia con el defecto de síntesis de hormonas tiroideas. Sin embargo, todos ellos tenían tests de función tiroidea normal cuando el tratamiento con L-T4 fue interrumpido a los 7-9 años de edad. Además, el cuarto hermano, un compuesto heterocigota para las dos mutaciones DUOX2 tenía solo hipertirotropinemia transiente al nacer, lo cual mejoró sin el suplemento de L-T4 a los dos meses de edad. Otros pacientes reportados por Maruo fueron compuestos heterocigotas para una mutación sin sentido y otra de cambio de sentido (p.K530X y p.E879K), o dos mutaciones de cambio de sentido (p.H678R y p.L1067S; p.A649E y p.R885Q). Sin embargo, el impacto funcional de estas mutaciones sobre la función de DUOX2 no ha sido evaluada in vitro. Es notable que todos los pacientes, con defectos bialélicos, tuvieron solo hipotiroidismo congénito transiente.Con el incremento del número de casos reportados, la correlación genotipo-fenotipo se ha dificultado notablemente. Defectos monoalélicos (forma dominante) de DUOX2 se han encontrado, tanto en pacientes con hipotiroidismo transiente, como en pacientes con un fenotipo moderado pero permanente. Mientras que defectos bialélicos (forma recesiva) pueden encontrarse en pacientes que presentan desde un fenotipo transiente a severo y permanente. Esto indicaría que la expresión de los defectos de DUOX2 se encontraría aparentemente influenciada por el contexto genético (DUOX1, por ej.) y podría, al menos en parte, depender del consumo de yodo. Dado que la yodinación por la TPO requiere yodo y H2O2, un aumento del yodo nutricional podría conducir a una mejor utilización de H2O2 provista por DUOX1. Cantidades excesivas de yodo en la dieta japonesa tradicional podrían explicar el hecho de que algunos pacientes japoneses, con pérdida completa de la actividad de DUOX2, solo desarrollen hipotiroidismo congénito transiente o hipertirotropinemia transiente (84). Este efecto mitigante de una sobrecarga de yodo sobre los defectos de DUOX2, se contrapone con el efecto conocido como “Efecto Wolf-Chaikoff”, mediante el cual puede detectarse un bloqueo de organificación fisiológico inducido por exceso de yodo (81).Mutaciones adicionales han sido identificadas en el gen DUOX2. Pfarr reportó el estudio de dos niños con hipotiroidismo congénito (85). El primer paciente presentaba una nueva inserción heterocigota en el gen DUOX2 (ins602G), la que resulta en cambio de marco de lectura y la aparición de un codón de terminación prematuro de la traducción en la posición 300. Análisis del ADNc mostró la pérdida del exón 5. Su madre eutiroidea fue portadora heterocigota para la mutación, mientras que su padre no portaba ninguna mutación en el gen DUOX2. El segundo paciente analizado resultó ser un compuesto heterocigota para las mutaciones g.602insG y p.D506N. El p.D506N estaba presente en uno de los alelos de la madre no afectada clínicamente y en un hermano, mientras que el padre eutiroideo fue heterocigota para la g.602insG. Tonacchera y colaboradores han identificado las mutaciones p.S911L y p.C1052Y en un paciente con hipotiroidismo congénito, con glándula tiroides eutópica y defecto de organificación parcial (86). Mutaciones de DUOX2 han sido identificadas también en casos de bocio eutiroideo familiar. Así, el grupo de Ohye ha reportado una paciente de unos veinte años de edad, de origen Japonés, que presentó un bocio eutiroideo progresivo, con una alta captación de yodo y descarga de perclorato positiva (73%). Dicha paciente desencadenó un hipotiroidismo con anticuerpos anti-tiroideos negativos en la quinta década de su vida. El estudio molecular reveló una mutación con cambio de sentido en forma homocigota (p.R1110Q), en una posición conservada del

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primer loop intracelular del dominio homólogo con NOX2. Estudios subsiguientes, en familiares de la paciente, evidenciaron la presencia de dicha mutación en otros miembros de la familia con bocio eutiroideo, como así también portadores con fenotipo normal (teniendo en cuenta que los mismos no fueron estudiados por “screening” neonatal, no se descarta que hayan presentado hipotiroidismo transiente). Este primer reporte de una mutación bialélica en DUOX2, identificada en un adulto, permite considerar la posibilidad de una aparición tardía del defecto en la organificación con bocio congénito eutiroideo (87). En síntesis, han sido reportadas hasta el momento 22 mutaciones en el gen de DUOX2, 11 de las cuales corresponden a mutaciones con cambio de sentido que se traducen en un cambio de aminoácido, 5 mutaciones sin sentido que generan proteínas truncas de menor tamaño, 1 mutación que afecta un sitio consenso de “splicing” y 5 mutaciones con cambio en el marco de lectura (Tabla 3).

Existen también antecedentes de pacientes, con defectos de organificación, en los cuales ni el gen de TPO ni DUOX2 presentaron mutaciones. Estudios en poblaciones de pacientes con estas características permitió identificar la primera mutación en el gen de DUOXA2 (44) en una paciente de origen chino que presentaba un fenotipo moderado pero permanente de hipotiroidismo congénito y PIOD (18% de descarga). Esta paciente presentó una mutación homocigota sin sentido (Y246X), que resultaba en una ausencia total de función de DUOXA2 in vitro. Los portadores de dicha mutación en forma heterocigota presentaron función tiroidea normal y screening neonatal negativo. Esto indicaría que defectos monoalélicos en DUOXA2 no presentarían haploinsuficiencia, en contraste con lo que ocurre con DUOX2 y el consecuente hipotiroidismo transiente o PIOD moderado que puede desencadenarse. Asímismo, considerando no sólo la presencia del sistema DUOXA1/DUOX1, un mecanismo adicional para mantener el suplemento de H2O2 en pacientes con deficiencia de DUOXA2 es la activación parcial de DUOX2 por DUOXA1, tal como fue demostrado in vitro (44). Se ha descripto un caso más complejo en el cual un paciente con hipotiroidismo congénito presentó una mutación con cambio de aminoácido (p.C189R) en el alelo materno de DUOXA2, causando la pérdida de función evidenciada in vitro, y una gran deleción comprometiendo DUOX2, DUOXA2 y DUOXA1 en el alelo paterno (88). Este paciente presentó una función tiroidea cercana a la normal, evidenciando un fenotipo leve de la patología, si bien presentaba un único alelo funcional de DUOXA1 (el materno).

Tabla 3. Mutaciones Sistema DUOX

Posición aminoacídica Referenciasp.Q36HG201fsp.R376Wp.R434Xp.G418fsX482p.L479fsX481D506Np.K530Xp.K628fsX638p.A649Ep.H678Rp.Q686Xp.R701Xp.R842XAfecta al splicingp.E879Kp.R885QS911Lp.S965fsX994C1052Y

Varela et al., 2006Pfarr et al., 2006Vignone et al., 2005Moreno et al., 2002Varela et al., 2006Maruo et al., 2008Pfarr et al., 2006Maruo et al., 2008Maruo et al., 2008Maruo et al., 2008Maruo et al., 2008Moreno et al., 2002Moreno et al., 2002Vigone et al., 2005Varela et al., 2006Maruo et al., 2008Maruo et al., 2008Tonacchera et al., 2009Moreno et al., 2002; Varela et. al, 2006Tonacchera et al., 2009

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Dado que los defectos en DUOXA2 resultan en una pérdida parcial de función del sistema generador de H2O2 - DUOX2, es posible anticipar que la expresividad de estos defectos se encontrará modificada por el suplemento nutricional de yodo.La incidencia de mutaciones en DUOX2 en el hipotiroidismo congénito no ha sido determinada. Dichas mutaciones son frecuentes en el subgrupo de pacientes con hipotiroidismo congénito con PIOD confirmado. En casos de sospecha de defectos de organificación no sindrómicos (tamaño normal a aumentado de la glándula tiroides con alta TG sérica), no confirmados por test de descarga de perclorato, debería comenzar a estudiarse el gen de TPO, especialmente si el hipotiroidismo congénito es profundo, y luego los genes de DUOX2 y DUOXA2.

NISDado su papel fundamental en la fisiología tiroidea, los cambios en la expresión y/o función del NIS, debidos a mutaciones en dicho gen, causan un amplio espectro de trastornos de la tiroides. El bocio congénito y el hipotiroidismo causados por la defectuosa capacidad de concentración de yoduro indicarían posibles alteraciones genéticas en el gen NIS. Los criterios de diagnóstico para el síndrome denominado «defecto del transporte de yoduro» (Iodide Transport Defect: ITD) propuestos por Stanbury y Dumont (1983) (89) son: (1) bocio con hipotiroidismo o hipotiroidismo compensado,(2) poca o ninguna absorción de yodo radioactivo en la glándula tiroides,(3) incapacidad de concentración de yoduro en glándulas salivales y en estómago. Otra clave para el diagnóstico deriva de la respuesta a la terapia con alta dosis de yoduro. Aunque los pacientes con ITD responden a la terapia de reemplazo con hormonas tiroideas, deben lograr también un rápido restablecimiento del estado eutiroideo frente a un aumento del aporte de yoduro (90). La edad en que los pacientes acuden a consulta por primera vez, así como la edad de presentación de bocio y / o hipotiroidismo, varía desde la etapa neonatal hasta la edad adulta. El bocio de los pacientes con ITD varía en tamaño y puede ser difuso o nodular. El examen histológico de la pieza quirúrgica de las glándulas tiroides revela frecuentemente marcadas anormalidades nucleares (90). Este defecto se presenta con un modo de herencia autosómico recesivo, por lo tanto, el ITD congénito se debe a mutaciones bialélicas homocigotas o compuestos heterocigotas en el gen NIS.En 55 individuos de 29 familias (91) se han identificado y caracterizado 13 defectos moleculares diferentes (Tabla 4) (92-104). Si bien todos ellos presentan una captación defectiva de yoduro, las características clínicas son heterogéneas, particularmente en relación a la presencia de bocio y a la profundidad del hipotiroidismo.

Tabla 4. Mutaciones en el gen de NIS.

Exón/Intrón Posición nucleotídica Posición aminoacídica ReferenciasExón 1Exón 1Exón 2Del: exón 3- intrón 7Exón 6Exón 6Exón 7Exón 9

Exón 10Exón 11Exón 13Exón 13

c.176T>Ac.277G>Cc.371G>Ag.2541-8732delc.799 C>Gc.816 C>Ac. 859-864delc.1060 A>C

c.1183 G>Ac.1315-1329delc.1593 C>Gc.1628 G>A

p.V59Ep.G93Rp.R124Hp.M142-Q323delp.Q267Ep.C272Xp.V287-G288 delp.T354P

p.G395Rp.A439-P443delp.Y531X; p.Ser509ArgfsX7p.G543E

Fujiwara et al., 2000Kosugi et al., 1998aSzinnai et al., 2006Kosugi et al.,2002Pohlenz et al., 1998Pohlenz et al.,1997Montanelli et al., 2009Fujiwara et al.,1997;Fujiwara et al.,1998;Kosugi et al.1998b;Matsuda et al.,1997;Tatsumi et al.,1998Kosugi et al., 1999Tonacchera et al.,2003Pohlenz et al.,1998Kosugi et al., 1998a

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Con el fin de ejemplificar la existencia de manifestaciones clínicas variables, y de abordar el posible vínculo entre fenotipo y genotipo, se reseñan a continuación algunos casos analizados.Nueve meses después de que el gen fuera clonado, se describió el primer cambio de sentido homocigota identificado en un paciente japonés, que presentó hipotiroidismo congénito causado por defecto en el transporte de yoduro. El diagnóstico se basó en la falta de concentración de yodo radiactivo en glándula salival y en las respuestas clínica y bioquímica al tratamiento con yoduro de potasio. El bocio leve, con múltiples nódulos, se había desarrollado a los 8 años. La secuenciación puso de manifiesto una transversión A>C en la posición 1060 del ADNc (c.1060 A>C), responsable de la sustitución p.T354P. La transfección de células HEK-293 con el ADNc mutado reveló pérdida total de la actividad transportadora de yoduro, lo que confirmó el papel patogénico de esta mutación. Conforme a la estructura actualmente aceptada de la proteína, el residuo 354 se encontraría en el TMS IX (98). Casi simultáneamente, se identificó la misma mutación homocigota en otro paciente japonés que, en cambio, presentaba un gran bocio y resultaba eutiroideo mientras consumía cantidades relativamente altas de yodo (100). La evaluación de la tasa de expresión del gen permitió observar que los niveles de ARNm eran notablemente superiores en la glándula tiroides del paciente respecto al tejido tiroideo normal. Esta información sugirió que existe una regulación de la expresión de NIS mediada por el mismo yoduro (100). Posteriormente se demostró que el nivel de proteína NIS en tiroides se encontraba significativamente aumentado, y que dicha proteína mutante estaba sobreexpresada en la membrana basolateral de tirocitos, confirmando que la mutación p.T354P no afecta a la correcta localización del transportador, sino al transporte mismo (100).Recientemente, Carrasco y su grupo de trabajo demostraron que la falta de actividad de p.T354P no es debida a un cambio estructural en la hélice, inducida por la incorporación de una prolina, sino a la pérdida de un grupo hidroxilo en la posición 354. Se demostró que los residuos β-hidroxilados Thr-351, Ser-353, Thr-354, Ser-356 y Thr-357 así como la Asn-360 y Asp-369, juegan un papel clave en la unión y/o translocación del Na+ (105). A pesar de que en varios pacientes se detectó la misma mutación p.T354P en forma homocigota, hay una marcada heterogeneidad en el cuadro clínico, especialmente en relación a la presencia de bocio e hipotiroidismo. Se observó en algunos casos ausencia de bocio, aunque en la mayoría se identificó un bocio difuso. Algunos pacientes fueron eutiroideos, mientras que otros presentaban hipotiroidismo severo observado en la primera infancia. La diferencia a nivel de la regulación de la expresión de NIS en la tiroides puede estar relacionada con la heterogeneidad clínica. Además, la ingesta de yodo influye en la función de la tiroides en los pacientes con ITD. Durante la infancia el cuadro clínico podría depender del origen de la leche, dado que la leche materna contiene mayor cantidad de yoduro y es aún más evidente en pacientes japoneses que consumen gran cantidad de este halógeno, especialmente de algas marinas (106).De los pacientes analizados por Kosugi, S. (100), aquellos que fueron alimentados con leche artificial desarrollaron cretinismo antes del año de edad. Sólo unos pocos presentaron bocio al nacer o poco después del nacimiento, mientras que el bocio generalmente se presentó en etapas posteriores. La importancia del estudio detallado, acerca de la fisiopatología de esta sustitución, reside en su frecuencia de aparición, dado que es la principal causante de ITD, principalmente en pacientes japoneses (93).En el año 1998, Kosugi describió por primera vez dos mutaciones. Una de ellas con presencia alélica heterocigota acompañada de la ya descripta p.T354P. La nueva alteración se debió a la transversión G>C en la posición c.277 del exón 1, responsable del reemplazo de la correcta glicina por arginina en la posición aminoacídica 93 (p.G93R) y se localizaría en el TMS III. La segunda mutación fue identificada en dos hermanos y se trató de una transición homocigota G>A en la posición c.1628, con presencia alélica homocigota responsable de la sustitución p.G543E que se localizaría en el TMS XIII. Si bien la expresión de todas ellas mostraron una captación mínima de yoduro en células COS-7 transfectadas, el primer paciente fue diagnosticado con un bocio difuso a los 16 años, mientras que los pacientes homocigotas para p.G543E mostraron hipotiroidismo severo desde la primera infancia (100). Posteriormente se determinó que, a diferencia de la proteína con la mutación p.T354P, que es normalmente sintetizada y conducida a la membrana plasmática, aquella con la alteración p.G543E logra madurar sólo parcialmente, y no está destinada correctamente a la superficie celular, siendo entonces retenida intracelularmente. Estos hallazgos indican que el residuo Gly543 desempeñaría un rol importante en la maduración y en el tráfico de NIS (107). Otro caso identificado fue el de un paciente con un primer diagnóstico, al nacimiento, de hipotiroidismo congénito debido a atireosis, dado que la glándula no podía ser visualizada. A los 12 años de edad desarrolló bocio nodular y en presencia de una disminuida captación de yodo radiactivo, tanto en glándula tiroidea como salival, el diagnóstico Cap 38/16


se modificó a ITD (96). El análisis molecular permitió distinguir dos mutaciones en el gen NIS: una transversión C>G en la posición c.799 del exón 6, que causa la sustitución p.Q267E, y una segunda transversión C>G en la posición c.1593 correspondiendo al exón 13, generadora de un codón stop prematuro (Y531X), como así también de un sitio críptico de “splicing” 3’ en el mismo exón 13, que causa una deleción de 67 nucleótidos, conduciendo a un cambio en el marco de lectura y stop prematuro (p.Ser509ArgfsX7 (F-515X) (96) (Fig.1). p.Q267E se encontraría en el loop intracelular que separa los TMS VII y VIII (108). Minuciosos análisis moleculares, llevados a cabo por Carrasco y su grupo de trabajo, pusieron de manifiesto que p.Q267E disminuye el transporte de yoduro y la actividad, a causa de la reducción del número de recambio de moléculas (Vmax), sin afectar la expresión ni el tráfico a la membrana plasmática, y sin alterar la afinidad (Km) de NIS por I- ni por Na+ (108). La segunda mutación identificada se presenta con bases moleculares singulares, dado que si bien aquellas que afectan sitios de “splicing” representan aproximadamente el 15% de todas las mutaciones puntuales, que causan enfermedades en humanos, más de dos tercios de éstas afectan la zona 5’ de “splicing”. El uso preferencial de un sitio críptico por sobre el auténtico sitio consenso es muy poco común, sobre todo cuando se trata de la secuencia consenso AG del sitio de empalme 3’. El clonado y expresión del ADNc con la transversión c.1593C>G reveló, en siete de ocho clones, la deleción de 67 pb, que provoca un corrimiento en el marco de lectura y un stop prematuro en el codón 515. La proteína resultante carece de los 129 aminoácidos carboxiterminales. El clon restante no expresó la deleción de 67 pb. Esto indicaría que el sitio críptico 3’ no se utilizaría exclusivamente (96).

La familia más numerosa analizada incluyó a 10 miembros, en muchos de los cuales se identificó una transición homocigota en el exón 10 (c.1183 G>A) responsable de la sustitución p.G395R. Este cambio provoca pérdida de la actividad captadora de yoduro demostrada mediante ensayos de transfección en células COS-7. Los análisis por inmunofluorescencia e inmunohistoquímica sugieren que p.G395R se sintetiza correctamente y es dirigida a la membrana plasmática (103). Estos hallazgos fueron confirmados por Dohan y colaboradores, quienes demostraron que la presencia de un residuo sin carga con una cadena lateral pequeña, en la posición 395, es un requisito para la correcta función de NIS. El hecho de que el recambio se viera más afectado por la sustitución, que la afinidad por el sustrato, sugirió que la reacción de acoplamiento Na+ / I- se viera obstaculizada por un cambio conformacional, en el que participaría el TMS X (109). Estos pacientes no desarrollaron bocio, pero fueron severamente hipotiroideos. Esto podría ser una característica específica de p.G395R, pero también podría deberse a que fueron diagnosticados tempranamente y comenzaron el tratamiento con T4 entre los 3-14 días de vida (103). Otro caso bien caracterizado fue el de dos hermanos españoles. El primero de ellos desarrolló bocio desde el

Figura 1: Esquema comparativo del splicing nativo (A) y críptico (B). Adaptado del trabajo de Pohlenz, J. 1998. Las posiciones nucleotídicas se consideran según la numeración del ADNc. Las líneas verticales indican correlación entre las secuencias analizadas y las consenso (NYAGG / A) de splicing 3’ y (YNYURAC) puntos de ramificación. Se indica la cantidad de nucleótidos que separa la zona de ramificación de los sitios aceptores. Y: pirimidina. R: purina. N: cualquier nucleótido. U: uracilo.

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nacimiento y, si bien fue tratado hormonalmente, presentó un retraso mental severo, probablemente debido al retraso en el inicio y/o insuficiencia en el tratamiento. Su hermano fue diagnosticado al nacer y se instauró un tratamiento precoz, no desarrollando, entonces, bocio ni retraso mental. La captación de yodo radiactivo en la glándula tiroides y en las salivales fue baja en ambos pacientes.En análisis molecular permitió identificar, en ambos hermanos, la existencia de una deleción de 6192 pb junto con una inserción invertida de 431 pb. La deleción está comprendida entre el nucleótido 19 del exón 3 hasta 162 nucleótidos previos al extemo 3’ del intrón 7, mientras que la inserción corresponde a los primeros 135 pb del exón 5 junto a los primeros 296 pb del intrón 5 dispuestos de modo invertido (95) (Fig.2).El resultado es una proteína carente de 182 aminoácidos, en la que el fragmento no incluido abarca desde el residuo Met-142, que se ubicaría en el TMS IV, hasta el residuo Gln-323 del cuarto loop extracelular (p.M142-Q323del).Esta proteína mutante no presentó actividad de captación de yoduro en células COS-7 transfectadas, confirmando que es la causa directa de ITD. Por otra parte, se demostró mediante tinción inmunohistoquímica, que la proteína NIS mutante es sintetizada pero se acumula en el citoplasma (95).

El último caso descripto fue en 2009, y corresponde al de una niña en la que el hipotiroidismo congénito fue detectado por “screening” neonatal. En este caso, se inició la terapia de reemplazo con LT4 inmediatamente después de la primera evaluación, a los 20 días del nacimiento. El desarrollo físico y mental fue normal, aunque a los 14 años desarrolló bocio nodular. La secuenciación directa del ADN genómico reveló la presencia de una deleción homocigota de seis nucleótidos (c.859-864delGTCGGC) en el exón 7. La supresión de estos nucleótidos se corresponde con la pérdida de los aminoácidos 287 y 288 (p.V287-G288del) ubicados al comienzo del TMS VIII. Esta proteína mutante fue incapaz de concentrar yoduro en el ensayo de transfección de células COS-7 (91).

PendrinaEl Síndrome de Pendred fue descripto por primera vez en 1896 como una patología que combinaba sordera y bocio

(110), pero el fenotipo preciso se ha detallado en los últimos años (111-113). Se caracteriza por sordera neurosensorial, bocio y defecto parcial en la organificación del yodo. Esta última característica fue demostrada por Morgans y Trotter en 1958 (114). El riñón no se vería afectado, posiblemente por la presencia de Pendrina como un transportador redundante en él (115). Se presenta con un modo de herencia autosómico recesivo y las manifestaciones suelen ser tempranas, casi siempre en la infancia. Es la forma más común de sordera sindrómica y se calcula una incidencia de 1:10000 individuos (116). Las causas genéticas son mutaciones homocigotas o compuestos heterocigotas en el gen SLC26A4 causantes de la alteración en la conducción de aniones. En el tirocito provocan, entonces, el bocio característico del síndrome, aunque éste puede pasar desapercibido hasta la adolescencia o vida adulta. Si bien la condición hipotiroidea es variable, es casi inevitable la presencia de anormalidades estructurales de la cóclea y agrandamiento del acueducto vestibular (EVA: enlarged vestibular aqueduct) (117). Debido a que el diagnóstico clínico preciso está obstaculizado por la presencia de fenotipos variables, y a que el resultado positivo del test de descarga de perclorato no es específico de este Síndrome, los análisis genéticos y moleculares son importantes en la identificación de esta enfermedad.

Figura 2: Representación esquemática del evento de inserción/deleción basada en el trabajo de Kosugi, S. 2002

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Estos estudios han conducido a la identificación de más de 160 mutaciones en el gen SLC26A4 (http://www.healtcare.uiowa.edu/laboratorios/pendredandbor/slcMutations.htm). En la Tabla 5 se muestra la mayor parte de las mutaciones identificadas (118-151). Éstas se distribuyen a lo largo de todo el gen, por lo que deben secuenciarse los 21 exones junto con las secuencias intrónicas adyacentes con el fin de identificar alelos mutantes. Las alteraciones identificadas incluyen mutaciones sin sentido, con cambio de sentido, alteración en los sitios de “splicing” como así también grandes y pequeñas deleciones con y sin corrimiento en el marco de lectura.

Tabla 5. Mutaciones en el gen SLC26A4. Cambio nucleotídico Cambio aminoacídico Exón/Intrón Referenciasg.IVS 1 -2 A>G

c.2T>Cc.28C>Ac.68 C>Ac.70C>Gc.84C>A

c.85G>C

c.127C>Ac.149T>Gg.IVS 2 -1 G>Ag.IVS2-IVS3 del 4kBc.170C>Ac.230A>Tc.233A>Gc.269C>Tc.304G>Ac.311C>Tc.314A>Gc.317C>Ac.349 C>Tc.367C>Tc.395C>Tc.398T>Ac.409T>Cc.412G>T

25bp del + 5 bp insc.419C>Ag.IVS 4 +7 A>Gc.416G>C

c.425C>Gc.439A>Gc.497G>Ac.565G>Tc.580C>T g.IVS 5 -1 G>A

Sitio de splicing

p.M1Tp.P10Tp.S23Xp.R24G

p.S28Rp.E29Q

p.R43Sp.L50RSitio de splicing

p.S57Xp.K77Ip.Y78Cp.S90Lp.G102Rp.A104Vp.Y105Cp.A106Dp.L117Fp.P123Sp.T132Ip.S133Tp.S137Pp.V138F

p.V138Xp.P140HSitio de splicingp.G139A

p.P142Rp.M147Vp.S166Np.A189Sp.T193ISitio de splicing

Intron 1

Exón 2Exón 2Exón 2Exón 2Exón 2

Exón 2

Exón 2Exón 2Intrón 2Intrón 2-Intrón3Exón 3Exón 3Exón 3Exón 3Exón 4Exón 4Exón 4Exón 4Exón 4Exón 4Exón 4Exón 4Exón 4Exón 4

Exón 4Exón 5Intrón 4Exón 5

Exón 5Exón 5Exón 5Exón 5Exón 5Intrón 5

Lopez-Bigas, N. , 2002, Prasad, S. 2004, Pryor, S.P. 2005Prasad, S. 2004Prasad S, comunicación personalBlons, H. 2004Prasad, S. 2004Fugazzola, L. 2002, Park, H.J. 2003,Park, H.J. 2005Campbell, C. 2001, Prasad, S. 2004, Blons, H. 2004. Prasad S, comunicación personalPrasad S, comunicación personalGonzalez Trevino, O. 2001Park, H.J. 2003Park, H.J. 2003Wu, C.C. 2005Prasad, S. 2004, Blons, H. 2004Park, H.J. 2003Taylor, J.P. 2002Prasad, S. 2004Campbell, C. 2001Campbell, C. 2001Reardon, W. 2000Tsukamoto, K. 2003Lopez-Bigas, N. 2002Fugazzola, L. 2002, Borck, G. 2003Blons, H. 2004Van Hauwe, P. 1998, Coyle, B. 1998, Gonzalez Trevino, O. 2001, Campbell, C. 2001, Borck, G. 2003, Blons, H. 2004, Pryor, S.P. 2005Gonzalez Trevino, O. 2001Pera, A. 2008bLopez-Bigas, N. 1999Van Hauwe, P. 1998, Stinckens, C. 2001, Prasad, S. 2004Park, H.J. 2005Park, H.J. 2005, Tsukamoto, K. 2003Park, H.J. 2005Prasad S, comunicación personalAdato, A. 2000, Blons, H. 2004Tsukamoto, K. 2003

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c.626G>T

c.697G>Cc.707T>C

c.716T>Ac.754T>Cg.IVS 6 -2 A>Gc.811G>Cc.898A>Cg.IVS 7 -2 A>G

g.IVS 7 +1 G>Ac.970 A>Tg.IVS 8 +1 G>A

g.IVS 8 +4 A>Gg.IVS 8 -2 A>Gc.1003T>C

c.1061T>Cc.1105A>Gc.1115C>T

g.IVS9+3A>Gc.1151A>G

c.1172G>Ac.1174A>T

c.1181delTCTc.1226G>Cc.1226G>A

c.1229C>T

c.1229C>Tc.1231G>Cc.1238A>Cc.1246A>C

p.G209V

p.V233Lp.L236P

p.V239Dp.S252PSitio de splicingp.D271Hp.I300LSitio de splicing

Sitio de splicingp.N324TSitio de splicing

Sitio de splicingSitio de splicingp.F335L

p.F354Sp.K369Ep.A372V

p.E384G

p.S391Np.N392Y

p.S394delp.R409Pp.R409H

p.T410M

p.T410Rp.A411Pp.Q413Pp.T416P

Exón 6

Exón 6Exón 6

Exón 6Exón 6Intrón 6Exón 7Exón 7Intrón 7

Intrón 7Exón 8Intrón 8

Intrón 8Intrón 8Exón 9


Intrón 9Exón 10

Exón 10Exón 10


Exón 10


Usami, S. 1999, Campbell, C. 2001, Van Hauwe, P. 1998, Reardon, W. 2000, Blons, H. 2004, Pryor, S.P. 2005Hu, H. 2007Van Hauwe, P. 1998, Coyle, B. 1998, Reardon, W. 2000, Campbell, C. 2001, Stinckens, C. 2001, Prasad, S. 2004,Blons, H. 2004, Pryor, S.P. 2005Park, H.J. 2003Park, H.J. 2005, Hu, H. 2007Coucke, P.J. 1999Van Hauwe, P. 1998, Prasad, S. 2004Prasad S, comunicación personalCoucke, P.J. 1999, Park, H.J. 2005, Tsukamoto, K. 2003, Hu, H. 2007, Wu, C.C.2005, Park, H.J. 2005Van Hauwe, P. 1998 Prasad, S. 2004Coyle, B. 1998, Bogazzi, F. 2000, Campbell, C. 2001, Fugazzola, L. 2002, Blons, H. 2004, Tsukamoto, K. 2003, Pryor, S.P. 2005Park, H.J. 2003Yong, A.M. 2001, Prasad, S. 2004Campbell, C. 2001, Prasad, S. 2004, Pryor, S.P. 2005Blons, H. 2004, Pera, A. 2008aUsami, S. 1999, Tsukamoto, K. 2003Usami, S. 1999, Tsukamoto, K. 2003, Wu, C.C.2005Park, H.J. 2005Coyle, B. 1998, Cremers, W.R. 1998, Prasad, S. 2004, Borck, G. 2003, Blons, H. 2004, Pryor, S.P. 2005Blons, H. 2004Hu, H. 2007, Tsukamoto, K. 2003, Park, H.J. 2005Yong, A.M. 2001Park, H.J. 2003Coyle, B. 1998, Van Hauwe, P. 1998, Fugazzola, L. 2002, Prasad, S. 2004, Blons, H. 2004, Gillam, M.P. 2005Coyle, B. 1998, Kitamura, K. 2000, Reardon, W. 2000, Lopez-Bigas, N. 2002, Fugazzola, L. 2002, Blons, H. 2004, Wu, C.C.2005, Park, H.J. 2005Wu, C.C.2005Gonzalez Trevino, O. 2001Pera, A., 2008bCoyle, B. 1998, Van Hauwe, P. 1998, Reardon, W. 2000, Campbell, C. 2001, Stinckens, C. 2001, Prasad, S. 2004, Blons, H. 2004

Cap 38/20


c.1262A>Gc.1271G>Ac.1284_1286delTGCc.1334T>G

c.1337 A>Gc.1343C>Ac.1343C>Tc.1363A>Tc.1371C>Ac.1394T>Gc.1439T>Ac.1454C>Gc.1468A>Cc.1489G>A

c.1489G>Cc.1523C>Ac.1540C>Ac.1541A>Gg.IVS 13 +9 C>Gc.1588T>C

c.1589A>Cg.IVS 14 +1 G>Ag.IVS 14 -7 A>Gg.IVS 14 -1 G>Ac.1655G>Tc.1666T>Cc.1667A>Gc.1694G>A

c.1708G>Ac.1751C>A1790T>C

c.1826 T>Gc.1829C>Ac.1870C>Gc.1958T>Cc.1970G>Ac.1975G>CC.1997C>Tc.2000T>Gc.2015G>Ac.2027T>Ac.2048T>Cc.2059G>T

p.Q421Rp.G424Dp.A429delp.L445W

p.Q446Rp.S448Xp.S448Lp.I455Fp.N457Kp.L465Wp.V480Dp.T485Rp.I490Lp.G497S

p.G497Rp.T508Np.Q514Kp.Q514RSitio de splicingp.Y530H

p.Y530SSitio de splicingSitio de splicingSitio de splicingp.S552Ip.Y556Hp.Y556Cp.C565Y

p.V570Ip.A584Ep.L597S

p.V609Gp.S610Xp.L624Vp.V653Ap.S657Np.V659Lp.S666Fp.F667Cp.G672Ep.L676Qp.F683Sp.D687Y


Exón 11Exón 12Exón 12Exón 12Exón 12Exón 12Exón 13Exón 13Exón 13Exón 13

Exón 13Exón 13Exón 13Exón 13Intrón 13Exón 14

Exón 14Intrón 14Intrón 14Intrón 14Exón 15Exón 15Exón 15Exón 15


Exón 17Exón 17Exón 17Exón 17Exón 17Exón 17Exón 17Exón 17Exón 17Exón 17Exón 18Exón 18

Prasad, S. 2004Pera, A. 2008bCoyle, B. 1998, Prasad, S. 2004Cremers, W.R. 1998, Van Hauwe, P. 1998, Coucke, P.J. 1999, Reardon, W. 2000, Masmoudi, S. 2000, Lopez-Bigas, N. 2002, Prasad, S. 2004, Blons, H. 2004, Pryor, S.P. 2005Reardon, W. 2000Hu, H. 2007Wu, C.C.2005, Hu, H. 2007Park, H.J. 2003Park, H.J. 2003Bogazzi, F. 2004Campbell, C. 2001Pera, A. 2008bLi, X.C. 1998Li, X.C. 1998, Prasad, S. 2004, Park, H.J. 2005Bogazzi, F 2004Bogazzi, F. 2000Pera, A. 2008bPryor, S.P. 2005Yong, A.M. 2001Coyle, B. 1998, Coucke, P.J. 1999, Campbell, C. 2001, Blons, H. 2004, Pryor, S.P. 2005Pryor, S.P. 2005Fugazzola, L. 2002, Blons, H. 2004Park, H.J. 2005Park, H.J. 2005Blons, H. 2004Lopez-Bigas, N. 2002Coyle, B. 1998Van Hauwe, P. 1998, Prasad, S. 2004, Tsukamoto, K. 2003, Pryor, S.P. 2005Prasad S, comunicación personalPrasad S, comunicación personalCampbell, C. 2001, Fugazzola, L. 2002, Blons, H. 2004, Pryor, S.P. 2005, Pera, A. 2008aPryor, S.P. 2005Tsukamoto, K. 2003Prasad S, comunicación personalCampbell, C. 2001Tsukamoto, K. 2003Hu, H. 2007Tsukamoto, K. 2003Everett, L.A. 1997, Pera, A. 2008bCoyle, B. 1998, Campbell, C. 2001Park, H.J. 2005Prasad, S. 2004Prasad S, comunicación personal

Cap 38/21


La prevalencia de algunas mutaciones varía entre los diferentes grupos étnicos (123). Por ejemplo, las sustituciones p.L236P, p.T416P y g.IVS8+1G>A ocurren con relativa frecuencia en las poblaciones europeas (112), mientras que en el 53 % de los pacientes japoneses se ha identificado la sustitución p.H723R, sugiriendo la existencia de un posible efecto fundador (123,116).

Los primeros estudios funcionales de las proteínas mutantes (p.L236P, p.T416P, p.E384G), identificadas en pa-cientes con Síndrome de Pendred, demostraron que eran incapaces de transportar yoduro (127,143,152-154), mientras que aquellas identificadas en individuos con sordera (EVA), pero sin bocio, fueron capaces de mediar en parte el transporte de yoduro (155). Estas observaciones han llevado a pensar que la ausencia de bocio en los pacientes con EVA puede ser debida a la actividad residual de ciertas Pendrinas mutantes (155), pero la detección de mutaciones comunes, identificadas posteriormente en pacientes con Síndrome de Pendred y EVA, no confirman esta hipótesis (116, 127).Recientemente se han caracterizado otras alteraciones identificadas en pacientes con EVA y con Síndrome de Pendred. Cuatro de las mutaciones analizadas, (p.E29Q, p.R409H, p.G424D y p.T485R) mostraron una reduc-ción significativa en el transporte de cloruro/yoduro, mientras que p.P140H, p.Q413P, p.Q514K y p.D724G care-cían completamente de actividad transportadora (132). A diferencia del gen NIS, solo un pequeño porcentaje de las variantes identificadas en el gen SLC26A4 ha sido caracterizado funcionalmente. El efecto patógeno de muchas de éstas se ha fundado principalmente sobre la base de dos criterios: la conservación evolutiva de los residuos afectados y su presencia en una cohorte control. Sin embargo, las sustituciones p.E29Q (112, 113, 120) y p.D724G (120) si bien tienen repercusiones negativas sobre el transporte mediado por SLC26A4, se han identificado recientemente en individuos sanos que formaban parte de un estudio poblacional que incluyó 214 individuos (141). Aunque es posible que los controles porten estas varian-tes en heterocigosis, es recomendable evaluar el efecto nocivo de las variantes identificadas en pacientes, aún se presenten también en individuos control (141).

DEHAL 1 La yodotirosina deiodinasa es una enzima presente en la tiroides que deyodina mono- y di-yodotirosinas (MIT, DIT) y recicla yodo para la síntesis eficiente de las hormonas tiroideas. La falta de actividad de esta enzima no interfiere directamente con la síntesis de hormonas tiroideas o con su secreción. Sin embargo, cuando esto sucede, pasan a circulación yodotirosinas y hay pérdida de ellas en la orina. La principal consecuencia de este defecto es, por lo tanto, una gran pérdida de yodo, lo que intensifica la estimulación de la tiroides, hiperplasia, bocio y aumento de la síntesis y pérdida de los precursores de las hormonas tiroideas. El análisis de la expresión génica del tejido tiroideo, y la utilización de un método computacional de sustracción, permi-tió evidenciar por primera vez la expresión preferencial en la tiroides del ARNm de DEHAL1 (Moreno et al., 2003).

c.2080T>Cc.2139T>Gc.2162C>T

c.2168A>G

c.2171G>Ac.2170G>Ac.2182-2183insGc.2217G>Ac.2219G>Tc.2326C>T

p.S694Pp.I713Mp.T721M

p.H723R

p.D724Gp.D724Np.Y728Xp.G740Sp.G740Vp.R776C


Exón 19

Exón 19Exón 19Exón 19Exón 19Exón 19Exón 21

Blons, H. 2004Prasad S, comunicación personalUsami, S. 1999, Lopez-Bigas, N. 2002, Tsukamoto, K. 2003, Park, H.J. 2005, Blons, H. 2004Van Hauwe, P. 1998, Usami, S. 1999, Kitamura, K. 2000, Yong, A.M. 2001, Sato, E. 2001, Ishinaga, H. 2002, Prasad, S. 2004, Tsukamoto, K. 2003, Wu, C.C.2005, Park, H.J. 2005, Iwasaki, S. 2006Prasad, S. 2004 , Pera, A. 2008bBlons, H. 2004Fugazzola, L. 2000Prasad, S. 2004 , Pera, A. 2008bPera, A. 2008bPryor, S.P. 2005, Pfarr, N. 2006

Cap 38/22


El primer caso de hipotiroidismo, con demostración formal de incremento de yodotirosinas en plasma, fue des-cripto en la década de 1950 por Stanbury. El paciente era de Holanda, tenía 27 años y presentaba un progresivo crecimiento de la glándula tiroides desde el nacimiento. Los niveles séricos de tiroxina y tri-iodotironina eran bajos. Fue la primera vez en que se detectó secreción de MIT y DIT en su sangre y orina (Stanbury et al., 1955). El paciente no tenía retraso mental, debido a un tratamiento temprano con tiroides disecada.Desde ese momento hasta nuestros días, más de 25 pedigrees familiares han sido descriptos con deficiencia en la iodotirosina deiodinasa. Los fenotipos reportados tienen espectro amplio de severidad, que va desde el hipoti-roidismo con bocio intenso con retraso mental (“cretinismo”) hasta bocio eutiroideo simple. Los casos severos, usualmente se manifestaron temprano en la vida, mientras que los más leves fueron diagnosticados principalmen-te alrededor de la pubertad o en la edad adulta. Bocios, presentes invariablemente, fueron descriptos como difusos y blandos en las edades más tempranas, haciéndose firmes y nodulares en preadolescentes y adultos. Los bocios frecuentemente causaban la compresión del cuello, conduciendo a la remoción quirúrgica total o parcial. Cuando no eran removidos, el tratamiento con tiroides disecada o con gotas de Lugol (yodo) causaba, según reportes, la reducción de los mismos.La mayoría de los casos familiares reportados con defecto de yodotirosina deyodinasa sugiere fuertemente un patrón de herencia recesivo de la enfermedad, incluyendo sin embargo la posibilidad de características más leves (pequeños bocios) en heterocigotas. Variaciones en la expresión clínica de individuos heterocigotas podría depen-der del “uptake” individual de yodo. Moreno y colaboradores publicaron en el año 2008 las primeras mutaciones descriptas en el gen DEHAL1 huma-no presentes en tres pacientes homocigotas (Moreno, 2008). En una familia endogámica de origen turco, una paciente de sexo femenino, nacida en Alemania, resultó ser homocigota para una sustitución de citosina por timina en el exón 2 (c.301C>T), con el consecuente cambio de arginina por triptófano (p.R101W). La mutación afectó a un dominio catalítico nitroreductasa de la proteína DE-HAL1 en medio de dos sitios de unión a flavina mononucleótido (FMN), y se comprobó que inactiva la capacidad de deyodinar mono- y di-iodotirosinas. El “screening” neonatal de la paciente fue negativo. En el segundo año de vida, y con un retraso del desarrollo, se le diagnóstico hipotiroidismo. A pesar del tratamiento temprano y estricto control hormonal durante la infancia, la paciente tuvo retraso psicomotor con bajo IQ y bajo rendimiento escolar (Tabla 6).Dos hermanas pertenecientes a una familia endogámica de origen escocés resultaron homocigotas para una deleción de tres pares de bases en el exón 2 [c.315delCAT], que produjo el reemplazo de fenilalanina en el codón 105 e isoleucina en el codón 106 por leucina. La mutación se localiza en el dominio de nitroreductasa cerca de un sitio putativo de unión a FMN, y se comprobó que inactiva la capacidad de deyodinar mono- y di-iodotirosinas. Se les diagnóstico a las dos hermanas hipotiroidismo durante la infancia y no se les había realizado el “screening” neonatal de hipotiroidismo congénito. Ambas pacientes desarrollaron bocio y una de ellas tuvo un retraso mental (Tabla 6).En una familia de origen marroquí, en un varón nacido en Francia cuyos padres eran primos hermanos, se en-contró que era homocigota para una sustitución de timina por citosina (c.347T>C), que produjo un cambio del aminoácido isoleucina por treonina (p.I116T). La mutación se localiza en el dominio de nitroreductasa fuera de un sitio de unión a FMN y se comprobó que disminuye la actividad enzimática. La abundancia de la enzima es menor a lo normal y se debería a una degradación de la proteína. El “screening” neonatal había sido negativo. A los 8 años de edad se le diagnosticó hipotiroidismo severo no autoinmune (Tabla 6).Las tres mutaciones resultaron patogénicas, dado que redujeron la actividad enzimática de DEHAL1 para de-yodinar mono- y di-iodotirosinas. Todos los pacientes tenían bocio severo e hipotiroidismo, evidenciado en la infancia o la niñez.El fenotipo de estos pacientes recapitula bastante bien el clásico defecto de yodotirosina deyodinasa descripto en el siglo 20. En algunos casos el “screening” neonatal resultó negativo. Esto sugiere que la bioquímica y la manifestación clínica de la enfermedad pueden no estar presentes en el comienzo de la vida. La edad en que los pacientes mostraron la manifestación clínica fue muy variable, desde 18 meses a 8 años. Los factores por los cuales se da esta variabilidad pueden deberse a las diferencias ambientales en la ingesta de yodo y a la actividad residual en algunos mutantes DEHAL1. Los mecanismos patogénicos de las mutaciones en DEHAL1 pueden ser también diferentes (Moreno et al., 2008).

Cap 38/23


En el año 2008, Afink publicó un estudio molecular de DEHAL1 en una familia endogámica descendiente de belgas-marroquíes. Se identificó una mutación con cambio de sentido en el exón 4 del gen DEHAL1, que produjo un cambio de guanina por adenina (c.658G>A) y resultó en una proteína mutante con un cambio de alanina por treonina (p.A220T). La proteína mutada también demostró ser inactiva in vitro y además se degradó rápidamente (Afink, 2008).

Una mutación bialélica fue identificada en la paciente y en una de sus hijas, indicando que el padre (no disponible para los estudios) debería ser portador de la mutación y sugiriendo la existencia de un alto grado de consanguinei-dad en esta familia. Ambas pacientes presentaron severo hipotiroidismo y bocio. La madre tenía retraso mental. Su hija fue diagnosticada con hipotiroidismo en la época neonatal y fue tratada desde recién nacida. Utilizando cromatografía líquida de alta performance (HPLC) y espectrometría de masas en tandem (MS/MS) se encontró una excesiva cantidad de MIT y DIT en la orina en la madre. Los cuatro hijos restantes eran heterocigotas para la mutación p.A220T, no tenían hipotiroidismo o bocio cuando se examinaron a las edades de 8-14 años. Sin embargo, incluso en el estado eutiroideo, los niveles de tiroglobu-lina fueron elevados en tres de los individuos estudiados. Al mismo tiempo, la excreción urinaria de MIT y DIT se encontró elevada en un solo individuo. A pesar de esta variabilidad, el niño asintomático, con un aumento de MIT/DIT a la edad de 9 años, fue revisado clínicamente en la pubertad (14 años de edad) y se encontró hipotiroi-dismo severo y desarrollo de bocio (Tabla 6). Estos datos coinciden con hallazgos previos en pedigríes clásicos, sugiriendo que los individuos heterocigotas podrían tener un fenotipo, y que este fenotipo puede aparecer con el tiempo. Podría ser precipitado por factores intrínsecos o externos, tales como el desarrollo de la pubertad. La severidad del fenotipo de los heterocigotas podría depender de la disponibilidad ambiental de yodo. Se sabe que Bélgica es un país con deficiencia de yodo (Vitti et al., 2003). La posibilidad que las elevaciones de yodotirosina urinaria en el estadío preclínico puedan tener un valor predictivo para un desarrollo tardío de hipotiroidismo me-rece estudios futuros.Defectos en DEHAL1 pueden escaparse a la detección en el “screening” neonatal, conduciendo al retraso men-tal, por lo cual es muy importante mejorar la detección preclínica de deficiencia de yodotirosina deiodinasa en la etapa neonatal.La edad de aparición clínica de defectos en DEHAL1 es variable. El diagnóstico etiológico del hipotiroidismo, debido a un defecto de yodotirosina deyodinasa, debe investigarse en pacientes con fenotipo compatible. Esto puede tener implicancias fundamentales para el reconocimiento y seguimiento de nuevos miembros de la fami-lia. Por otro lado, la detección precoz también beneficia al paciente, ya que puede realizarse un tratamiento del hipotiroidismo tempranamente.

18 mesesInfanciaInfancia8 años5 añosNeonatal14 años

SíSíSíSíSíSíSí

HomocigotaHomocigotaHomocigotaHomocigotaHomocigotaHomocigotaHeterocigota


c.301C>Tc.315delCATc.315delCATc.347T>Cc.658G>Ac.658G>Ac.658G>A

p.R101WF105-I106LF105-I106LI116Tp.A220Tp.A220Tp.A220T

Moreno et. al, 2008Moreno et. al, 2008Moreno et. al, 2008Moreno et. al, 2008Afink et. al, 2008Afink et. al, 2008Afink et. al, 2008

Tabla 6. Mutaciones en el gen de DEHAL 1.

Edad de detección

Bocio Genotipo Exón Posición nucleotídica

Posición aminoacídica

Referencias

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RECEPTOR DE TSHLa resistencia a la TSH es una enfermedad genética caracterizada por altos niveles de TSH en el suero y con-centraciones reducidas de hormonas tiroideas, las cuales están asociadas con una glándula tiroides ubicada en la posición normal (eutópica) y de tamaño normal o pequeño, en ausencia de autoinmunidad (161-163). Por otra parte, la respuesta de la tiroides al estímulo por TSH está disminuida. Estas características fueron observadas hace más de 40 años en un paciente que presentaba hipotiroidismo congénito, volumen de la tiroides normal y una captación no incrementada de radioyodo luego de la administración exógena de TSH (164). Desde entonces, varios casos han sido reportados, siendo la causa de los mismos mutaciones de pérdida de función en el gen del receptor de TSH. Dado que el TSHR se expresa predominantemente en el tejido tiroideo, esta patología no incluye manifestaciones evidentes extra-tiroideas.La refractoriedad de la glándula tiroides a la acción de la TSH puede estar asociada a una producción deteriorada de hormonas tiroideas y crecimiento, a pesar de la secreción aumentada de TSH (resistencia completa a TSH). Sin embargo, cuando la sensibilidad del tejido tiroideo a la estimulación de TSH está parcialmente conservada, la elevación de los niveles de TSH puede compensar el defecto del receptor (resistencia parcial a TSH). En cuanto a la prevalencia, podría considerarse a la resistencia a TSH como una rara condición. Sin embargo, un grupo japonés muy recientemente reportó el análisis sistemático del gen del TSHR en el hipotiroidismo congénito (HC) (165). En su población de HC, la prevalencia observada de las mutaciones de pérdida de función bialélicas y monoalélicas fue de 4.3 % y 9.4 % en el HC, respectivamente. En las últimas dos décadas se han identificado mutaciones puntuales en la región codificante del gen que codifica para el TSHR, resultando en defectos estructurales de los receptores. Algunas de dichas mutaciones se encuen-tran asociadas al hipertiroidismo no autoimmune (mutaciones activantes) y a ciertas formas de hipotiroidismo congénito con glándula tiroides “in situ”. Se han reportado mutaciones somáticas en adenomas solitarios tóxicos de tiroides, bocios multinodulares y carcinomas de tiroides diferenciados. Mutaciones germinales en el TSHR producen hiperplasia tiroidea tóxica hereditaria, con un patrón de herencia autosómico dominante o, en el caso de mutaciones germinales de novo, hiperplasia tiroidea tóxica esporádica. Además, hay que mencionar que la mutación p.K183R en el ectodominio causa la estimulación ilegítima de la glándula por hCG, lo cual resulta en hipertiroidismo severo durante el embarazo. Hasta la fecha, numerosas mutaciones inactivantes han sido documentadas como responsables de la resistencia a TSH. Se han identificado mutaciones que originan cambio de aminoácido (ejemplo: p.P162A), mutaciones que conducen a la aparición de codones de terminación prematuros de la traducción (ejemplo p.W546X), deleciones/inserciones que originan cambio del marco de lectura y alteraciones en las regiones de unión intrón-exón (muta-ciones que producen errores de “splicing” y producen la pérdida de algún exón). Estas mutaciones naturales se distribuyen a lo largo de la secuencia del gen, sin “hot spots” significativos. La única región preservada es la cola intracitoplasmática, confirmando su rol menor en la transducción de señales. Algunas mutaciones, tales como C41S, P162A, C390W, R450H, W546X, A553T y T655fs, han sido reportadas más de una vez. En particular, las mutaciones W546X y R450H parecen ser las principales contribuciones a la disfunción tiroidea en las poblacio-nes galesa y japonesa respectivamente (165, 166).Los mecanismos responsables para la pérdida de la función del receptor son múltiples (expresión reducida o au-sente del receptor sobre la superficie celular, falla en la unión al ligando, incapacidad del receptor para activar y actuar sobre las proteínas G). Mutaciones que producen la síntesis de un receptor truncado generalmente afectan la cantidad de receptor que se expresa en la membrana plasmática. Este es el caso de la mutante T655X (delC), identificada por Persani y colaboradores (167) la cual fue identificada en un paciente con resistencia dominante a la TSH. Esta mutación, que origina un cambio en el marco de lectura, conduce a la producción de un receptor que pierde completamente la región TM7 y la cola C-terminal. Cuando fue expresado transientemente en células Cos-7 o HEK293/, el receptor mutante sufre una reducida expresión en la superficie celular, tal como fue eva-luado por análisis FAC, tanto como por dañada producción de AMPc basal y estimulada por TSH (168). Hallazgos similares fueron observados para la mutación W546X (169), la cual introduce un “stop” prematuro en TM4, o para una mutación de deleción-inserción que conduce a un cambio de marco y un “stop” prematuro en el codón 419 (170). Por otra parte, se ha sugerido que la escisión del exón 6, tal como se reportó en dos pacientes, la cual causa la deleción de un LRR en el dominio de unión amino terminal, interfiere con la unión de la TSH al receptor (171).Inicialmente, se pensó que las mutaciones que producen cambio de aminoácido, localizadas en el ECD alteraban

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la unión al ligando. Sin embargo, la mayoría de las mutaciones reportadas en esta región se caracterizan también por una expresión reducida en la superficie celular. Esto es probablemente la consecuencia del mal plegamiento del receptor, lo cual sería incompatible con la exportación del RE y la inserción en la membrana plasmática. Esta situación podría esperarse cuando las mutaciones afectan los residuos que juegan un rol importante en el mante-nimiento de la estructura completa del ECD. Por ejemplo, la mutación de un residuo cisteína de la posición 41 (C41S), el cual se piensa que forma puentes disulfuro con otros residuos cisteína en el sitio N-terminal de la re-gión LRR, está asociada con la captura intracelular del receptor (168, 172). Un fenómeno similar fue mostrado para la mutación C390W. Sin embargo, esta mutante conservó una expresión parcial en la superficie celular y los datos experimentales también sugirieron una cierta reducción de la unión a TSH con alta afinidad (169). Un hecho muy interesante es que algunas mutaciones en el ECD estás inesperadamentes asociadas con un incremento de acti-vidad independiente de ligando. Este es el caso de las mutaciones C390W (173) y R310C (174), las cuales muestran reducida unión a la hormona y estimulada producción de AMPc, pero una incrementada actividad constitutiva basal constante. Además, la actividad constitutiva incrementada de la mutante R310C podría explicar el eutiroi-dismo observado en los pacientes afectados (174). Finalmente, se ha reportado una mutación asociada con unión normal a la hormona pero con incapacidad para activar la adenilato ciclasa (173). Esta mutación, D410N, afecta un aminoácido en en el extremo de la región bisagra, próxima a TM1. Se ha demostrado que esta región estaría implicada en conferir la señal de activación desde el ECD hacia el dominio serpentina (175, 176). Se podría esperar que mutaciones que producen cambio de aminoácido en los segmentos TM y “loops” conec-tores interfieran con la activación del receptor o el acoplamiento a la proteína G. Sin embargo, las mutaciones inactivantes que afectan el dominio serpentina generalmente también se caracterizan por una reducción signifi-cativa de expresión en la superficie celular. Así, el defecto de “targeting” de membrana parece ser el principal mecanismo que conduce a la pérdida de función para las mutaciones de cambio de aminoácido, que afectan los dominios codificados por el exón 10 (Tabla 7). Sin embargo, las mutaciones R450H, V473I (177) según se repor-tó, poseen una expresión conservada en la membrana celular pero una señalización defectuosa, sugiriendo así un rol relevante de estos residuos in TMD2 en la transducción de la señal estimulatoria por la TSH. Además, la mutación Q489H en el primer loop extracelular demostró tener una expresión conservada, tal como se midió por citometría celular, pero una unión a TSH disminuída al igual que la actividad AMPc, debido a un proceso post traduccional defectuoso y glicosilación (178). Una variante del receptor (Y601H), identificada en un paciente japo-nés con resistencia a TSH, e interpretada originalmente como un polimorfismo silente (179) daña selectivamente la producción de IP sin interferir con la unión de TSH o la producción de AMPc (180). Esta mutación involucra una tirosina conservada de la posición 601 al final de TM5, la cual parece ser un determinante importante del acoplamiento a Gq. Se ha reportado otra mutación inactivante en el TSHR (L653V) en el mismo dominio del receptor y afectando Gq/IP3, más que una señal dependiente de GsαAMPc (181). Estos datos indican que la intre-gridad de ambos caminos parece ser requerida para la transducción eficiente del estímulo de la TSH en las células tiroideas.El mecanismo de resistencia a TSH en pacientes con mutaciones en el TSHR heterocigotas es menos obvio, y podría involucrar un dosaje génico (haploinsuficiencia) o un efecto dominante negativo ejercido por el TSHR mutante sobre el receptor “wild type”. Se ha demostrado, recientemente, la presencia del efecto dominante nega-tivo in vitro ejercido por alguna de estas mutantes (C41S, L467, C600R) (172). De hecho, en células transfectadas con TSHRs “wild type” y mutantes, se observó una reducción en la producción de AMPc en condiciones basales y bajo la estimulación con TSH, cuando se comparó con las células transfectadas únicamente con el receptor “wild-type”. Además, la co-expresión de TSHr mutantes causó la captura intracelular, principalmente en el re-tículo endoplásmico del receptor “wild-type”. Más aún, Persani y colaboradores, documentaron mediante trans-ferencia de enegía de resonancia entre fluorocromos y co-inmunoprecipitación, la existencia de una interacción física entre los receptores “wild-type” y mutantes. Según estos datos, la ocurrencia de resistencia a TSH, en los casos con mutaciones inactivantes, podría deberse a una reducción de la cantidad el TSHR “wild-type” presente en la membrana celular, causada por oligomerización con mutantes TSHR retenidas intracelularmente (172, 182). Cualquiera sea el mecanismo involucrado, expresión reducida en la superficie celular, reducida afinidad por li-gando, defectuosa activación o acoplamiento del receptor a proteína G, hay un cierto grado de correlación entre la función dañada del receptor medida in vitro y el fenotipo clínico (183). De esta manera, las mutaciones C41S y

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T655X (delC), las cuales conducen a la más baja expresión en la superficie celular y niveles basales de AMPc in vitro, fueron asociadas con niveles más altos de TSH en los pacientes con resistencia dominante a TSH (168). Una situación análoga ha sido reportada en un estudio sobre tres familias japonesas (177). Los individuos afectados fue-ron todos compuestos heterocigotas para R450H y, ambas V473I, R519G o R519C. Es de interés que el defecto de producción de AMPc, estimulada in vitro (R519G> R519C> R450H> V473I) correlacionaron bien con los niveles de TSH séricos en pacientes portando los genotipos siguientes: R519G/R450H>R519C/R450H>V473I/R450H. Otro factor que influencia la severidad del fenotipo es el número de alelos mutados. De hecho, las formas do-minantes, en las cuales solo un alelo en el TSHR está mutado, son siempre leves, mientras que la presencia de dos alelos mutados generalmente se asocia con un fenotipo más severo. Por esta razón, la resistencia a TSH fue originalmente descripta como una enfermedad recesiva (184, 185). Tal dependencia del dosaje puede ser observada mediante la examinación cuidadosa de los pedigríes con resistencia completa a la TSH, en la cual los individuos, quienes heredaron dos alelos mutados, tuvieron un fenotipo claro y más severo, cuyos miembros familiares he-terocigotas solo presentaron ligeras elevaciones en la TSH. Finalmente, las manifestaciones leves de mutaciones en el TSHR heterocigotas simples fueron reveladas por la descripción de familias con resistencia dominante a TSH (168). El número de alelos mutados, el defecto funcional del TSHR causado por mutaciones específicas, y probable-mente su abilidad o no para interferir, a través de un mecanismo dominante negativo, sobre la función del recep-tor “wild-type” son los principales determinantes de la severidad de la enfermedad. Sin embargo, los tests de función tiroidea pueden variar considerablemente entre diferentes individuos afectados con la misma mutación o entre miembros de la misma familia. Además, las fluctuaciones de los niveles de TSH pueden ser observados aún en el mismo individuo. Estos hallazgos sugieren que los factores ambientales (requerimiento de hormonas tiroi-deas, suplemento de yodo, traumatismos tiroideos adquiridos) tanto como modificadores genéticos desconocidos podrían jugar un rol en la fenómica de la enfermedad.Mutaciones inactivantes en el TSHR explican solo un “subset” de casos con las características clínicas de re-sistencia a la TSH (186-188), sugiriendo el involucramiento de otros mecanismos. Los posibles mecanismos alternativos podrían, en principio, incluír las moléculas de TSH circulantes con conservada inmuno-reactividad, pero actividad biológica dañada o defectos que afectan elementos del camino de señalización “downstream” del TSHR (186, 187).El primer elemento “downstream” del TSHR es Gsα, la proteína G que acopla la estimulación del TSHR al efector enzimático, adenilato ciclasa. Esta proteína, codificada por el gen (GNAS1) sobre el cromosoma 20q13, el cual está sujeto a “imprinting” parental (189, 190). Mutaciones inactivantes en GNAS1, heredadas de la madre, causan una forma más generalizada de resistencia a hormona denominada PseudoHypoParathyroidism tipo 1ª (PHP1a) (191), el cual es primer síndrome de resistencia a hormona que ha sido descripto por Albright et al (1942) y denominado también osteodistrofia hereditaria de Albright (AHO). Si bien ésta es una forma suave de resistencia a TSH, podría conducir a niveles dismunuidos de hormonas tiroideas en el período neonatal (192). La presencia de resistencia a TSH en estos pacientes se justifica por la expresión preferencial de un alelo mutante materno en la tiroides, como en otros tejidos “target” de hormonas peptídicas, que actúan a través de la misma vía GPCR-Gsα-AMPc, tales como riñón (PTH), gonadas (FSH/LH) y pituitaria (GHRH) (193). Recientemente, se ha reportado que una resistencia a TSH suave podría ser identificada también en un “subset” de pacientes con PHP1b, lo cual está asociado con un defecto de mutilación del locus GNAS (194).La expresión reducida del TSHR podría ser uno de los posibles mecanismos que conducen al hipotiroidismo en pacientes con mutaciones en NKX2.1 (195). El fenotipo de resistencia a TSH, con una glándula in situ, puede obser-varse en estos pacientes (196). Recientemente, un estudio realizado por el “genome wide association” (GWA) des-cribió la asociación de niveles circulantes de TSH con polimorfismos nucleotídicos involucrando el gen PDE8b, el cual codifica una fosfodiesterasa que degrada AMPc específica (PDE) (197). Una actividad incrementada de PDE limita la expresión de mutaciones activantes en el TSHR en los adenomas autónomos de tiroides (198, 199) y varia-ciones en el gen PDE se supone que predisponen a la formación de tumores en glándulas endócrinas (200). Una incrementada actividad PDE, que degrada AMPc en tejido tiroideo, podría constituir un mecanismo adicional que conduce a una sensibilidad reducida a TSH. En la Tabla 7 se citan las mutaciones inactivantes identificadas hasta la actualidad en el gen del TSHR (165, 166, 168-

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174, 177, 178, 181, 184, 201-220).Tabla 7. Mutaciones inactivantes en el gen del TSHR. Mutaciones Referenciasp.Q8fsX62p.P27Tp.E34Kp.R46Pp.C31Xp.P68Sp.R109Q

123-124insTGCCAI152fsX157p.P162A

p.I167Np.A204Vp.G245Sp.L252Pp.R310Cp.Q324Xp.C390W

p.D403N

406-412 del+insp.D410N p.Y444Xp.R450H

p.467Pp.V473Ip.T477Ip.W488R p.Q489Hp.G498Sp.R519Cp.R519Gp.W520Xp.F525Lp.M527Tp.W546Xp.A553Tp.A593Vp.C600Rp.Y601Hp.R609Xp.L653VT655X(delAC)p.V689GIntrón 5 g.IVS5-1G>AIntrón 6 g.IVS6+3G>C

Tonacchera et al. (2007)Camilot et al. (2005), De Marco et al. (2009)Camilot et al. (2005), De Marco et al. (2009)Camilot et al. (2005), De Marco et al. (2009)Nicoletti et al. (2009), de Roux et al. (1996), Alberti et al. (2002), Calebiro et al. (2005)Tenenbaum-Rakover et al. (2009), Nicoletti et al. (2009)Clifton-Bligh et al. (1997), Camilot et al. (2005), Rapa et al. (2009), Nicoletti et al. (2009), Narumi et al. (2009)Camilot et al. (2005), Rapa et al. (2009)Nicoletti et al. (2009)Sunthornthepvarakul et al. (1995), de Roux et al. (1996), Tonacchera et al. (2001), Tonacchera et al. (2004), Camilot et al. (2005), Tonacchera et al. (2007), Rapa et al. (2009), Nicoletti et al. (2009)Sunthornthepvarakul et al. (1995)Narumi et al. (2009)Yuan et al. (2007)Tonacchera et al. (2004), Camilot et al. (2005)Russo et al. (2000), Nicoletti et al. (2009)De Roux et al. (1996)De Roux et al. (1996), Biebermann et al. (1997), Calaciura et al. (2002a), Nicoletti et al. (2009)Camilot et al. (2005), De Marco et al. (2009), Narumi et al. (2009), Rapa et al. (2009), Nicoletti et al. (2009)Bieberman et al. (1997)De Roux et al. (1996), Tonacchera et al. (2007), Nicoletti et al. (2009)Jeziorowska et al. (2006)Nagashima et al. (2001), Shibayama et al. (2005), Tsunekawa et al. (2006), Narumi et al. (2009)Alberti et al. (2002), Calebiro et al. (2005)Tsunekawa et al. (2006)Tonacchera et al. (2000)Camilot et al. (2005), De Marco et al. (2009), Rapa et al. (2009)Sura-Trueba et al. (2009)Nagashima et al. (2001)Tsunekawa et al. (2006)Tsunekawa et al. (2006)Rapa et al. (2009)De Roux et al. (1996)Camilot et al. (2005), De Marco et al. (2009), Rapa et al. (2009), Nicoletti et al. (2009)De Roux et al. (1996), Clifton-Bligh et al. (1997), Jordan et al. (2003), Park et al. (2004)Abramovicz et al. (1997), Park et al. (2004), Nicoletti et al. (2009)Fricke-Otto et al. (2005)Alberti et al. (2002), Calebiro et al. (2005)Takeshita et al. (1994)Tiosano et al. (1999), Richter-Unruh et al (2004)Grasberger et al. (2007), Tenenbaum-Rakover et al. (2009)Gagné et al. (1998), Alberti et al. (2002)Yuan et al. (2007)Bretones et al. (2001)Gagné et al. (1998)

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219.Richter-Unruh A, Hauffa BP, Pfarr N, Pohlenz J 2004 Congenital primary hypothyroidism in a Turkish family caused by a homozygous nonsense mutation (R609X) in the thyrotropin receptor gene. Thyroid 14 :971–974.

220.Bretones P, Duprez L, Parma J, David M, Vassart G, Rodien P 2001 A familial case of congenital hypothyroi-dism caused by a homozygous mutation of the thyrotropin receptor gene. Thyroid 11:977–980.

Cap 38/40


PARTE 4: HIPOTIROIDISMO · agenesia, hipoplasia) que representan el 85 % de los casos (2,3). ... la hormonogénesis tiroidea y como la proteína de reserva de hormonas tiroideas y

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