THESE DE DOCTORAT DE L'UNIVERSITE DE NANTES COMUE UNIVERSITE BRETAGNE LOIRE ECOLE DOCTORALE N° 602 Sciences pour l'Ingénieur Spécialité : « (Génie des Procédés) » « Optimisation de la culture d’Haslea ostrearia en photobioréacteur » Thèse présentée et soutenue à « Nantes », le « 01/07/2019 » Unité de recherche : Laboratoire GEPEA, UMR CNRS 6144 Thèse N° : Par « Rémi NGHIEM-XUAN » Rapporteurs avant soutenance : Réjean Tremblay Professeur, Université du Québec à Rimouski UQAR Ingrid Fruitier-Arnaudin Maître de conférences HDR, Université La rochelle Composition du Jury : Président : Philippe Michaud Professeur, Université Clermont-Auvergne Examinateurs : Philippe Michaud Professeur, Université Clermont-Auvergne Ian Probert Docteur, Station Biologique de Roscoff Dir. de thèse : Pascal Jaouen Professeur, Université de Nantes Co-dir. de thèse : Jérémy Pruvost Professeur, Université de Nantes Co-enc. de thèse : Vincent Turpin Maître de conférences, Université de Nantes Invité(s) Isabelle Rouillard Docteur, école Centrale de Nantes
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THESE DE DOCTORAT DE
L'UNIVERSITE DE NANTES
COMUE UNIVERSITE BRETAGNE LOIRE
ECOLE DOCTORALE N° 602
Sciences pour l'Ingénieur
Spécialité : « (Génie des Procédés) »
« Optimisation de la culture d’Haslea ostrearia en photobioréacteur » Thèse présentée et soutenue à « Nantes », le « 01/07/2019 » Unité de recherche : Laboratoire GEPEA, UMR CNRS 6144 Thèse N° :
Par
« Rémi NGHIEM-XUAN »
Rapporteurs avant soutenance : Réjean Tremblay Professeur, Université du Québec à Rimouski UQAR Ingrid Fruitier-Arnaudin Maître de conférences HDR, Université La rochelle
Composition du Jury :
Président : Philippe Michaud Professeur, Université Clermont-Auvergne Examinateurs : Philippe Michaud Professeur, Université Clermont-Auvergne
Ian Probert Docteur, Station Biologique de Roscoff Dir. de thèse : Pascal Jaouen Professeur, Université de Nantes Co-dir. de thèse : Jérémy Pruvost Professeur, Université de Nantes Co-enc. de thèse : Vincent Turpin Maître de conférences, Université de Nantes
Invité(s) Isabelle Rouillard Docteur, école Centrale de Nantes
Remerciements
La thèse est une expérience exceptionnelle et bien plus riche en enseignements que
ce à quoi je m’attendais et remercier toutes les personnes qui m’ont accompagné dans ce
projet me semble être une bonne conclusion, que vous lirez certainement en premier.
Tout d’abord, rien n’aurait pu être possible sans le professeur Pascal Jaouen qui
m’a accueilli au GEPEA et m’a permis de réaliser cette thèse passionnante. Un très grand
merci à mon co-directeur Jérémy Pruvost qui m’a beaucoup appris scientifiquement, m’a
apporté ses conseils et a su m’encourager dans cette épreuve. J’exprime également toute
ma gratitude à mon co-encadrant de thèse le docteur Vincent Turpin pour avoir fourni les
souches d’Haslea ostrearia, son encadrement sur sa culture ainsi que sa patience pour mes
erreurs d’orthographe. J’exprime également toute ma gratitude au professeur Jean-Luc
Mouget pour m’avoir prodigué ses conseils et son expertise sur cette souche de
microalgue.
Je remercie sincèrement les membres du jury de m’avoir fait l’honneur d’examiner
et d’évaluer mon travail. Merci au professeur Réjean Tremblay et au docteur Ingrid
Fruitier-Arnaudin d’avoir accepté d’être rapporteurs de ma thèse. Merci au docteur Ian
Probert et au professeur Philippe Michaud ainsi qu’à notre invité, le docteur Isabelle
Rouillard pour leur intérêt et leur disponibilité.
Merci à l’administration du GEPEA et plus particulièrement à Carole, Laurette et
Marie-Pierre pour leur aide, leur bonne humeur ainsi que leur efficacité.
Je remercie chaleureusement tout le service technique sans qui le laboratoire ne
Figure 26: Représentation de la géométrie (Gauche) du PBR torique avec ses
dimensions, (Droite) de 2 types d'hélice utilisé pour l'agitation du PBR torique (Pruvost
et al., 2006) ..................................................................................................................................................... 39
Figure 27: Prédiction de la vitesse moyenne du fluide en PBR torique UO en fonction de
la vitesse de rotation des 2 types d'hélices (Fig. 25) utilisées en Torique (Pruvost et al.,
Figure 56: Représentation des fractions molaires de carbone dissous en fonction du pH à
25°C (Kaplan et al., 1986) .......................................................................................................................... 73
Figure 57: Photographie de la première culture d'Haslea ostrearia en photobioréacteur
de technologie Airlift au GEPEA (Jubeau, 2009) .............................................................................. 78
Figure 58: Installation expérimentale d'un photobioréacteur à membrane immergée
pour la culture d'Haslea ostrearia (Rossignol et al., 1999) .......................................................... 79
Figure 59: Photographie de cultures d'Haslea ostrearia en immobilisation cellulaire
passive : (Gauche) en erlenmeyer non agité 500 mL, (Droite) en bonbonne de verre
borosilicaté non agité 10 L ........................................................................................................................ 80
Figure 60: Culture d'Haslea ostrearia dans les PBR expérimentaux UQAR : (a)
photographie de deux des PBR, (b) courbe de la EMn mesuré dans le surnageant durant
35 jours de batch (Gastineau et al., 2014) .......................................................................................... 81
Figure 61: Méthodologie de la préparation de la culture d'Haslea ostrearia en tank de
500 L et en open pond expérimental de 10m3 (Turpin et al., 2001) ........................................ 81
Figure 62: Variation de la densité cellulaire et de la concentration en marennine dans le
surnageant au sein des culture en batch d'Haslea ostrearia (en tank 500 L et pond 10 m3)
(Turpin et al., 2001) .................................................................................................................................... 82
Figure 63: représentation du photobioréacteur à cellules immobilisées expérimental
(Lebeau et al., 2000) .................................................................................................................................... 83
Figure 64: représentation d'une inclusion cellulaire dans un polymère d'alginate de
Figure 65: photographie au microscope optique : (A) de billes d'alginate vide, (B) de
microcapsule d’alginate contenant Nitzschia closterium (Lebeau et al., 1998).................... 84
Figure 66: Représentation chronologique des innovations de productivité en marennine
extracellulaire selon les différentes technologies de systèmes de culture mis en place par
les laboratoires MMS, du GEPEA et de l'UQAR .................................................................................. 87
Figure 67: Cellule de Nageotte Figure 68: Coupe latéral de la cellule de Nageotte ....... 93
Figure 69: Gravure de la cellule de Nageotte ..................................................................................... 94
Figure 70: Mesure des différentes formes de carbones par TOC-L CSH/CSN....................... 98
Figure 71: Enceinte de culture Sanyo MLR-350 .............................................................................101
Figure 72 : Flasque de culture de tissus cellulaire stérile non traitée (25 cm² de surface
de culture) .....................................................................................................................................................101
Figure 73: panneau de LEDs à variateur pour irradiance horizontale ..................................103
Figure 74: Schéma du PBR à cellules immobilisées ......................................................................104
Figure 75: Schémas du PBR Cristal (Moutel, 2016) ......................................................................105
Figure 76: Schémas du PBR Airlift (Souliès, 2014) .......................................................................106
Figure 77: Schémas du PBR Torique (Souliès, 2014) ...................................................................107
Figure 78: Schémas du PBR plan 6L (Souliès, 2014) ....................................................................108
Figure 79: Représentation de la technique de mesure expérimentale du MRPA sur le PBR
Fig. 6: Biomass [X] (bars) and EMn (circles) volumetric productivities (Pv) according to
different macro and micro nutrient concentrations in artificial seawater. Data is mean
±95% CI for n=3 ..........................................................................................................................................133
Fig. 7: Comparison of Haslea ostrearia cell density culture in new NX-25N100P6Si
medium with two natural seawater-based media. Data is mean ±95% CI for n=3. .........135
Fig. 8: Comparison of EMn concentration from Haslea ostrearia culture in new NX-
25N100P6Si medium with two natural seawater-based media. Data is mean ±95% CI for
Fig. 24: Passive and active continuous culture of Haslea ostrearia in immobilized cell
PBR. Data is mean ± 95% CI for n = 3 and n = 2 for mean DIC. .................................................196
Fig. 25: Batch culture of Haslea ostrearia for 2% and 15% air/CO2 proportion for cell
density (A) and extracellular marennine concentration (EMn) (B), in Crystal PBR. Data
are mean ± IC 95% for n=3 .....................................................................................................................198
Fig. 26: Continuous culture of Haslea ostrearia at 15% CO2 in a Crystal PBR. Cell density,
extracellular marennine (EMn) and dissolved inorganic carbon (DIC) were measured.
Data is mean ± 95% CI for n = 3 ............................................................................................................199
Fig. 27: Semi-continuous culture of Haslea ostrearia in 1 L airlift PBR with carbon fed-
batch and 2% CO2. Dry weight (DW), extracellular marennine concentration (EMn) and
dissolved inorganic carbon (DIC) were measured. Data is mean ± 95% CI for n = 3 ......201
Fig. 28: Evolution of NO3-, PO42- and SiO32-concentration for semi-continuous culture of
Haslea ostrearia in a 1 L airlift PBR. Data is mean ± 95% CI for n = 3 ...................................202
Fig. 29: Semi-continuous Haslea ostrearia cell culture in 1 L airlift PBR with C, P, Si fed-
batch conditions. Dry weight (DW) and extracellular marennine concentration (EMn)
were measured. Data is mean ± 95% CI for n = 3 ..........................................................................204
Fig. 30: Light tolerance curve of Haslea ostrearia, describing the evolution of surface
productivity (PS) depending on MRPA values for biomass and extracellular marennine
(EMn) results. Data is mean ± 95% CI for n = 5 ..............................................................................205
Fig. 31: Haslea ostrearia total pigment, extracellular marennine (EMn) and light
conversion efficiency (η) into biomass as a function of MRPA. Data is mean ± 95% CI for
n = 5 .................................................................................................................................................................206
Fig. 32: Haslea ostrearia total pigment, extracellular marennine (EMn) and light
conversion efficiency (η) into EMn as a function of MRPA. Data is mean ± 95% CI for n =
Tableau 5 : Etude bibliographique de la sensibilité d'organismes cellulaires face aux taux
de cisaillement ............................................................................................................................................... 42
Tableau 6 : Gamme de température supporté par 5 groupes taxonomiques de
microorganismes photosynthétique (Ras et al., 2013) .................................................................. 69
Tableau 7: Evolution de la solubilité du carbone en fonction de la température, PCO2=380
Tableau 10: Biométrie du clone NCC 495 d'Haslea ostrearia et aspect au début et à la fin
de la thèse ........................................................................................................................................................ 91
Tableau 11: Biométrie du clone NCC 501 d'Haslea ostrearia et aspect à réception du
etc …) capables d'oxyder les protéines, l'ADN et les membranes des cellules (attaque des
lipides constitutifs par peroxydation lipidique) (Holmgren, 1989). Les DRO peuvent être
d'origine exogène (produits par des rayonnements ionisants) ou bien endogène (sous-
produits du métabolisme normal de l'oxygène souvent importants dans la communication
entre les cellules). Les cellules subissant ce processus de dégradation se défendent à l’aide
souvent, de petites molécules antioxydantes telles que l'acide ascorbique (vitamine C), les
tocophérols (vitamines E), ou encore de molécules polyphénoliques plus grosses.
Cependant, chez les diatomées, la production de thioredoxine semble fortement
réduite par rapport à d’autres mécanismes de régulation. D’après les travaux de Sachse et
al. (2013), la transcription des enzymes intervenant dans le cycle de Calvin de
Phaeodactylum tricornutum cultivé en cycle jour/nuit et nuit complète a été quantifiée.
19
Les gènes codant pour la phosporibulokinase (PRK qui catalyse la phosphorisation du
ribulose 5-phosphate (RuP) en ribulose 1,5-bisphosphate (RuBP) pour la régénération de
la RuBISCO) et la glycéraldéhydedéshydrogénase (GAP-C1 qui catalyse la première étape
de la glycolyse, convertissant le D-glyceraldehyde 3-phosphate (G3P) en 3-phospho-D-
glyceroyl phosphate, essentiel à la maintenance du niveau d’ATP et du métabolisme des
carbohydrates) sont fortement sollicités durant la phase lumineuse. Sachse évoque
l’hypothèse que la surproduction de PRK et GAP-C1 soit un des mécanismes évolutifs des
diatomées pour compenser le manque de thioredoxine et donc optimiser la croissance
cellulaire face aux agressions des DRO.
7.6 La composition pigmentaire
La présence de certains pigments accessoires ou surnuméraires confère aux algues
la capacité d’absorber différentes longueurs d’ondes, et ainsi des propriétés spécifiques
de survie dans différents environnements. Ces pigments forment des complexes
protéiques appelés antennes collectrices, capables de se charger en énergie lumineuse par
l’interception de photons de longueurs d’ondes dépendantes de la composition des
pigments accessoires (Fig. 13).
Figure 14: Représentation de la compostions pigmentaire des photosystèmes et la circulation de l'énergie lumineuse chez une chlorophycée
Les photons sont récoltés par les pigments (chlorophylle b, c, et caroténoïdes de
protection) qui permettent leurs transmissions aux centres réactionnels, composés de
chlorophylle a, (aussi appelé P680). L’apport d’énergie va exciter le P680 qui va ainsi
libérer l’électron à la plastoquinone, démarrant la réaction de photosynthèse.
20
Cette composition pigmentaire a pour rôle d’accroître la gamme d’absorption de la
lumière et est dépendante de l’espèce de l’organisme photosynthétique étudié, mais aussi
de l’intensité lumineuse à laquelle la cellule est soumise (Masojidek et al., 2013). Selon De
Reviers (2002) la majorité des diatomées ont une composition pigmentaire particulière
composée de chlorophylle a, c, et de fucoxanthine. Cela est confirmé par Carreto et al.,
(1976) et Kuczynska et al., (2015), qui précisent que les diatomées possèdent un groupe
de pigments caroténoïdes photoprotecteurs incluant le bêta-carotène, les xanthophylles
comme la diadinoxanthine, la diatoxanthine, la violaxanthine, l’anthéraxanthine et la
zéaxanthine.
Figure 15: Spectre d'absorption des pigments photosynthétiques (Devred et al., 2014)
La figure 15 présente le spectre d’absorption des différents pigments
photosynthétiques pouvant être retrouvés chez les organismes photosynthétiques. Ces
pigments principaux et accessoires sont dits photosynthétiques du fait de leur rôle dans
la réaction de photosynthèse. Cependant, dans le cas d’Haslea ostrearia, la sécrétion de la
marennine n’a pas été identifiée comme liée à la captation d’énergie lumineuse, et n’est
donc pas considérée comme un pigment photosynthétique (Schubert et al., 1995). Sa
production semble toutefois avoir une relation étroite avec la lumière et donc un lien avec
21
le métabolisme photosynthétique (Neville & Daste, 1978 ; Tremblin et al., 2000 ; Mouget
et al., 2005).
8 La marennine
8.1 La structure chimique
L’analyse élémentaire a été effectuée au CNRS par le laboratoire ICP-MS de Nantes,
par spectrométrie de masse ICP (Pouvreau et al., 2006). La marennine est donc composée
ainsi :
- IMn O = 48% (±0.50), C = 39.55% (±0.15), N=5.70% (±0.30), H=4.50% (±0.25),
Na=1.25% (±0.05), Ca = 1% (±0.05)
- EMn O = 53.5% (±0.50), C = 36% (±0.60), H = 3.80% (±0.15), N=1.70% (±0.25), Na =
3% (±0.05), Ca = 2% (±0.05)
Figure 16: 2D RMN (a) Spectre 1H–13C EMn d’Haslea ostrearia Correspond au spectre 1D 1H (Gastineau et al., 2014)
Cependant, Les études de spectrométrie de masse, spectroscopie Raman, RMN et
RMN 2D ne permettent pas de déduire la structure exacte. Les lignes noires (Fig. 15 a)
séparent les zones comportant des carbones reliés à un ou plusieurs atomes d’hydrogène
; le pyranose générique (Fig. 15 b); la région cyclique 1H–1H TOCSY de l’EMn avec 90 ms
22
de temps de mélange est représentée figure 15 c. Le signal fort 1H observé à 3,65 ppm
représente une impureté (Gastineau et al., 2014).
La différence de structure d’IMn/EMn est sensible chez Haslea ostrearia. L’EMn
semble contenir plus de protons anomériques en conformation alpha (4,9 – 5,7 ppm).
Cependant, les deux formes contiennent un cycle organique aromatique (3,4 – 5,4 ppm)
ainsi qu’un fort signal à 1,22 ppm révélant une région aliphatique (c.a.d, une longue chaîne
carbonée). Selon ces résultats, la marennine serait composée d’un cycle carboné
(Aromatique/benzénique) relié à une longue chaîne carbonée par un carbone
anomérique.
8.2 Les propriétés physico-biochimiques de la marennine
8.2.1 Les propriétés biochimiques
- Activité antibactérienne:
L’impact des deux types de marennine IMn et EMn a été testé par le laboratoire du
MMS sur trois espèces Polaribacter irgensii, Pseudoalteromonas elyakowii et Vibrio
aesturianus. Sélectionnés pour leur dangerosité, Pseudoalteromonas elyakowii et Vibrio
aesturianus ont été identifiés comme des souches de bactéries dangereuses pour la
croissance des huîtres, Polibacter étant une souche terrestre. Le potentiel antibactérien
de la marennine a été évalué par la méthode de diffusion de disque en gel d’agar. Il a été
constaté l’augmentation du cercle d’inhibition de croissance sur gélose avec
l’augmentation de la concentration de marennine utilisée. L’inhibition de la croissance des
bactéries est effective même avec une faible concentration de marennine de 1µg.ml-1.
Cependant, aucune zone d’inhibition n’a été observée pour la croissance de bactéries
terrestres (Gastineau et al., 2012).
- Activités antivirale et cytotoxique:
Cette étude a été effectuée sur la lignée de cellules Vero (Vero cell African green
monkey kidney cell), très utilisées dans la recherche de toxines bactériennes ainsi que
comme cellule hôte pour la culture de virus. Cette lignée cellulaire est aneuploïde ce qui
permet de nombreuses réplications cellulaires sans l’apparition de caractéristiques
sénescentes. L’application de IMn et EMn sur la lignée Vero montre des changements de
morphologie après 3 jours de traitement. Cependant, aucun effet cytotoxique n’a été
23
constaté avec la forme EMn. Concernant l’activité antivirale de la marennine, elle a été
comparée à celle du Zovirax (molécule référence contre le virus de l’herpès HSV-1 et sa
faible cytotoxicité, aussi commercialisée sous le nom d’Activir) (Table. 1).
Tableau 1: Activité antivirale de l’EMn et l’IMn purifiées (Gastineau et al., 2012)
Code CC501(µg/mL) EC502 (µg/mL)
Zovirax >200.0 0.2
IMn marennine 107.2 24.0
EMn marennine >200.0 27.0
Cependant, les deux formes EMn et IMn semblent posséder une activité anti
herpétique très efficace. Avec un EC50 de 24-27µg. ml-1, 2 fois plus important que celui du
Zovirax.
- Activité antiproliférative:
L’expérience a été effectuée sur plusieurs lignées de cellules tumorales humaines :
M113 (mélanome) ; SKOV3 et SHIN3 (cancer ovarien) ; SW116 (cancer du côlon) ; R3111
(cancer des reins) ; 1355 (cancer des poumons) ; et MCF7 (cancer du sein) provenant du
département INSERM U463 (Université de Nantes). La présence d’IMn et d’EMn permet
d’engendrer une différence de morphologie chez les cellules cancéreuses, les cellules
n’adhèrent plus sur les surfaces et prennent une forme globulaire sauf pour la lignée SHIN
3. Aucune dégénérescence ou toxicité n’a été observée sur les cultures, mais la marennine
semble inhiber la croissance de certaines lignées cellulaires (Table. 2) (Gastineau et al.,
2012).
1CC50 représente 50% de la concentration cytotoxique 50%, la concentration qui réduit l'absorbance des cellules pseudo-infectées à 50% de celle du témoin. 2EC50 représente 50% de la concentration antivirale, la concentration qui protège de 50% la cellule contre
l’infection virale HSV-1.
24
Tableau 2: Activité antiproliférative de la marennine IMn et EMn purifiées sur différentes lignées de cellules cancéreuses (Gastineau et al., 2012a)
Lignée cellulaire IC50
3 (µg. mL-1±SE)
EMn IMn
Cancer des
poumons
1355 1,10 ± 0,56 0,79 ± 0,35
Cancer des
poumons
NSCLC-N6 14,4 ± 9,8 nd4
Cancer du sein MCF-7 6,5 ± 3,5 22,2 ± 8,7
Cancer du rein R3III 25,9 ± 9,8 36,7 ± 1,1
Mélanome M113 >100 82,7 ± 33,0
Cancer des ovaires SKOV-3 >100 no5
Cancer des ovaires SHIN3 no no
Cancer du colon SW116 >100 >100
La lignée SHIN3 ne semble pas sensible aux différentes doses des deux formes de
marennine. SKOV-3, SW116 et M113 montre une inhibition à grande concentration de
marennine (100μg. mL-1, 31 ± 9%, 36 ± 4%, and 49 ± 3%, respectivement) pour EMn.
Seulement SW116 est sensible à l’IMn à haute concentration (100 µg. mL-1, 38 ± 7%). Les
deux formes de marennine montrent d’intéressants résultats sur l’inhibition des cellules
cancéreuses de poumons (1355 et NSCLC-N6). L’activité antiproliférative illustrée par
l’IC50 se situe entre 0.79 - 82.7 μg. mL-1 pour l’IMn et entre 1.10 - 25.9 μg. mL-1 pour l’EMn.
Les propriétés de la marennine sont actuellement étudiées pour une valorisation
potentielle dans différents domaines. La marennine pourrait être valorisée dans
l’industrie agroalimentaire, en tant que pigment bleu naturel comestible, ainsi que dans
le domaine de l’ostréiculture (CNC). La région de Marenne-Oléron est la principale région
de production française avec les huîtres labellisées « Fines de claire vertes », dont la
3Analyses statistiques des IC50 déterminées avec ± SE pour n = 6 (ANOVA, SNK; p < 0.05). IC50 représente la concentration minimum de marennine nécessaire pour provoquer 50% de l’inhibition de croissance cellulaire. 4nd = non déterminé 5no = pas d’inhibition détectée.
25
marennine donne aux huîtres cultivées dans cette région leur couleur bleu-vert unique.
Le phénomène de verdissement des huîtres est encore peu compris (Moreau, 1968 et
Gastineau et al., 2012b). C’est un phénomène affectant plusieurs tissus des mollusques
(manteau, branchies, épithélium intestinal), se produisant à différentes intensités et
fréquences au cours de l’année et dans de nombreuses régions, mais ne présente une
grande importance que dans le bassin de Marenne. La variation de l’efficacité du
phénomène de verdissement des huitres est importante d’une claire à une autre.
L’utilisation de la marennine pourrait être un moyen de limiter la mortalité des larves de
bivalves, due à son activité antibactérienne contre les pathogènes marins (Turcotte et al.,
2016 ; Latour et al., 2018). Depuis 2008, la filière ostréicole subit une surmortalité des
huîtres jeunes causées par le virus OsHV1. Cette crise est internationale et a entraîné une
forte baisse de la production d’huîtres en France, passant d’environ 126 000 tonnes en
2006 à 84 100 tonnes en 2010/2011 et 79 200 en 2014/2015 (CNC).
Les caractéristiques antibactériennes, anti-tumorales et anti-virales pourraient
être valorisées en industrie pharmaceutique, le marché des produits antiviraux devenant
plus en plus important depuis 2015 dû à l’augmentation de la population. En contrepartie,
l’expiration des brevets d’anciens antiviraux tels que Sustiva, Combivir, Tenofovir,
Telbivudine, Tamiflu et Relenza (pour 2017) va relancer la compétition des médicaments
génériques. En 2013, le marché des antiviraux était estimé à 22,1 milliards de dollars et
espère atteindre les 30,1 milliards de dollars pour 2017 (Franco, 2012). Le marché des
traitements anti-herpès est quant à lui, estimé à 4,9 milliards de dollars pour 2017. Une
portion de 0,7% de la population globale adulte, entre 15-49 ans est touchée par le virus
de l’herpès chaque année. En 2008, environ 600 millions d’adultes sont touchés par le
virus de l’herpès (Yasobiotech). Les dépenses mondiales en anticancéreux quant à eux,
atteignent $100 milliards (90 milliards d'euros), en 2014, en hausse de 10,3% par rapport
à l'année précédente, selon un rapport consacré à l'oncologie du cabinet IMS Health. Ce
montant représente 10,8% de l'ensemble des dépenses de médicaments à travers le
monde et inclue les traitements de support, comme les antinauséeux ou les traitements
de l'anémie. Le cabinet spécialisé prévoit qu'elles atteindront 117 à 147 milliards de
dollars en 2018, soit une croissance annuelle cumulée estimée entre 6% et 8%.
Les pigments bleus naturels étant rares, la marennine est un candidat pour la
production de cosmétiques d’origine naturelle. Le bleu indigo peut être produit à partir
26
de fleurs d’Indigofera tinctoria, commun en Asie et en Afrique et surtout connu en Europe
depuis le 15ème siècle pour la teinture des vêtements. Cependant, en termes de colorant
alimentaire d’origine naturelle, seule la phycocyanine, extraite de la spiruline, est
autorisée par les normes européennes (EFSA 2011).
8.2.2 Les propriétés physiques
La marennine est un pigment bleu-vert hydrosoluble possédant un déplacement
bathochrome réversible légèrement différent entre ses deux formes IMn et EMn.
Figure 17: Observation de marennine EMn à pH basique (gauche) et acide (droite) (Jubeau, 2009)
Ces deux formes changent de couleur en fonction du pH et de leur pKa. Les pH
basiques donnent une couleur vert sombre, alors qu’une partie des pH acides donnent une
couleur bleu ciel à la marennine (Fig. 17). La valeur du pKa de L’IMn et EMn détermine
leur limite de changement de couleur, respectivement 4,74 ± 0,05 et 4,02±0,02 (Fig. 18a
et b).
Figure 18: Absorbance de l'IMn (a) et EMn (b) en fonction du pH (Pouvreau et al.,2006)
27
L’analyse par spectrométrie nous renseigne sur le coefficient d’extinction molaire, le
point isobestique et le pKa de la marennine (Table. 3).
Tableau 3: Constantes physiques caractéristiques de la marennine par analyse spectrophotométrique (Pouvreau et al.,2006)
Les deux types de marennine sont complètement solubles dans l’eau pure avec une
concentration de saturation atteinte à 25g. L−1 à 25°C pour les deux formes ; Insolubles en
solvants organiques avec précipitation de 20 à 60°C. Après étude en spectrométrie de
masse le poids moléculaire de la marennine est estimé à 10,751±1 KDa pour IMn et 9,893
± 1 KDa pour EMn (Pouvreau et al., 2006).
8.3 Le métabolisme de production de marennine
La voie métabolique de production de marennine est encore inconnue. La question
même de l’origine et de la nécessité pour la microalgue du métabolite reste hypothétique,
confrontant la théorie du métabolite primaire à celui du métabolite secondaire.
Un métabolite primaire est directement impliqué dans la croissance, le
développement et la reproduction normale d'un organisme. Indispensable, il a en grande
majorité, une fonction physiologique intrinsèque, souvent partagée par d’autres
organismes taxonomiquement éloignés. A l’inverse, un métabolite secondaire n'est pas
directement impliqué dans ces processus physiologiques fondamentaux indispensables,
mais possède une fonction écologique ou relationnelle importante. De manière générale,
un métabolite secondaire se retrouve présent dans un ensemble taxonomiquement
restreint d'organismes (Plantes, Champignons, Bactéries etc...). Chez les plantes,
beaucoup de métabolites secondaires se retrouvent sous la forme de « polyphénols » ou
« composés phénoliques ». Souvent d'un poids moléculaire élevé, ce sont des molécules
aromatiques constituées d’un groupement phényle (C6) et d’un hydroxyle (-OH) dérivant
d’acides aminés aromatiques (e.g. tyrosine, phénylalanine) comme les flavonoïdes, les
tanins ou encore les lignines (Scriban, 2006).
28
Certaines études effectuées par le laboratoire MMS, soutiennent l’hypothèse d’une
production continue de marennine corrélée à celle de sa biomasse. L’intensité lumineuse
semble jouer un rôle important dans la production de biomasse et de la marennine qui
n’est pas seulement libérée lors d’une limitation en nutriment mais aussi au cours de la
phase exponentielle (Mouget et al., 2004). D’autres travaux montrent l’affinité d’Haslea à
la lumière bleue pour la production de biomasse et de marennine (Mouget et al., 2005)
(Fig.20). D’autre part, les cellules perdant de leur taille au cours du temps, produisent en
moyenne des quantités de marennine plus faibles (Mouget et al., 2005) (Fig.19).
Figure 19: Courbes de croissance d’Haslea ostrearia sous lumière blanche (WL), bleu (BL), vert (GL), jaune (YL), ou rouge (RL) à faible (20μmol photons m−2 s−1) et fort intensité lumineuse (100μmol photons m−2 s−1)
(Mouget et al., 2005)
29
Figure 20: Contenu en marennine de cellules d’Haslea ostrearia de différentes tailles (longueur de cellule) produites sous lumière bleu (⧯) ou blanche (⧮) (Mouget et al., 2005)
Concernant les figures 19 et 20, la concentration cellulaire est plus importante à
haute irradiance avec des courbes de croissance similaires entre elles, indépendamment
du spectre de lumière appliqué. Cependant, en phase exponentielle, la concentration
cellulaire la plus importante reste en lumière blanche. Alors qu’à faible irradiance, la
concentration cellulaire la plus importante est atteinte sous lumière bleue.
Indépendamment de la lumière, la figure 19 (différents clones d’Haslea sont utilisé A-G)
nous montre que les clones les plus longs (53 – 80µm) présentent les résultats de
concentration de marennine les plus importants.
Cependant, d’autres études menées à MMS et au GEPEA, soutiennent l’hypothèse
du métabolisme secondaire. Malgré un constat évident de la capacité d’Haslea ostrearia à
synthétiser de la marennine (même en très faible quantité) tout au long de sa croissance,
Neuville et Daste (1972), ont montré que la carence azotée avait un impact sur la
production d’EMn, confirmée par Rossignol, (1999) et Lebeau, (2000) (Fig. 21).
30
Figure 21: Cinétique de production de marennine et absorption de nitrate par des cellules d'Haslea ostrearia immobilisées dans le gel d’agar (Lebeau et al., 2000)
La figure 19, montre la production de marennine (⦁) et l’absorption de nitrate (o)
au court de la culture d’Haslea ostrearia dans le prototype de PBR à cellules immobilisées
de Lebeau (Présenté Chapitre I.5.4.2.2.1). La culture est en continu avec un taux de
renouvellement de milieux de culture de 0,025 J-1. Son travail ne présente pas d’autres
mesures de macroéléments nous permettant de confirmer avec certitude que seuls les
nitrates impactent la production de marennine. Cependant, ces résultats de corrélation
remettent en question l’hypothèse du métabolite primaire.
9 Valorisation de la biomasse
9.1 Les pigments
9.1.1 La marennine intracellulaire
La production de marennine intracellulaire pour valorisation est actuellement peu
envisagée, considérant les productivités plus importantes apportées par les technologies
de milking (Rossignol, 1999). La valorisation de l’IMn reste cependant une possibilité
après cassage cellulaire.
9.1.2 La fucoxanthine
La fucoxanthine est un pigment d’intérêt qui donne aux micro et macroalgues une
couleur brune. La composition en fucoxanthine d’Haslea ostrearia n’est pas connue mais
les diatomées, les dinophycées et les phéophycées possèdent en moyenne 20,4% (w/w)
du pigment. La fucoxanthine est un pigment de la famille des caroténoïdes
majoritairement répandu chez les macroalgues et les diatomées. Ce pigment, lié à la
31
chlorophylle a, c et aux apoprotéines forme le meilleur complexe photo absorbeur qui
transfère l’énergie lumineuse à la chlorophylle a pour la réaction photosynthétique. La
fucoxanthine possède des liaisons alléniques, un groupe carbonyle, un 5,6-monoepoxide
et un groupe acétyle qui définissent ses activités sur la physiologie humaine. Ce
caroténoïde montre une forte activité antioxydante, anti-inflammatoire, anti-obésité
(Abidov et al., 2010), antidiabétique (réduction du taux de glucose dans le sang),
anticancéreux et anti-hypertensive (Woo et al., 2010).
Le marché de la fucoxanthine est considéré comme un marché de niche en
croissance avec une valeur de la molécule estimé à 3000€/kg. Principalement pour la
consommation animale en aquaculture, elle est aujourd’hui en vente en gélule comme
complément alimentaire pour la nutrition humaine. La fucoxanthine peut être extraite à
partir de macroalgue comme Laminaria japonica, Eisenia bicyclis, et Undaria
pinnatifidacar, sur un marché très verrouillé par de nombreux brevets, car ces algues sont
déjà consommées en Asie du sud-est et en Europe. Cependant depuis 2005, certaines
entreprises comme Setalg, Algosud ou encore Nature-Algue commercialisent la
microalgue Odontella aurita en gélule pour la consommation humaine.
9.2 Les lipides
La composition lipidique d’Haslea représente un atout potentiel pour sa valorisation
économique. En phase épipélagique, Haslea semble produire des globules lipidiques
intracellulaires qui font remonter les cellules à la surface par densité. La composition
chimique des lipides produits est peu connue, mais le pourcentage produit en masse sèche
se rapproche des résultats obtenus sur des souches étudiées au GEPEA (Table. 5).
Tableau 4: Comparaison de la biomasse et la concentration lipidique produite par différentes microalgues
Biomasse (g/L) Lipides (% MS)
Chlorella sp.6 1 - 2 28 - 32
Chlamydomonas reinhardii7
1 – 2,5 19 - 21
Haslea sp.8 3,0 x 10-2 – 3,6 x 10-2 30,6 - 35,8
6 Taleb et al., 2015 ; Liang et al., 2009 7 Lemasson C. 2015 8 Griffiths et al., 2009
32
Les rendements lipidiques chez Haslea sp., sont élevés comparés à d’autres cellules
modèles du laboratoire. Cependant, les rendements de biomasses sont encore très peu
élevés et maîtrisés pour cette diatomée. D’autres études démontrent que Haslea ostrearia
contient principalement des mono- et digalactosyldiacylglycérol (MGDG and DGDG,
respectivement) membranaires sous forme C18/C16 and C18/C18 (Dodson et al., 2013).
Ces acides gras sont d'importants lipides membranaires, où ils remplacent les
phospholipides pour la préservation du phosphate, alors disponibles pour d'autres
processus biologiques essentiels (Peter et Benning 2002). Chez les plantes supérieures,
ses galactolipides (MGDG et DGDG) sont responsables de la régulation des oxydes
nitriques (composés considérés comme DRO) et ont donc été liés à des activités anti-
inflammatoire, diététique et antitumoral chez l’être humain (Gao et al., 2014).
10 Caractérisation de la fragilité cellulaire
L’agitation étant un paramètre de culture identifié comme important pour la
culture d’Haslea ostrearia (Robert, 1989 ; Rossignol et al., 1999 ; Vandanjon et al., 1999),
la conception et l’optimisation d’un système de culture nécessite la compréhension des
bases de la dynamique des fluides. Les phénomènes de cisaillement dûs à une déformation
d’un fluide sont donc détaillés dans cette partie.
10.1 Notions de cisaillement
10.1.1 La déformation d’un fluide : l’écoulement laminaire et turbulent
La déformation d’un fluide peut être observée par l’ajout de marqueurs (fumée
pour les gaz, colorant pour les liquides) permettant la caractérisation de l’écoulement
d’un fluide. Il est constaté que lorsque le marqueur diffuse très lentement au sein du
système, différentes couches (appelée lamelles) glissent les unes par rapport aux autres
sans se mélanger, formant un gradient de vitesse de vecteur parallèle à un instant t
l’écoulement est dit laminaire. Si tous les vecteurs vitesses sont à la fois parallèles et
égaux, l'écoulement laminaire est uniforme. A contrario, si le marqueur est « perturbé de
manière aléatoire et irrégulière dans toutes les directions » : l’écoulement est dit
turbulent. Les vecteurs de vitesse sont inégaux (différents en direction, sens, intensité).
Des tourbillons (vortex) se forment (Fig. 22).
33
Figure 22: écoulement autour d’un cylindre, (Gauche : laminaire Rex< 5×105), (Droit : turbulent Rex> 5×105)
Le passage d’un régime laminaire à un régime turbulent est régi par la vitesse de
déformation, des caractéristiques visqueuses du fluide ainsi que de la forme de
l’écoulement (espace fermé, canalisation, espace ouvert, etc.…). Ainsi, pour un écoulement
turbulent, les grandeurs caractérisant cet écoulement varient de manière aléatoire. La
notion même d’écoulement turbulent permanent ne peut être comprise qu’en moyenne.
A l’inverse, les fluctuations des gradeurs caractérisant un écoulement laminaire sont
négligeables, voire nulles pour les régimes laminaires parfaits.
La distinction entre les différents régimes s’effectue grâce au nombre de Reynolds :
Équation 2
𝑅𝑒 =𝑉𝐿
𝑣
V est la vitesse du (m.s-1), L la longueur spécifique du système (m) et 𝑣 la viscosité
cinématique. La transition d’un régime laminaire à un régime turbulent se fait
graduellement sur une plage critique de nombre de Reynolds, dont les valeurs peuvent
dépendre des systèmes étudiés. Les écoulements laminaires ont lieu à faible Reynolds
(Rex<2000 pour les cas les plus fréquents) tandis que les forts nombres de Reynolds
correspondront aux écoulements turbulents (Rex> 2000 pour les cas les plus fréquents)
(Bergman 2011).
10.1.2 Les fluides newtoniens et la viscosité
Lors de l’écoulement d’un fluide des forces tangentielles de frottement à cet
écoulement s’opposent au mouvement du fluide. Ces forces sont présentes sur les
extrémités non mobiles d’un système (les parois d’une canalisation par exemple) mais
sont aussi dues aux interactions entre les molécules du fluide, appelées forces de viscosité
intrinsèques aux fluides.
34
Plusieurs grandeurs physiques caractérisent la viscosité : la viscosité dynamique
(celle utilisée le plus généralement), la viscosité cinématique, la seconde viscosité et la
viscosité de volume. Nous ne nous intéresserons qu’aux deux premières (Nic et al., 2014) :
- La viscosité dynamique µ, est la grandeur de référence quand on parle de viscosité
sans autre précision. Elle se mesure en Pascal-seconde (Pa. s-1) et traduit le lien
entre la contrainte de cisaillement et le gradient transversal de la vitesse
d'écoulement dans le fluide « dynamique » :
Équation 3
µ =𝜏
γ
τ étant la contrainte de cisaillement (Pa), et γ le gradient de vitesse aussi appelé
taux de cisaillement (s-1).
- La viscosité cinématique ν, s’exprime en m2. s-1 et se déduit en divisant la viscosité
dynamique par la masse volumique ρ soit :
Équation 4
𝑣 =µ
ρ
Cependant, ces équations (3 et 4) ne sont valables que pour les fluides dits
newtoniens. Pour ses fluides, µ est une constante intrinsèque dépendant uniquement de
la température et de la pression. Dans le cas des fluides non newtoniens, la viscosité est
un paramètre dépendant de la température, de la pression mais aussi des forces en action
sur lui-même, faisant varier la rhéologie du fluide en fonction des contraintes. En d’autres
termes, le fluide newtonien continu de s’écouler indépendamment des forces extérieures
qui agissent sur lui (l’eau est un fluide newtonien parce qu’il conserve sa viscosité quelle
que soit la vitesse à laquelle il est agité).
10.2 Les contraintes de cisaillement en photobioréacteur
Le photobioréacteur représente le système le plus optimisé pour la culture de
microalgues, l’analyse des réactions biochimiques et la maîtrise des conditions axéniques.
Ce procédé optimisé implique plusieurs éléments tels que l’agitation, la recirculation,
l’aération, le pompage, tous dans le but de faciliter et d’optimiser le transfert de matière,
de chaleur autant que l’accès à la lumière au sein du photobioréacteur. Ces opérations
35
peuvent être appliquées à plusieurs intensités, entraînant pour le mélange des
contraintes de cisaillements pouvant être considérées comme excessives et causer une
mortalité cellulaire ou une baisse du taux de croissance (Wang & Lan, 2018).
10.2.1 Technologie Airlift
L’ajout de CO2 est essentiel à la culture des microalgues, en tant que source
inorganique de carbone pour la croissance. Il est nécessaire également d’aérer la culture
pour retirer l’excès de O2 dissous produit par cette même croissance (Ugwu et al., 2008).
Cette pression d’O2 peut devenir un problème pour la production de biomasse, faisant
rentrer la microalgue en photo-respiration (présenté Chapitre I.1.5) et ainsi diminuant la
d’injection du CO2 peut monter jusqu’à UGMAX=0,180 m. s-1, mais permet une moyenne de
UGMOY=0,05 m. s-1 au sein du PBR Airlift.
37
Figure 24: Simulation MFN du champ de vitesse de la phase liquide, coloré par intensité de vitesse superficielle (m. s-1). (a) représente une Airlift 1L, (b) représente un Airlift 100L (Ndiaye et al., 2018)
Du fait du passage des bulles, le taux de cisaillement apporté par cette vitesse
superficielle de gaz est relié par l’équation suivante (Chisti et Murray Moo-Young, 1989) :
Équation 5
�́� = 5000𝑈𝐺
Où UG la vitesse superficielle de gaz (m. s-1) et γ́ taux de cisaillement (s-1).
Le taux de cisaillement maximum moyen apporté par la turbulence de l’agitation
gazeuse est estimé entre 150 s-1 et 275 s-1 au sein du trajet gazeux dans une PBR Airlift.
Cependant, l’éclatement et l’apparition des bulles respectivement en haut et en bas du
PBR favorise l’apparition de micro vortex pouvant produire jusqu’à 14 000 s-1 de taux de
cisaillement moyen (Contreras et al., 1998 ; Michiel et al., 2010 ; Barbosa et al., 2003).
Malgré l’intérêt évident d’une utilisation de fines bulles pour le transfert de matière, la
multiplication de points d’entrée de gaz additionnée à de fines bulles peut être négative
pour la culture de cellules sensibles aux contraintes de cisaillement (Barbosa et al.,
2003 ; Sobczuk et al., 2006). La multiplication des points d’entrées augmente les
cisaillements dus à la génération des bulles, la production de micro vortex et la fréquence
d’explosion des fines bulles en haut du PBR.
38
10.2.2 Technologie Torique
La géométrie particulière de ce photobioréacteur de laboratoire a été mise au point
par le GEPEA dans le but d’étudier la réponse biologique des microalgues face aux
conditions environnementales appliquées et contrôlées. La géométrie du PBR est un
élément important car elle conditionne le comportement de l’algue au sein du PBR. Le
PBR torique est basé sur la forme « torique » permettant un mélange parfait (limitant les
zones mortes). Cette agitation permet un accès amélioré du micro-organisme à la lumière
en générant un mouvement dans le sens du gradient de lumière intra-PBR (présenté
Chapitre I.5.1.1). D’autre part, le procédé est entièrement automatisé pour le contrôle des
Figure 25: schéma du pilote laboratoire Torique de production contrôlée de microalgues (Artu, 2016)
L’injection de gaz en point bas du PBR permet une régulation du pH par ajout de
CO2 mais aussi l’agitation du milieu de culture dans le sens anti-trigonométrique (sens
horaire). Le mouvement principal est toutefois obtenu par l’agitation produite par la/les
hélice(s) marine(s) (Fig. 26 Droite). La forme torique (Fig. 26 Gauche) permet alors une
agitation efficace sans zones non agitées favorisant l’apparition de cellules stagnantes et
de biofilms (Pruvost et al., 2004).
39
Figure 26: Représentation de la géométrie (Gauche) du PBR torique avec ses dimensions, (Droite) de 2 types d'hélice utilisé pour l'agitation du PBR torique (Pruvost et al., 2006)
Tout comme la technologie Airlift, le champ de contraintes de cisaillement réparti
au sein du PBR est complexe et ne peut être réduit qu’à un chiffre moyen. Malgré une
bonne agitation sans zones mortes, les contraintes de cisaillement sont hétérogènes dans
l’ensemble du volume du PBR torique. L’agitation par hélice marine, engendre des
turbulences ainsi que des contraintes plus importantes que dans le reste du PBR, de même
que le point d’injection de gaz (malgré un faible débit d’injection maîtrisé par débitmètre
massique) génère des cisaillements ciblés plus importants. Cependant, la configuration de
la géométrie en boucle de ce PBR permet deux avantages. Tout d’abord la recirculation en
boucle entraîne toutes les cellules vers l’hélice qui ainsi subissent le même historique de
cisaillement au sein de la culture. D’autres part, une faible rotation de l’hélice (donc de
faibles contraintes de cisaillements) couplée à l’injection de gaz suffit à obtenir une bonne
efficacité de mélange (Pruvost et al., 2006).
40
Figure 27: Prédiction de la vitesse moyenne du fluide en PBR torique UO en fonction de la vitesse de rotation des 2 types d'hélices (Fig. 25) utilisées en Torique (Pruvost et al., 2006)
La corrélation entre la vitesse moyenne du fluide et la vitesse de rotation de l’hélice (Fig.
27) est comparée aux résultats de Khalid et Legrand (2001) effectués en boucle à section
circulaire. La vitesse moyenne obtenue par la rotation de l’hélice est un peu plus faible
que celle calculée par Khalid et Legrand, due à la section carrée de la géométrie du PBR
réduisant le débit induit de 10-20% des résultats. Comme présenté précédemment, de
fortes vitesses de rotations d’hélice ne sont pas nécessaires pour éviter la sédimentation
chez les microalgues pélagiques (par exemple, la culture de Chlamydomonas reinhardtii
en PBR Torique s’effectue à U0=0,05 m. s-1).
Figure 28: Prédiction des valeurs globales (VY), ε et εimp en fonction de la vitesse moyenne du flux en PBR Torique (Pruvost et al., 2006)
41
La Figure 28, montre l’évolution de la vitesse moyenne en direction de
l’atténuation de lumière au sein du PBR (VY), ainsi que le taux de cisaillement (ε imp et ε)
en fonction de la vitesse moyenne induite dans le PBR (UO) par la vitesse de rotation de
l’hélice. Le taux de cisaillement est séparé en deux pour différencier le cisaillement moyen
provoqué par l’hélice (ε imp) du cisaillement moyen en boucle (ε). Une évolution linéaire
des paramètres de cisaillement et de vitesse est observée. Les deux types d’hélice
permettent une redirection des microalgues dans le gradient d’atténuation de lumière,
qui se fait de plus en plus importante avec la vitesse moyenne engendrée par l’hélice. De
même, le taux de cisaillement augmente proportionnellement à la vitesse moyenne
induite par l’hélice, pouvant atteindre 90 s-1 en moyenne, 30 s-1 dans la boucle et 140 s-1
dans la zone de l’hélice (hélice 1) pour UO=0,4 m. s-1. Les résultats sont légèrement plus
faibles pour l’hélice 2 avec presque 70 s-1 moyen pour 30 s-1 en boucle et 110 s-1 dans la
zone de l’hélice.
10.3 L’impact des cisaillements sur les organismes microscopiques
unicellulaire libre et en tissus
10.3.1 La sensibilité des microalgues/cyanobactéries/tissus d’organismes
pluricellulaires
Malgré une génération de cisaillement au sein du PBR, l’agitation est essentielle
pour la culture de microorganisme non limitée et donc pour la production industrielle.
Cependant, dans la littérature, certains micro-organismes supportent moins bien
l’agitation. La tolérance des micro-organismes face à ces contraintes de cisaillements est
un phénomène complexe dépendant des facteurs physiologiques (benthique, pélagique,
croissance en colonie etc…) autant que des paramètres physiques (tailles, formes,
flagelles, filaments etc…) de chaque micro-organisme. De manière générale,
l’agitation/cisaillement affecte très peu les Chlorophycées mais elle affecte certaines
Cyanobactéries, Haptophytes, algues rouges, beaucoup de Diatomées et surtout les
Dinoflagellés qui sont considérés comme fragiles. Les tissus cellulaires (peau, organes
etc…) sont aussi étudiés dans la littérature pour leur comportement physiologique sous
contraintes. Après la récolte et la comparaison de ces informations (Table. 5), aucune
réelle corrélation n’a été observée entre la fragilité cellulaire, la forme, la taille ou même
la Classe des cellules étudiées face aux contraintes/taux de cisaillements.
42
Tableau 5 : Etude bibliographique de la sensibilité d'organismes cellulaires face aux taux de cisaillement
Type
d’organismes Classe Espèce
Aperçu
microscopique
Système de
culture
Cisaillement
limite
supporté
Références
Algue verte
Chlorodendrophyceae Tetraselmis
suecica
Rhéomètre 75 000 (s-1)
Michiels et al., 2015
Chlorophyceae Chlorella vulgaris
Cuve agitée 0,9 (Pa) Leupold et al., 2013
Chlorophyceae Senedesmus
obliquus
Cuve agitée 0,9 (Pa) Leupold et al., 2013
Chlorophyceae Chlamydomonas
reinhardtii
Cuve agitée 0,2 (Pa) Leupold et al., 2013
Les chiffres présentés proviennent de plusieurs études non liées entre elles et restent subjectifs. Ceci est du aux différences de temps et de techniques d’application des taux de cisaillement, régime d’écoulement des différentes études.
43
Algue rouge Porphyridiophyceae Porphyridium
cruentum
Cuve agitée 2 (Pa)
Cole K. M. & Sheath R. G.,
1990
Sobczuk et al., 2006
Cyanobactérie
Cyanophyceae Arthospira
platensis
Cuve agitée 2,2 (s-1) Mitsuhashi et al., 1995
Cyanophyceae Aphanizomenon
flos-aquae
Cuve agitée 0,45 (Pa)
Leupold et al., 2013
Bronnenmeier et Märkl,
1982
Synechocystis sp.
Barreau
aimanté 0,114 (Pa) Fadlallah et al., 1995
Diatomée Bacillariophyceae Phaeodactylum
tricornutum
Cuve agitée 7 000 (s-1) Contreras et al., 1998
44
Coscinodiscophyceae Skeletonema
costatum
Rhéomètre 5 000 (s-1) Michiels et al., 2015
Mediophyceae Chaetoceros
muelleri
Rhéomètre 930 (s-1) Michiels et al., 2010
Haptophytes Prymnesiophyceae Isochrysis
galbana
Rhéomètre 5 000 (s-1) Michiels et al., 2015
Dinoflagellé
Dinophyceae Protoceratium
reticulatum
Verrerie
agitée
0,12 (Pa)
0,16 (mPa)
Garcia et al., 2007
Camacho et al., 2007
Dinophyceae Lingulodinium
polyedrum
Rhéomètre 0,004 (Pa) Juhl et al., 2000
Dassow et Latz 2002
Dinophyceae Pyrocystis lunula
Microscope
à force
atomique
Light production
at
36 (µPa)
Tesson et Latz 2015
45
Système
immunitaire
vertébré
Mammalia Lymphocyte T
humain
10 – 20 (Pa) Chittur et al., 1988
Système
sanguin Mammalia
Erythrocyte
humain
Rhéomètre ≥ 2 000 (s-1) Mauer et al., 2016
Tissu
épithélial
ovarien
Insecta
Cellules Sf9
Spodoptera
frugiperda
Verrerie
agitée 0,084 (Pa) Connor et al., 2002
46
Après étude du tableau 5, il apparait que le cisaillement n’est pas qu’une fonction
de facteurs physiques mais aussi de facteurs biologiques, rendant la comparaison sur
cellules vivantes plus compliquée qu’une étude de résistance d’un solide inerte. D’autre
part, chaque analyse de fragilité a été effectuée dans différents systèmes menant à des
cisaillements d’intensité différentes, en type et en durée. Hormis l’importance physique
de l’agitation dans la production en bioréacteur, limiter la fragilité cellulaire à un seul
chiffre de contrainte/taux de cisaillement n’est pas suffisant pour comprendre la
complexité des phénomènes mis en jeu. Son impact sur la physiologie cellulaire, positif ou
négatif, est important à comprendre. Ce phénomène appelé la mécano-transduction ou
mécano-sensibilité regroupe les mécanismes physiologiques cellulaires engendrés par
des stimuli mécaniques, transformant ces signaux mécaniques en signaux électriques ou
chimiques (Griffin et al., 1992 ; Tavernarakis & Driscoll 1997). L’un de ces phénomènes le
plus impressionnant s’illustre sur la baie Laguna Grande à Porto Rico (Fig. 29) abritant un
consortium planctonique de dinoflagellés (Lingulodinium polyedrum, Pyrocystis lunula)
bioluminescentes sous stimuli mécaniques (Tesson et al., 2015 ; Dassow et Latz 2002).
Figure 29: (Gauche) plage de la baie Laguna Grande de nuit, Porto Rico et observation de bioluminescence sur les vagues ; (droite) isolement du consortium bioluminescent en laboratoire
Parmi ce consortium se démarque en concentration Pyrocystis lunula (Fig.30),
capable de synthétiser luciférine/luciférase, un complexe protéique bioluminescent dans
une stratégie de protection contre les prédateurs (Esaias & Curl 1972 ; Buskey & Swift
1985). Selon Tesson et Latz (2015), il suffit d’une contrainte de 36 µPa pour que cette
cellule irradie, une stimulation inférieure à 1.8 µPa ne déclenchant pas la synthèse
protéique bioluminescente. Ainsi, cela prouve l’importance des cisaillements et de leur
intensité dans la réponse des microorganismes.
47
Figure 30: Observation en microscopie optique de la dinoflagellé Pyrocystis lunula, (Gauche) sans agitation sous lumière ; (Droite) après agitation sans lumière
Un autre exemple de l’importance physiologique de la sensibilité aux contraintes
de cisaillement est la culture de tissus d’organismes pluricellulaires. La lignée Sf9 de
cellules ovariennes de Spodoptera frugiperda est une lignée de cellules se cultivant,
immobilisées en tissu mais aussi, libres en verrerie agitée (Fig. 31).
Figure 31: Observation en microscopie optique de la lignée cellulaire Sf9 de tissu ovarien de Spodoptera frugiperda, (Gauche) culture adhérente en tissu ; (Droite) culture libre agitée
Les cellules supportent de très faibles contraintes de cisaillement (0,084 Pa) mais
la culture en cellule libre reste possible. L’agitation d’une de ces cultures en tissu
provoque immédiatement la mort cellulaire, même à très faible agitation. Ainsi, le
problème de la sensibilité de cette souche aux contraintes n’est pas tant le fait des
cisaillements que celui de sa physiologie (Akhnoukh et al., 1993 ; Connor et al., 2002).
La structure cellulaire joue un rôle dans la fragilité aux contraintes mécaniques.
Selon les travaux de Barbosa et al. (2004), le mutant de Chlamydomonas reinhardtii
CC1883 cell wall mutant 15, ne possède pas de paroi cellulaire rigide contrairement à son
équivalent souche sauvage. Soumis aux mêmes contraintes liées au bullage en colonne, le
mutant CC1883 montre un taux de mortalité cellulaire de 1,01 ± 0,29 h-1 pour la même
48
vitesse superficielle du gaz mesuré à 0,085 m. s-1. Ainsi la constitution même de la
membrane cellulaire et le type de parois peuvent fortement altérer la réponse de la cellule
face aux contraintes de cisaillements. La majorité des algues vertes possèdent des parois
riches en cellulose, les cyanobactéries possèdent du peptidoglycane permettant une
certaine rigidité alors que les diatomées possèdent le frustule de silice amorphe formant
une protection de verre rigide. Cependant, le frustule ne rend pas les diatomées forcément
plus résistantes comme démontre Sobczuk et al., (2006). De plus, contrairement aux
autres formes de parois cellulaires, le frustule nécessite une étape d’ouverture lors de la
division asexuée et sexuée de la cellule, rendant potentiellement cette cellule sensible lors
de la division. Ainsi, une paroi rigide ne peut assurer à elle seule une grande résistance
aux contraintes de cisaillement.
Quelques études (Leupold et al., 2013 ; Fadlallah et al., 2016) montrent que le
nombre de couches dans la paroi cellulaire peut potentiellement permettre à la cellule de
résister aux contraintes, comme Scenedesmus obliquus et Synechocystis sp. qui compte
parmi les microalgues multi lamellaires. Cependant, Arthrospira platensis compte aussi
parmi ces organismes multi lamellaires sans pour autant être capable de résister à plus
de 2,2 s-1 (Mitsuhashi et al., 1995 ; Leupold et al., 2013). L’épaisseur des membranes
cellulaires semble elle aussi, peu responsable de la résistance de la cellule puisque que
Chlamydomonas reinhardtti qui possède une paroi de 200 nm est moins résistante que
Chlorella vulgaris avec une paroi de 17-21 nm (Wang et Lan, 2018).
La taille de la cellule est un élément sur lequel il est presque possible de corréler la
sensibilité à la contrainte. En effet, même dans un régime laminaire non parfait, il peut
survenir des micros vortex liés à l’imperfection des parois du système, la présence de
particules ou encore la viscosité du milieu liée à la croissance du microorganisme. Plus les
cellules sont petites et plus elles ont peu de risque d’être impactées par ses micro
perturbations hydrodynamiques. Cependant, les cellules plus grosses ou plus larges telles
que les Dinoflagellés, Diatomées ou Haptophytes sont plus enclines à souffrir de ce
phénomène. Ces microalgues font en moyenne, partie des plus sensibles à l’agitation.
Concernant la diversité de physiologie de croissance des microorganismes, elle est très
importante (libre, filaments, colonies etc…) et ce paramètre semble être déterminant dans
la fragilité cellulaire. De hautes contraintes de cisaillement entraînent la séparation des
filaments tels que ceux d’Arthrospira platensis ou encore Aphanizomenon flos-aquae
49
(Bronnenmeier et Märkl, 1982 ; Leupold et al., 2013). Cependant, une fois de plus, certains
microorganismes tels que Skeletonema costatum poussent en chaînettes et se montrent
2000 fois plus résistants qu’Arthrospira platensis, 5 fois plus que Chaetoceros muelleri et
aussi résistants qu’une cellule isolée d’Isochrysis galbana. Ou encore, Tetraselmis suecica
possède la même forme et la même taille que Chaetoceros muelleri, pourtant ce dernier
est 80 fois moins résistant que Tetraselmis suecica (Michiels et al., 2010 ; Michiels et al.,
2015).
Certaines microalgues sont motiles et possèdent des flagelles. Ces algues sont
souvent présentées comme plus sensibles aux contraintes de cisaillement et la
destruction de ce flagelle entraîne, le plus souvent, la mort de la microalgue. La majorité
des algues vertes ne possèdent pas de flagelle, mais Chlamydomonas reinhardtii est une
exception qui se montre plus sensible aux cisaillements (0.2 Pa) que beaucoup d’algues
vertes. Cependant, Tetraselmis suecica possède aussi jusqu’à 4 flagelles et se montre
particulièrement résistant (75 000 s-1 soit presque 75 Pa dans une viscosité proche de
celle de l’eau) malgré une perte de mobilité (Jaouen, 1988). Les dinoflagellés, organismes
majoritairement flagellés sont aussi considérés comme les plus sensibles des microalgues.
Malgré quelques exceptions telles que Tetraselmis suecica, les flagellés sont des
organismes majoritairement plus sensibles à l’agitation que les non flagellés, ainsi la
présence de flagelles semble être un élément déterminant dans la sensibilité à l’agitation.
Le métabolisme et les cycles de croissances sont aussi des facteurs qui peuvent
jouer un rôle dans le phénomène de sensibilité cellulaire. Beaucoup de microalgues sont
plus sensibles aux cisaillements lors de leurs divisions cellulaires, expliqué par le fait que
les cellules possèdent une taille plus importante et ces parois/membranes plus fines
(pendant un court temps) lors de la division cellulaire, comme Tetraselmis suecica,
Chaetoceros muelleri, Isochrysis galbana et Skeletonema costatum présenté par le travail
de Michels et al., (2016). L’exemple du système de division cellulaire des diatomées
présenté plus haut illustre aussi l’impact que pourrait avoir le cycle de division sur la
sensibilité aux contraintes. Cependant, contrairement à la relation du cycle de division
avec les cisaillements, le constat de l’impact du métabolisme sur la sensibilité aux
cisaillements est aussi important que celui de la sensibilité des cisaillements sur le
métabolisme. L’agitation mécanique peut engendrer la détérioration cellulaire ou
l’interruption de croissance (cas de la majorité des cellules présentées tableau 6). De
même que le tissu cellulaire de lignée Sf9 peut altérer /adapter son métabolisme pour
50
supporter une faible agitation et permettre une croissance plus rapide des cellules libres
agitées (Connor et al., 2002). Pour finir, Les lymphocytes T et érythrocyte humains,
montrent une capacité d’adaptation très importante face à l’altération de l’intensité des
contraintes de cisaillements et la viscosité du fluide en canalisation (représentation d’un
conduit sanguin), faisant varier leurs formes pour supporter les variations (Chittur et al.,
1988 ; Mauer et al., 2016).
10.3.2 La caractérisation de la fragilité d’Haslea ostrearia
Comme la majorité des diatomées, Haslea possède une coque de silice amorphe
appelée frustule. Cette coque apporte une protection aux diatomées mais permet aussi le
maintien de la membrane cellulaire (Crawford et al., 2001). Longtemps considérées
comme fragiles, les premières hypothèses de cette fragilité se sont reposées sur sa
structure de verre ainsi que de sa forme pennée. Cependant, la caractérisation de la
fragilité d’une souche ne dépend pas seulement des paramètres physiques de la structure
mais aussi de sa physiologie. De plus, il existe une grande diversité de systèmes de culture
qui possèdent chacun selon leurs formes, une diversité de mélange hydrodynamique et
donc de cisaillement. L’association entre les résultats de fragilité cellulaire et l’agitation
du réacteur est complexe. Les travaux de Rossignol (1999) ont permis de cerner les
limites physiques d’Haslea ostrearia face à différents systèmes de transferts et de
destruction cellulaire.
10.3.2.1 Passage dans une pompe péristaltique
Les premiers tests de Rossignol (1999), ont été faits dans des systèmes de transfert
de type pompes péristaltiques reconnus pour générer le moins de cisaillements possibles
(Le Borgne 2011). La viabilité cellulaire d’Haslea ostrearia a été mesurée après le passage
dans une pompe péristaltique à 3 temps de passages différents (Fig. 32).
51
Figure 32: Cinétique de croissance de culture après traitement en pompe péristaltique (Q=25 L. h-1) selon le
nombre de passage (étoile) témoin, + (croix) 10 passages, o (rond) 100 passages, ◻ (carré) 250 passages (Rossignol, 1999)
Haslea ostrearia montre une faible sensibilité à ce type de pompe après
250 passages au moins. Cependant, la sensibilité est moindre que chez les autres types de
systèmes testés par Rossignol. Aucune différence de taux de croissance après la remise en
culture des échantillons traités par pompes péristaltiques n’a cependant été constatée
mais les productivités baissent légèrement. On constate aussi, que même si la sensibilité
à 250 passages est faible, le nombre de passages est lui, aussi relativement faible, comparé
à l’utilisation d’une pompe de recirculation dans un PBR en continu où ces différents
passages peuvent durer sur plus d’un mois.
10.3.2.2 Impact des ultrasons
Les travaux de Rossignol se sont aussi concentrés sur l’étude de la sensibilité
d’Haslea aux ultrasons de manière à comprendre sa fragilité et envisager différentes
techniques de bioraffinage. Différentes expériences ont été réalisées permettant de
comprendre l’impact de la sonication sur les cellules d’Haslea (Fig. 33).
52
Figure 33: Influence de la puissance et de la durée de sonication sur le cassage des cellules d'Haslea ostrearia, V=300ml, □ (carrée) 550W, △ (triangle) 400W, ○ (rond) 300W (Rossignol 1999)
Selon ces résultats, la sonication à un effet non immédiat mais létal sur Haslea, avec
100% de mortalité apparaissant presque 2 minutes après le début de traitement à plus
haute intensité (550W). Cependant l’impact du volume de l’échantillon et donc de la
propagation des ultrasons dans le milieu de culture n’est pas négligeable (Fig. 34).
Figure 34: Influence du volume de suspension traité sur le cassage cellulaire d'Haslea ostrearia, P=550W, ◼
(Carré) 90s, ◻ (blanc) 60s (Rossignol 1999)
Cette méthode de cassage cellulaire ne semble pas détruire immédiatement les
cellules mais il est observé, par microscopie électronique à balayage (Fig. 35) que les deux
moitiés du frustule sont déboîtées, les parois sont altérées et visiblement percées par
endroit modifiant la membrane et permettant la libération du contenu cellulaire.
Cependant, les apex ne semblent pas altérés.
53
Figure 35: Observation de cellules d'Haslea ostrearia après traitement aux ultrasons par microscopie électronique à balayage : t=40s, P=400W, V=200mL (document LBM - ISOMer)
La puissance de sonication permet une meilleure efficacité de cassage de cellules
alors que le volume de suspension agit de manière inversement proportionnelle sur
l’efficacité de cassage.
10.3.2.3 Désintégration haute pression
Tout comme pour les travaux de sonication, de manière à pouvoir récupérer la
marennine intracellulaire, le système de broyage à haute pression a été utilisé pour
évaluer la résistance d’Haslea ostrearia à différentes pressions de 30 à 270 MPa (1 cycle)
(Fig. 36).
Figure 36: Influence de la pression du système de broyage haute pression sur le cassage cellulaire et la libération de marennine dans le milieu (1 cycle), ♦ (losange) dommages cellulaires, + (croix) diamètre moyen
des particules, ● (rond) marennine libérer (Rossignol 1999)
30 MPa permettent le broyage d’une partie des cellules mais c’est à partir de
100 MPa (1 cycle) que la totalité des cellules est broyée et que l’on obtient une
récupération optimale de marennine intracellulaire. Le rapport direct du cassage
54
cellulaire et de la dimension cellulaire est inversement proportionnel, dépendant de la
pression et du nombre de cycles (Fig. 37).
Figure 37: Influence du nombre de cycle du système de broyage haute pression sur la répartition de la taille des particules par granulométrie laser, (carré plein) culture initiale ; (carré vide) 30 MPa, 1 cycle ; (étoile)
L’analyse microscopique, quant à elle, montre la destruction du frustule après
traitement (Fig. 38), à la plus faible pression du système, allant jusqu’à détruire les
différentes couches du frustule.
Figure 38: Observation d'Haslea ostrearia par microscopie électronique à balayage (a) avant traitement, (b) après traitement (1 cycle 30 MPa) (Rossignol 1999)
Les expériences ont montré qu’Haslea ostrearia ne résiste pas à 30 MPa, la plus
faible pression du broyeur haute pression, ce qui est due selon Rossignol (1999) à sa taille,
sa forme pennée ainsi qu’aux caractéristiques physiques de son frustule.
55
10.3.2.4 Pompe à engrenages
La dernière technique utilisée par Rossignol (1999), pour le bio raffinage d’Haslea
ostrearia est le système de pompe à engrenages connu pour son fort potentiel de
cisaillement (Le Borgne 2011). Après observation au microscope électronique à balayage
(Fig.39), l’impact négatif de la pompe à engrenage est constaté sur la viabilité cellulaire
d’Haslea. L’étude de répartition granulométrique (Fig. 40) confirme ces résultats.
Figure 39: Observation de cellules d'Haslea ostrearia au microscope électronique à balayage avant (Gauche) et après passage dans une pompe à engrenage (Droite) (5L, 15min, 350 L. h-1) (document LBM - ISOMer)
En comparant avant et après traitement (par microscopie), les cellules semblent
brisées majoritairement au niveau des pointes ce qui est confirmé par granulométrie avec
un décalage du pic représentant les cellules entières (A1) vers un diamètre plus faible (A2).
Figure 40: Comparaison des répartitions granulométriques d'une culture d'Haslea ostrearia avant ⦁ (rond) et
après 100 passages ◻ (carré) dans la pompe à engrenages (300 L. h-1) (Rossignol 1999)
De même, la surface du pic correspondant à des fragments de cellules augmente
(B1 et B2) La présence de cellules cassées aux extrémités entraîne une répartition
granulométrique étendue des cellules (entre 5 et 15 µm de diamètre moyen).
56
Comme les travaux précédents de Rossignol, l’impact du cisaillement des pompes
dépend du nombre de cycles et de l’intensité du débit (Fig. 41).
Figure 41: Dégradation cellulaire en fonction du nombre de passages et du débit de circulation ◼ (carré) 200 L. h-1, ▲ (triangle) 300 L h-1, ● (rond) 400 L. h-1 (Rossignol 1999)
Selon la figure 41, plus le nombre de passages est important et plus la dégradation
cellulaire augmente, de même à nombre de passages identiques, l’augmentation du débit
de circulation augmente le taux de dégradation cellulaire. Selon Rossignol, cette
augmentation provient de l’augmentation de l’intensité des contraintes de cisaillement dû
à l’augmentation du débit, du changement de régime d’écoulement au sein de la pompe et
de l’augmentation de la fréquence de passages.
10.3.2.5 Centrifugation
Le procédé de centrifugation étant un procédé très utilisé pour la manipulation
laboratoire et préindustrielle d’une souche. Rossignol a cherché l’accélération et la durée
de centrifugation maximale que la souche pouvait supporter de 500 à 50 000 g sur des
durées de 1 à 90 minutes (Fig. 42).
57
Figure 42: Influence de l'accélération centrifuge sur la dégradation cellulaire et la libération de marennine (Rossignol 1999)
Les résultats montrent l’impact non négligeable de l’accélération centrifuge sur
Haslea ostrearia. En effet, au-dessus de 20 000 g presque 50% des cellules sont détruites,
ce qui est confirmé par une augmentation de la marennine relâchée dans le surnageant
par les cellules mortes. L’accélération maximale (50 000 g) engendre plus de 80% de
mortalité cellulaire ce qui valide l’impact négatif de l’accélération sur la souche.
L’impact de la durée de centrifugation sur le cassage cellulaire a été investigué
pour deux accélérations (15 000 g et 30 000 g) (Fig. 43).
Figure 43: Influence de la durée de centrifugation sur la dégradation cellulaire et la libération de marennine (Rossignol, 1999)
À une accélération <20 000 g, aucune dégradation significative est observée,
cependant, à une accélération >20 000 g, l’impact de la durée de centrifugation sur la
58
dégradation cellulaire est avéré et passe de 50% après 1min à plus de 60% après 45 min.
Une centrifugation <20 000 g pendant 15min est donc conseillée pour la
récolte/séparation d’Haslea ostrearia.
10.3.2.6 Conclusion
Toutes les techniques étudiées par Rossignol sont très efficaces pour le cassage
cellulaire d’Haslea ostrearia et démontrent ainsi que cette souche est particulièrement
sensible face aux systèmes de récolte, transfert et séparation. A l’origine mises en œuvre
pour mesurer l’efficacité d’extraction de la marennine intracellulaire, ces études
démontrent une fragilité liée à différentes caractéristiques physiologiques. D’après les
précédentes études par microscopie et granulométrie, Rossignol présente la Figure 44,
qui permet de comparer la répartition des tailles de cellule après traitement ultrasons,
pompe à engrenage et broyeur haute pression.
Figure 44: Comparaison de la granulométrie des suspensions selon la méthode de cassage cellulaire (Rossignol 1999)
La pompe à engrenages et les ultrasons sont des méthodes aussi efficaces pour la
libération de marennine mais les particules broyées restent de dimensions plus élevées
59
(diamètres compris entre 1 et 3 µm après). Le broyage haute pression, quant à lui, réduit
la cellule à des fragments de très faible diamètre (<1 µm). Le système de pompe à
engrenages semble casser très rapidement les apex cellulaires, alors que les ultrasons
« déboîtent » les deux parties du frustule (épithèque et hypothèque) libérant ainsi la
marennine interne. La technique de centrifugation n’est pas présentée sur la figure 44.
Cependant, les résultats montrent qu’il est nécessaire de manipuler cette souche à
15 000g maximum pendant 15 min pour ne pas observer de mortalité cellulaire.
Rossignol conclut ainsi, que parmi les techniques utilisées pour l’extraction de la
marennine, la pompe à engrenage représente le meilleur compromis : quantité extraite et
simplicité de mise en œuvre. Cependant, cela conclut aussi que l’apport ou le transport
d’Haslea ostrearia ne peut se faire par pompe sans altérer les rendements au sein du
photobioréacteur. Seul le système de pompe péristaltique semble avoir un faible impact
sur les cellules jusqu’à environ 200 passages à Q=25 L. h-1, mais les cultures supposeront
des débits parfois plus grands avec des fréquences de passages plus élevées, selon les
systèmes mis en œuvre
11 La culture microalgale en photobioréacteur
La culture de microalgues est ancestrale, elle avait déjà lieu il y a 2000 ans, en Chine,
où Nostoc, une cyanobactérie était récoltée pour l’élaboration de farine (Spolaore et al.,
2006). Au Mexique, en 1325, les Aztèques récoltaient la Spiruline dans le lac Texcoco pour
former des galettes séchées qu’ils consommaient (Belay et al., 1996). La première
production commerciale de spiruline démarre au Mexique par la compagnie Sosa
Texcoco, possédant plusieurs centaines d’hectares d’évaporateurs solaires en spirales
(pour une précédente activité de production de carbonate de sodium et chlorure de
calcium). Après un développement inattendu d’Arthropsira platensis, l’entreprise décida
d’utiliser en 1940, 20 hectares de ses évaporateurs pour la culture de cette cyanobactérie
(Fig. 45).
60
Figure 45: Infrastructures de production de spiruline de la compagnie Sosa Texcoco 1960
Très vite, le constat du besoin en lumière limitant les microalgues, entraîne
l’élaboration de systèmes spécifiquement pensés pour la production de microalgues,
appelés photobioréacteurs (PBRs) pour les plus contrôlés. Ces procédés de cultures sont
catégorisés par taille, niveau de contrôle des paramètres de culture (pH, température,
lumière, etc…), mode d’agitation, source lumineuse (solaire ou artificielle) ou encore
géométrie (plan, tubulaire, etc…). Aucun PBR de culture universelle n’a été créé pour
l’instant. L’intégration de la lumière dans le procédé le rend plus complexe qu’une
technologie classique. Ainsi, les technologies PBR actuelles, industrielles et de laboratoire,
dépendent de la zone géographique, des ressources à la disposition (eau, surface,
électricité, soleil…), des connaissances sur la souche cultivée (fragilité, extrêmophile,
besoin en lumière…), et du marché visé par l’application du procédé (agro-alimentaire,
D’autres travaux (Butterwick et al., 2005 ; Kudo et al., 2000 ; Xin et al., 2011 ;
Dermoun et Chaumont, 1992) mettent en lumière la diversité du comportement
microalgal face à la température (Fig. 55). Cependant, malgré cette diversité, les résultats
de la culture de Chlorella vulgaris correspond aux modèles d’Alexandrov, d’Hinshelwood
et de Ratkowsky qui centre la température optimale de croissance entre 20 – 25 °C.
71
Figure 55: effet de la température sur le taux de croissance de Phaeodactylum tricornutum, Scenedesmus sp., Dinobryon divergens et Porphyridium cruentum (Ras et al., 2013)
La température ne va pas altérer que les caractéristiques physiologiques de la
souche mais va avoir un impact non négligeable sur la chimie du milieu de culture, et ainsi
altérer les rendements de la culture. Les travaux de Le Gouic (2013) mettent en évidence
cet impact sur la solubilité du carbone, même dans les conditions de températures
supportées par les cellules (Table. 7).
Tableau 7: Evolution de la solubilité du carbone en fonction de la température, PCO2=380 ppm (Le Gouic, 2013)
Ainsi, la culture en PBR thermostaté, conduit à de meilleures productivités (à
température optimale de croissance) et à des résultats reproductibles.
11.3.3 Le pH
De même que pour la température, une gamme de pH optimale de croissance de
chaque microalgue existe. Chlorella vulgaris est capable de croître dans des cultures à pH
compris entre 5 et 9. Cependant, les croissances optimales sont obtenues dans des
cultures à pH compris entre 7 et 8. Les cyanobactéries sont souvent capables de supporter
des gammes de pH plus élevées, et donc des conditions de cultures souvent moins
axéniques, comme dans le cas des cultures ouvertes à pH 10 de spiruline (Richmond
1986).
72
Tout comme pour le cas de la température, le contrôle du pH au cours d’une culture
en photobioréacteur est essentiel pour la reproductibilité des résultats et l’assurance
d’obtenir des productivités optimales (à pH optimale de croissance).
Il est possible de réguler le pH de différentes manières :
- Par l’ajout de NaOH ou HCl, à l’image des cultures de microorganismes en
bioréacteurs. Le phénomène de respiration engendrant la décroissance de pH au
cours de la culture (Phase sombre), il est nécessaire de rajouter du NaOH pour
contrôler le pH. Dans le cas d’une culture autotrophe, le phénomène de
photosynthèse engendre une croissance du pH au cours de la culture, l’ajout d’HCl
est nécessaire.
- Par l’ajout de CO2. L’augmentation du pH liée au phénomène de photosynthèse,
peut être régulée par l’ajout de CO2, dont l’acidité tamponne le pH de la culture.
Ainsi, cette technique permet la régulation du pH tout en assurant un apport en
carbone inorganique constant.
Cette montée en pH des cultures en photo-auhotrophie est liée à la consommation
du Carbone Inorganique Dissous (CID), absorbé sous forme de HCO3 dans les
chloroplastes et consommé sous forme de CO2 comme le montre l’équilibre chimique
suivant (Eq. 7) :
Équation 7
𝑯+ + 𝑯𝑪𝑶𝟑 → 𝑪𝑶𝟐 + 𝑯𝟐𝑶
La Rubisco fixe le CO2 produit dans le cycle de Calvin et consomme le proton (H+)
libéré lors du processus photosynthétique. La transformation du HCO3– en CO2 libère alors
un ion OH- au sein de la cellule, qui doit le neutraliser par l’absorption de H+
extracellulaire. La baisse de H+ dans le milieu entraîne donc la montée du pH (Chi et al.,
2011).
En système de culture ouvert, la concentration en carbone inorganique au sein de
la culture et en équilibre avec l’atmosphère contenant des concentrations proches de
380ppm en CO2 (Le Gouic, 2013). Ainsi l’ajout de CO2 en continus justifie pour assurer un
apport en carbone inorganique constant. L’injection de CO2 en PBR assure donc une
73
culture non limitée en carbone inorganique. Les études de Le Gouic, basées sur Chlorella
vulgaris, permettent d’affirmer des besoins de 10 mM en CID pour une culture non limitée
de 1g. L-1 (MS). Ce carbone est apporté en début de culture par du bicarbonate de sodium
et/ou alimenté au cours de la culture par injection de CO2.
Le CID est présent sous différentes formes dont l’équilibre et la physico-chimie est
régie par le pH de la culture (Fig. 56).
Figure 56: Représentation des fractions molaires de carbone dissous en fonction du pH à 25°C (Kaplan et al., 1986)
Seul le CID sous forme de CO2 est soumis au phénomène d’équilibre entre les
phases aqueuses et gazeuses, pouvant engendrer une désorption du CID de la culture.
Ainsi, comme représenté sur la figure 56, les pH élevés à partir de 8 favorisent une faible
désorption du CO2 du fait d’une faible concentration en CO2 dissous dans le milieu. Ce
phénomène est souvent mis à profit dans les cultures de Spiruline en système de culture
ouvert pH>9. Cependant, la proportion plus importante des autres formes de carbone à
pH élevé, peut aussi engendrer des réactions inattendues entre espèces chimiques au sein
du milieu de culture, comme la précipitation des sels minéraux (Olsen et al., 2006).
11.3.4 La composition du milieu de culture
La composition du milieu de culture est essentielle pour la culture non limitée des
microalgues. Les microorganismes autotrophes consomment des nutriments sous forme
de minéraux divisés en deux classes, les macronutriments et les micronutriments.
74
Les macronutriments constituent les éléments que la microalgue requiert (mais ne
consomme pas forcément) une forte concentration (supérieure à 10 mg. g-1 de masse
sèche) tels que le carbone, l’azote, l’hydrogène, le phosphate, le calcium, le magnésium, le
souffre, le potassium et la silice pour les diatomées (Kaplan et al., 1986 ; Grobbelaar
2003). Le carbone est l’élément majoritaire qui constitue la biomasse, il représente
environ la moitié de la masse sèche de la microalgue. L’hydrogène et l'oxygène sont
présents en grande quantité aussi, mais obtenus à partir de la photolyse de l’eau ou par
consommation de l’oxygène dissous. Ainsi, le deuxième élément le plus important à
fournir après le carbone est l’azote dont la proportion peut varier de 1 à 10% de la matière
sèche. Ce macronutriment est indispensable à la production de pigments (essentiel à la
photosynthèse) et aux protéines (multiplication cellulaire). Dans le cas des diatomées, la
proportion de l’azote est souvent de l’ordre de 1 %, mais la cellule consomme aussi en
concentration similaire, la silice pour constituer son frustule. L’azote est consommé sous
forme d’ions nitrates pour la majorité des cas, mais peut aussi être consommé sous forme
d’ammonium ou encore de nitrite (dépend des espèces). Certains microorganismes sont
capables de consommer des formes organiques (urée) ou encore sous forme gazeuse (N2)
(Kaplan et al., 1986).
Le troisième élément essentiel à la croissance cellulaire est le phosphore. Il
représente en moyenne moins de 1% de la masse sèche, mais reste majeur pour la
production d’énergie chimique (ATP). Il est assimilé sous forme inorganique (HPO2-,
H2PO4-) mais certaines algues consomment du phosphate sous forme organique (Na2-β-
Glycérophosphate) (Andersen 2005). Le tableau suivant présente ces nutriments et ce
qu’ils représentent en termes de pourcentage dans la matière sèche selon Grobbelaar
(2003) (Table. 8).
Tableau 8: liste des macroéléments nécessaires à la croissance microalgale (Grobbelaar 2003)
Macroéléments Composés % de la matière sèche
C CO2, HCO3-, CO32-, molécules
organiques 17,5-65
O O2, H2O, molécules organiques 20,5-33
H H2O, H2S, molécules organiques 2,9-10
N N2, NH4+, NO3-, NO2-, aminoacides, urée
etc. 1-14
75
Na Multiples sels inorganiques (NaCl,
Na2SO4…) 0,04-4,7
K Multiples sels inorganiques (KCl,
K2SO4…) 0,1-7,5
Ca Multiples sels inorganiques (CaCl2,
CaCO3…) 0-8
P H2PO4-, HPO4
2- 0,05-3,3
S Multiples sels inorganiques (MgSO4…) 0,15-1,6
Mg Multiples sels inorganiques (MgSO4,
MgCl) 0,05-7,5
Cl NaCl, KCl, CaCl2… -
Si Na3SiO3, 9H2O 0-23
Les micronutriments constituent les éléments que la microalgue requiert (mais ne
consomme pas forcément) à faible concentration (Inférieur à 10 mg. gx-1 de la masse
sèche) tel que le fer, le brome, le manganèse, le cuivre, le molybdène, le valium, le cobalt,
le nickel, le sélénium, l’aluminium, le lithium, le rubidium ainsi que les vitamines et autres
facteurs de croissance (Kaplan et al., 1986 ; Grobbelaar 2003). Bien que présents en
faibles quantités, ces éléments sont essentiels pour la croissance des microalgues.
Cependant, peu d’études déterminent des besoins précis en micronutriments et leur
dosage reste encore à l’heure actuelle très complexe en raison des faibles concentrations.
Le tableau suivant présente ces nutriments et ce qu’ils représentent en termes de
pourcentage de matière sèche selon Grobbelaar (2003) (Table. 9).
Tableau 9: liste des microéléments nécessaires à la croissance microalgale (Grobbelaar 2003)
Microélément Composés % de la matière sèche
Fe FeCl3, Fe(NH4)2SO4 0,02-3,4
Zn, Mn, Br, B, Mo, V, Sr,
Al, Rb, Li, Cu, Co, I, Se - <0,1
Ce manque de connaissances sur les besoins en microéléments des microalgues a
poussé les premiers chercheurs dans le domaine, à baser leurs milieux de culture sur la
composition de leurs environnements naturels respectifs. La composition des
76
échantillons de substrats naturels est analysée et certains milieux de culture sont même
élaborés à partir des substrats naturels stérilisés (eau de mer, eau minérale, terre,
sédiments, etc… (Andersen, 2005)). La culture de microalgue intensive en PBR nécessite
un milieu de culture concentré en macro et macronutriment pour s’assurer d’une culture
non limitée et des productivités importantes. De même, un milieu artificiel est nécessaire
pour s’assurer d’une reproductibilité des résultats de productivités. Dans le cas de la
culture d’Haslea ostrearia, le laboratoire MMS a déjà cherché à optimiser la composition
du milieu de culture pour l’élaboration d’un milieu d’eau de mer artificiel, appelé DAM
(Gagneux et al., 2007).
11.3.5 L’agitation
L’agitation n’est pas considérée, dans la majorité des cas, comme un paramètre
directement lié à la croissance de la cellule. Cependant, comme présenté chapitre I.4.3,
certains microorganismes répondent différemment au facteur agitation.
D’un point de vue biologique, certaines microalgues possèdent une physiologie
nécessitant une agitation plus faible voire aucune agitation. Cette agitation induit des
forces (contraintes) pouvant hypothétiquement altérer l’intégrité physique de la cellule
ou inhiber la croissance par un phénomène de mécano-sensitivité. Il est généralement
constaté que certaines microalgues (dont Haslea ostrearia) ne peuvent supporter une
agitation conventionnelle, sans altérer les productivités, faisant du paramètre agitation,
un paramètre limitant au sein du PBR.
D’un point de vue physique, le paramètre agitation est considéré comme le plus
important depuis la mise en place des premiers réacteurs chimiques et bioréacteurs, au
même titre que la température et le pH (Hochfeld, 2005 ; Gabelle et al., 2012). L’agitation
permet l’optimisation de la cinétique de réaction chimique, favorisant l’homogénéité de
plusieurs paramètres tels que la thermique, la salinité, le pH et la concentration en
biomasse (pour les bioréacteurs et PBR). Ainsi, indirectement liés, le contrôle et le
maintien d’une bonne agitation permettent d’optimiser la productivité en biomasse en
bio-procédé.
Pour la culture de microalgues, les essais de Phillips et Myers en 1950, démontrent
qu’une culture agitée produit une biomasse plus dense. Ils expliquent cette différence par
la présence de gradients thermiques et de pH au sein du système de culture non agité
77
(Richmond et Hu, 2008). De plus, les travaux de Pruvost et Cornet (2012) présentent
l’homogénéité d’une culture comme un aspect essentiel pour de bonnes productivités
dues à un accès homogène des cellules à la lumière. Différents systèmes d’agitation sont
utilisés en PBR, des systèmes mécaniques et non-mécaniques, permettant la mise en
mouvement des microalgues. L’agitation non mécanique est l’agitation par bullage. Ce
type d’agitation à deux avantages : les contraintes de cisaillement générées sont
généralement faibles. De plus, il permet de favoriser le transfert de l’oxygène dissous de
la phase liquide vers la phase gazeuse, ce qui réduit le risque d’inhibition de la croissance
lié à une trop forte concentration en oxygène dans le milieu de culture (Kazbar, 2018).
L’agitation mécanique peut s’effectuer via une pompe de recirculation, une hélice
marine, une roue à aube ou encore par agitation manuelle en fonction de l’application et
de la géométrie du système de culture utilisé.
11.4 La culture d’Haslea ostrearia en photobioréacteur
Malgré la difficulté de cultiver Haslea ostrearia, le GEPEA et le MMS ont mis en place
différents types de systèmes de culture en cellules libres et en cellules immobilisées
(Rossignol 1999 ; Lebeau et al., 2000). Les hypothèses de l’incapacité d’Haslea ostrearia à
croître en système de cultures conventionnelles sont nombreuses. Les besoins en
nutriments de cette souche sont, depuis longtemps remis en question, ainsi que la gestion
des paramètres de cultures (Température, pH et irradiance). Cependant, l’agitation et plus
précisément les contraintes de cisaillement sont souvent citées.
11.4.1 Culture en cellules libres agitée
Peu de photobioréacteurs conventionnels en cultures agitées ont été utilisés pour
cultiver Haslea ostrearia, car la culture en erlenmeyer agité et en PBR montre déjà une
mort cellulaire (Jubeau, 2009). Très vite, l’agitation est apparue comme un paramètre
suspecté d’inhiber la croissance et/ou briser les cellules d’Haslea. Le GEPEA s’est penché
sur l’étude de la résistance d’Haslea en soumettant la cellule à des systèmes de
recirculation et de destruction cellulaire (Présenté chapitre I.4.3.2) et constate une
sensibilité réelle plus importante face à ces systèmes chez Haslea que chez d’autres
microalgues modèles cultivées au laboratoire (Chlorella vulgaris, Chlamydomonas
reinhardtii etc…).
78
Jubeau (2009) a essayé de cultiver Haslea ostrearia au GEPEA dans le premier PBR
de technologie Airlift, malheureusement sans succès (Fig. 57).
Figure 57: Photographie de la première culture d'Haslea ostrearia en photobioréacteur de technologie Airlift au GEPEA (Jubeau, 2009)
L’agitation a donc toujours été une problématique essentielle à la culture d’Haslea
ostrearia poussant les scientifiques du GEPEA et de MMS à se tourner vers d’autres
technologies. Les travaux de Rossignol et al., 1999, permettent ainsi la culture d’Haslea en
cellules libres agitées grâce à la mise en place d’un photobioréacteur à membrane
immergée (Fig. 58).
79
Figure 58: Installation expérimentale d'un photobioréacteur à membrane immergée pour la culture d'Haslea ostrearia (Rossignol et al., 1999)
Le PBR à membrane immergée est constitué d’un cylindre de verre de 40 cm de
hauteur, 15 cm de diamètre d’un volume total de 7 L pour un volume réactionnel de 6 L.
Deux modules plans d’ultrafiltration de 2 x 45 cm2, en polyacrylonitrile, à un seuil de
coupure de 40 KDa (IRIS 3038 Orelis, Miribel-France), sont placés au fond du PBR. Le
principe de ce PBR consiste à filtrer le surnageant au court du temps grâce à la force
hydrostatique de l’eau, puis de renvoyer, une fois par jour, du milieu de culture frais en «
retrolavage » par la membrane sous un gradient hydrostatique de 6 kPa. Pour optimiser
le transfert de nutriments, le PBR est agité par barreau aimanté pendant 5 min après
l’addition du milieu frais. Les faibles coûts et les faibles cisaillements générés par une
circulation de substrats sans pompe, représentent tout l’intérêt de ce système de culture.
Les productivités en marennine de ce système atteignent 2,45 ± 0,25 mgEMn. L-1. J-1
(Rossignol et al., 1999) et son considéré comme un record pour l’époque.
11.4.2 Culture en cellule immobilisées
L’immobilisation cellulaire consiste à fixer une cellule à un support. Ce concept est
divisé en deux types : l’immobilisation passive et active.
80
11.4.2.1 L’immobilisation cellulaire passive
L’immobilisation passive consiste à fixer des cellules sur support en utilisant la
capacité naturelle de ces cellules à produire une matrice adhérente au support (Moreno-
Garrido, 2013). Haslea ostrearia semblant en être capable de par sa physiologie (Rincé et
al., 1999), le laboratoire MMS a développé cette technologie. Dans un premier temps, la
culture de cellules immobilisées passivement s’est effectuée en système de culture fermé
à éclairage artificiel tel que les erlenmeyers et les bonbonnes de verre borosilicatées non
agitées (Fig. 59).
Figure 59: Photographie de cultures d'Haslea ostrearia en immobilisation cellulaire passive : (Gauche) en erlenmeyer non agité 500 mL, (Droite) en bonbonne de verre borosilicaté non agité 10 L
Basées sur les travaux du laboratoire MMS, ces techniques de culture permettent
d’atteindre de 2 à 10 mg. L-1 de marennine extracellulaire en condition de batch
(Rossignol 1999 ; Jubeau 2009 ; Prasetiya et al., 2016). Le laboratoire canadien de l’UQAR
a lui aussi développé des systèmes de cultures fermés à éclairage artificiel expérimental.
Les PBR de 100 L (Fig. 60) permettent de monter à des concentrations en marennine
d’environ 6 mg. L-1 et des productivités en batch de 0,2 mgEMn. L-1. J-1 (Gastineau et al.,
2014 ; Turcotte et al., 2016).
81
Figure 60: Culture d'Haslea ostrearia dans les PBR expérimentaux UQAR : (a) photographie de deux des PBR, (b) courbe de la EMn mesuré dans le surnageant durant 35 jours de batch (Gastineau et al., 2014)
Le laboratoire MMS a de son côté mis en place un système de culture ouvert à
éclairage solaire de 10 m3, ouvrant la voie de la culture d’Haslea ostrearia en extérieur
pour des applications ostréicoles (Fig. 61).
Figure 61: Méthodologie de la préparation de la culture d'Haslea ostrearia en tank de 500 L et en open pond expérimental de 10m3 (Turpin et al., 2001)
Les conditions de culture de ce système sont moins contrôlées que pour le cas de
systèmes fermés. Les productivités obtenues sont présentées ci-dessous (Fig. 62).
82
Figure 62: Variation de la densité cellulaire et de la concentration en marennine dans le surnageant au sein des culture en batch d'Haslea ostrearia (en tank 500 L et pond 10 m3) (Turpin et al., 2001)
Ce système permet d’atteindre une concentration de 2 x 107 cellules. L-1 et une
concentration en marennine extracellulaire de 3,4 mg. L-1, soit une productivité
volumique moyenne de 0,34 mg. L-1. J-1.
11.4.2.2 L’immobilisation cellulaire active
L’immobilisation cellulaire active consiste à fixer des cellules sur support ou
bloquer les cellules dans une matrice, en utilisant une technologie d’immobilisation
biocompatible pour adhérer/ bloquer les cellules sur/dans le support (Moreno-Garrido,
2013). Parmi les méthodes d’immobilisation, beaucoup sont utilisées pour les
microorganismes non photosynthétiques tels que l’immobilisation dans/sur la mousse
synthétique, les billes/le gel de silice, des fibres de matériaux rugueux etc… La contrainte
de la propagation de la lumière, indispensable pour les microorganismes
photoautotrophes, limite les méthodes d’immobilisation active aux gels d’agar-agar,
d’alginate, carraghénane et autres gels transparents.
11.4.2.2.1 Inclusion cellulaire en matrice agar-agar
La technique d’inclusion cellulaire en gel d’agar-agar est très utilisée en
microbiologie pour le comptage et même la culture cellulaire (Lebeau et al., 1999 ;
Moreno-Garrido, 2013). Lebeau valorise ici cette technique pour bloquer les cellules au
centre du PBR dans un gel d’agar, au contact d’un tube percé où débouchaient des fibres
optiques permettant la diffusion de la lumière dans la fine couche d’Agar. Une membrane
poreuse constituée d’une grille en Inox maintenait la structure de gel sur le tube Inox (Fig.
63).
83
Figure 63: représentation du photobioréacteur à cellules immobilisées expérimental (Lebeau et al., 2000)
Le milieu de culture frais est injecté en continu (D=0,25 J-1) et circule dans le PBR
et le gel d’agar grâce à une pompe pour la récupération de la marennine extracellulaire.
Malgré l’ingéniosité du procédé, les résultats de productivité volumique restent faibles et
ne dépassent pas 0,5 mgEMn. L-1. J-1 (Rossignol 1999 ; Lebeau et al., 2000).
11.4.2.2.2 Inclusion cellulaire en billes d’alginates
Le principe de cette technique consiste à inclure des cellules à l’intérieur d’un
polymère d’alginate de calcium. Cette technique de culture cellulaire a été étudiée sur
d’autres microalgues avant Haslea, souvent dans le but de protéger les cellules de
l’agitation, d’optimiser la récupération d’exométabolites et/ou de biomasse (Moreira et
al., 2005), faciliter l’ingestion de biomasse en aquaculture (Espinosa et al., 2006), pour la
gestion en souchotèque (Lebeau et al., 1998) ou encore pour le traitement de l’eau (Wilde
et Benemann, 1993 ; Vilchez et al., 1997).
84
Figure 64: représentation d'une inclusion cellulaire dans un polymère d'alginate de calcium
Comme présenté en figure 64, les cellules (microalgues) mélangées dans la
solution d’alginate de sodium, se retrouvent incluses au sein des billes d’alginate lors de
la polymérisation (instantanée) de l’alginate avec des cations bivalents (Mg2+, Sr2+, ou
Ca2+…).
Quelques études ont été réalisées sur la croissance d’Haslea ostrearia et Nitzschia
closterium en billes d’alginate (Lebeau et al., 1998 ; Espinosa et al., 2006 ;) notamment
pour le stockage de ces souche (Fig. 65).
Figure 65: photographie au microscope optique : (A) de billes d'alginate vide, (B) de microcapsule d’alginate contenant Nitzschia closterium (Lebeau et al., 1998)
Les résultats de production de biomasse/marennine dans ses conditions, ne
montrent pas de productivités importantes (expérimentation pour le stockage) mais
surtout, la conservation du polymère d’alginate ne dépasse pas 15 jours avant de montrer
des signes de dégradation dans l’eau de mer. Cependant, la solution de production en
85
billes d’alginate, pour la protection des cellules contre les cisaillements reste
envisageable. Malgré une dissolution du gel en eau de mer due essentiellement à la
présence de cations, certaines techniques de chélation des cations « parasites » et/ou de
renforcement du gel sont possibles (Moreira et al., 2006 ; Castro-Ceseña & Del Pilar
Sánchez-Saavedra, 2014). D’autre part, il a été constaté que la division cellulaire
engendrait aussi une perturbation de la structure des billes (Lebeau et al., 1998).
86
Conclusion
Haslea ostrearia est une microalgue eucaryote de la classe des Bacillariophyceae
(diatomées), du genre Haslea. Cet organisme photosynthétique est capable de produire et
d’excréter de la marennine (Gastineau et al., 1983), un pigment bleu-vert. Découverte
avec le phénomène de verdissement des huîtres, la marennine est sécrétée par Haslea
ostrearia dans les claires à huîtres et est filtrée par les huîtres (et d’autres bivalves) pour
donner à leurs branchies une couleur verdâtre (2014 ; Barillé et Cognie, 2000 ; 1998 ;
Gastineau et al.,). La marennine a donc un intérêt organoleptique pour la production
d’huîtres mais ce pigment possède aussi des propriétés antibactérienne, antivirale,
antitumorale et allélopathique (Gastineau et al., 2012) à fort potentiel applicatif.
Contrairement aux microorganismes photosynthétiques modèles (Chlorella sp,
Spirulina sp, Chlamydomonas sp etc…) la culture d’H. ostrearia en photobioréacteur dans
des conditions conventionnelles est considérée comme très difficile. La réponse de cette
souche tychopélagique face à l’agitation reste incomprise. Différents essais ont été
cependant réalisés par le laboratoire MMS, du GEPEA ainsi que celui de l’UQAR, comme
présentés ci-dessous (Fig. 66).
Basé sur des constats de croissances observées en erlenmeyers à agitation
magnétique ainsi que dans des bioréacteurs en verre (données non publiées), une mort
cellulaire est très vite observée. De plus, Rossignol et al., (1999), démontre qu’Haslea
ostrearia souffre, plus que d’autres microalgues (modèles) face aux contraintes imposées
par la recirculation en pompe. Ainsi, Lebeau a créé un PBR à cellules immobilisées.
D’autres technologies de cultures immobilisées (actives et/ou passives) ont été
développées telles que la culture en bassin pour le verdissement des huîtres (Turpin et
al., 2001), la culture en billes d’alginate (Lebeau et al., 1998) et encore les PBRs
expérimentaux de l’UQAR au Canada (Gastineau et al., 2014). Le GEPEA se tourne vers des
technologies à cellules agitées (pas en continu) telles que la première culture en PBR
airlift (Jubeau, 2009), sans succès, ou encore le PBR à membrane immergée de Rossignol
(1999), permettant, jusqu’ici, les meilleurs rendements en productivité volumique de
EMn. Malgré ces avancées technologiques conséquentes, différentes problématiques de
cultures restent à résoudre, et ont fait l’objet de cette thèse, dont le but est de créer et/ou
optimiser un photobioréacteur spécifique pour la culture continue industrielle d’Haslea
ostrearia.
87
Figure 66: Représentation chronologique des innovations de productivité en marennine extracellulaire selon les différentes technologies de systèmes de culture mis en place par les laboratoires MMS, du GEPEA et de l'UQAR
88
Ainsi, les différents systèmes de culture, présentés figure 66, n’ont pas utilisé les
mêmes milieux de culture ainsi que les paramètres de cultures. Ces différences
proviennent majoritairement des contraintes de chaque procédé, mais aussi d’un manque
de connaissances sur la réponse d’Haslea ostrearia face aux paramètres de culture.
Beaucoup de travaux ont été mis en place pour déterminer le meilleur milieu de culture
pour Haslea ostrearia (Turpin et al., 1999 ; Gagneux-Moreaux et al., 2007 ; Mouget et al.,
2009). Cependant, les seuls milieux retenus pour la production en continue (industrielle
ou non) sont des milieux à base d’eaux de mer naturelle (F/2, ES1/3 présenté chapitre
III), pouvant être limitant pour la production d’EMn et diminuant la reproductibilité des
résultats de productivité en biomasse et en marennine. D’autre part, le pH et la
température de culture utilisés dans tous les systèmes de cultures sont ingénieusement
basés sur les conditions de culture de l’écosystème d’Haslea ostrearia. Cependant, ces
deux paramètres, très importants pour une culture, peuvent être à l’origine d’une
limitation de la productivité et les informations récoltées sur la réponse d’Haslea ostrearia
à ces paramètres dans la littérature, ne permettent pas de nous assurer des conditions
optimales de production.
La sensibilité d’Haslea ostrearia à l’agitation reste aussi à éclaircir. Cependant,
quelques études ont déjà été publiées essentiellement par le laboratoire du GEPEA. Cette
cellule semble plus sensible que des modèles tels que Chlorella face à des traitements de
broyages, recirculation et séparation (Rossignol, 1999). Aucun type de pompe ne permet
de faire recirculer Haslea ostrearia en continu sans altérer l’intégrité cellulaire. Le
traitement de sonication semble provoquer l’altération du frustule mais surtout déboîte
les deux parties de celui-ci et déclenche la mort cellulaire à partir de 2 minutes de
traitement à 550 W. L’impact du traitement de centrifugation est aussi non négligeable
sur Haslea ostrearia avec 50% de mortalité cellulaire >20 000 g.
Cependant, les contraintes appliquées sur la cellule lors de ces traitements
s’éloignent fortement des contraintes potentielles apportées dans un photobioréacteur.
Selon le mode d’agitation et le type de photobioréacteur, les contraintes au sein du PBR
peuvent être fortement différentes, mais la déformation du fluide liée à l’agitation d’un
système de culture entraîne inévitablement des contraintes de cisaillement pouvant
impacter l’intégrité cellulaire (Olmos et al., 2003 ; Pruvost et al., 2006 ; Ndiaye et al., 2018
; Wang & Lan, 2018).
89
Ce phénomène de sensibilité cellulaire aux contraintes de cisaillement (ou autres
types de contraintes) est appelé mécano-sensitivité cellulaire (Griffin et al., 1992 ;
Tavernarakis & Driscoll 1997) et peut favoriser (ou non) la production d’un métabolite
chez certaines cellules tout comme déclencher la mort cellulaire, souvent à hauts
cisaillements. L’impact physique du cisaillement déclenché par l’agitation n’est donc le
plus souvent, pas directement responsable de la baisse de productivité. Un lien peut
apparaître avec la physiologie de la cellule. La question est donc ici, de comprendre si
Haslea ostrearia est réellement sensible aux contraintes de cisaillement, ou si elle possède
une physiologie différente des microalgues considérées comme modèles en production
lorsque les cisaillements sont appliqués.
Pour terminer, la production de marennine extracellulaire par Haslea ostrearia est
un phénomène beaucoup étudié, qui pourtant reste encore sujet à débat. Beaucoup
d’hypothèses divergentes sont soulevées dans les travaux existant (Moreau, 1970 ;
Neuville et Daste, 1978 ; Rossignol, 1999 ; Lebeau et al., 2000 ; Tremblin et al., 2000 ;
Robert et al., 2002 ; Mouget et al., 2005). Le mécanisme de synthèse et d’accumulation de
marennine reste globalement inconnu. D’autre part, les connaissances accumulées sur la
réponse d’Haslea ostrearia face à la lumière ne permettent pas d’établir une gamme de
tolérance précise. Les limites lumineuses qu’Haslea est capable de supporter sont encore
méconnues à l’échelle du PBR de laboratoire alors que ces informations sont essentielles
pour l’élaboration/optimisation d’un PBR à échelle industrielle.
90
Chapitre II:
Matériel et méthodes
91
1 Matériel biologique
1.1 Haslea ostrearia
La microalgue utilisée lors des études de production durant cette thèse est Haslea
ostrearia, (diatomée) prélevée à Bouin (France, Vendée) et isolée au laboratoire MMS (EA
2160) de l'Université de Nantes. Cette souche provient de la Nantes Culture Collection
(NCC), elle est référencée sous le numéro NCC 495. Les caractéristiques biométriques de
ce clone sont présentées dans le tableau 10. Ce clone a été sélectionné pour sa production
de marennine.
Tableau 10: Biométrie du clone NCC 495 d'Haslea ostrearia et aspect au début et à la fin de la thèse***
Date de
biométrie
02/03/2016 20/03/2018
Longueur (µm) 73,09±0,72 31,40±0,36
Largeur (µm) 8,80±0,37 6,04±0,15
Aspect
La déformation de la cellule observable le 20/03/2018 (Tableau 10) semble
inévitable et survient dès les premières semaines de la mise en culture en verrerie.
D’autre part, la cellule diminue en taille au cours des divisions successives sur plusieurs
générations, ce qui explique son différentiel de taille deux ans après la première culture
d’Haslea. Cette décroissance de taille est liée à la physiologie des diatomées et finit par
réduire les productivités (biomasse/marennine) d’Haslea. Ainsi, le clone NCC 501
(Tableau 11) a été fourni par le MMS pour terminer les résultats de thèse.
*** Les valeurs sont significatives ± IC 95% pour n=50.
92
Tableau 11: Biométrie du clone NCC 501 d'Haslea ostrearia et aspect à réception du clone†††
Date de biométrie 09/04/2018
Longueur (µm) 65,45±0,32
Largeur (µm) 6,89±0,15
Aspect
1.2 Nannochloropsis galitana
La souche Nannochloropsis gaditana est une Chlorophycée marine. Le clone 527,
provenant de la collection NCMA/CCMP est cultivé depuis 2015 (Taleb et al., 2015) au
GEPEA. Cette souche n’a été utilisée que pour la validation du photobioréacteur à cellules
immobilisées.
1.3 Chlorella vulgaris
La souche Chlorella vulgaris est une Chlorophycée d’eau douce. Le clone F&M-M33,
provenant du Fotosintetica & Microbiological Srl Culture Collection, est cultivé depuis
2015 (Taleb et al., 2015) au GEPEA. Cette souche n’a été utilisée que pour le test de
résistance de la technologie d’immobilisation cellulaire par encapsulation en bille
d’alginate face à l’agitation en airlift.
††† Les valeurs sont significatives ± IC 95% pour n=50.
and silicon) are given in Table 1 for all the growth media. No significant differences were
observed except for a lower nitrogen concentration in the ES1/3 medium. In addition, no
124
copper was added to ES1/3, as it was with the F/2, ASW and Conway media, however,
differences due to the presence of copper in different seawater supplies cannot be
disregarded. Nitrogen concentrations remained proportional to phosphorus
concentration in the three media, and a higher concentration of silica was also found in
ES1/3 than in the other media. The main difference between the media was the supply of
phosphorus, which was organic (Na2-β-glycerophosphate) for the ES1/3 medium.
4.2 Effect of organic and inorganic sources of carbon and phosphorus on
Haslea growth
The various carbon and phosphorus sources (organic or inorganic, noted as org and
inorg respectively), as well as the addition of Cu, were tested in flat flasks (Fig. 2). The
composition of the conventional ES1/3 medium (C-inorg P-org) was shown to strongly
limit cell productivity with only 4.6 x 106 cell L-1 d-1. Biomass productivity was also
strongly inhibited when organic P sources were combined with the addition of Cu, with
2.2 x 105 and 3.3 x 105 cell L-1 d-1 for C-inorg P-org Cu and C-org P-org Cu respectively.
However, when both P and C sources were in organic form, cell productivity was
significantly higher with 17 x 106 cell L-1 d-1. Similar high productivity of was also
observed when using only inorganic sources, with 18 x 106 cell L-1 d-1 for both C-inorg P-
inorg Cu and C-inorg P-inorg.
125
Fig. 2: Cell, Extracellular Marennine (EMn) and specific EMn productivity of Haslea ostrearia in batch culture after 7 days in natural seawater-enriched (ES 1/3) based medium with different sources of phosphorus and
carbon. P EMn specific and Pv are, respectively, the specific EMn productivity and the volumetric productivity. Data is mean ±95% CI for n=3.
Concerning the specific EMn productivity results, carbon and phosphorus sources
also seemed to have a consistent impact. The first apparent observation emphasizes that
all the culture media composed of organic phosphorus seemed to stimulate specific EMn
production. In contrast, the culture media made with inorganic sources of phosphorus
definitely resulted in low levels of specific EMn production. For growth media where
photosynthesis was hypothesized to occur (C-inorg P-org Cu and C-org P-org Cu), low
biomass with no significant differences (T.Test p=0.424) and high specific EMn
productivity was obtained, with respectively 1.37 and 5.38 mg 106 cell-1 d-1. However, the
medium (C-inorg P-org Cu) induced lower EMn productivity than (C-org P-org Cu), with
respectively 0.30 and 1.78 mg L1 d-1. Comparing similar medium compositions with and
without copper, the presence of copper was found to stimulate EMn synthesis in the
presence of organic carbon, whereas the opposite was found with inorganic carbon, with
EMn production significantly lower (T.Test p=0.008).
These results lead to the assumption that H. ostrearia has difficulty consuming
inorganic carbon (photosynthesis) in the presence of an organic source of phosphorus,
0
1
2
3
4
5
6
0
5
10
15
20
25
PV
EMn
(m
g L-1
d-1
)P
EM
n s
pec
ific
(m
g 1
06ce
ll-1
d-1
)
PV
cell
(10
6ce
ll L-1
d-1
)
PV cell PV EMn P EMn specific
126
and may, therefore, favor the organic source of carbon for growth, but this hypothesis
cannot be demonstrated without further studies.
Fig. 3: Impact of organic phosphorus and copper on marennine and biomass productivities according to carbon and phosphorus sources in ES1/3 based medium. Data is mean ±95% CI for n=3.
Figure 3 presents a detailed analysis of the influence of copper and P organic
sources. For a better clarity, each result was normalized against its control. P-org C-inorg
and P-org C-org experiments results have been normalized against the same treatment
with inorganic phosphorus (P-inorg C-inorg and P-inorg C-org). Concerning the Cu
experimental results, these have been normalized against the same treatment without
emphasized the significant impact that organic phosphorus has on biomass productivity.
Cell productivity lost 74.6% vs the control with an inorganic carbon source, compared to
cell productivity with an inorganic phosphorus medium, whereas, in the presence of
organic carbon, the culture had 17.1% higher productivity with organic phosphorus than
with inorganic. As a result, it can be concluded that H. ostrearia presents significantly
better growth in either a completely organic or inorganic medium (in terms of carbon and
phosphorus), and presents significant difficulties with growth on organic phosphorus
with inorganic carbon. Additionally, the organic phosphorus allows H. ostrearia to achieve
-150
-100
-50
0
50
100
150
200
Bio
mas
s
EMn
Bio
mas
s
EMn
Bio
mas
s
EMn
Bio
mas
s
EMn
Bio
mas
s
EMn
Bio
mas
s
EMn
C-inorg C-org C-inorg P-org C-inorg P-inorg
C-org P-org C-org P-inorg
Imp
act
of
org
anic
PO
42
-an
d C
u2
+ o
n b
iom
ass
and
m
are
nn
ine
pro
du
ctiv
itie
s (%
)
Porg Cu
127
a gain of 94.0% and 122.9% in EMn productivity when combined with an inorganic and
an organic source of carbon, respectively.
Regarding EMn production, two typical media can be considered. C-inorg P-org
medium offers a final EMn concentration of 18.0 ± 0.2 mg L-1 compared to 11.1 ± 3.3 mg
L-1 for the C-inorg P-inorg medium. For the former, a small quantity of biomass was
produced whilst producing a large quantity of EMn, whereas for the latter, a large amount
of biomass was produced but with a small EMn specific productivity.
Concerning the impact of Cu on biomass and EMn productivity, Figure 3 confirms
the previous hypothesis on completely inorganic medium. Copper does not significantly
impact biomass productivity when an inorganic P source is used (C-inorg P-inorg and C-
org P-inorg) in contrast with an organic P source (C-inorg P-org and C-org P-org).
Regarding marennine production, the correlation of the presence of copper with
the resulting productivity is unclear. Copper was found to only stimulate EMn
productivity for a completely inorganic medium (carbon and phosphorus) with 20.4%
more EMn. However, the ES1/3 medium induced a loss of 87.2% EMn productivity when
copper was added, whereas (C-org P-org Cu) medium showed a constant specific EMn
production (Fig. 2 and 3).
Because organic sources were not found to be mandatory for H. oslearia growth, a
fully mineral medium was retained as a basis for the remaining part of this study. At large
scale, a medium such as this will indeed limit bacterial contamination.
4.3 Determination of inorganic C and P source concentration in natural
seawater culture medium
A stoichiometry analysis based on biomass elemental composition (C, H O, N, P, S,
Si) has been carried out with the aim of defining a medium that allows a biomass
concentration of 1 g L-1 to be achieved without macronutrient limitation [33,34]. Failing
to obtain significant biomass for analysis, the elemental composition of H. ostrearia has
been estimated based on the elemental composition of Chlorella vulgaris, which was
grown separately for the purpose (data not shown). Contrary to the Chlorophyceae, H.
ostrearia is a member of the Bacillariophyceae and needs silicon for frustule synthesis.
According to Turpin et al. [35], the macronutrient mass ratio C:N:P:Si, for H. ostrearia
128
growth is 106:16:1:16. The cell, therefore, needs the same mass of silica as nitrogen. Based
on this result, and the molecular weight of Si (28 g mol-1) and N (14 g mol-1), the following
molar elemental composition formula of H. ostrearia is proposed:
C3.805H4.110O1.359N0.688P0.081S0.024Si0.344
The biomass molecular weight (Mbiomass=24.72 g mol-1) and this formula allow us
to theoretically determine the C, N, P, S, Si concentration needed to produce 1g L-1 of
biomass (for example, for 1 g of biomass, H. ostrearia needs 7 mmol of nitrogen). Based
on this analysis, phosphorus and carbon concentrations in the ES1/3 medium were found
to be underestimated compared to the nitrogen and silica available in the medium. The
composition of the medium was, therefore, adjusted to propose a composition more
equilibrated in N and P. By applying a 1.5 coefficient to ensure 1 g L-1 biomass was
achieved without limitation, this led to 25-fold and 100-fold increases in N and P,
respectively (noted 25N100P) (Table 1).
In the first instance, micronutrient concentrations were considered to be in excess
in the medium, and their original concentrations as defined in the ES 1/3 medium were,
therefore, kept, but in completely inorganic source. However, the silica concentration
(Table 1) was found to be impossible to achieve without the precipitation phenomenon.
According to Fournier and Rowe (1977), amorphous silica solubility is restricted to 100 –
150 mg L-1 (1.7 – 2.7 M) at 25°C, which could decrease to 1-7 mg L-1 (1.7 x 10-5 to 1.2 x 10-
4 M) with the presence of calcium, aluminium and iron cations. However, it may increase
with dissolved inorganic matter. Because of this very low solubility, it was decided to
supply silica separately to the photobioreactor experiments.
A new set of experiments in flat flasks was designed to validate the new media
proposed (Fig. 4), namely NP medium (which corresponds to a fully mineral medium but
with the same N and P molar concentration as the previous ES1/3 medium shown in Table
1, but obtained from natural seawater with various enrichments in N and P up to
25N100P). Note that the period of growth for this experiment did not exceed 8 days.
129
Fig. 4: Cell, EMn and specific EMn volumic productivities of Haslea ostrearia for various media (ES 1/3, artificial seawater (ASW) and ES 1/3 based medium with completely inorganic C and P (NP)). P EMn specific
and Pv are, respectively, the specific EMn productivity and the volumetric productivity. Data is mean ±95% CI for n=3.
According to Figure 4, the NP medium was found to be much more efficient than
ES1/3 in terms of both biomass and EMn. Although the ES1/3 medium allowed the best
EMn specific productivity (Fig. 2 and 3), 6N24P allowed higher EMn concentration with
1.32 mg L-1 compared to 0.17 mg L-1 for ES1/3. The ASW medium allowed cell growth
higher than the ES1/3 medium but was still inferior to NP, with respectively 0.9 x 107cell
L-1 d-1 and 1.8 x 107cell L-1 d-1.
The progressive increase in concentration of N and P resulted in an increase of
biomass up to the 6N24P enrichment. This medium composition showed the best biomass
and EMn production, of respectively 3.0 x 107 cell L-1 d-1 and 1.3 mg L-1 d-1. With higher
enrichment (9N36P and more), therefore, a significant decrease in EMn and biomass
productivity was observed, and the 18N72P medium ultimately led to cell death. These
results could be explained by the silica and carbon concentration, which was the same for
all media but not increased proportionally. The rationale was that Si concentration limited
the strain growth at 3.0 x 107 cell L-1 d-1 (see below). A significant precipitation was
observed from the 12N48P concentrations. Note that 3.0 x 107 cell L-1 d-1 also represents
the maximum value of biomass production that is currently reported in the literature
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
ES1/3 NP 6N24P 9N36P 12N48P 18N72P 25N100P ASW
PV
(mgE
Mn
L-1
d-1
)P
EM
n s
pec
ific
(m
g 1
06ce
ll-1
d-1
)
PV
(10
7ce
ll L-1
d-1
)
Medium
Pv Biomasse Pv EMn Pspecifique EMn
130
(Rossignol et al., 1999). Medium stability could, thus, explain the actual low H. ostrearia
biomass production, as precipitates are not biologically available for cell growth.
The 6N24P medium, which led to the best productivity, was used as a basis for
further investigation of H. ostrearia macronutrient needs in PBR (see final section).
4.4 Component interaction and medium precipitation
Nguyen et al. (2013, 2014) explained the precipitation/flocculation phenomenon
of a seawater-based medium by the interaction between high concentrations of Ca2+, PO43-
and Mg2+ ions. By using Visual MINTEQ V3 software (KTH, Sweden), which enables
prediction of dissolution equilibrium, the percentage of chemical species of
macronutrients (N, P, Si, C) was investigated for the 25N100P medium at different pH
levels and at a fixed temperature (22°C) (Fig. 5).
Dissolution equilibrium predictions confirmed the interaction of the Ca2+, PO43-
and Mg2+ ions. The seawater endogenous ions, Ca2+ and Mg2+, were found to react with the
macronutrient enrichment ions in the culture medium. In addition, the extent of
precipitation increased with pH value. The magnesium precipitated with around 0.8% of
carbon and 20% of phosphorus, as well as with the calcium with 0.4% of carbon and 3.4%
of phosphorus at pH 7.8. Phosphorus precipitation with calcium and magnesium was
emphasized, with an important loss of 23.35% of the phosphate even at pH 7.8. Note that
no significant precipitation was predicted with the nitrogen source.
131
Fig. 5: Simulation of precipitated molecules (%) in the 25N100P medium for 3 pH values (Visual MINTEQ software)
Unfortunately, silica interaction could not be predicted with Visual MINTEQ, as the
software was set up for freshwater analysis. However, silica interaction in seawater is a
common matter for diatom culture and has been studied by Vollast et al. (1968). Their
results confirm the precipitation of hydrated magnesium silica, called synthetic sepiolite,
by the addition of metasilicate in seawater (eq. 1):
This equilibrated equation finds the solubility of amorphous silica to be 115 ppm,
as confirmed by Morey et al. (1995) with the possibility of precipitation of other nutrients
dependent on variations in temperature and pH.
The analysis shows that the precipitation phenomenon in natural seawater could
represent a significant limitation for H. ostrearia cultivation due to the high content of
both Ca2+ and Mg2+, as it limits medium enrichment and, therefore, the achievable biomass
132
concentration and productivity. Reducing calcium and magnesium, as a possible solution
to prevent precipitation, was investigated by designing an artificial medium.
4.5 Study of the impact of micronutrients on biomass and marennine
production in artificial seawater medium
Based on the previous study (Fig. 4), it was assumed that a medium composition of
nitrogen and phosphorus higher than 6N24P (inorganic) could be limited by silica
concentration. The 6N24P (inorganic) composition was, therefore, chosen for
micronutrient addition tests to prevent Si limitation during growth in artificial seawater.
The design for the experiment, which consisted of a large set of 180 flat flasks (Fig. 6),
provided useful information on the importance of each micronutrient for the optimization
of both biomass and EMn production in artificial medium conditions.
133
Fig. 6: Biomass [X] (bars) and EMn (circles) volumetric productivities (Pv) according to different macro and micro nutrient concentrations in artificial seawater. Data is mean ±95% CI for n=3
-0,5
0
0,5
1
1,5
2
2,5
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
4.5
x 1
0-5
4.5
x 1
0-4
4.5
x 1
0-3
4.5
x 1
0-2
8.4
x 1
0-5
8.4
x 1
0-4
8.4
x 1
0-3
8.4
x 1
0-2
1.0
x 1
0-5
1.0
x 1
0-4
1.0
x 1
0-3
1.0
x 1
0-2
5.8
x 1
0-9
5.8
x 1
0-8
5.8
x 1
0-7
5.8
x 1
0-6
3.9
x 1
0-9
3.9
x 1
0-8
3.9
x 1
0-7
3.9
x 1
0-6
6.8
x 1
0-6
6.8
x 1
0-5
6.8
x 1
0-4
6.8
x 1
0-3
1.2
x 1
0-6
1.2
x 1
0-5
1.2
x 1
0-4
8.1
x 1
0-3
9.0
x 1
0-3
1.6
x 1
0-2
9.2
x 1
0-2
5.3
x 1
0-3
5.3
x 1
0-2
5.3
x 1
0-1
2.3
x 1
0-7
2.3
x 1
0-6
2.3
x 1
0-5
2.3
x 1
0-4
6.6
x 1
0-9
5.4
x 1
0-8
5.4
x 1
0-7
5.4
x 1
0-6
3.4
x 1
0-1
0
3.4
x 1
0-9
3.4
x 1
0-8
3.4
x 1
0-7
2.5
x 1
0-3
2.5
x 1
0-2
2.5
x 1
0-1
6.5
x 1
0-1
0
6.5
x 1
0-9
6.5
x 1
0-8
6.5
x 1
0-7
9.0
x 1
0-5
9.0
x 1
0-4
9.0
x 1
0-3
3.0
x 1
0-8
3.0
x 1
0-7
3.0
x 1
0-6
3.0
x 1
0-5
B Br Ca Co Cu F Fe K Mg Mn Mo Ni S Se Sr Zn
PV
EMn
(m
g L-1
d-1
)
PV
bio
mas
s [X
] (1
06 c
ell
L-1d
-1)
Nutrients concentration (mol L-1)
B [X] PV Br [X] PV Ca [X] PV Co [X] PV Cu [X] PV F [X] PV Fe [X] PV K [X] PV Mg [X] PV Mn [X] PV Mo [X] PV
Ni [X] PV S [X] PV Se [X] PV Sr [X] PV Zn [X] PV B [EMn] PV Br [EMn] PV Ca [EMn] PV Co [EMn] PV Cu [EMn] PV F [EMn] PV
Fe [EMn] PV K [EMn] PV Mg [EMn] PV Mn [EMn] PV Mo [EMn] PV Ni [EMn] PV S [EMn] PV Se [EMn] PV Sr [EMn] PV Zn [EMn] PV
134
The first objective was to decrease the magnesium and calcium concentration to
reduce the occurrence of precipitation/flocculation, which was found to lead to culture
death. The best productivity was obtained at a cell density of 35.0±2.2 x 106 cell L-1 d-1,
with a calcium concentration of ca. 1.0 x 10-3 M, which is 9.4 times less than in the ASW
medium. The best productivity for magnesium was found at 6.4±0.4 x 106cell L-1 d-1 for a
magnesium concentration of 5.3 x 10-2 M, which is the same concentration as the ASW
medium composition.
The second objective was to increase micronutrient concentration to ensure a high
productivity with increasing concentrations of nitrogen, phosphorus and silica, thus,
preventing growth limitation. The only micronutrient that led to the highest biomass
productivity of 25.8±4.0 x 106cell L-1 d-1 was iron, with a concentration of 1.2 x 10-4 M.
This concentration represents 10 times that in the ASW medium, and biomass
productivity increased 5-fold. Zinc also seemed to increase biomass and EMn production
when increased 100-fold, compared to ASW. In addition, 10 times less boron than in ASW
increased biomass productivity, reaching 6.9±0.9 x 106cell L-1 d-1. Finally, a 10-fold
increase in nickel nutrient (3.4 x 10-8 M) led to higher EMn and biomass productivity, with
0.61±0.04 mg L-1 d-1 and 7.3±0.4 x 106cell L-1 d-1, respectively. H. ostrearia seemed to
tolerate the ASW range of concentrations for the other nutrients: bromine, cobalt, copper,
sulfur, selenium and strontium (T.Test with p>0.05). We can note that conclusions were
similar for both biomass and EMn, except for the molybdenum test, which seemed to show
an inverse correlation. This was not investigated further in the present work.
These results enabled the design of the new artificial seawater NX medium based
on the highest productivities previously obtained (Fig. 6).
4.6 Validation of the artificial seawater NX medium in a photobioreactor
Following verification that there was no visual precipitation, three recipes for
culture medium were tested in a 1 L Airlift photobioreactor. The same conditions of light
(300 µmol m-2 s-1), temperature (22°C), pH (7.8) and cell inoculation concentration were
applied. However, to definitely prevent silica and carbonate precipitation in the artificial
medium, the concentration of carbon and silicon added was equilibrated with the
nitrogen and phosphorus concentration following the same approach based on
stoichiometric growth, leading to 25N100P6Si media with a 10 mM of dissolved carbon
135
concentration maintained constant for the entire culture duration with CO2 addition via
the gas phase. Figure 7 presents the results in terms of cell density and EMn concentration
for batch cultures of 22 days.
Fig. 7: Comparison of Haslea ostrearia cell density culture in new NX-25N100P6Si medium with two natural seawater-based media. Data is mean ±95% CI for n=3.
Fig. 8: Comparison of EMn concentration from Haslea ostrearia culture in new NX-25N100P6Si medium with two natural seawater-based media. Data is mean ±95% CI for n=3
The three batches represented in Figures 7 and 8 reveal the efficiency of the new
artificial seawater culture medium NX. In terms of biomass, the ES1/3 medium limited
Cell viability was measured with a Nageotte counting chamber (Marienfeld, AQRA,
India) and a light microscope (AXIO Scope A1, Zeizz, Germany). The living cells were
counted before and after each physical treatment to calculate cell viability (%). Note that
staining to distinguish living and dead cells was found to be unnecessary due to the
specific shape of dying/dead H. ostrearia cells, as shown in Figure 9. All measurements
were made around 1 x 105 cells mL-1 in the early stage of the stationary step (maximal
concentration usually observed in an Erlenmeyer flask).
157
Fig. 9: Microscopic view of Haslea ostrearia. (A) is the contrast of two cells, cell (1) being alive and cell (2) being dead. (B and C) shows living cells in a bloc of cellular residues, with an assessment of cell viability by
chlorophyll fluorescence under UV
3.3 Photosynthetic efficiency and pigments measurement
Photosynthetic efficiency as described by the PSII quantic efficiency (i.e. Fv/Fm
fluorescence ratio) was measured by Chlorophyll fluorescence to estimate the impact of
shear stress/mixing on the photosynthetic capacity of the cell. This was obtained with a
chlorophyll fluorimeter (Water-Pam, Heinz Walz, Germany). The maximal value of Fv/Fm
fluorescence ratio is reported as reaching 0.6 for diatoms (Rech, 2004).
To measure pigments, Chlorophylls a and c and total carotenoids were measured
after extraction in 90% acetone (Strickland and Parsons, 1968; Ritchie, 2008).
Chlorophylls a and c were measured using Ritchie’s methodology (2008), and carotenoids
by the Strickland and Parsons (1968) methodology. Extracted pigment solution was
measured (480, 630, 647 and 664 nm) by spectrophotometer (V-630 UV-VIS, JASCO,
Germany). Note that these measurements were only made for torus-PBR experiments.
The extracellular marennine (EMn) was measured using a spectrophotometer (V-630 UV-
VIS, JASCO, Germany) in the supernatant after centrifugation of the sample. A wavelength
of 669 nm was selected and the EMn mass concentration measured using the Beer-
158
Lambert equation (ɛ = 12 x 104 mol L-1 cm-1 and MEMn = 9893 g mol-1) in accordance with
Pouvreau et al. (2006).
3.4 Determination of Mean Rate of Photon Absorption (MRPA)
The mean rate of photon absorption noted that “MRPA” refers to the photons
absorbed by cells per unit of time and biomass, and is expressed as µmolh𝑣 gX -1 s-1 (Cornet
et al., 1998; Pruvost et al., 2008; Kandilian et al., 2014). This physical quantity is related
to the light condition and the radiative properties of the cells, which were measured for
the experiment using a spectrophotometer with integrative sphere (Pilon et al., 2011;
Kandilian et al., 2016). MRPA can also be deduced from a balance on the photonic phase
on the culture system (Pruvost et al., 2008):
Equation 2
𝐴𝑙𝑖𝑔ℎ𝑡 =𝑆
𝑉 𝐶𝑋
(𝑞𝑂 − 𝑞𝐿) =𝑎𝑆
𝐶𝑋
(𝑞𝑂 − 𝑞𝐿)
where Alight is the MRPA received during a light period (µmolh𝑣 gX -1 s-1), q0 and qL refer
respectively to input and output photon flux density on the culture system (µmolh𝑣 m-2 s-
1), CX is the biomass concentration (g L-1), and aS the specific illuminated surface of the
culture system (m-1), which is the ratio between the illuminated surface S (m2) and the
culture volume V (m3).
Determination of the MRPA value was used to characterize the light absorbed by
suspended cells over a 24 h cycle. For this purpose, MRPA was first calculated during the
illuminated period (denoted Alight) and then related to the total culture cycle:
Equation 3
𝐴24ℎ, suspended = 𝑅𝑙𝑖𝑔ℎ𝑡𝐴𝑙𝑖𝑔ℎ𝑡
where RLight refers to the ratio of the light cycle (14/24 in our case) to compare results to
the continuous light case (denoted “Alight”).
The MRPA was then referred to the pelagic population (i.e. suspended cells). As a
consequence, the biomass concentration of pelagic cells Cpelagic was used as a reference
concentration in Eq. 2 with:
159
Equation 4
𝐴𝑙𝑖𝑔ℎ𝑡 =𝑎𝑆
𝐶𝑝𝑒𝑙𝑎𝑔𝑖𝑐
(𝑞𝑂 − 𝑞𝐿)
Because the biomass in suspension was a function of the stirring conditions, Cpelagic
was estimated as a function of the concentration of pelagic cells achieved in stirred
(Cstirred) and unstirred (Cunstirred) conditions. Cpelagic was obtained as a weighted function of
both concentrations to take into account the different stirring periods therefore applied:
USA). Three different viscosity values were tested (8.54 x 10-3 Pa s-1, 2.84 x 10-2 Pa s-1 and
1.06 x 10-1 Pa s-1, corresponding respectively to 0.3, 0.5 and 1% of LBG). Note that for higher
values, a non-Newtonian shear thinning behavior tends to appear (Michiel et al., 2010; El
Batal et al., 2012).
3.5.2 Effect of shear stress in stirred flasks
In complementary experiments in constant and homogeneous shear stress fields,
the effect of mixing as obtained in stirred flasks was studied. The cells were cultivated
162
under the same conditions as the inoculum culture, with constant 24 h light and light
cycles of 14 h/10 h. Some Erlenmeyer flasks were stirred by a magnetic stirrer while
others remained unstirred. For the mixed flasks, shear rate intensity was estimated as
constant at 50 s-1 as fixed by the magnetic stirrer rotation speed. This shear rate value was
estimated according to Halasz et al. (2008). This corresponded to a Reynolds number Re
of around 5,000, corresponding to a turbulent regime (Re >4,000) inside the flasks (Rott,
1990).
3.5.3 Investigation in torus-shaped PBR
A torus-shaped PBR stirred by a marine impeller was used to investigate the long-
term effect of mixing and shear stress on H. ostrearia culture (Fig. 10, impeller no.2 was
used here). As with most mixed bioreactors, the effect of shear stress on living cells is
difficult to characterize. The shear stress field is difficult to determine accurately because
of a marked heterogeneity in the culture volume. This heterogeneity makes the shear
stress effect on living cells dependent on the cells’ history (and therefore trajectory) in
the culture vessel. The torus-shaped PBR has some advantages here. It can be divided into
two zones: the impeller zone and the circular loop zone (Fig. 10 left). This configuration
avoids a dead mixed volume (Khalid and Legrand, 2001). Because of its loop
configuration, the device also allows all the flowing cells under consideration to be
subjected to a similar history up to hydrodynamic shear stress. Although the shear stress
field is heterogeneous in the overall culture volume, all cells periodically flow in the region
of the impeller (approx. every 10 s), where the maximum shear rate occurs. Shear rate
can also be varied by simply modifying the rotation speed of the impeller, and even a low
impeller rotation speed (200 rpm) leads to good mixing conditions that avoids
sedimentation of H. ostrearia cells.
The impeller rotation speed was fixed at 200 rpm for all the experiments.
Following Pruvost et al. (2006) who numerically investigated the hydrodynamics of the
torus-shaped PBR, this leads to a mean bulk velocity of Uo = 0.05 m s-1 which was found
sufficient to avoid cell sedimentation, corresponding to an average shear rate value of 30
s-1 in the impeller zone and 10 s-1 in the loop zone, with an average value of 20 s-1 for the
total volume. Note that unlike the rheometer experiment where laminar conditions were
guaranteed, a turbulent regime was obtained in the torus PBR. These average shear rate
163
values can therefore only be considered as a first indication, as turbulent flows will
generate shear stress time and spatial variation.
Regarding culture conditions, the torus-shaped PBR enables full control of pH,
temperature, light and also mixing, in terms of stirring periods and intensity (i.e. impeller
rotation speed). Air is injected into the PBR to avoid the accumulation of dissolved oxygen,
which contributes to culture mixing. The flow rate was fixed at constant throughout the
experiments. CO2 was used for pH regulation, mixed in the air circuit by a control valve to
maintain a low variation in the total gas flow rate (100 mL min-1). Cells were grown in
non-limited culture medium 12N48P natural seawater (ES/3 complete inorganic
modified medium) to guarantee that any modification of the biomass productivity when
measured was only due to the effect of mixing.
Fig. 10: Representation of the torus shaped PBR geometry with its dimensions (left), and 2 types of impellers used for it stirring (right) (Pruvost et al., 2006)
3.6 Statistics
The statistics were compiled using XLSTAT 2019 software (Addinsoft). The normality
of the distribution law for the different samples was identified by the Shapiro-Wilk test to
select the tests (T-test). Statistics were measured with triplicate data for the experiments
in Figures 12 to 16 and with sextuplicate data for the in experiments Figures 17 to 19.
164
4 Results
4.1 Effect of short-term application of homogeneous and constant shear
stress
4.1.1 Investigation of experiment duration in rheometer treatment
As a first assessment of the experimental characterization in the rheometer, the
culture (i.e. seawater medium and microalgae cells) was first exposed at 20°C to a
constant shear rate of 30,000 s-1 (the highest intensity provided by the rheometer) for
300 min. The high viscosity of the medium was found to decrease after 260 min due to the
small volume and noted evaporation, although the temperature was regulated at 20°C. Up
until 260 min the proportionality of shear stress to sample viscosity for Newtonian fluid
was assessed as expected (Eq. 11) but with a variation in shear stress of 22% over the
total period, indicating a progressive decrease in apparent viscosity of the medium. For
the first 60 min the shear stress variation represented only 0.4%, which was considered
acceptable for our experiment (Fig. 11).
Fig. 11: Dynamic viscosity of the sample and shear stress applied over time at a constant shear rate of 30,000 s-1
In terms of the effect that shear stress has on cell viability, no significant
relationship was observed, even after five hours of treatment at the highest shear stress
of the rheometer (Fig. 12). The progressive decrease in viscosity (before 230 min) cannot
therefore be related to a cell disruption process. This was assumed to be attributable to
the thixotropic behavior of the culture (medium, algae and released exometabolites),
which is usually encountered in the liquid phase with solid inclusions (Reiner and Scott
Blair, 1967). Note that, while decreasing the apparent viscosity and therefore shear stress
value for a constant stress rate, this helps to limit the shear stress impact on cells.
Based on these results, a single hour of treatment was selected as the reference for
experiments. It was also considered unnecessary to analyze treatment at a lower shear
stress or shear rate.
Fig. 12: Evolution of cell viability at a constant shear rate (30,000 s-1) over time. Data is mean ± 95% CI for n = 3
Results are presented in Fig. 12. No apparent cells destruction was observed even
at the highest shear rate value reached by the rheometer.
4.1.2 Effect of viscosity on cell viability by rheometer treatment
The literature reports different quantities when investigating the effect of
hydrodynamics on cell viability. Shear stress (τ) is usually used (Connor et al., 2002;
Michiel et al., 2010; Leupold et al., 2013), but shear rate was also proposed (Barbosa et
al., 2004; Contreras et al., 1998), while some studies report the effects of operating
parameters of the processes used (Rossignol et al., 1999; Jaouen et al., 1998; Vandanjon
et al., 1999).
In our study, the shear rate is considered the reference and viscosity was
progressively increased to modify shear stress accordingly, as described in Table 12.
60
70
80
90
100
110
120
0 60 120 180 240 300 360
Ce
ll vi
abili
ty (
%)
Time (min)
166
Fig. 13: Haslea ostrearia cell viability at a constant shear rate of a 30,000 s-1 with different concentrations of Locust Bean Gum (LBG) to modify viscosities and shear stress accordingly. Data is mean ± 95% CI for n = 3
In all cases, no significant impact of viscosity on H. ostrearia cell viability was
observed, as shown in Fig. 13 (cell viability > 95%). At a constant shear rate, the shear
stress applied can increase up to 3180 Pa for 1% LBG mixture, but even at this value no
cell disruption was observed. Note that the Taylor number remained below the critical
value, indicating that no Taylor vortices occurred during the experiments.
Table 12: Experimental conditions during the experiment with progressive shear stress increase for a constant shear rate of 30,000 s-1
Control 0.3% LBG 0.5% LBG 1% LBG
Shear stress τ (Pa)
32.1 256.2 852 3180
Taylor number Ta
12.13 6.41 0.8 0.04
Dynamic viscosity µ (Pa
s-1) 1.07 x 10-3 8.54 x 10-3
2.84 x 10-2
Shear thinning 1.06 x 10-1
Shear thinning
We can note that these results contrast with those of Michiel et al., (2010). These
authors imposed a much lower shear rate (from 0 to 1000 s-1) and observed 66% cell
death in the rheometer experiment for the diatom Chaetoceros muelleri at 1.3 Pa. This may
be attributed to a difference in fragility of the species.
80
85
90
95
100
105
110
Control 0.3% LBG 0.5% LBG 1% LBG
Ce
ll vi
abili
ty (
%)
Sample of microalgae
167
4.1.3 Investigation in day/night cycles
Like many microalgae cultured in solar conditions, Halsea ostrearia cells seem to
synchronize with day/night cycles, triggering cell division during the dark phase (Mitsue
León-Saiki et al., 2018; De Winter et al., 2017). To study whether shear rate could have
more impact during the cell division stage, cell fragility was measured with a rheometer
on a flask culture subjected to light (14 h) and dark (10 h) periods. Because of the culture
growth and therefore cell concentration increase, cell viability was determined using the
cell concentration measured after treatment (2.41 ± 0.46 x 107 cell L-1) (Fig. 14).
The highest shear rate was first applied in the rheometer (30,000 s-1). Results are
given in Figure 14. H. ostrearia cells were found to be unaffected by the shear rate during
the 14 h of the light period (confidence interval and T-test does not allow variations to be
concluded between control and treated samples P > 0.05). We can note that the cell
viability of control samples is usually inferior to that of treated samples. This could be
attributable to cell homogenization by rheometer treatment compared to the control
(even with manual stirring before sample), by re-suspending some of the immobilized
cells in their own biofilm.
Same observation can be done for the night period. No significant shear stress
impact was observed. In addition, an increase in cell density, definitely linked to cell
division, is present throughout the night period. Note that this confirms that H. ostrearia
synchronizes with the light cycle.
168
Fig. 14: Haslea ostrearia cell viability cultivated in day/night culture. Cells were subjected to a constant shear rate (30,000 s-1) for 1 h. Values are reported for every hour during the day (14 h) and night (10 h) period of culture. Data is mean ± 95% CI for n = 3
169
4.2 Effect of long-term application of hydrodynamics shear stress in
turbulent flow
4.2.1 Investigation of stirring and dark/night illumination effects on H. ostrearia
in flask culture
Before analyzing H. ostrearia growth in a mixed PBR, the cell was cultured
beforehand in flasks. Cell growth with and without a magnetic stirrer was measured for
two illumination conditions: a 14 h/10 h photoperiod and constant illumination. Agitation
conditions produced by the magnetic stirrer (mean rotation 100 rpm) led to an estimated
shear rate of 50 s-1 in turbulent flow conditions (Halasz et al., 2008). Results are reported
in Fig. 15 in terms of cell productivity.
Fig. 15: Haslea ostrearia culture with and without stirring in light/dark cycle and constant 24 h illumination for 8-day batch. Data is mean ± 95% CI for n = 3
Surprisingly, the unstirred constant 24 h light and the unstirred 24 h in the light
cycle revealed the lowest cell productivity whatever the stirring conditions (between 1.2
and 2.0 x 106 cells L-1 d-1), the best results being achieved with the unstirred culture with
day/light cycles (7.5 x 106 cells L-1 d-1). Comparing stirred cultures, the culture in the
day/night cycle led to a 5.7-fold increase under the same light conditions (6.8 x 106 cells
L-1 d-1) as the 24 h lit culture (1.2 x 106 cells L-1 d-1).
Note that even though the day/night stirred culture production was slightly lower
than the unstirred one under same illumination conditions, the T-test confirmed no
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
unstirred Stirred light Stirred 24h unstirred
Light cycle L/D Light 24h
Ce
ll p
rod
uct
ivit
y (1
06ce
ll L-1
d-1
)
Light and stirring conditions
170
significant difference between the two results (P > 0.05). However, for constant 24 h
illumination, a significant impact on constant stirring can be concluded. It can therefore
be concluded that day/night periods are required for increased Haslea ostrearia growth.
Constant stirring has a lower effect, although it seems to negatively affect cell productivity
under turbulent flow conditions with magnetic stirring at around 50 s-1.
4.2.2 Investigation of mixing effect in torus shaped photobioreactor
A possible effect of stirring and shear rate on H. ostrearia cells can be highlighted
from previous results in flasks, achieved in turbulent flow and mainly when a night period
was added. These conditions are therefore very different from those applied in rheometer
experiments (homogeneous shear rate condition in laminar flow).
A full set of experiments was then conducted in a torus-shaped PBR to investigate
the possible long-term effect. The PBR was operated in semi-continuous conditions, and
cell density and photosynthetic efficiency were monitored every hour for 48 h (Fig. 16).
Only the two last days of the semi-continuous culture are reported here (after 7 days of
biomass productivity stabilization). The PBR was operated at a dilution rate of D = 0.1 d-1
with and without stirring by the marine impeller. Note that during the 48 h period of
measurement, the dilution rate was stopped for easier analysis of the cell response
(possibly hidden by culture harvesting). Yellow and blue areas represent light and dark
periods respectively throughout the culture. In addition, for the first 24 h of the culture
the PBR was unstirred and the impeller activated only after the first 24 h for the
remainder of the 48 h. Results are given in Figure 16.
Changes in culture conditions were found to affect cell productivity. In addition,
the response could not be described as usual, with successive increases and decreases in
cell density. A small increase from 1.7 x 108 cells L-1 to 2.5 x 108 cells L-1 appeared from 6
h to 8 h respectively on average, then cell density remained stable until 24 h when it
increased greatly from 25 h to 28 h, corresponding to the beginning of the stirring,
reaching 4.0 x 108 cells L-1. However, cell density decreased immediately to 1.7 x 108 cells
L-1 from 28 h to 31 h. Note that contrary to the experiments conducted in flasks, the
synchronized division stage was not observed at night.
Regarding PSII efficiency (Fv/Fm), values were found to range between 0.62 and
0.69, which is considered the optimal photosynthetic capacity for diatoms (Rech, 2004).
171
A decrease of 5% was observed at 26 h of the culture, which could be due to the impact of
mixing. However, this wide variation can also be observed throughout the culture, even
in unstirred conditions. In all cases, variations did not exceed 10%. It can therefore be
concluded that mixing itself has no significant impact on the photosynthetic capacity of H.
ostrearia cells. Only cell division seems to be affected by stirring.
172
Fig. 16: Time evolutions of cell density and fluorimetry during semi-continuous culture of Haslea ostrearia in a torus-shaped PBR. Data is mean ± 95% CI for n = 3
173
In a second experiment, H. ostrearia was cultivated in semi-continuous mode at D
= 0.1d-1 in constant light, but with different stirring durations. The goal was to better
identify cell response to stirring to establish a mixing strategy for H. ostrearia culture in
photobioreactors. Results are given in Fig. 17 & 18.
Fig. 17: Cell and biomass surface productivity (PS) obtained for semi-continuous culture of Haslea ostrearia in a torus PBR in continuous light with five different stirring duration conditions (0; 8; 14; 20; 24 h). Data is
mean ± 95% CI for n = 6
Figure 17 shows that 8, 14 and 20 h of stirring led to the largest biomass
productivities; larger than unstirred culture (i.e. 0 h in Fig. 17). 1.8 ± 0.2 g m-2 d-1 can be
achieved with 8 hours stirring, compared to unstirred culture which reaches 1.0 ± 0.2 g
m-2 d-1. However, 24 h stirring was shown to greatly reduce biomass productivity at 0.3 ±
0.2 g m-2 d-1. The same results profile can be observed for cell productivity, achieving up
to 22.9 ± 0.5 x 108cells m-2 d-1. However, constant stirring for 24 h led to only 4.3 ± 0.3 x
105 cells m-2 d-1 (equivalent to a cell density of 1.1 x 105cell L-1 which is lower than the
inoculation concentration of 1.5 x 105 cells L-1). So, even if a low biomass is still measured
for constant 24 h stirring, it tends to indicate that culture loss will result if the same
conditions are applied over time. Indeed, the 0.3 ± 0.2 g m-2 d-1 measured here can be
assumed to be mainly composed of cellular exometabolites and empty silica frustules as
observed by light microscopy. The T-test revealed no significant differences between the
14 h and 20 h experiments on biomass productivity (P > 0.05) or between 8 h and 14 h on
cell productivity (P > 0.05).
0
5
10
15
20
25
30
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
0 8 14 20 24
Cel
l PS
(10
8ce
ll m
-2d
-1)
Bio
mas
s P
S(g
m-2
d-1
)
Stirring time (Hours)
Biomass Cell
174
Fig. 18: Total photosynthetic pigment production (%) and Extracellular marennine (EMn) excretion (%) for semi-continuous culture of Haslea ostrearia in a torus PBR in constant light and different stirring duration
conditions. Data is mean ± 95% CI for n = 6
In terms of pigment production, the content of extracellular marennine (% W/W)
as shown in Figure 18 remains almost unaffected when 0, 8, 14 and 20 h of stirring is
applied, with a content of 0.61 ± 0.04, 0.57 ± 0.18, 0.24 ± 0.44 and 0.34 ± 0.09% of biomass
produced, respectively. This absence of significant difference between the 0 h (no
stirring), 8 h, 14 h and 20 h experiments on EMn productivity is confirmed by a confidence
interval. Surprisingly, the constant 24 h stirring led to significant results, with 6.81 ±
1.92%. This can be attributed here to the intracellular marennine which may have been
released after cell disruption, possibly due to shear stress.
In terms of total pigment concentration (% w/w), similar results as for biomass
productivity were observed. Stirring time allowed an increase of total pigment
concentration of 2.2 ± 0.3 % of biomass for 8 h of stirring, against 1.3 ± 0.2 % for unstirred
conditions. However, the increase in stirring time quickly becomes unfavorable for
pigment production, decreasing to 0.8 ± 0.1 % of biomass for a 24 h mixing period.
Our results tend to emphasize that Halsea ostrearia growth rate is favored by
applying mixing, but also that cells possibly disrupt over a 24 h period of stirring (at least
under the hydrodynamic conditions applied here). Where this relates to results achieved
in day/night periods, the cell disruption may be explained by the sensitivity of H. ostrearia
cells at the division stage, which could occur in a 24 h period. However, the wide variation
in pigment content also requires explanation. Mixing may indeed have an impact on total
-1012345678910
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
0 8 14 20 24
EMn
(%
w/w
)
Tota
l ph
oto
syn
thet
ic p
igm
en
t (%
w/w
)
Stirring time (Hours)
Total pigment EMn
175
pigment production by modifying the photosynthetic conditions in bulk culture. It was
actually shown that mixing does not affect the photosynthetic capacity of the cell, so
suspended cells are capable of photosynthetic conversion. Photosynthetic pigments are
known to be closely related to received light, with an overall decrease in pigment with
increasing light overexposure to limit the energy overload.
The results presented in Figures 17 and 18 alone, therefore, do not prove that 8 h
of stirring is the optimal value for H. ostrearia culture. Because of the large sedimentation
rate of H. ostrearia cells, stirring could indeed induce a change in access to light, which
could also benefit growth. To better analyze this, the rate of photon absorption, as
represented by the MRPA, was estimated for each stirring time (Equation 3). Results are
given in Figure 19.
Fig. 19: Estimation of Mean Rate of Photon Absorption (A24H, suspended) for 0, 8, 14, 20 and 24 h stirring duration in torus PBR, according to biomass surface productivity (PS) achieved (L = 4cm) (q0 = 300 μmol m-2 s-1). Data
is mean ± 95% CI for n = 6
Although this result must be considered as a first estimation due to the difficulty
in re-suspending H. ostrearia cells correctly in in the culture volume (measurement of cell
concentration is used in Eq. 8), this curve can be compared with the data obtained for
Chlorella vulgaris and Nannochloropsis gaditana, which possess optimal MRPA ranges 11
Richmond Scientific, UK) at 16°C. Fresh natural seawater was provided by Le Croisic
Ocearium (Loire Atlantique, France) and filtered at 0.7 µm then 0.45 µm before being used
for the medium.
3.7.2 Immobilized cell PBR
A PBR of 500 mL was designed to culture H. ostrearia in immobilized cell
conditions. It was designed to limit the shear stress impact of stirring by applying a low
liquid recirculation of the medium through the culture (Fig. 20). Recirculation of the
medium was carried out using a peristaltic pump and controlled to obtain a low horizontal
flowrate of 7 mL min-1. This value was set semi-empirically to avoid influencing the
formation of a biofilm of H. ostrearia (data not shown).
192
Fig. 20: Representation of the immobilized cell photobioreactor 500mL, aS=33 m-1
Gas was injected through the external wall of the PBR near to the pH probe to
better control pH regulation. pH was regulated by CO2 injection with an automatized
valve. The PFD was provided by setting a horizontal LED panel above the PBR. This
prevents any increase in temperature in the culture. The PBR was of Polymethyl
methacrylate (PMMA) material, with a depth of 0.03m (aS = 33 m-1).
This culture system was found to be well-adapted for investigating benthic cell
culture, which was obtained by allowing the cells to produce a cell “tissue” naturally at the
bottom of the PBR or by creating cell inclusions in agar gel. Agar gel and cell inclusion of
H. ostrearia was carried out using the Lebeau et al. (1999) protocol.
3.7.3 Airlift PBR 1L and 6L
1 L airlift PBR technology was used to cultivate H. ostrearia in conventional mixed
conditions. This type was proved to lead to sufficiently low shear stress for H. ostrearia
culture, as demonstrated in a previous work (Fig. 21) (data not shown). Gas was injected
at the center bottom of the PBR, which proved efficient for both mixing and gas-liquid
mass transfer (Kazbar, 2018; Ndiaye et al. 2018).
193
Fig. 21: Representation of 1 L airlift photobioreactor, aS = 33 m-1 (Souliès, 2014)
This technology is more adapted to planktonic (i.e. suspended) cells. It was found
that a single localized gas injection was insufficient to prevent cell sedimentation
completely, which occurs in the “dead zone” around the gas injection. Regarding shear
stress, high values were mainly located along the gas path. A value of around 150 s-1 in
this PBR was estimated, with a maximum of 275 s-1 through the injection axis (Ndiaye et
al., 2018; Chisti and Moo-Young, 1989). However, the bubble disruption and coalescence
that are present oat the top and bottom of the PBR respectively are also known to promote
the emergence of micro-vortices capable of producing up to 14,000 s-1 of mean shear rate
(Contreras et al., 1998; Barbosa et al., 2004; Michels et al., 2010).
In addition to the 1 L airlift PBR, a 6 L airlift PBR was used to study the effect of
light on H. ostrearia culture. This PBR was made of PMMA, which enables determination
of the MRPA by measuring PFD q0 and qL on both sides of the PBR (Equation 13). Note
that whereas the 1 L airlift PBR had only one gas injection, the 6 L airlift PBR is based on
multiple injections by injecting gas through a rubber mat placed on the bottom of the PBR
(Fig. 22).
194
Fig. 22: Representation of 6 L airlift photobioreactor, aS=25 m-1 (Souliès, 2014)
This perforated rubber mat allowed a continuous injection of gas along the bottom
of the PBR in the form of microbubbles, and consequently homogeneous aeration and
stirring of the PBR. The drawback is that the higher values of shear rate obtained in bubble
wakes are obtained across almost the entire culture volume, with a higher frequency of
bubble disruption/coalescence of microbubbles than in the 1 L PBR (Barbosa et al.,
2004; Sobczuk et al., 2006). Whereas the 1 L airlift PBR does not allow perfect biomass
homogeneity, the 6 L airlift PBR provides better cell suspension, which is a mandatory
condition for accurate measurement of MRPA in pelagic condition. Note that due to the
absence of a dead zone in this PBR, the gas flow rate was reduced every night to avoid the
stirring impacting the cell culture during cell division, as shown in a previous work (data
not shown).
3.7.4 Airlift Crystal PBR
The Crystal PBR is designed for the culture of microalgae species presenting a high
sedimentation rate (Moutel, 2016). Inspired by a settling tank, the shape of this PBR
allows cells to settle down to the gas injection, leading to cell re-suspension (Fig. 23). This
PBR has a culture volume of 250 mL, is 20 mm thick and has an illuminated surface of
14426.99 mm2. It was used for the first culture test of H. ostrearia in mixed conditions.
195
All the airlift PBRs (1 L, 6 L, Crystal) were controlled at a temperature at 22°C. This
was achieved by regulating the room temperature and with fans at the back of the Crystal
PBR only. Light was supplied by LED panels on the day/night cycle 14 h/10 h.
Fig. 23: Representation of Crystal photobioreactor 250 mL, aS = 57 m-1 (Moutel, 2016)
4 Results
4.1 Immobilized-cell culture
H. ostrearia was cultivated in passive cell immobilization to protect the cell from
the effects of shear stress. The immobilized-cell PBR culture was carried out in continuous
mode at dilution rate D = 0.1 d-1, 22°C throughout the culture, with pH regulation fixed at
7.8, a PFD of 200 µmol m-2 s-1 in the day/night cycle 14/10 and cultivated in ES1/3
(inorganic) modified medium. As a passive cell immobilization culture, the biomass was
not mixed, which did not require daily measuring of biomass concentration, and only two
points of cell density were carried out. EMn and dissolved inorganic concentrations in the
culture medium were measured. The results were compared with the agar cell inclusion
culture, which was conducted in the same PBR under the same conditions (Fig. 24). An H.
ostrearia cell in agar gel was included to achieve similar cell density to the passive-cell
196
immobilized culture inoculation. Note that cell immobilization in alginate beads was also
carried out but no positive results were obtained (data not shown).
Fig. 24: Passive and active continuous culture of Haslea ostrearia in immobilized cell PBR. Data is mean ± 95% CI for n = 3 and n = 2 for mean DIC.
Time evolutions of cell density, EMn and dissolved organic concentrations are
given in Fig.24. For biomass concentration, only values at to (4.13 x 107 cell L-1 for passive;
4.18 x 107 cell L-1 for active culture) and tend (cell death) were carried out.
Regarding immobilization, cell death was observed at day 9 whatever the passive
or active culture. Immobilized cell culture being demonstrated elsewhere, this could be
attributed to our growing conditions (see below). Our experiments, however, were found
to be sufficient for estimating marennine production. Both culture techniques revealed
maximum production at day 4, with 3.7 ± 0.2 mgEMn L-1 and 4.5 ± 0.2 mgEMn L-1 for active
immobilized and passive immobilized cultures respectively. In either case, EMn
production over time was found to be unstable and led to a progressive decrease in EMn
concentration, doubtless due to cell death.
Regarding culture loss, multiple attempts were carried out and similar results
obtained. This could not be attributed to shear stress, and the culture medium was
validated elsewhere (see below). One explanation could be the DIC concentration, as
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0,0E+00
5,0E+06
1,0E+07
1,5E+07
2,0E+07
2,5E+07
3,0E+07
3,5E+07
4,0E+07
4,5E+07
5,0E+07
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
EMn
co
nce
ntr
atio
n (
mg
L-1)
Mea
n D
IC (
mM
)
Ce
ll d
ensi
ty (
cell
L-1)
Time (days)
Cell active Cell passive EMn active EMn passive Mean DIC
197
shown in Fig. 24. Values given here are an average of the concentrations obtained in
passive and active cell immobilization tests, as similar values were achieved. A
progressive decrease was obtained, which could lead to the appearance of carbon
limitation. It is known that immobilization reduces mass transfer in the cell’s biofilm.
Since a decrease in DIC contributes to the decrease of this mass transfer, it could lead to
limitation of the cells’ access to the carbon source in the film, leading to cell death. Because
the immobilization approach was only applied to obtain some preliminary values in EMn
production for future comparisons to other culture techniques, this was not investigated
further. The effect of carbon supply was investigated in suspended cell conditions (see
section below).
4.2 Haslea ostrearia culture in Crystal PBR
4.2.1 Investigation of CO2 tolerance of Haslea ostrearia in batch culture
CO2 intolerance in H. ostrearia was hypothetized by Robert (1983). In a natural
environment, H. ostrearia usually grows on the bottom of a biofilm, and consequently has
natural protection against the gas phase. Two air enrichments of CO2 (2 and 15%) were
tested in suspended cell culture. A Crystal PBR was used because of its efficiency with cells
presenting a high sedimentation rate. Batch cultures with the same conditions as for
immobilized cell culture were conducted (22°C, pH regulation fixed at 7.8) with an
incident PFD of 115 µmolh m-2 s-1 in day/night cycle 14/10. The incident PFD was
modified to take into account the larger specific illuminated surface of the Crystal PBR (i.e.
lower depth of culture). Results are given in Figure 25.
198
Fig. 25: Batch culture of Haslea ostrearia for 2% and 15% air/CO2 proportion for cell density (A) and extracellular marennine concentration (EMn) (B), in Crystal PBR. Data are mean ± IC 95% for n=3
A marked effect of the CO2 supply was observed. Cell densities reached 2.5 x 108
cell L-1 at day 8 and 1.4 x 108 cell L-1 at day 6 for 15% CO2 and 2% CO2 respectively (T-test
p < 0.001). The main impact was on EMn production, which reached 7.3 mg L-1 against 1.0
mg L-1 with 15% CO2 and 2% CO2 at day 10 respectively (T.-test p < 0.001). We noted a
decrease in EMn concentration for the 2% CO2. This could be attributable to EMn
degradation or consumption by bacteria. Finally, H. ostrearia was found to tolerate CO2-
enriched gas injection when combined with pH regulation. Increasing the proportion of
CO2 (and consequently the carbon transferred to the gas phase, as shown in next section)
revealed an increase in both cell density and EMn concentration. The relevance of carbon
limitation on H. ostrearia culture was therefore confirmed.
199
4.2.2 Assessment of Halsea ostrearia growth in continuous mixed culture
To assess the possibility of cultivating H. ostrearia in stirred conditions, a
continuous culture was conducted under mixed conditions in a Crystal PBR. The CO2
supply in the gas phase was set at 15% and the same conditions as in previous batch
culture were applied. The dilution rate was set at D = 0.1 d-1. Results are given in Figure
26.
Fig. 26: Continuous culture of Haslea ostrearia at 15% CO2 in a Crystal PBR. Cell density, extracellular marennine (EMn) and dissolved inorganic carbon (DIC) were measured. Data is mean ± 95% CI for n = 3
A maximum cell density of 1.5 ± 0.1 x 108 cell L-1 was reached at day 5 before
decreasing to 1.1 ± 0.1 x 108 cell L-1 at day 9. Regarding EMn production, the stirred
continuous culture led to a productivity of 6.9 ± 0.1 mgEMn L-1 at day 9 and 8.2 ± 0.2 mgEMn
L-1 at day 22. These values can be compared to immobilized-cell continuous culture which
reached a maximum of 4.5 ± 0.2 mgEMn L-1. The interest of cultivating H. ostrearia in mixed
conditions was here confirmed.
We can note also that both cell density and EMn concentration, as well as inorganic
carbon concentration, stabilized at day 8 for 4 days, before a decrease in cell density and
inorganic carbon. EMn concentration then started to increase (day 15), demonstrating
EMn synthesis or intracellular marennine (IMn) release in the medium. Despite the 15%
CO2 injection, dissolved inorganic carbon was also found to decrease continuously, as
observed previously in the immobilized cell PBR culture. This indicated the need for a
further increase in carbon supply to avoid possible growth limitation.
4.3 Investigation of nutrient consumption in PBR culture
4.3.1 Carbon consumption
The DIC concentration was raised by adding sodium bicarbonate at the beginning
of the culture. Le Gouic (2013) estimated that Chlorella vulgaris needs up to 10 mM of DIC
to avoid carbon limitation, which could be given either by a phase of gas injection enriched
with CO2, or by dissolution of a chemical carbon source in the medium. 10 mM
corresponds to a sodium bicarbonate concentration of 1.2 g L-1. This concentration was
found to lead to nutrient precipitation in the seawater-based medium due to the
interaction of silicon, phosphate and carbonate with Ca2+ and Mg2+ endogenous entities in
seawater (Morey et al., 1995; Nguyen, 2013).
H. ostrearia was therefore cultivated in semi-continuous mode in the 1 L airlift
PBR, with a fed-batch strategy conducted on a sodium bicarbonate source. For this
purpose, a solution of sodium bicarbonate (5 mM maximum) was injected punctually
every day. Because of the parallel CO2 injection, this enabled us to raise the final DIC to
around 10 mM while avoiding the precipitation phenomenon. This was added to the
ES1/3 medium (6N24P inorganic medium), which was optimized for H. ostrearia growth
in PBR, as presented previously (Nghiem-Xuan, 2019). The semi-continuous mode was
selected to cultivate H. ostrearia because of its benthic characteristic, which leads to an
inhomogeneous culture. Harvesting was then applied for a limited period of time per day.
Other parameters were similar: temperature was fixed at 22°C throughout the culture, pH
regulation was fixed at 7.8 and PFD at 200 µmol m-2 s-1 (measured to obtain the same
MRPA value according to the different aS of the PBRs, see Eq.1) in day/night cycle 14/10
and dilution rate at D = 0.1 d-1 (Fig. 27).
201
Fig. 27: Semi-continuous culture of Haslea ostrearia in 1 L airlift PBR with carbon fed-batch and 2% CO2. Dry weight (DW), extracellular marennine concentration (EMn) and dissolved inorganic carbon (DIC) were
measured. Data is mean ± 95% CI for n = 3
Unlike with previous experiments, a constant production of biomass and EMn was
obtained throughout the semi-continuous culture. Dry biomass concentration reached
320 mgX L-1, corresponding to 2.6 x 108 cell L-1 and an EMn concentration of up to 8.2
mgEMn L-1. DIC concentration was found to stabilize progressively at the targeted 10 mM
concentration. The carbon-fed batch strategy was therefore found to be suitable to obtain
202
a stable and constant productivity of 31.7 ± 0.3 mgX L-1 d-1 of biomass and 0.8 ± 0.1 mgEMn
L-1 d-1
4.3.2 Silicon, nitrogen and phosphorus consumption
Silicon and phosphorus consumption were investigated during the semi-
continuous culture presented in Figure 27. The main macronutrients over time evolutions
are given in Figure 28.
All nutrients were found to decrease, as expected. Nitrate decreased to 57% of its
initial concentration (1.73 mM) but without deprivation, with a final concentration of
around 1 mM. Phosphate and silicon dioxide concentrations showed a marked decrease
and could therefore be suspected of limiting cell growth (around 0.7% of the initial
concentration after 4 days). A slight increase of PO42- and SiO32- concentration by day 7
was also noted. This could be attributable to cell release or possible dissolution of small
quantities of agglomerated compounds. In the case of the SiO2 colorimetric measure
method, the high production of EMn by day 7 (Fig. 27) is suspected of interacting with the
method and possibly overestimation of SiO2 concentration.
Fig. 28: Evolution of NO3-, PO42- and SiO32-concentration for semi-continuous culture of Haslea ostrearia in a 1 L airlift PBR. Data is mean ± 95% CI for n = 3
Time evolutions of main nutrients enable to determine substrate consumption
rates (rS), specific substrate consumption rates (QS) and the yield factor (YX) for NO3-, PO42-
and SiO32- (Table 13).
0
50
100
150
200
250
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
2000
0 2 4 6 8 10 12 14 16
PO
42
-an
d S
iO3
2-co
nce
ntr
atio
n (
µM
)
NO
3-C
on
cen
trat
ion
(µ
M)
Time (Days)
N P Si
203
Table 13: Nutrient consumption of Haslea ostrearia (rS, QS and YX determination for NO3-, PO42- and SiO32-) in semi-continuous culture in an airlift PBR
NO3 PO4 SiO2
rS (µmol L-1 d-1) 3.0 x 10-1 1.0 x 10-1 9.2 x 10-2
QS (µmol gX-1 d-
1) 1.3 4.3 x 10-1 3.9 x 10-1
YX (µmol gX-1) 9.4 x 10-3 3.2 x 10-3 2.9 x 10-3
PO42- and SiO32- consumption rates were found to be respectively 1.0 x 10-1 and 9.2
x 10-2 µmol L-1 d-1; 3 times less than the NO3- consumption rate (nitrogen is the main
nutrient source of photosynthetic organisms). The specific substrate consumption rate
enables us to determine the need for these nutrients. The values obtained here emphasize
the need to increase SiO32- and PO42- concentration in the ES 1/3 medium to avoid any
limitation. However, SiO32- and PO42- are highly precipitating molecules with Ca2+ and
Mg2+ ions, such as sodium bicarbonate (Morey, Fournier & Rowe, 1995; Nguyen, 2013). It
was therefore decided to extend the fed-batch strategy on HCO3- to PO42-, SiO32-. The
nutrient feeding rate was based on the specific substrate consumption rate (Table 13) to
ensure no limitation of the nutrient and that no precipitation phenomenon would occur.
According to Figure 8, for a productivity of PV = 28.33 mgX L-1 d-1, H. ostrearia would need,
for example, a fed-batch of 1.1 x 10-2 µmol L-1 d-1 of SiO32- nutrient and 1.2 x 10-2 µmol L-1
d-1 for PO42-. This fed-batch strategy was implemented in a semi-continuous culture on ES
1/3 medium (6N24P inorganic). No further increase in either biomass or EMn
productivity was observed (data not shown). Thus, a further increase in N and P
concentrations was applied, and H. ostrearia was cultivated on 12N48P (Fig. 29). The
temperature was fixed at 22°C throughout the culture, pH regulation was fixed at 7.8, the
PFD at 330 µmol m-2 s-1 in day/night cycle 14/10 and the dilution rate at D = 0.1 d-1.
Results are given in Fig. 29.
204
Fig. 29: Semi-continuous Haslea ostrearia cell culture in 1 L airlift PBR with C, P, Si fed-batch conditions. Dry weight (DW) and extracellular marennine concentration (EMn) were measured. Data is mean ± 95% CI for n =
3
The fed-batch strategy applied to P-C-Si elements was found to prevent any
precipitation phenomenon in semi-continuous mode culture. This allowed the provision
of macronutrients such as N, P, Si and C in higher concentrations, leading to a 12N48P
medium.
A constant biomass and EMn production were obtained, stable over a period of
more than 20 days. However, whereas biomass productivity reached 51.8 ± 2.3 mgX L-1 d-
1, EMn productivity only reached 0.2 ± 0.1 mgEMn L-1 d-1. Medium enrichment in Si and P
could therefore have a negative impact on EMn synthesis, reducing EMn productivity from
0.8 ± 0.1 mgEMn L-1 d-1 (Fig. 27 B) to 0.2 ± 0.1 mgEMn L-1 d-1. On the other hand, it significantly
increased biomass concentration, up to 522 mgX L-1 (equal to 4.22 x 108 cell L-1). This value
can be considered high compared to H. ostrearia standards. Additionally, stable
production such as this can be considered an important methodologic achievement. This
opens up the possibility of further optimization of H. ostrearia culture in suspended cells.
The section below presents the investigation of light tolerance in a 6 L airlift PBR.
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
5
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0 5 10 15 20 25 30
EMn
co
nce
ntr
atio
n (
mg
L-1)
DW
(g
L-1)
Time (Days)
DW EMn
205
4.4 The ingathering of optimal growth parameters for biomass and EMn
productions
4.4.1 Light tolerance and cell response
This study was carried out in the 6 L airlift PBR, in order to measure input and
output PFD for MRPA measurement (Eq. 13). The temperature of the culture was fixed at
22°C, pH regulation at 7.8 and dilution rate at D = 0.1 d-1. The test was carried out with 6
different PFDs ranging from 140 to 400 µmol m-2 s-1 (140, 165, 210, 300, 350, 400 µmol
m-2 s-1), with a day/night cycle 14 h/10 h. Each culture was monitored for 3 times the
residence time to obtain a constant productivity (Fig. 30).
Fig. 30: Light tolerance curve of Haslea ostrearia, describing the evolution of surface productivity (PS) depending on MRPA values for biomass and extracellular marennine (EMn) results. Data is mean ± 95% CI for
n = 5
The results given in Figure 30 reveal that both EMn and biomass were found to be
closely related to MRPA values. This indicates a light tolerance of the cell response in both
growth (as it should be) and also EMn production. An optimal MRPA value was achieved
for both, indicating a light tolerance of biological responses. Concerning biomass
productivity, the highest values were achieved in the range 10.7-12.3 µmolhv gx-1 s-1,
leading respectively to 1.6 ± 0.1 and 1.7 ± 0.1 gx m-2 d-1. However, the highest EMn
productivity was 11.0 ± 0.5 mgEMn m-2 d-1 which was obtained at 8.4 µmolhv gx-1 s-1, with a
different optimal value, therefore, than for biomass growth. With both biomass and EMn,
MRPAs higher and lower than 12.3 µmolhv gx-1 s-1 resulted in lower productivity. We can
also note that the range of optimal MRPA values, as well as the profile of the curves
0
2
4
6
8
10
12
14
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
2
0 2 4 6 8 10 12 14 16
PS
EMn
(m
g m
-2d
-1)
PS
Bio
mas
s (g
m-2
d-1
)
MRPA (µmol g-1 s-1)
Biomass EMn
206
achieved, are close to the photosynthetic growth response of Chlorella vulgaris and
Nannochloropsis gaditana (Artu, 2016).
The results can be combined to determine light conversion efficiency, which
represents the amount of biomass produced per µmolh absorbed (gx molh-1):
Equation 14
ηX/hν
=𝑆𝑋
(𝑞0 − 𝑞𝐿)
where SX represent the surface productivity in g m-2 d-1.
Fig. 31: Haslea ostrearia total pigment, extracellular marennine (EMn) and light conversion efficiency (η) into biomass as a function of MRPA. Data is mean ± 95% CI for n = 5
Figure 31 presents the results of light conversion efficiency and total pigment
content. Both evolutions as a function of the MRPA are found to be similar here. Light
conversion efficiency was found to decrease for values lower than 6 and higher than 14
µmolh gx-1 s-1, with maximal values around 0.10 ± 0.01 gx molh-1 in the range 8 and 12
µmolh gx-1 s-1.
The highest pigmentation result (2.9 ± 0.1% w/w) was found at 12.3 µmolh gx-1 s-
1, a value similar to the optimal MRPA condition for biomass productivity. We can note,
however, that the reverse was observed for Chlorella vulgaris, where a progressive
decrease in pigment content was obtained with increasing MRPA value, as a result of the
well-known pigment acclimation process (i.e. decrease of pigment content with increased
light absorption). This could be attributed to the effect of marennine. The EMn content,
0
0,02
0,04
0,06
0,08
0,1
0,12
0,14
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
0 2 4 6 8 10 12 14 16
η(g
mo
l-1)
Pig
me
nt
(% w
/w)
MRPA (µmolhv gx-1 s-1)
Total pigment EMn η biomass
207
which is also presented Figure 31, decreases continuously with the rise in MRPA.
However, the EMn content curves appear to cross the total pigment curve at 8 µmolh gx-1
s-1, representing a maximal light conversion efficiency of biomass for H. ostrearia.
To better understand EMn excretion as a function of light, the light conversion
efficiency of EMn was investigated. Results are given in Fig. 32.
Fig. 32: Haslea ostrearia total pigment, extracellular marennine (EMn) and light conversion efficiency (η) into EMn as a function of MRPA. Data is mean ± 95% CI for n = 5
As well as total photosynthetic pigment content correlated to light conversion into
biomass efficiency, Figure 32 also shows a similar evolution for the EMn produced (%
w/w) and light conversion into EMn efficiency. The rise in MRPA leads to a decrease in
EMn (%) from 1.89 ± 0.08 % to 0.17 ± 0.05%. The decrease in light conversion into EMn
efficiency occurs at 8 µmolh gx-1 s-1, which also leads to an increase in light conversion
into biomass efficiency (Fig. 31). Figures 31 and 32 show that 8 µmolh gx-1 s-1 triggers
lower EMn production in favor of biomass.
4.4.2 pH
The goal of this experiment was to observe and measure the impact of pH
conditions on H. ostrearia culture in order to select the optimal pH (pHOPT) conditions for
EMn production. The culture was carried out in a 1 L airlift PBR in semi-continuous mode
using a P, Si, C fed-batch strategy. The temperature of the culture was fixed at 22°C
throughout, pH regulation was fixed at 6; 7.8; 8.3; 9 and the dilution rate at D = 0.1 d-1.
The PFD was fixed at 300 µmol m-2 s-1 (to obtain AOPT around 12 µmolh gx-1 s-1) in the
0,00E+00
2,00E-04
4,00E-04
6,00E-04
8,00E-04
1,00E-03
1,20E-03
1,40E-03
1,60E-03
1,80E-03
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
0 2 4 6 8 10 12 14 16
η(g
mo
l-1)
Pig
me
nt
(% w
/w)
MRPA (µmolhv gx-1 s-1)
EMn Total pigment
208
day/night cycle 14/10. All cultures were monitored for 3 times the residence time to
achieve constant biomass productivity. Results are given in Fig.33 (the presence of the *
symbol indicates the presence of visual precipitation throughout the culture).
Fig. 33: pH effect on Haslea ostrearia total photosynthetic pigment concentration, biomass and extracellular marennine (EMn] productivitys (PS) in semi-continuous culture in 1 L airlift PBR. Data is mean ± 95% CI for n
total pigment concentration (2.42 ± 0.08 %) at pH 8.3. However, for the same pH EMn
productivity was low, reaching only 5.27 ± 0.24 mgEMn m-2 d-1. pH 6 also showed low EMn
productivity, biomass and pigment concentration respectively at 6.71 ± 0.37 mgEMn m-2 d-
1, 0.63 ± 0.06 gx m-2 d-1 and 0.48 ± 0.05 %. However, pH 7.8 led to interesting EMn results
with 14.10 ± 0.65 mgEMn m-2 d-1; the best results for this study.
Pigment content was found to follow the same evolution as for biomass
productivity, which tends to attest to the direct relation of pH to H. ostrearia
photosynthetic growth. However, the results should be considered in hindsight because
of the consequences of pH variation. pH value is known to greatly impact the medium
chemistry of H. ostrearia, which could induce a limiting of nutrient conditions or
chemistry interaction with EMn. This hypothesis is supported by the increasing
precipitation with increasing pH value. pH 9 was found to lead to a high level of
precipitation, which raises the chemistry instability of the medium (Nghiem-Xuan, 2019).
0
2
4
6
8
10
12
14
16
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
6 7.8 8.3* 9*
PS
EMn
(m
g m
-2d
-1)
Tota
l ph
oto
syn
thet
ic p
igm
en
t (%
w/w
)
PS
bio
mas
s (g
m-2
d-1
)
pH
Total pigment PS Biomass PS EMn
209
Despite this precipitation, pigment concentration was found to be higher at pH 8.3 with
2.42 ± 0.08% than for pH 7.8. Finally, this raises the possibility of a pHOPT close to 8.3 while
avoiding any high level of precipitation.
Although the best biomass and pigment productivity result was achieved at pH 8.3,
the best EMn productivity was achieved at pH 7.8, which also exhibits no visual
precipitation. Because the culture of H. ostrearia was found to be more convenient at pH
7.8 due to the precipitation phenomenon being amplified in higher pH conditions, the pH
value of 7.8 was selected as pHOPT for the rest of the studies.
4.4.3 Temperature
The goal of this experiment was to observe and measure the impact of temperature
conditions on H. ostrearia culture in order to select the optimal temperature (TOPT)
condition for EMn production. The culture was carried out in a 1 L airlift PBR in semi-
continuous mode with P, Si, C fed-batch. During the culture, the temperature was
regulated at 16; 22; 25; 30°C throughout, pH regulation was fixed at 7.8 and the dilution
rate at D = 0.1 d-1. The PFD was fixed at 300 µmol m-2 s-1 (to obtain AOPT=12 µmolhv gx-1 s-
1) in the day/night cycle 14/10. All cultures were monitored for 3 times the residence time
to obtain a constant productivity. The results are given in Figure 34. The presence of the
* symbol indicates the presence of visual precipitation throughout the culture.
210
Fig. 34: Temperature effect on Haslea ostrearia ostrearia total photosynthetic pigment concentration, biomass and extracellular marennine (EMn] productivity (PS) in semi-continuous culture in 1 L airlift PBR.
Data is mean ± 95% CI for n = 5.
Temperature was found to impact the H. ostrearia culture, but mainly by triggering
the precipitation phenomenon which could negatively impact cell culture, as presented
above for the pH study. Precipitation was found to occur at temperatures higher than
22°C. Considering only a non-precipitate culture initially, the highest biomass results
were achieved at 22°C with 1.63 ± 0.06 gx m-2 d-1. There was therefore no significant
impact (T-test p = 0.748 for n = 5) of temperature on EMn productivity between 16 and
22°C. In terms of pigment concentration, there was no significant impact (T-test p = 0.563
for n = 5) at 16°C with 1.80 ± 0.29% compared to 22°C culture with 2.08 ± 0.15%, but a
higher pigment concentration is reached at 25°C with 2.62 ± 0.20%.
As with the pH study, the precipitation phenomenon definitely impacts biomass
and EMn. It can be noted, however, that pigment concentration is higher at 25°C even
though precipitation occurs. These results raise the possibility of a TOPT = 25°C, however,
precipitation also impacts biomass productivity greatly, decreasing it from 1.63 ± 0.06 gx
m-2 d-1 to 0.73 ± 0.19 gx m-2 d-1 in the 25°C and 30°C experiment. EMn productivity also
decreased with the increase in temperature. There could be various explanations for this:
the molecule could be degraded at a higher temperature, less could be produced by the
cell or it could interact with the precipitation phenomenon. Finally, because of the
precipitation phenomenon, 22°C was considered as TOPT for the rest of the study.
0
1
2
3
4
5
6
7
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
16 22 25* 30*
PS
EMn
(m
g m
-2d
-1)
Tota
l ph
oto
syn
thet
ic p
igm
en
t (%
w/w
)
PS
bio
mas
s (g
m-2
d-1
)
Temperature (°C)
Total pigment PS biomasse PS Emn
211
4.4.4 Physiologic stress for EMn overproduction
Based on previous results, the optimal values for MRPA, temperature and pH were
gathered (AOPT, TOPT and pHOPT) for H. ostrearia culture. Different conditions were then
tested to induce stressing conditions for EMn overproduction. Figure 29 shows
continuous production of EMn in a semi-continuous culture without nutrient limitation.
This was retained as a reference. Even in unrestricted conditions, the productivity of EMn
was found to be low at 0.2 mgEMn L-1 d-1, corresponding to 6.06 mgEMn m-2 d-1.
The following experiment consists of measuring EMn, biomass, cell and pigment
productivity in order to understand if nutrient depletion or limitation leads to
overproduction of EMn. This study was carried out in a 1 L airlift PBR and under the same
culture conditions as previously, but with TOPT = 22°C, pHOPT = 7.8 and AOPT = 12.3 µmolhv
gx-1 s-1. Depletion conditions were carried out to cultivate H. ostrearia without nitrogen,
phosphorus, silica or carbon nutrients. Nutrient concentration for limitation conditions
was fixed with regard to the 20-times diluted culture of Rossignol (1999). These
concentrations represent 2.39 x 10-4 M for nitrogen, 3.05 x 10-5 M for phosphorus and 5.49
x 10-5 M for silica. All cultures were monitored for 3 times the residence time to confirm
constant productivity (Fig. 35; 36; 37).
Fig. 35: Total photosynthetic pigment concentration of Haslea ostrearia under various nutrient limitations and depletions. Data is mean ± 95% CI for n = 5
The impact of nutrient limitation and depletion on pigment concentration can be
observed in Figure 35. None of the depleted or limited culture offers any increase in
pigment concentration, with values below 2.5 ± 0.2%. H. ostrearia pigment synthesis is
highly reduced by nitrogen depletion and limitation, at 0.7 ± 0.3% and 1.2 ± 0.4%
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
P Si N C P Si N
Depletion Nodepletion
LimitationTota
l ph
oto
syn
thet
ic p
igm
en
t (%
w/w
)
212
respectively. Both results can be explained by the high nitrogen requirement for protein
synthesis. The reduction of pigment content shows the cell’s capacity to adapt to balance
its composition in order to survive, and certainly impacts the cell’s photosynthetic
efficiency.
Fig. 36: Biomass and EMn productivity of Haslea ostrearia culture under various nutrient limitations and depletions. Data is mean ± IC 95% for n = 5.
The results are therefore analyzed in terms of EMn and biomass productivity
(Figure 36). Depletion and limitation were found to reduce biomass productivity by
almost 2.7 times compared to the unrestricted culture. In terms of EMn productivity,
depletion conditions only led to lower productivity than the unrestricted culture, at 5.3 ±
0.2 mgEMn m-2 d-1. However, P, Si and N limitation conditions led to higher productivity,
replete culture is 3.5 times higher. Finally, all these results show that nutrient limitation
0
10
20
30
40
50
60
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
P Si N C P Si N
Depletion Nodepletion
Limitation
PS
EMn
(m
g m
-2d
-1)
PS
bio
mas
s (g
m-2
d-1
)
Biomass EMn
213
(especially in Si and N) leads to a more marked release of EMn, resulting in greater EMn
productivity.
Since nutrient depletion is known to greatly affect cell physiology and morphoply,
Figure 18 presents both cell and biomass productivity for various nutrient depletion and
limitation conditions. Similar trends for both quantities were observed under both
nitrogen depletion and limitation, with respectively 4.3 ± 0.2 x 105 and 5.5 ± 0.2 x 105cell
m-2 d-1, which were found to be related to biomass productivity. However, in phosphorus
depletion and limitation conditions, cell productivity reached respectively 18.4 ± 0.5 x 105
and 9.4 ± 0.1 x 105cell m-2 d-1, whereas biomass productivity was found to be constant (T-
test p = 0.274 for n = 5) with 0.6 ± 0.1 gx m-2 d-1 for P depletion and 0.6 ± 0.1 gx m-2 d-1 for
P limitation.
Fig. 37: Biomass and cell productivities (PS) of Haslea ostrearia culture under various nutrient limitations and depletions. Data is mean ± 95% CI for n = 5.
As was observed between EMn and biomass productivity, nutrient depletion and
limitation led to a low correlation (r = 0.4178) between cell and biomass productivity.
This decorrelation is mainly observed in nutrient depletion for phosphorus and silicon.
The observation of different cell productivities with low biomass productivities attests to
a metabolism reorientation of H. ostrearia in depletion culture conditions. High cell
density in phosphorus-depleted conditions but with 3.5 times lower mass than no-
depleted culture shows that cell variation composition may be linked to metabolism
adaptation (Rodolfi et al., 2009; Goiris et al., 2015; Bajwa et al., 2018).
02468101214161820
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
P Si N C P Si N
Depletion Nodepletion
LimitationP
SC
ell
(10
5ce
ll m
-2d
-1)
PS
bio
mas
s (g
m-2
d-1
)
Biomass Cells
214
As a conclusion to these studies, no clear correlation can be assessed between
biomass and cell EMn productivity. However, it can be concluded that unrestricted culture
favors biomass production, with 1.6 ± 0.1 gx m-2 d-1, and nitrogen limitation favors EMn
release, with 54.5 ± 1.8 mgEMn m-2 d-1.
4.5 Towards an optimized production protocol
4.5.1 EMn concentration impact on process productivity
Previous studies have exhibited differing optimal conditions (pHOPT, TOPT, AOPT)
between growth and EMn production. This raises the hypothesis of EMn having a negative
impact on biomass productivity, and consequently on EMn productivity. Two tests were
therefore carried out to identify the impact of EMn on productivity.
H. ostrearia was cultivated in semi-continuous mode to remove 90% of culture
medium at each culture medium renewal, taking advantage of the benthic cell
characteristics. For this purpose, stirring was stopped a few hours before culture renewal
to allow the cells to sediment at the bottom of the PBR, and culture was renewed by
pumping culture medium from the top of the culture volume before replacing it with fresh
medium.
Two residence times were used: 10 days and 5 days, corresponding to around D =
0.09 d-1 and D = 0.18 d-1 respectively. The experiments were done with an optimized
formulation of NX medium to avoid Si, P and C fed-batch strategy. The cultures were
carried out in a 1 L airlift PBR. The temperature of the culture was fixed at 22°C, pH
regulation at 7.8 and incident PFD at 300 µmol m-2 s-1 (to obtain AOPT = 12 µmolh gx-1 s-1)
in the day/night cycle 14/10. For the first part of the study, H. ostrearia was cultivated
under nitrogen limitation (NX-5N100P6Si) conditions in order to enhance marennine
production, according to results achieved in the previous section. Results are given in Fig.
38 and 39.
215
Fig. 38: Evolution of cell density and extracellular marennine concentration (EMn) for semi-continuous culture of Haslea ostrearia in NX medium in 1 L airlift PBR (D = 0.09 d-1, corresponding to 10 days of residence
time). Data is mean ± 95% CI for n = 3.
After 10 days, cell density reached 4 ± 0.1 x 108cell L-1, which also corresponds to
maximum EMn concentration (11 mgEMn L-1). Culture medium was then renewed at 90%.
As expected, this resulted in a marked decrease in EMn concentration due to the dilution
(around 2 mgEMn L-1). Similar observation can be made on day 20, when the second
medium renewal was applied. After 10 days of EMn accumulation in the culture medium,
the concentration was decreased by culture renewal. However, this also induced a
continuous decrease in cell density over time. Even though the cell should have been
immobilized at the bottom of the PBR during the sample step, some of the cells were
definitely sampled during medium renewal. Cell density decreased to finally reach 0.4 ±
0.1 x 108cell L-1 by day 31. In addition, EMn concentration was found to remain below 11.6
± 0.1 mgEMn L-1 and decrease greatly over time, reaching 5.7 ± 0.3 mgEMn L-1 at day 31.
The same observation was made for the 5 days’ residence time experiment (Fig.
39). EMn concentration increased between each culture renewal, reaching 4.3 ± 0.1 mgEMn
L-1 and 5 ± 0.1 mgEMn L-1 at day 10 and day 15 respectively, but then decreased over the
culture to reach 1.3 ± 0.3 mgEMn L-1 by day 31. In terms of cell density, each medium
renewal reduced it and the cells barely managed any growth. Cell density reached 3.3 ±
0.1 x 108cell L-1 by day 5 and finally decreased to 1.7 ± 0.1 x 107cell L-1.
0
2
4
6
8
10
12
14
0,0E+00
5,0E+07
1,0E+08
1,5E+08
2,0E+08
2,5E+08
3,0E+08
3,5E+08
4,0E+08
4,5E+08
5,0E+08
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31
EMn
co
nce
ntr
atio
n (
mg
L-1)
Cel
l den
sity
(ce
ll L-1
)
Times (Days)
Cell density EMn
216
Fig. 39: Evolution of cell density and extracellular marennine concentration (EMn) in a semi-continuous (D=0.18 d-1 corresponding to 5 days of residence time) culture of Haslea ostrearia in NX medium in a 1 L airlift
PBR. Data is mean ± 95% CI for n=3
Comparing the two experiments, the 10 days’ residence time experiment and 5
days’ residence time experiment led to an average EMn productivity of 1.0 mgEMn L-1 d-1
and 0.7 mgEMn L-1 d-1 respectively. Both these productivities are lower than the results
obtained by Rossignol (1999). In addition, no stable production was obtained for any of
these tests. The dilution step led to progressive cell density decrease, although EMn
concentration was regularly decreased. There was no strong evidence of any relationship
between EMn concentration and biomass productivity. However, a progressive evolution
of H. ostrearia cell population was observed, which was found to be distributed in the
benthic and pelagic phases even after 24 hours without manual stirring (Table 14).
0
1
2
3
4
5
6
0,0E+00
5,0E+07
1,0E+08
1,5E+08
2,0E+08
2,5E+08
3,0E+08
3,5E+08
4,0E+08
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31
EMn
co
nce
ntr
atio
n (
mg
L-1)
Cel
l den
sity
(ce
ll L-1
)
Time (Days)
Cell density EMn
217
Table 14: Repartition and observation under light microscope of the Haslea ostrearia cell population density after 24 h without manual stirring. Data is mean ± 95% CI for n = 3.
Pelagic phase Benthic phase
Cell population
density (%)
42.7 ± 0.4 57.3 ± 0.4
Visual
appearance
The results of Table 14 could explain the decrease in cell density at each medium
renewal, as mainly pelagic cells were harvested. The visual appearance of the cells also
raises the hypothesis of a higher IMn production by the benthic cell population than the
pelagic one. As described by Robert (1983) and Rossignol (1999), this cell behavior is
observed in the natural H. ostrearia environment, which confirms the possibility that
pelagic cell population could be constituted mainly of young cells, and the benthic cell
population constituted of older ones. This hypothesis could explain why removing pelagic
cells leads to a progressive decrease in cell density, as young cells were mostly harvested
at each medium renewal.
4.5.2 Implementation of EMn continuous production process
In a final assessment of our optimization procedure, the knowledge and data
gathered from our experiments was combined to carry out continuous EMn production in
a conventional process.
H. ostrearia was cultivated in NX-25N100P6Si medium (unrestricted growth
medium) until day 8, to optimize the biomass produced and increase marennine
production or/and release. NX-5N100P6Si medium (N limited growth medium) was then
injected at D = 0.25 d-1 in order to overproduce EMn under nitrogen stress culture
conditions. During the culture, TOPT was fixed at 22°C and pHOPT regulation at 7.8. The PFD
was fixed at 300 µmol m-2 s-1 (biomass AOPT=12 µmolhv gx-1 s-1) in the day/night cycle
218
14/10 throughout the culture. Note that the PFD fixed at 200 µmol m-2 s-1 (EMn AOPT=8
µmolhv gx-1 s-1) was initially thought to be overproducing marennine, but with the
concentration of marennine in the PBR expected to be significant, light attenuation should
also be increased. The PFD was therefore slightly increased. Results are given in Fig. 40.
Fig. 40: Evolution of dry weight (DW), extracellular marennine concentration (EMn) and specific EMn concentration of Haslea ostrearia for semi-continuous culture in NX media with optimal culture conditions in
a 1 L airlift PBR. Data is mean ± 95% CI for n = 3
The 8-day batch culture with NX-25N100P6Si allowed a maximum biomass
concentration of 0.63±0.02 g L-1 to be reached. Biomass then instantly decreased by day
8 with the addition of nitrogen-limited medium (NX-5N100P6Si), leading to an increase
in EMn production with a maximum EMn concentration of 19.64 ± 0.19 mg L-1 on day 15.
The specific EMn concentration also increased by day 8 as expected, from 0.88 ± 0.05 mg
108cell-1 to 7.81 ± 0.08 mg 108cell-1 by day 15, and attested to the capacity of H. ostrearia
to overproduce EMn in nitrogen-limited complete inorganic medium. To confirm the
efficiency of the airlift stirred culture, H. ostrearia was cultivated in the same conditions
but in the immobilized cell PBR. Results are given in Fig. 41.
Fig. 41: Evolution of dry weight (DW) and extracellular marennine concentration (EMn) of Haslea ostrearia for a continuous culture in NX media with optimal culture conditions in a 500 mL immobilized cell PBR. Data
is mean ± 95% CI for n = 3
Similar biomass and EMn evolutions as discussed above (Fig. 24) were obtained.
However, the EMn concentration reached 10.6 ± 0.2 mg L-1, whereas previous
immobilized cell culture remained at around 4.5 ± 0.2 mg L-1. This emphasizes the interest
of our systematic optimization of culture conditions. In terms of biomass, time monitoring
was not allowed by cell immobilization. Only to (0.07 ± 0.02 g L-1) and tend (0.15 ± 0.05 g L-
1) were carried out.
Compared to stirred culture, the interest of producing H. ostrearia in suspended
(pelagic) cells is confirmed here. An EMn productivity of 4.5 ± 0.2 mg L-1 d-1 was obtained,
although the influence of EMn concentration on cell growth or physiology was not
elucidated.
5 Discussion
This study was the result of numerous experiments aimed at elucidating the main
parameters governing H. ostrearia culture in PBR. All immobilization studies resulted in
low productivity (0.63 ± 0.05 mgEMn L-1 d-1 for passive immobilized cell and 0.43 ± 0.05
mgEMn L-1 d-1 for agar gel immobilization). Alginate entrapment bead was not found to be
resistant to stirring and medium chemistry. Carbon nutrient limitation was found to be a
highly relevant limiting parameter. Even though pH is regulated by CO2 injection, the
geometry of the PBR led to a low mass transfer of CO2 in the biofilm.
Le travail présenté dans ce manuscrit de thèse a permis de découvrir une partie
des problématiques de la culture d’Haslea ostrearia en photobioréacteur, et ainsi
apprendre à maîtriser et orienter la production de cette microalgue à fort potentiel, mais
dont la culture optimisée reste un enjeu en vue de son exploitation contrôlée.
Une première problématique identifiée durant cette thèse a été la variabilité des
résultats en milieu d’eau de mer enrichie (Turpin et al., 1999 ; Gagneux-Moreaux et al.,
2007 ; Mouget et al., 2009). La composition et la concentration des éléments nutritifs de
ces milieux sur base naturelle entraine un phénomène de précipitation limitant la
croissance d’H. ostrearia en PBR. Les milieux minéraux d’eau de mer artificiels (NX-
5N10P6Si et NX-25N100P6Si) élaboré par une approche stœchiométrique de la
composition élémentaire de la biomasse, ont permis la diminution du phénomène de
précipitation, augmentant respectivement, les productivités en EMn et en biomasse. Les
interactions chimiques entre les ions Ca2+, Mg2+, PO43-, HCO3- et SiO32- provenant de la
solution d’enrichissement, ont été confirmées par simulation des équilibres physico-
chimiques. D’autre part, l’étude de l’impact de chaque nutriment sur les productivités en
biomasse et en EMn démontre que 10 fois moins de Calcium dans le milieu entraîne une
augmentation de productivité d’un facteur 5,5 en cellules, et 2 en EMn. La concentration
en Magnésium n’a pu être ni baissée ni augmentée sans provoquer des pertes de
productivité. L’augmentation des concentrations de Fer et de Zinc ainsi que la baisse de
Bore et de Nickel, ont permis d’obtenir de meilleures productivités en biomasse et en
marennine extracellulaire ainsi qu’un contrôle des conditions nutritionnelles en PBR.
Cette nouvelle composition de milieu nous permet d’envisager l’augmentation de
macronutriments (N, P, Si) dans le but d’augmenter le seuil de productivité que ce milieu
permet d’atteindre en PBR. De plus, il est possible d’utiliser cette approche pour
l’élaboration d’autres milieux de culture. Cependant, à pH>8, une précipitation est encore
présente, et s’avère létale pour les microalgues à pH>9. Une étude physico-chimique du
230
milieu de culture est donc encore nécessaire pour éviter le phénomène de précipitation
avant d’envisager l’augmentation des concentrations de macronutriments.
Le milieu NX est un milieu minéral, mais les études sur l’impact des sources de
Carbone et de Phosphate ont montré qu’il est possible d’obtenir de bons résultats de
productivité en EMn et en biomasse avec des sources organiques de nutriments. La
mixotrophie d’H. ostrearia n’a pas été démontrée dans cette thèse, mais les diatomées
possèdent une gestion de l’énergie chimique (ATP et NADPH) différente de celle des
chlorophycées pour la fixation du Carbone. Un échange rapide entres ces molécules existe
entre le chloroplaste et la mitochondrie, permettant de combler rapidement le déficit du
rapport ATP/NADPH de la photosynthèse grâce à l’énergie produite par respiration
(Bailleul et al., 2015). Le fait qu’H. ostrearia possède potentiellement cette capacité,
soulève l’hypothèse d’une alternative mixotrophe au milieu inorganique NX. Quoi qu’il en
soit, bien que l’utilisation de l’eau de mer naturelle puisse être préférable à une
production à grand volume, le milieu artificiel NX de composition connue et contrôlée,
apporte une reproductibilité dans l’étude de la culture de cette algue et de la production
de la marennine à l’échelle du laboratoire. A l’avenir, la méthodologie d’enrichissement
combinée à une prédiction des limites de dissolution et de précipitations pourra être
étendu au cas de milieux à base d’eau de mer naturelle. Ainsi, même si celle-ci contient
des concentrations élevées en Ca2+ par exemple, il sera possible d’appliquer une stratégie
fed-batch d’enrichissement progressif afin d’apporter les nutriments nécessaires à la
croissance, tout en gardant un milieu de croissance chimiquement stable.
Bien que l’impact du milieu de culture ait été montré dans la limitation de la
croissance d’H. ostrearia en PBR, l’impact des conditions d’agitation soulève encore des
problématiques de culture. Malgré les travaux du GEPEA (Rossignol et al., 1999 ;
Vandanjon et al., 1999) et ceux de cette thèse. L’étude du phénomène de mécano-
sensitivité se heurte à la mesure de réponse biologique d’H. ostrearia, la différence des
conditions appliquées entre les expériences à hydrodynamique maîtrisée et les réelles
conditions turbulentes en PBR. La sensibilité d’H. ostrearia n’a donc pu être rapportée à
une grandeur type liée aux contraintes de cisaillement, car l’origine même de sa sensibilité
ne semble pas être entièrement physique mais est également due à sa physiologie.
La sensibilité générale des diatomées face à l’agitation est connue et présentée
dans la littérature (Wang et Lan, 2018). Dans le cas d’H.ostrearia, l’hypothèse de la
231
sensibilité due à son système de division cellulaire est la plus plausible à notre niveau de
compréhension de cette microalgue. La baisse de productivité en biomasse observée
durant la culture en PBR torique, indique une difficulté d’H. ostrearia à supporter le
régime turbulent, même à faible cisaillement (20 s-1) et en agitation continue. Pourtant, la
même intensité de 8h d’agitation par jour provoque une augmentation de productivité de
biomasse d’un facteur 1,8 par rapport à une culture non agitée. Il a pu être montré que
l’agitation permet aussi d’augmenter l’accessibilité des cellules à la lumière, une
corrélation directe ayant en effet à pu être montrée avec la remise en suspension des
cellules par l’agitation. Ainsi, du fait de la sédimentation rapide des cellules menant
naturellement à protéger les cellules de la lumière, une durée trop longue d’agitation peut
amener les cellules en suspension à recevoir un excès lumineux sur une journée. D’autre
part, si on suppose que la synchronisation de la population cellulaire ne se déroule qu’en
période de nuit, une agitation de 8h alternée n’engendre des contraintes de cisaillement
que seulement durant la période de jour. Ainsi, ce gain de productivité pourrait autant
venir de la sensibilité d’Haslea ostrearia en phase de division cellulaire, que d’une
meilleure exposition à la lumière. La baisse de concentration en pigment
photosynthétique tend à corroborer l’hypothèse d’une réponse à la lumière. Cependant,
ce point mériterait d’être approfondi, notamment en étudiant plus en détail la relation
entre croissance et lumière absorbée (MRPA), elle-même modifiée par la stratégie de mise
en suspension des cellules.
Compte-tenu des résultats obtenus, une stratégie de 8h d’agitation par jour en PBR
torique a été mis en place, avec pour but d’améliorer l’accès à la lumière des cellules tout
en évitant les stress hydrodynamiques pendant la nuit et/ou la surexposition lumineuse.
Même si cela s’est avéré concluant, une optimisation de cette stratégie reste possible par
une étude du comportement d’H. ostrearia en mode tychopélagique de croissance
(cellules en suspension), pour contrôler au mieux l’impact de la lumière sur le
comportement cellulaire et d’isoler ce comportement de celui provoqué par l’agitation.
Concernant la stratégie d’agitation en PBR Airlift, le comportement tychopélagique d’H.
ostrearia peut en effet s’avérer clé, car cette stratégie permet à une partie de la population
cellulaire de se fixer au fond du PBR (comportement benthique) et de limiter l’impact de
l’agitation turbulente générée par le gaz, alors qu’une remise en suspension des cellules
favorise la réception de lumière pour les cellules au comportement tychopélagique.
Visuellement, les cellules se sont révélées différentes, laissant présager une physiologie
232
différente également. Une étude plus précise de la physiologie tychopélagique/benthique
d’H. ostrearia permettrait une meilleure compréhension et un meilleur contrôle de la
stratégie d’agitation (vis-à-vis de la croissance et de la marennine).
Considérant les cisaillements provoqués par un régime laminaire, la résistance sur
courte durée d’H. ostrearia a été confirmée et à de très hauts taux de cisaillement non
présents en PBR (jusqu’à 30 000 s-1). La forme pennée de la microalgue est l’hypothèse la
plus plausible pour expliquer nos résultats, lui donnant des propriétés anisotropes lui
permettant de diminuer l’impact des cisaillements sur elle-même selon son orientation
dans le fluide (Mauer et al., 2016). Cependant, comparée à la résistance d’autres
diatomées en régime laminaire, H. ostrearia est capable de supporter une intensité de
cisaillement d’un facteur 4,5 plus important que Phaeodactylum tricornutum et
Chaetoceros muelleri (Sobczuk et al., 2005 ; Michiel et al., 2010). Le régime laminaire est
très rare en PBRs conventionnels (Olmos et al., 2003 ; Pruvost et al., 2006 ; Ndiaye et al.,
2018 ; Wang et Lan, 2018). Envisager la conception d’un système de culture
spécifiquement dédié pour H. ostrearia en conditions de régime laminaire uniforme,
permettrait l’application d’agitation et l’optimisation du transfert de matière (élimination
du gradient T°C et pH) sans altérer l’intégrité cellulaire. A noter que des réacteurs à flux
laminaire (LFR) reposant sur le contrôle d’un régime laminaire au sein du PBR sont
communément utilisé en génie des procédés et pourraient servir d’inspiration.
Concernant la réponse d’H. ostrearia à la lumière, nos études ont permis de
confirmer des hypothèses précédemment mentionnées dans la littérature mais en
soulèvent aussi d’autres. H. ostrearia possède un besoin en énergie lumineuse (AOPT=12
µmolhv. gx-1. s-1) similaire à ceux de Chlorella vulgaris et Nannochloropsis gaditana (Artu,
2016). Cependant, nous avons observé une variation pigmentaire importante dans une
gamme de MRPA de 8,4 à 12,3 µmolhv. gx-1. s-1, correspondant respectivement aux AOPT
EMn et AOPT biomasse. L’hypothèse d’une utilisation de la marennine (hypothétiquement
intracellulaire) dans la photosynthèse chez H. ostrearia est donc plausible. Comprendre
les conditions de production d’un exo-métabolite tel que la marennine est une
problématique importante pour la conception optimisée d’un procédé de culture et
d’extraction de ce composé.
En débat dans la communauté scientifique (Robert, 1983 ; Neuville et Daste, 1972 ;
Rossignol, 1999 ; Lebeau et al., 1999), l’origine de la marennine reste d’une façon générale
233
à élucider. Les résultats de cette thèse ont permis d’identifier quelques stress
physiologiques induisant la surproduction de l’EMn. Les résultats démontrent que les
carences en nutriments provoquent chez H. ostrearia une forte diminution voire un arrêt
de l’excrétion de l’EMn, alors que les limitations en Silice et en Azote permettent la
stimulation de l’excrétion. Les faibles résultats de productivité (en cellule et en EMn)
obtenus en PBR à cellules immobilisées (actives et passives) ont conduit à remettre en
question ce mode de culture. Au final, H. ostrearia a donc été cultivée en PBR agité airlift
dans un milieu NX pour optimiser la production de biomasse, puis cultivée dans un milieu
NX (limité N) en continu pour stimuler l’excrétion d’EMn. Cette technique de culture
permet d’obtenir des productivités de 4.5±0.16 mg L-1 d-1 en EMn ce qui correspond à 1,8
fois les productivités publiées par Rossignol (1999) en PBR à membrane immergée
(Figure 81).
La comparaison aux PBR à membrane immergée permet d’envisager une autre
piste d’optimisation. En effet, dans notre étude et contrairement aux travaux de Rossignol
(1999), la récolte d’EMn a été effectuée par surverse en semi-continu, ce qui entraîne une
partie des cellules (principalement tychopélagiques). Il est intéressant de constater qu’H.
ostrearia excrète de l’EMn en continu même en conditions non limitées par les nutriments.
Cela nous permet d’envisager d’optimiser les productivités en EMn du procédé (en
adaptant par exemple les concentrations du milieu de culture pour limiter la cellule en
Azote) en maintenant les cellules dans le PBR grâce aux membranes immergées. On peut
aussi ajouter qu’une concentration importante d’une molécule active tel que l’EMn dans
le milieu soulève l’hypothèse d’un impact négatif de la molécule sur le comportement d’H.
ostrearia (Robert et Turpin, 1993 ; Rossignol, 1999). Les travaux deRossignol (1999) sur
la filtration en continu d’EMn par membrane immergé permettrait donc de palier à ce
potentiel impact négatif de la marennine sur la productivité. Nous avons ainsi estimé qu’il
était encore possible d’augmenter d’un facteur 3 nos productivités volumiques en EMn
dans les conditions de culture optimales identifiées dans cette thèse (PVestimé = 13,5 mgEMn
L-1 j-1).
234
Figure 81: Représentation chronologique actualisée des travaux successifs visant à améliorer la production en marennine extracellulaire selon les différentes technologies de systèmes de culture mises en place par les laboratoires MMS, du GEPEA et de l'UQAR
235
Pour conclure de façon générale sur la culture d’H. ostrearia, les cultures effectuées
en PBRs à cellules immobilisées ont permis jusqu’ici de cultiver H. ostrearia (Rincé et al.,
1999 ; Rossignol, 1999 ; Lebeau et al., 2000 ; Turpin et al., 2001), mais la montée en échelle
de ce type de culture reste une problématique, un tel système apporte aussi des
problématiques propres de transfert de matière au sein du biofilm, avec possible
apparition de gradients localisés de pH, de température, de nutriments (Hochfeld, 2005 ;
Gabelle et al., 2012 ; Souliès, 2014 ; Ndiaye et al., 2018). L’utilisation de systèmes de
culture agités conventionnels (tel que airlift) pour la culture d’H. ostrearia s’est avérée
une alternative possible. Cependant cette algue est sensible aux pompes ainsi qu’à
l’agitation en régime turbulent, notamment avec un couplage qui apparait entre cycles
d’éclairement et périodes d’agitation. Un système d’agitation alterné ou spécifique
(régime laminaire) doit être appliqué. Les études présentées dans cette thèse nous
Wilde E. W., Beneman J. R., (1993). Bioremoval of heavy metals by use of microalgae.
Advanced Biotechnology, 11: 781-812.
Woo M.N., Jeon S.M., Kim H.J., Lee M.K., Shin S.K., Shin Y.C., Park Y.B., Choi M.S., (2010)
Fucoxanthin supplementation improves plasma and hepatic lipid metabolism and blood
glucose concentration in high-fat fed C57BL/6N mice. Chemistry Biology Interaction,
2010, 186, 316–322.
Xin L., Hong-ying H., Yu-ping Z., (2011). Growth and lipid accumulation properties of a
freshwater microalga Scenedesmus sp. Under different cultivation temperature.
Bioressource Technology, 102:3098-3102
Yasobiotech. Site : http://www.yasobiotech.com/anti-viral-market.html
Titre : Optimisation de la culture d’Haslea ostrearia en photobioréacteur
Mots clés : Milieu de culture, fragilité cellulaire, conditions de culture, photobioréacteur, marennine extracellulaire, Haslea ostrearia, diatomée.
Résumé : Haslea ostrearia est une diatomée capable d’excréter un pigment bleu-vert appelé marennine d’intérêt industriel en aquaculture, cosmétique et pharmaceutique. Sa culture en laboratoire et à grande échelle est actuellement un défi, cette espèce à comportement benthique étant considérée comme sensible à l’agitation des systèmes de cultures conventionnels. Cette thèse décrit l’identification, l’étude et
l’optimisation des paramètres limitants de la culture en photobioréacteur. Un milieu de culture d’eau de mer artificielle a été conçu pour garantir une production stable et non limitée par les nutriments. La fragilité d’Haslea ostrearia au cisaillement hydrodynamique a été caractérisée en appliquant différentes intensités de taux de cisaillement.
Les paramètres optimaux de culture et les conditions d’excrétion de marennine extracellulaire ont été finalement identifiés en photobioréacteur. Au final, les résultats obtenus ont permis de proposer des protocoles et systèmes optimisés de culture, adaptés aux spécificités et besoins d’Haslea ostrearia. Les résultats de cette thèse permettent d’envisager la culture semi-continue de cette microalgue, avec des productivités supérieures à celles rencontrées jusqu’alors dans la littérature. La méthodologie permet également d’apporter les bases pour une optimisation future de la culture d’Haslea ostrearia contrôlée à plus grande échelle, ainsi que sa production de marennine extracellulaire associée.
Title : Optimization of Haslea ostrearia culture in photobioreactor
Abstract : Haslea ostrearia is a marine diatom able to produce and excrete a blue-green pigment called marennine, exhibiting potential industrial valorization in aquaculture, cosmetic and pharmaceutics. Its laboratory and large-scale culture are challenging because this benthic strain is considered as sensitive to mixing conditions in conventional culture system. This thesis describes the identification, the
study and the optimization of limiting parameters of the cell culture in a photobioreactor. A new artificial seawater medium has been designed in order to guarantee a stable and no-nutrients limited production. The Haslea ostrearia fragility to hydrodynamics shear stress has been characterized by applying different intensities of shear rate.
The optimal culture parameters and excretion conditions of extracellular marennine have been finally identified in a photobioreactor. In the end, the results obtained made it possible to propose protocols and optimized culture systems, adapted to Haslea ostrearia specificities and needs. The results of this thesis make it possible to consider the semi-continuous culture of this microalgae, with higher productivities than those described so far in the literature. The methodology also provides the basis for future optimization of the Haslea ostrearia controlled culture on a larger scale, as well as its asociated extracelular marennine production.