Pantoea stewartii stewartii in corn seed with …...1 การตรวจสอบเช อ Pantoea stewartii subsp. stewartii ในเมล ดข าวโพดด วยเทคน

1

ปญหาพเศษปรญญาตร สาขาเทคโนโลยชวภาพทางการเกษตร

เรอง

การตรวจสอบเชอ Pantoea stewartii subsp. stewartii ในเมลดขาวโพดดวยเทคนค Surface Plasmon Resonance (SPR) Biosensor

Detection of Pantoea stewartii subsp. stewartii in corn seed with Surface Plasmon

resonance (SPR) biosensor technique

โดย

นางสาวณฎฐณชา ไชยทองศร

ควบคมและอนมตโดย

……………………………..…... วนท……เดอน…...........….พ.ศ….…... (ดร.สจนต ภทรภวดล) อาจารยทปรกษาปญหาพเศษ

1

การตรวจสอบเชอ Pantoea stewartii subsp. stewartii ในเมลดขาวโพดดวยเทคนค Surface Plasmon Resonance (SPR) Biosensor

นางสาวณฎฐณชา ไชยทองศร

บทคดยอ

เชอ Pantoea stewartii subsp. stewartii (Pss) เปนเชอสาเหตโรคเหยวของขาวโพด และมรายงานวาสามารถถายทอดโรคผานทางเมลดพนธ และจดอยในรายชอเชอตองหามของการสงออกเมลดขาวโพด การทดลองนเพอพฒนาวธการตรวจเชอ Pss ในเมลดขาวโพดดวยเทคนค Surface Plasmon Resonance (SPR) Biosensor และเปรยบเทยบประสทธภาพการตรวจสอบเชอ Pss ในเมลดขาวโพดทปลกเชอ ระหวางชดตรวจสอบทผลตเปนการคา Triple Antibody Sandwich ELISA (TAS-ELISA ,Agdia®) , เทคนค SPR biosensor และเทคนค Indirect ELISA จากการเปรยบเทยบการทดสอบความจ าเพาะเจาะจงของการตรวจเชอทง 3 เทคนค พบวาเทคนค SPR biosensor ใหผลดทสดเมอเปรยบเทยบกบเทคนคอน แตยงเกดปฏกรยาขามกบเชอแบคทเรยทใกลชดกบเชอ Pss และมความไวในการตรวจสอบเชอ Pss ในเมลดขาวโพดทอตราสวน 1:5,000 (เมลดขาวโพดทมเชอ ตอ เมลดขาวโพดปกต) เชนเดยวกบเทคนค TAS-ELISA ของ Agdia®

ค าส าคญ : เชอ Pantoea stewartii subsp. stewartii , เทคนค Surface Plasmon Resonance (SPR) Biosensor, การตรวจสอบเมลดขาวโพด ปญหาพเศษ : ปรญญาตร สาขาเทคโนโลยชวภาพทางการเกษตร คณะเกษตร ก าแพงแสน มหาวทยาลยเกษตรศาสตร อาจารยทปรกษา : ดร.สจนต ภทรภวดล ปทพมพ : 2554 จ านวนหนา : 45

1

Detection of Pantoea stewartii subsp. stewartii in corn seed with Surface Plasmon Resonance (SPR) Biosensor technique

Miss Nudtanicha Chaithongsri

Abstract

Pantoea stewartii subsp. stewartii (Pss) is a causal agent of corn wilt disease and can also be seed-transmitted. This bacterium is classified as an important quarantine pest disease in many countries. This experiment aims to develope the new method for detect Pss in artificial inoculated corn seeds using Surface Plasmon Resonance (SPR) Biosensor technique and compare the results with commercial kit , Triple Antibody Sandwich ELISA (TAS-ELISA ,Agdia®) and Indirect ELISA method. In comparison with other methods , the specificity test showed that SPR Biosensor technique has least cross reaction with closely related bacter. For sensitivity test, both of SPR Biosensor and TAS-ELISA Agdia® technique were detected 1 in 5,000 of Pss infected seeds. Key words : Pantoea stewartii subsp. stewartii , Surface Plasmon Resonance (SPR) Biosensor , Detection of corn seed Degree : Bachelor of Science, Program in Agricultural Biotechnology, Faculty of Agriculture at Kamphaeng Saen, Kasetsart University Advisor : Dr. Sujin Patarapuwadol Year : 2011 Page : 45

2

ค านยม

ขอกราบขอบพระคณ ดร.สจนต ภทรภวดล อาจารยทปรกษาปญหาพเศษ ทกรณาใหโอกาส ความร ค าแนะน า ตลอดจนใหความชวยเหลอและความเอาใจใสทดตลอดมา จนท าใหการศกษาวจยในครงนของขาพเจาส าเรจลลวงไปไดดวยด ขอขอบพระคณ คณวารรตน สมประทม และพๆหองปฏบตการ A309 อาคารปฏบตการวจยศนยเทคโนโลยชวภาพเกษตร มหาวทยาลยเกษตรศาสตร วทยาเขตก าแพงแสนทกคนทคอยใหค าปรกษา ก าลงใจ และความชวยเหลอทดตลอดระยะเวลาการท างานทผานมา ขอขอบพระคณ คณจฑาเทพ วชระไชยคปต ทใหความอนเคราะหแอนตซรม IgY-Pss คณณฏฐพร อทยมงคล ทใหความอนเคราะหเชอ Pss และเชอแบคทเรยทแยกไดจากขาวโพด ดร.ณฎฐมา โฆษตเจรญกล ทใหความอนเคราะหเชอ E.chrysanthemi เพอใชในการทดลองครงน ขอขอบพระคณ ส านกงานพฒนาวทยาศาสตรและเทคโนโลยแหงชาต (สวทช.) ทใหทนสนบสนนการเรยนจนกระทงจบการศกษาในระดบชนปรญญาตร และใหโอกาสไดพฒนาตนเอง ไดเกบเกยวความรและประสบการณเพอเปนก าลงส าคญของประเทศชาตตอไปในอนาคต ขอขอบพระคณสาขาเทคโนโลยชวภาพทางการเกษตร คณะเกษตร ก าแพงแสนมหาวทยาลยเกษตรศาสตร วทยาเขตก าแพงแสน ทใหทนสนบสนนการท าปญหาพเศษในครงน ขอกราบขอบพระคณคณพอสฤษด คณแมลดดา ไชยทองศร และทกคนในครอบครวตลอดจนเพอนๆ ทคอยใหความรก ความหวงใย และก าลงใจทดในท างาน ท าใหขาพเจาประสบความส าเรจในการศกษาเชนวนน

สดทายประโยชนและคณคาอนพงมจากการท าปญหาพเศษในครงน ขอมอบแดคณะ

เกษตร ก าแพงแสน มหาวทยาลยเกษตรศาสตร วทยาเขตก าแพงแสน สถาบนอนเปนทรกยง

ณฎฐณชา ไชยทองศร กมภาพนธ 2555

1

สารบญ

เรอง หนา สารบญตาราง (1) สารบญภาพ (2) ค าน า 1 วตถประสงค 3 อปกรณและวธการ 11 ผลและวจารณผลการทดลอง 23 สรปผลการทดลอง 36 เอกสารอางอง 37 ภาคผนวก 40

2

สารบญตาราง

ตารางท หนา 1 ชนด สายพนธ และแหลงทมาของเชอแบคทเรยทใชในการทดลอง 11 2 การเตรยมตวอยางส าหรบตรวจสอบเชอ Pss ในเมลดขาวโพด 19 3 การเตรยมตวอยางส าหรบทดสอบความไวในการตรวจเชอ Pss ในเมลดขาวโพด 21 4 ผลการทดสอบความจ าเพาะเจาะจงของแอนตซรม (IgY-Pss) กบเชอ 26 แบคทเรย 6 ชนด ดวยเทคนค Indirect ELISA 5 ผลการทดสอบความจ าเพาะเจาะจงของเทคนคตางๆตอการตรวจเชอ Pss 28 6 การตรวจเชอ Pss (LMG 2715) ในเมลดขาวโพด 31 7 เปรยบเทยบผลการทดสอบความไวในการตรวจสอบเชอ Pss 34 ระหวางเทคนค Indirect ELISA, TAS-ELISA และ SPR biosensor

(1)

3

สารบญภาพ

ภาพท หนา 1 ล าดบการเกดปฏกรยาของโมเลกลสารชวภาพทตองการทดสอบ 9 บนแผนสไลดแกวทเคลอบอนภาคทองค า 2 การเปลยนแปลงของสญญาณ SPR ในแตละขนตอนทเกดปฏกรยาระหวาง 10

แอนตบอดกบแอนตเจนดวยเทคนค SPR biosensor 3 ขนตอนการทดสอบเชอดวยเทคนค SPR biosensor 17 4 ลกษณะของเชอ Pss 23 5 ผลการวเคราะหขนาดดเอนเอของยน hrpS ของเชอ Pss ดวยเทคนค 24 Bio-PCR 6 คาการเปลยนแปลงมม SPR เมอทดสอบความจ าเพาะเจาะจง ของเทคนค 29 SPR biosensor ในการตรวจสอบเชอแบคทเรยชนดตางๆทเจอจางใน peptone buffer 7 คาการเปลยนแปลงมม SPR ในการตรวจเชอ Pss (LMG 2715) 32 จากเมลดขาวโพดดวยเทคนค SPR biosensor ภาคผนวก ก การเตรยมสารตางๆ ทใชในการทดลอง 41

(2)

1

ค าน า

โรคเหยวของขาวโพดเกดจากเชอ Pantoea stewartii subsp. stewartii (Pss) ซงเปนโรคทกอใหเกดความเสยหายทางเศรษฐกจในอตสาหกรรมผลตขาวโพดเปนอยางมาก โดยเชอนสามารถแพรกระจายผานทางดวง Chaetocnema pulicaria และตดตอผานทางเมลดพนธได (Pepper, 1967) นอกจากนยงจดเปนเชอแบคทเรยสาเหตโรคทส าคญทอยในรายชอเชอตองหามระหวางประเทศในกฎหมายกกพชและอยในรายชอสงตองหามของประเทศผน าเขาและสงออกเมลดพนธขาวโพด (Pataky and Ikin, 2003) รวมถงประเทศไทยตามพระราชบญญตกกพช พ.ศ. 2507 แกไขเพมเตมโดยพระราชบญญตกกพช (ฉบบท 2) พ.ศ. 2542 ก าหนดขาวโพดเปนพชก ากด ตองมใบปลอดโรคกอนทจะสงออกหรอน าเขาจากตางประเทศ แมวาในประเทศไทยยงไมเคยมรายงานถงการตรวจพบโรคเหยวของขาวโพดทเกดจากเชอ Pantoea stewartii subsp. stewartii ดงนนเพอเปนการปองกนและควบคมเชอโรคดงกลาวไมใหเขามาในประเทศ รวมถงเพอปองกนการกดกนทางการคา จงจ าเปนตองหาวธการตรวจสอบเชอโรคดงกลาวทมประสทธภาพ มความแมนย า รวดเรว เปนทยอมรบตามมาตรฐานสากล และสามารถใชในการอางองได ปจจบนเทคนคทใชในการตรวจสอบเชอแบคทเรยโรคพชมหลายชนดซงมขอจ ากดของแตละเทคนคตางกนออกไป เชน การตรวจสอบเชอดวยชดตรววจสอบ ELISA ส าเรจรป Agdia® ซงมขอจ ากดคอ ไมสามารถแยกความมชวตของเชอแบคทเรย (Sutula et al., 1986) สามารถใหปฏกรยาผลบวกกบเชอแบคทเรยใกลชดได และไมแมนย าเมอใชกบการตรวจเมลดพนธขาวโพดของประเทศไทย (จฑาเทพ และคณะ,2550) นอกจากนยงมวธตรวจสอบเชอดวยเทคนค PCR ซงมขอดคอ เปนเทคนคทมความไวในการตรวจสอบเชอสง อยางไรกตามมขอจ ากด คอ ไมสามารถแยกความมชวตของเชอแบคทเรยได และไมสามารถตรวจเชอแบคทเรยทเกดการกลายพนธบางประเภท เชน Pss strain DC116 ซงเปนสายพนธทไมรนแรงได (Coplin et al.,2001) นอกจากนงานวจยของ จฑาเทพ (2550) พบวาการท าปฏกรยาดวยไพรเมอรตอยน hrpS ทมความจ าเพาะเจาะจงตอเชอ Pss ใหปฏกรยาผลบวกกบเชอแบคทเรยทมความใกลชดกบเชอ Pss เชน Pantoea agglomerans ในประเทศไทย

2

ตอมามรายงานการใชเทคนค Surface Plasmon Resonance (SPR) biosensor ในการตรวจสอบเชอแบคทเรยโรคพช ไดแก การตรวจเชอ Acidovorax avenae subsp. citrulli (Aac) สาเหตโรคผลเนาเเบคทเรยในเมลดแตงโมและแคนตาลป (Puttharugsa et al., 2011) เทคนคนมขอดคอ สามารถตรวจสอบเชอไดอยางจ าเพาะเจาะจง ไมจ าเปนตองมการตดฉลากแอนตบอดดวยเอนไซมเพอรายงานผลการตรวจสอบ (Fahriye et al., 2008) และสามารถรายงานผลไดในขณะเกดปฏกรยา (Real time detection) (Katsamba et al., 2002) ในการทดลองนจงมวตถประสงคเพอพฒนาวธการตรวจเชอ Pantoea stewartii subsp. stewartii (Pss) ในเมลดขาวโพดดวยเทคนค Surface Plasmon Resonance (SPR) biosensor และเปรยบเทยบประสทธภาพการตรวจสอบเชอ Pss ระหวางเทคนค SPR biosensor เทคนค Indirect ELISA และเทคนค TAS-ELISA

3

วตถประสงค

1. เพอพฒนาวธการตรวจเชอ Pantoea stewartii subsp. stewartii (Pss) ในเมลดขาวโพด 2. เพอเปรยบเทยบประสทธภาพการตรวจสอบเชอ Pss ระหวางเทคนค SPR biosensor

เทคนค Indirect ELISA และเทคนค TAS-ELISA

สถานทท าการทดลอง

หองปฏบตการ A309 และ A329 อาคารปฏบตการวจยศนยเทคโนโลยชวภาพเกษตร มหาวทยาลยเกษตรศาสตร วทยาเขตก าแพงแสน จงหวดนครปฐม

ระยะเวลาในการศกษา

เดอนพฤษภาคม พ.ศ. 2554 ถง เดอนพฤศจกายน พ.ศ. 2554

4

การตรวจเอกสาร

ลกษณะและคณสมบตของเชอ Pantoea stewartii subsp. stewartii สาเหตโรคเหยวของขาวโพด เชอ Pantoea stewartii subsp. stewartii (Pss) เปนแบคทเรยชนดแกรมลบ รปรางเปนทอน ไมเคลอนท ไมมหาง (flagella) ไมสรางสปอร ขนาดเซลลประมาณ 0.4-0.8 x 0.9-2.2 μm อณหภมทเหมาะกบการเจรญอยในชวง 27-30°C และจะเจรญไดต าสดทอณหภม 8-9°C อณหภมทท าใหเชอนตายหมด (Thermal death point) อยท 53°C (Pepper, 1967) ลกษณะโคโลนบนอาหาร YDC (yeast extract dextrose calcium carbonate) เปนสเหลองและกลมนนมนวาว สวนบนอาหาร NGA (nutrient-glucose agar) มลกษณะกลมผวหนาแบบเรยบ หรอผวหนาเปนหลมเหมอนปลองภเขาไฟ เปนสครมออกเหลองจนถงเหลองสม ขนาดโคโลนประมาณ 1.8-11 mm มชวงการแบงเซลลประมาณ 1.8-3.2 ชวโมงตอรอบ แบคทเรยสราง polysaccharide ประเภท stewartan โดยเฉพาะเมอเจรญบนอาหารทม yeast extract เปนองคประกอบ (Pataky and Ikin, 2003) เชอในกลมนมความทนทานตอเกลอไดสงถง 5-7% ดงนนสามารถใช 0.8% NaCl หรอ 0.01 M Potassium phosphate, pH 7.0 ในการแยกหรอเจอจางเชอแบคทเรยได ไมสามารถเจรญทอณหภม 37°C ไมเกดปฏกรยา Oxidase เกดปฏกรยา Catalase ไมสามารถสรางกรดจากการใช cysteine สามารถสรางกรดแตไมสรางแกสจากการใช arabinose, fructose, galactose, glycerol, D-glucose, lactose, β-methylglucoside, mannitol, mannose, sucrose และ xylose บางสายพนธสามารถสรางกรดได เมอใช sorbitol สามารถใช acetate, fumarate, gluconate, malate และ succinate ไมสามารถใช benzolate, citrate, malonate, oxalate, propionate และ tartrate ไมสราง indole ไมเกดปฏกรยา nitrate reduction เจรญไดชาบนอาหารทม gelatin ไมสามารถท าใหเกดสภาพเหลว (liquefaction) ไมสราง 2,5 di-keto-D-gluconate ไมสามารถผลต Hydrogen sulphide และไมเคลอนท (Coplin and Kado, 2000 และ Pepper, 1967)

5

อาการและพฒนาการของโรค เชอ Pss เปนสาเหตใหเกดอาการในตนขาวโพดได 2 ระยะ ไดแก ระยะตนออน ปรากฏอาการเหยวบรเวณใบยอด และลกลามไปทวตนกระจายผานทางทอล าเลยงน าและระยะทสองเมอตนขาวโพดตดเชอหลงจากเจรญพนระยะตนออน โดยเรมจากเกดจดแผลเลกจากการกดกนของแมลง ท าใหใบมลกษณะเรมจากเกดเปนจดฉ าน าบรเวณดงกลาว เชอแบคทเรยจะเพมปรมาณอยางรวดเรวในทอน า ใบขาวโพดจะแสดงอาการใบดางเขยวซด จนถงเหลอง ยาวขนานเสนใบ ขอบแผลเปนหยกคลน ตอมาอาการจะพฒนาเปนจดตายและขยายจนทวใบ เมอพชมการตดเชอกระจายทวตน ใบออนทเกดใหมทบรเวณกรวยใบจะมสน าตาลเขม บรเวณใบทมอาการฉ าน า เมอตดแผลและตรวจสอบภายใตกลองจลทรรศนจะพบการไหลของแบคทเรย (ooze) ออกจากแผล และใบขาวโพดจะแหงตายในทสด โดยเปลยนเปนสน าตาลคลายสฟางแหง หากพชไมตายจะมลกษณะใบซด เกสรตวผตาย ภายในล าตนมเชอ Pss เจรญอยจ านวนมาก โดยเฉพาะสวนล าตนบรเวณคอดน ในบางครงจะพบหยดเชอแบคทเรย (ooze) ซมออกมาจากสวนผวเปลอกหมฝกขาวโพด เชอนสามารถเขาไปภายในเมลดบรเวณ chalazal ในชน aleurone และระหวางเซลล endosperm แตไมพบในสวน embryo และเยอหมเมลด (seed coat) (จฑาเทพ, 2550) การถายทอดและการแพรกระจายของโรคเหยวในขาวโพด เชอนสามารถถายทอดผานทางเมลดขาวโพด (Pepper, 1967) โดยเชออาศยอยในสวน chalazal ในชน aleurone และระหวางเซลล endosperm ของเมลดแตไมพบใน seed coat หรอ embryo จาก Crop Protection Compendium ป 2005 รายงานวาพบเชอนเปนเชอประจ าถนของกลมประเทศในทวปอเมรกาเหนอ ไดแก ประเทศแคนาดา เมกซโก และสหรฐอเมรกา ในทวปอเมรกากลางและแครเบยน ไดแก สาธารณรฐคอสตารกา และเปอรโตรโก ในทวปอเมรกาใต ไดแก สาธารณรฐโบลเวย สหพนธสาธารณรฐบราซล สาธารณรฐเปร และประเทศกายอานา ในทวปยโรปและเมดเตอเรเนยน ไดแก สาธารณรฐออสเตรย และในทวปเอเชย ไดแก ประเทศอนเดย (จฑาเทพ, 2550) พชอาศยหลกของเชอแบคทเรยน คอขาวโพด โดยสามารถเขาท าลายไดทงขาวโพดหวาน ขาวโพดไร ขาวโพดขาวเหนยว ขาวโพดควและขาวโพดฝกออน ซงขาวโพดหวานจะออนแอตอเชอแบคทเรยนมากทสด เชอนถายทอดผานแมลงพาหะ ไดแก ดวงหมดขาวโพด (corn flea beetle; Chaetocnema pulicaria Melsh.) ซงจะเปนพาหะของเชอแบคทเรยเพอขามฤดหนาว เมอมการปลกขาวโพด แมลงจะกดกนใบและถายทอดสขาวโพดตนใหม ซงเปนปจจยทส าคญของ

6

การแพรระบาดในแปลงปลกขาวโพดในฤดกาลปลกถดไป โดยมลมเปนตวชวยในการแพรกระจาย ในสหรฐอเมรกาพบวาดวงหมดขาวโพดเปนแมลงเพยงชนดเดยวทมประสทธภาพในการถายทอดโรค ดงนนการควบคมโรคสามารถท าไดโดยใชพนธตานทาน และระบบการพยากรณอากาศเพอประเมนการอยรอดของแมลงพาหะ และพยากรณการระบาดในฤดปลกตอไปได การใชสารเคม อาจไมไดผลในกรณทปลกขาวโพดสายพนธออนแอ (Nutter-Jr. and Esker, 2003) ขอดและขอจ ากดของเทคนคตางๆ ทใชในการตรวจสอบเชอแบคทเรยสาเหตโรคพช เทคนคทใชในการตรวจสอบเชอแบคทเรยโรคพชมหลายชนดซงแตละเทคนคมขอจ ากดทแตกตางกนออกไป เชน การตรวจเชอดวยชดตรวจสอบ ELISA ส าเรจรป Agdia® ซงเปนทนยมและยอมรบของ National Seed Heath System (Pataky and Ikin, 2003) เทคนคนมขอด คอ สามารถตรวจซ าไดงายและคาใชจายต ากวาวธอน สามารถตรวจเชอแบคทเรยทปนเปอนในตวอยางเมลด พช และแมลงได แตมขอจ ากดคอ ไมสามารถแยกความมชวตของเชอแบคทเรยได และในการอานผลของปฏกรยา คาทเปนบวกนนตองอานคาไดมากกวา 3 เทาของคากรรมวธควบคม (negative control) แตในบางตวอยาง พบวาผลอยในชวงทมากกวาตวควบคมลบแตไมถง 3 เทาถอวาเปนคาทคลมเครอ (elevated) ตองมการตรวจสอบซ า (Sutula et al., 1986) นอกจากนมการใชเทคนค PCR ในการตรวจสอบเชอแบคทเรยโรคพช จากรายงานของจฑาเทพ (2550) มการใชเทคนค PCR ในการตรวจสอบเชอ Pss สาเหตโรคเหยวของขาวโพด ขอดของเทคนคน คอ สามารถตรวจสอบไดรวดเรว ตรวจตวอยางจ านวนมากตอครงได และมความไวตอการตรวจสอบ อยางไรกตามพบวาการตรวจสอบเชอ Pss ดวยเทคนค PCR โดยใชไพรเมอรทมความจ าเพาะเจาะจงตอยน hrpS ของเชอ Pss ปรากฎผลบวกกบเชอแบคทเรยทมความใกลชดกบเชอ Pss เชน Pantoea agglomerans ในประเทศไทย ในปจจบนมการใชเทคนค SPR imaging ในการตรวจเชอแบคทเรย ไดแก Acidovorax avenae subsp. Citrulli (Aac) สาเหตโรคผลเนาเเบคทเรยจากเมลดแตงโมและแคนตาลปดวย Monoclonal antibody โดยเปรยบเทยบกบเทคนค ELISA พบวาเทคนค ELISA ตรวจสอบเชอไดท 5 x 104 cfu/ml เทคนค SPR ตรวจสอบเชอไดท 5 x 105 cfu/ml อยางไรกตามเทคนค SPR มขอไดเปรยบคอ สามารถท าปฏกรยาซ า ณ ต าแหนงเดมได 5 ครงในระยะเวลาอนสน (Puttharugsa et al., 2011)

7

เนองจากเทคนคนมขอดอยหลายประการ เชน สามารถตรวจสอบเชอไดอยางจ าเพาะเจาะจง ไมจ าเปนตองมการตดฉลากแอนตบอดดวยเอนไซมเพอรายงานผลการตรวจสอบ (Fahriye et al.,2008) สามารถรายงานผลไดในขณะเกดปฏกรยา (real time detection) (Katsamba et al., 2002) นอกจากนเทคนค SPR biosensor มความแตกตางจากเทคนคทางเซรมวทยาอนๆ เนองจากการรายงานผลของปฏกรยาเปนผลมาจากการเขาจบกนอยางจ าเพาะเจาะจงระหวางแอนตเจนกบแอนตบอดทเกดขนจรงขณะเกดปฏกรยา ซงสามารถค านวณเปนคาคงทในการเขาจบกน (kinetic affinity; Ka) ระหวางแอนตเจนกบแอนตบอดได (Glaser and Hausdorf, 1996, และ Moonil et al., 2007) จงท าใหผลการทดลองทไดจากเทคนคนมความแมนย า (วารรตน, 2554) เทคนค Surface Plasmon Resonance (SPR) biosensor Biosensor Technique หรอ ตวตรวจวดทางชวภาพ เปนเครองมอตรวจวดทอาศยการท างานรวมกนระหวางสวนแปลงสญญาณ (Transducer) และสารชวภาพ (Biological Component) โดยอปกรณทใชในการตรวจวดการเขาจบกนของสารดงกลาวประกอบดวยโครงสรางหลก 2 สวน ไดแก สวนแรกเปนสวนทท าใหเกดสญญาณและตวตรวจจบสญญาณทเกดขนขณะเกดการเขาจบกนของสาร ประกอบดวยสารชวภาพทตรงอยกบ transducer อาจเรยกวา detector และสวนทสองเปนสวนขยายสญญาณและอานสญญาณของสารชวภาพทเกดจากการเขาจบกน สารชวภาพทน ามาใชมหลายชนดเชน แอนตบอด เอนไซม เนอเยอพชหรอสตว เปนตน (วารรตน, 2554) หลกการท างานและขนตอนของเทคนค SPR biosensor Surface Plasmon Resonance (SPR) เปนปรากฏการณเชงแสงซงเกดขนเมอแสงตกกระทบบนผวของโลหะเชน อนภาคทองค า ซงไวตอการเปลยนแปลงคณสมบตเชงแสง (Jarupat, 2005) เมอเกดการเขาจบกนของสารบนพนผวสไลดแกวในแตละขนตอนมากขนจะสงผลใหคาการเปลยนแปลงมมสะทอนกลบของแสงลดลงตามล าดบ (ภาพท 1) โดยการรายงานผลการเกดปฏกรยาเปนคาการเปลยนแปลงมม SPR ซงคาดงกลาวขนกบการเปลยนแปลงคาดชนการสะทอนกลบของแสง (reflection index) เมอเกดการเขาจบกนของสารบนพนผวสไลดทเคลอบอนภาคทองค ามากขนตามล าดบ จะสงผลใหคาดชนสะทอนกลบของแสงลดลง ซงสามารถวดเปนคาการเปลยนแปลงมม SPR ได ณ ชวงเวลานน โดยคามม SPR ทเปลยนแปลงมหนวย milli degree (mo) (Stenberg et al., 1991) จงมการน าหลกการ SPR มาประยกตใชในการตรวจสอบการเขาจบกนของสารชวภาพกบสง

8

ตรวจดวยเทคนค biosensor รวมเปนเทคนค SPR biosensor โดยการตรวจวดการเกดปฏกรยาดวยเทคนคนไมจ าเปนตองมการตดฉลากโมเลกลทใชเปนตวรายงานผล (บญสง, ม.ป.ป.) ซงแตกตางจากเทคนค ELISA ทตองตดฉลากแอนตบอดดวยเอนไซมเพอการรายงานผล โดยเทคนค SPR biosensor มขนตอนในการท างานหลายขนตอน เพอวดคาการเปลยนแปลงของมม SPR ทเกดขนจากการเขาจบกนของสารบนพนผวสไลดแกวทเคลอบอนภาคทองค าและสารตางๆ ดงน (วารรตน, 2554)

ขนตอนท 1 Base line เปนการบนทกคาการเปลยนแปลงมม SPR ทเกดขนหลงจากตรงแอนตบอดลงบนผวอนภาคทองค าทเคลอบดวยสารเคลอบผว (11-mercaptoundecanoic acid; 11 MUA) ขนตอนท 2 Association เปนการบนทกคาการเปลยนแปลงมม SPR ทเกดขนหลงจากแอนตบอดเรมท าเขาจบกบแอนตเจน ขนตอนท 3 Equilibrium เปนการบนทกคาการเปลยนแปลงมม SPR ทเกดขนหลงจากแอนตบอดเขาจบกบแอนตเจนจนถงจดสมดล ขนตอนท 4 Dissociation เปนการบนทกคาการเปลยนแปลงมม SPR ทเกดขนหลงจากลางแอนตเจนออกจากการเขาจบกบแอนตบอด ขนตอนท 5 Regeneration เปนการบนทกคาการเปลยนแปลงมม SPR ทเกดขนหลงจากลางแอนตเจนออกจากแอนตบอดดวย regenerate buffer ขนตอนท 6 Base line เปนการบนทกคาการเปลยนแปลงมม SPR ทเกดขนหลงจากการลางแอนตเจนออกดวย regeneration buffer ท าใหแอนตบอดพรอมส าหรบท าปฏกรยากบแอนตเจนในรอบตอไปและเปน base line ใหมส าหรบการตรวจสอบในครงตอไป (ภาพท 2)

9

ภาพท 1 ล าดบการเกดปฏกรยาของโมเลกลสารชวภาพทตองการทดสอบบนแผนสไลดแกวท เคลอบอนภาคทองค า (วารรตน, 2554)

ประกอบแผนสไลดแกวทเคลอบอนภาคทองค าบน hemi-cylindricle lens

กระตนแผนสไลดแกวดวย running buffer

สารปรบสภาพพรอมท าปฏกรยา

ตรงแอนตบอดลงบนแผนสไลดแกว

ยบย งปฏกรยาทไมจ าเพาะ

แอนตบอดเขาจบกบแอนตเจน

ลางแอนตเจนออกดวย regenerate buffer

Bacteria

Bacteria

10

ภาพท 2 การเปลยนแปลงของสญญาณ SPR ในแตละขนตอนทเกดปฏกรยาระหวาง แอนตบอดกบแอนตเจนดวยเทคนค SPR biosensor (วารรตน, 2554)

(6)

(5)

(4) (3)

(2)

(1)

11

อปกรณและวธการ

1. การเตรยมเชอแบคทเรย 1.1 เลยงเชอแบคทเรย Pss (Accession no. LMG2715 จาก Collection of Labora-torium voor Microbiologie en Genetica, Belgium ใบอนญาตน าเขาสงตองหามตาม พรบ. 2507 เลขท 017/2548) และเชอแบคทเรยทแยกไดจากเมลดขาวโพด ไดแก XE2 XE4 XE6 XE7 (ไดรบความอนเคราะหจากคณณฏฐพร อทยมงคล กรมวชาการเกษตร) เชอทแยกไดจากขาวโพดทแสดงอาการใบขดมรอยหยกคลนทขอบแผลและใบคลายอาการของโรคเหยวทเกดจากเชอ Pss และ Erwinia chrysanthemi ทแยกไดจากขาวโพด (Ech1) และกลวยไม (Ech2) (ไดรบความอนเคราะหจาก ดร. ณฎฐมา โฆษตเจรญกล กรมวชาการเกษตร) P. agglomerans DMST 4045, P.agglomerans DMST 20596 และ E.coli DH5α (ไดรบความอนเคราะหจากกรมวทยาศาสตรการแพทย) ดงแสดงในตารางท 1 โดยเขยเชอบนอาหาร NA บมทอณหภม 30 °C เปนเวลา 16-24 ชวโมง ตารางท 1 ชนด สายพนธ และแหลงทมาของเชอแบคทเรยทใชในการทดลอง

เชอแบคทเรย แหลงทมา

Pantoea stewartii subsp. stewartii LMG 2715 Collection of Labora-torium voor

Microbiologie en Genetica, Belgium

P. agglomerans DMST 4045 กรมวทยาศาสตรการแพทย

P. agglomerans DMST 20596 กรมวทยาศาสตรการแพทย

Escherichia coli DH5α กรมวทยาศาสตรการแพทย

Erwinia chrysanthemi กรมวชาการเกษตร

XE 2 กรมวชาการเกษตร

XE 4 กรมวชาการเกษตร

XE 6 กรมวชาการเกษตร

XE 7 กรมวชาการเกษตร

12

1.2 การตรวจสอบขนาดและรปรางของเชอแบคทเรย น าเชอแบคทเรยทเลยงไวบนอาหาร NA เปนเวลา 24 ชวโมง ดวยวธการยอมสแกรม (Double Gram’s stain) ซงดดแปลงวธการจาก วชย (2549) โดยใช loop เขยเชอ smear บนแผนสไลดแกว จากนนตรงเซลลแบคทเรยบนสไลดแกว ยอมเซลลแบคทเรยดวย crystal violet เปนเวลา 1 นาท ลางดวยน าเปลา หยด Iodine เปนเวลา 1 นาท ลางดวยน าเปลาและแอลกอฮอล 70 % ลางดวยน าเปลาอกครง ยอมดวย safanin O เปนเวลา 30 วนาท ลางดวยน าเปลา จากนนตรวจสอบลกษณะของเซลลแบคทเรยภายใตกลอง Compound microscope 1.3 การเตรยมสารละลายเชอแบคทเรย (Bacterial suspension) โดยใช loop เขยเชอแบคทเรยบนอาหาร NA อาย 16-24 ชวโมง ละลายใน PBS, pH 7.4 ปรมาตร 3 ml ปรบคาการดดกลนแสงใหได 0.2 ทความยาวคลน 600 nm โดยใช PBS, pH 7.4 ในการปรบคาการเจอจางของสารละลายและเปน Standard blank ท า serial dilution โดยเจอจางเชอแบคทเรยท 10-1 ถง 10-5 น าเชอแบคทเรยทคาการเจอจาง 10-4 และ 10-5 ไป spread plate บนอาหาร NA เพอตรวจนบจ านวน Colony และค านวณคา CFU/ml 2. การปลกเชอแบคทเรยในเมลดขาวโพด 2.1 การปลกเชอแบคทเรย Pss ในเมลดขาวโพด ปลกเชอแบคทเรยในเมลดขาวโพดซงดดแปลงวธการจากจฑาเทพ (2550) โดยน าเชอ Pss (LMG 2715) ทเลยงบนอาหาร NA ทอณหภม 30°C เปนเวลา 16-24 ชวโมง น าเชอแบคทเรยละลายในสารละลาย PBS, pH 7.4 ปรมาตร 400 ml ปรบคาการดดกลนแสงใหได 0.2 ทความยาวคลน 600 nm แชเมลดขาวโพดในสารแขวนลอยเชอแบคทเรยอตราสวน 200 เมลดตอสารละลายเชอ Pss (LMG 2715) ปรมาตร 50 ml ในเครองสญญากาศเปนเวลา 6 ชวโมง เมอครบเวลาจงคอยๆ ปลอยใหอากาศเขาไปในเครอง หลงจากนนน าเมลดทผานการปลกเชอผงใหแหงภายใตตปลอดเชอ ทดสอบเปอรเซนตการตดเชอในเมลดขาวโพดดวยเทคนค Bio-PCR

13

2.2 การตรวจสอบเปอรเซนตการตดเชอในเมลดขาวโพดทผานการปลกเชอดวยเทคนค Bio-PCR

ตรวจสอบเปอรเซนตการตดเชอในเมลดขาวโพดทผานการปลกเชอ โดยสมเมลดขาวโพดจ านวน 20 เมลด แตละเมลดแชในสารละลาย PBS, pH 7.4 ปรมาตร 1 ml ทอณหภม 4°C ขามคน ดดสวนใสปรมาตร 800 µl น าไปตกตะกอนดวยการปนเหวยงท 12,000 rpm เปนเวลา 10 นาท ทงสวนใส ละลายตะกอนดวยน า 5 µl น าสารแขวนลอยเซลลแบคทเรย 3 µl ไปตรวจสอบเชอ Pss (LMG 2715) ดวยเทคนค Bio-PCR โดยใชปฏกรยารวม 10 ไมโครลตร ซงประกอบดวย 2x Master mix PCR buffer 5 µl ใชไพรเมอรทจ าเพาะตอยน hrpS (Coplin and Majerczak, 2002) ดวยคไพรเมอร HRP1d (5’GCACTCATTCCGACCAC3’) ปรมาตร 0.4 µl และ HRP3c (5’GCGG-CATACCTAACTCC3’) ปรมาตร 0.4 µl และน า 1.2 µl น ามาสงเคราะหและเพมปรมาณตามวธการทดดแปลงจากจฑาเทพ (2550) โดยใชอณหภมในการท าปฏกรยา ดงน 94°C 2 นาท 94°C 20 วนาท 54°C 15 วนาท 72°C 90 วนาท และ 72 °C 5 นาท ท าปฏกรยาทงสน 30 รอบ จากนนตรวจสอบผลผลตของพซอารดวย Agarose gel electrophoresis 0.8% ใน 0.5X TBE (tris base 0.89 M, boric acid 0.89 M และ EDTA 0.02 M) ใชความตางศกยคงท 100 โวลต เปนเวลา 30 นาท ยอมเจลดวย ethidium bromide solution ตรวจสอบผลภายใตแสง ultraviolet (UV) ดวยเครอง UV-transiluminator (Vilber Lourmat, Eberhardzell, Germany) และบนทกภาพ

3. แอนตบอด IgY ตอเชอ Pss (IgY-Pss) 3.1 แหลงทมาของแอนตบอด แอนตบอด IgY-Pss เปน Polyclonal antibody ทไดมาจากการผลตในไกดวยวธการเตรยมแอนตเจนแบบเซลลมชวต (Life cell) ซงไดรบความอนเคราะหจากคณจฑาเทพ วชระไชยคปต โดยแอนตซรมทไดจากการฉดกระตนในไกดวย life cell นน มความจ าเพาะเทยบเทากบชดตรวจสอบส าเรจรปของบรษท Agdia (จฑาเทพ, 2550) เมอท าการตรวจสอบความจ าเพาะเจาะจงของแอนตบอดในเบองตน พบวา IgY-Pss เกดปฏกรยาขาม (Cross reaction) กบเชอแบคทเรยชนดอนๆ ทน ามาทดสอบ จงท าการลดปฏกรยาขามโดยวธการ (Cross absorption) กอนน ามาใชในการทดลองตอไป

14

3.2 การทดสอบความจ าเพาะเจาะจงของ IgY-pss ดวยเทคนค Indirect Enzyme-linked Immunosorbent Assay (Indirect ELISA) ดดแปลงจาก จฑาเทพ (2550) น าสารแขวนลอย (suspension) ของเชอแบคทเรยชนดตางๆ ไดแก Erwinia chrysanthemi, Pantoea stewartii subsp. stewartii LMG 2715, XE2, XE4, XE6, XE7, P. agglomerans DMST 4045, P. agglomerans DMST 20596 และ E. coli DH5α ทเลยงบนอาหาร NA เปนเวลา 24 ชวโมง น าสารแขวนลอยแบคทเรยเจอจางใน PBS, pH 7.4 ปรบคาการดดกลนแสงท 600 nm ประมาณ 0.2 น าสารแขวนลอยเซลลแบคทเรยเตมลงใน ELISA microtiter plate ปรมาตร 50 µl ตอหลม แตละตวอยางท า 2 ซ า บมท 37 °C เปนเวลาขามคน ลางดวย PBST (PBS, pH 7.4 และ 0.05% Tween 20) ปรมาตร 300 µl โดยลางทนท 1 ครง และบม 5 นาท อก 3 ครง เตมแอนตซรมทผานการ Cross absorbtion มาแลว 3 ครง อตราสวน 1:1,000 ใน 5% skim milk ทละลายดวย PBS, pH 7.4 ปรมาตร 50 µl บมท 37 °C เปนเวลา 1 ชวโมง และลางดวย PBST ตามวธการขางตน เตม Goat-anti Chicken IgY alkaline phosphatase (A1043 , Sigma, USA) อตราสวน 1:7,500 ใน PBS, pH 7.4 ปรมาตร 50 µl ตอหลม บมท 37°C เปนเวลา 1 ชวโมง และลางดวย PBST ตามวธการขางตน เตมซบสเตรท p-nitrophenyl phosphate (1 mg/ml) ปรมาตร 100 µl บมท 37°C เปนเวลา 30 นาท วดคาการดดกลนแสง (Optical Density; O.D.) ท 405 nm โดยเปรยบเทยบกบตวอยางควบคมลบ (negative control ) คอ PBS, pH 7.4 buffer การแปลผลการทดลอง คาทใหผลเปนบวกหรอตรวจพบเชอจะมคา O.D. มากกวาคา O.D. ของตวอยางกรรมวธควบคมอยางนอย 2 เทา

4. วธการตรวจสอบเชอแบคทเรย Pss ดวยเทคนคตางๆ ดงน 4.1 เทคนค SPR biosensor 4.1.1 การเตรยมแผนสไลดแกวทเคลอบอนภาคทองค าส าหรบใชในการท า ปฏกรยา ดดแปลงวธการจาก วารรตน (2554) สไลดแกวทมเสนผาศนยกลาง 2.54 cm ความหนา 0.085 cm ทผานการเคลอบพนผวดวยอนภาคทองค าหนงดานเปนชนหนา 50 nm (Autolab Springle, Utrecht, The

15

Netherlands) น าสไลดแกวดงกลาวมาเตรยมส าหรบการท าปฏกรยา โดยแชสไลดแกวในสารละลาย piranha (H2O2 : H2SO4 ความเขมขน 10 M อตราสวน 1:6) เปนเวลา 1 ชวโมง โดยใหดานทเคลอบอนภาคทองค าอยดานบนเสมอตลอดการเตรยมแผนสไลดแกว ลางสไลดแกวดวยน านงฆาเชอ 3 ครง จากนนน าสไลดแกววางในสารละลาย 11-Mercaptoundecanoic acid (11MUA) (Sigma-Aldrich, Capricorn, Singapore) เปนเวลา 16 ชวโมง ลางสไลดแกวดวยแอลกอฮอล 70 % จ านวน 3 ครง และน านงฆาเชอ 3 ครง ผงสไลดแกวใหแหง (ภาพท 4ก) 4.1.2 ขนตอนการตรวจสอบสญญาณของปฏกรยา (Autolab Springle, Utrecht, The Netherlands) ดดแปลงวธการจาก วารรตน (2554)

ปรบคาการเปลยนแปลงมม SPR ใหอยในชวง -2,000 ถง 2,000 millidegree ซงสงเกตจากกราฟทปรากฏทหนาจอมอนเตอร โดยคาทเหมาะสมและแนะน าใหใชมคาประมาณ -1,500 millidegree (ตามคมอของเครอง Autolab Springle) ตอมาจงปรบสภาพผวแผนสไลดแกวทเคลอบอนภาคทองค าใหเสถยรดวย PBS, pH 7.4 ขนตอนในการท าปฏกรยามดงน ขนท 1) กระตนผวสไลดแกว (activate surface) ทเคลอบอนภาคทองค าและใช 11 MUA ใหพรอมส าหรบการท าปฏกรยาดวยสารผสมระหวาง 3-(3-dimethylaminopropyl) carbodimide (EDC) และ N-hydroxyl-succinimide (NHS) (Fluka, P.O., USA) อตราสวน 1:1 เปนเวลา 15 นาท ขนท 2) ตรง IgY-Pss (immobilization) ตามระดบความเขมขนทตองการทดสอบบนผวสไลดแกวทผานการปรบสภาพจากขอท 1 เปนเวลา 20 นาท ขนท 3) ลดปฏกรยาทไมจ าเพาะบนผวสไลดแกว (deactivate surface) ดวย blocking reagent เปนเวลา 15 นาท ขนท 4) ท าปฏกรยา (interaction plot) กบแอนตเจน เชน สารแขวนลอยเซลลแบคทเรย (bacterial suspension) เปนเวลา 10 นาท และขนท 5) เตม regenerate buffer เพอลางแอนตเจนออกจากแอนตบอดเปนเวลา 10 นาท 4.1.3 การวเคราะหผลของปฏกรยา วเคราะหคาผลตางของการเปลยนแปลงมม SPR ทเกดขนบนพนผวสไลดแกวทเคลอบอนภาคทองค าระหวางคาการเปลยนแปลงมม SPR กอนการเตมแอนตเจนและภายหลงการเขาจบกนของแอนตบอดกบแอนตเจนอยางสมบรณ โดยวางแผนการทดลองแบบสมอยางสมบรณ (Complete random design; CRD) ทดสอบจ านวน 2 ซ า (วารรตน, 2554) วเคราะหความแตกตาง

16

ทางสถตของคาการเปลยนแปลงมม SPR ในแตละขนตอนดวยโปรแกรม R (Ross and Robert, 2009) 4.2 เทคนค Indirect ELISA น าสงทตองการทดสอบเตมใน ELISA microtiter plate ปรมาตร 50 µl ตอหลม แตละตวอยางท า 2 ซ า ดวยเทคนค Indirect Enzyme-linked Immunosorbent Assay (Indirect ELISA) ตามวธการในขอ 3.2

4.3 เทคนค TAS- ELISA (Agdia®)

ในการทดสอบใชชดตรววจสอบ ELISA ส าเรจรป Agdia® ส าหรบเชอ Pss (LMG 2715) (Agdia®,Inc.,USA) ตามค าแนะน าของบรษท มรายละเอยดดงน น า Capture antibody ทเจอจางใน Carbonate coating buffer อตราสวน 1: 200 เตมลงใน ELISA microtiter plate ปรมาตร 100 µl ตอหลม บมท 4°C เปนเวลา 16 ชวโมง ใน กลองชน ลางดวย PBST (PBS เตม 0.05% Tween 20) ปรมาตร 300 µl ลาง 3 ครงอยางรวดเรว เตมสารแขวนลอยเชอแบคทเรยดงกลาว ปรมาตร 50 µl ตอหลม แตละตวอยางท า 2 ซ า บมท 4°C เปนเวลา 16 ชวโมง ใน moist chamber ลางดวย PBST (PBS เตม 0.05% Tween 20) ปรมาตร 300 µl โดยลางอยางรวดเรว 8 ครง โดยไมตองบม เตมสารผสมระหวาง Detection antibody (bottom A) และ Alkaline phosphatase enzyme conjugate, (bottom B) ทเจอจางใน ECI buffer อตราสวน 1: 200 ปรมาตร 100 µl ตอหลม บมทอณหภมหอง เปนเวลา 2 ชวโมง ลางดวยวธการขางตน จากนนเตมซบสเตรท p-nitrophenyl phosphate 1 mg/ml ปรมาตร 100 µl บมท 37°C เปนเวลา 30 นาท ในทมด วดคาการดดกลนแสง (Optical Density; O.D.) ท 405 nm โดยเปรยบเทยบกบกรรมวธควบคม (negative ) ไดแกPBS, pH 7.4 การแปลผลการทดลอง คาทใหผลเปนบวกหรอตรวจพบเชอจะมคา O.D. มากกวาคา O.D. ของตวอยางกรรมวธควบคมอยางนอย 2 เทา

17

ภาพท 3 ขนตอนการทดสอบเชอดวยเทคนค SPR biosensor ก) อปกรณและสารเคมส าหรบการ ลางและเคลอบแผนสไลดแกวดวย 11 MUA ข) เครองมอทใชในการทดสอบ ค) การวาง แผนสไลดแกวทเคลอบอนภาคทองค าบนปรซมและ ง) โปรแกรมทใชในการท าปฏกรยา (Data acquisition version 5.1; Autolab Springle, Utrecht, The Netherlands) และ โปรแกรมการประมวลผลการท าปฏกรยา (Kinetic Evaluation version 5.1; (Autolab Springle, Utrecht, The Netherlands) (วารรตน, 2554)

18

5. การทดสอบความจ าเพาะเจาะจงของเทคนค SPR biosensor, เทคนค Indirect ELISA และ TAS- ELISA (Agdia®) ในการตรวจสอบเชอ Pss

เตรยมสารแขวนลอย (suspension) ของเชอแบคทเรยชนดตางๆ ไดแก Erwinia chrysanthemi, Pantoea stewartii subsp. stewartii LMG 2715, P. agglomerans DMST 4045, P. agglomerans DMST 20596 และ E.coli DH5α ทเลยงบนอาหาร NA เปนเวลา 24 ชวโมง น าเซลลแบคทเรยเจอจางใน Peptone buffer ปรบคาการดดกลนแสงท 600 nm ประมาณ 0.2 น าสารแขวนลอยเซลลแบคทเรยทเตรยมไดไปทดสอบความจ าเพาะเจาะจงในแตละเทคนคตามวธการของเทคนคตางๆดงกลาวขางตน โดยทดสอบแบคทเรยแตละชนดๆ ละ 2 ซ า จากนนน าผลการทดลองทไดมาวเคราะหความแตกตางทางสถตดวยโปรแกรม R (Ross and Robert, 2009) 6. การตรวจสอบเชอ Pss ในเมลดขาวโพด การเตรยมตวอยางส าหรบตรวจสอบเชอ Pss ในเมลดขาวโพด แบงเปนวธการตางๆ ดงตารางท 2 โดยแตละการทดลองท า 2 ซ า จากนนน าผลทไดของแตละเทคนควเคราะหความแตกตางทางสถตดวยโปรแกรม R (Ross and Robert)

19

ตารางท 2 การเตรยมตวอยางส าหรบตรวจสอบเชอ Pss ในเมลดขาวโพด

ตวอยาง ชนดของ buffer

วธการเตรยมเชอจากเมลดขาวโพด

1. เมลดขาวโพดปกต 100 เมลด Peptone Buffer แชใน Buffer เขยาบนเครอง shaker 60 rpm

นาน 12-14 ชวโมง ทอณหภมหอง 2. เมลดขาวโพดปกต 100 เมลด Peptone Buffer แชในBuffer เขยาบนเครอง shaker 60 rpm

นาน 12-14 ชวโมง ทอณหภมหอง จากนนน าเมลดขาวโพดดงกลาวมาบด และกรองเฉพาะสวนน าบดมาใชทดสอบ

3. เมลดขาวโพดทปลกเชอตอเมลดขาวโพดปกต อตราสวน 10:100 เมลด

Peptone Buffer แชใน Buffer เขยาบนเครอง shaker 60 rpm นาน 12-14 ชวโมง ทอณหภมหอง

4. เมลดขาวโพดทปลกเชอตอเมลดขาวโพดปกต อตราสวน 10:100 เมลด

Peptone Buffer แชในBuffer เขยาบนเครอง shaker 60 rpm นาน 12-14 ชวโมง ทอณหภมหอง จากนนน าเมลดขาวโพดดงกลาวมาบด และกรองเฉพาะสวนน าบดมาใชทดสอบ

5. เมลดขาวโพดปกต 100 เมลด GEB buffer แชใน Buffer เขยาบนเครอง shaker 60 rpm นาน 12-14 ชวโมง ทอณหภมหอง

6. เมลดขาวโพดทปลกเชอตอเมลดขาวโพดปกต อตราสวน 10:100 เมลด

GEB buffer แชในBuffer เขยาบนเครอง shaker 60 rpm นาน 12-14 ชวโมง ทอณหภมหอง จากนนน าเมลดขาวโพดดงกลาวมาบด และกรองเฉพาะสวนน าบดมาใชทดสอบ

7. เชอ Pss PBS, pH 7.4 สารแขวนลอยเชอแบคทเรย O.D.= 0.2 ท 600 nm

8. กรรมวธควบคม PBS, pH 7.4 -

20

7. การทดสอบความไว (sensitivity) ในการตรวจสอบเชอ Pss ดวยเทคนคตางๆ การเตรยมตวอยางส าหรบทดสอบความไวในการตรวจเชอ Pss ในเมลดขาวโพด แบงเปนตวอยางตางๆ ดงตารางท 3 โดยแตละการทดลองท า 2 ซ า และน าตวอยางขางตนมาทดสอบดวยเทคนค SPR biosensor, Indirect ELISA และ TAS-ELISA โดยเปรยบเทยบความแตกตางทางสถตระหวางผลการตรวจสอบตวอยางเชอ Pss ทคาการเจอจางตางๆ (อตราสวนระหวางเมลดขาวโพดทมเชอ Pss ตอเมลดขาวโพดปกต) กบกรรมวธควบคมและวเคราะหความแตกตางทางสถตดวยโปรแกรม R (Ross and Robert)

21

ตารางท 3 การเตรยมตวอยางส าหรบทดสอบความไวในการตรวจเชอ Pss ในเมลดขาวโพด

ตวอยาง ชนดของ buffer วธการเตรยมเชอจากเมลดขาวโพด

1. เมลดขาวโพดทปลกเชอผสมกบเมลด ขาวโพดปกต อตราสวน 1:100

Peptone Buffer แชใน Buffer เขยาบนเครอง shaker 60 rpm นาน 12-14 ชวโมง ทอณหภมหอง

2. เมลดขาวโพดทปลกเชอผสมกบเมลด ขาวโพดปกต อตราสวน 1:1,000

Peptone Buffer แชในBuffer เขยาบนเครอง shaker 60 rpm นาน 12-14 ชวโมง ทอณหภมหอง จากนนน ามาบด และกรองเฉพาะสวนน าบดมาใชทดสอบ

3. เมลดขาวโพดทปลกเชอผสมกบเมลด ขาวโพดปกต อตราสวน 1:5,000

Peptone Buffer แชใน Buffer เขยาบนเครอง shaker 60 rpm นาน 12-14 ชวโมง ทอณหภมหอง

4. เมลดขาวโพดปกต 120 เมลด Peptone Buffer แชในBuffer เขยาบนเครอง shaker 60 rpm นาน 12-14 ชวโมง ทอณหภมหอง จากนนน าเมลดขาวโพดดงกลาวมาบด และกรองเฉพาะสวนน าบดมาใชทดสอบ

5. เมลดขาวโพดปกต 120 เมลด GEB buffer แชใน Buffer เขยาบนเครอง shaker 60 rpm นาน 12-14 ชวโมง ทอณหภมหอง

6. เมลดขาวโพดทปลกเชอผสมกบ เมลดขาวโพดปกต

GEB buffer แชในBuffer เขยาบนเครอง shaker 60 rpm นาน 12-14 ชวโมง ทอณหภมหอง จากนนน ามาบด และกรองเฉพาะสวนน าบดมาใชทดสอบ

7. เชอ Pss GEB buffer สารแขวนลอยเชอแบคทเรย O.D.= 0.2 ท 600 nm

8. เชอ Pss Peptone buffer สารแขวนลอยเชอแบคทเรย O.D.= 0.2 ท 600 nm

9. GEB buffer * 10. Peptone buffer * * คอ กรรมวธควบคม

22

8. เปรยบเทยบประสทธภาพการตรวจสอบเชอ Pantoea stewartii subsp. stewartii ในเมลด ขาวโพดระหวางเทคนค SPR biosensor, เทคนค Indirect ELISA และ ชดตรววจสอบ TAS-ELISA (Agdia®) เปรยบเทยบผลการตรวจสอบเชอ Pss (LMG 2715) ของทง 3 เทคนค โดยพจารณาจากความจ าเพาะเจาะจง (specificity) และคาการทดสอบความไว (sensitivity) ในการตรวจสอบเชอ Pss ในเมลดขาวโพด

23

ผลและวจารณผลการทดลอง 1. ลกษณะโคโลนและรปรางของเชอ Pss ภายใตกลองจลทรรศน

หลงจากการเลยงเชอแบคทเรยบนอาหาร NA เปนเวลา 2 วน พบโคโลนของเชอ Pss ขนาด

ประมาณ 1.0-2.0 mm ลกษณะโคโลนมสเหลองนวล ขอบเรยบ ผวมนวาว แตไมเยม ทบแสง และนนต า ซงสอดคลองกบการรายงานของ Pataky and Ikin (2003) นอกจากนพบขอบโคโลนลกษณะขอบหยก โคโลนคอนขางแบน (ภาพท 4ก) จากการตรวจสอบขนาดและรปรางของเชอ Pss (LMG 2715) ทเลยงบนอาหาร NA เปนเวลา 24 ชวโมง ดวยวธการยอมสแกรม (Double Gram’s stain) และตรวจสอบลกษณะของเซลลภายใตกลองจลทรรศน (Compound microscope) ทก าลงขยาย 4,000 เทา พบวาเชอ Pss (LMG 2715) เปนเชอแบคทเรยแกรมลบ มรปรางเปนทอนสน (ภาพท 4ข) ซงสอดคลองกบการรายงานของ Pepper (1967)

ภาพท 4 ลกษณะของเชอ Pss ก) ลกษณะโคโลนของเชอ Pss (LMG 2715) บนอาหาร NA และ ข) รปรางของเชอ Pss ภายใตกลองจลทรรศนทก าลงขยาย 4,000 เทา

ก ข

24

2. การตรวจสอบเปอรเซนตการตดเชอ Pss ในเมลดขาวโพดทผานการปลกเชอ การปลกเชอแบคทเรยในเมลดขาวโพด ตามทไดดดแปลงวธการจากจฑาเทพ (2550) ดวยการเพมเวลาการแชเมลดขาวโพดใน Peptone buffer จาก 4 ชวโมง เปน 6 ชวโมง ในสภาพสญญากาศ และตรวจสอบเปอรเซนตการตดเชอในเมลดขาวโพดทผานการปลกเชอ Pss (artificial seed inoculation) ดวยเทคนค Bio-PCR ทใชไพรเมอรตอยน hrpS ทจ าเพาะเจาะจงตอเชอ Pss ตามรายงานของ จฑาเทพ (2550) พบวาเมลดขาวโพดพนธอนทรย 2 ทผานการปลกเชอ Pss ในสภาพสญญากาศเปนเวลา 6 ชวโมง มเปอรเซนตการตดเชอในเมลดเปน 100 % ซงพจารณาไดจาก PCR product ทมขนาดประมาณ 900 bp (ภาพท 5) ภาพท 5 ผลการวเคราะหขนาดดเอนเอของยน hrpS เชอ Pss ดวยเทคนค Agarose gel eletrophoresis 0.8% ภายหลงการเพมปรมาณดวยเทคนค Bio-PCRจากไพรเมอร HRP1d และ HRP3c M คอ Middle range DNA marker (Fermentas, Ontario, Canada) 1 คอ 1-8 เปนเมลดขาวโพดพนธอนทรย 2 ทปลกเชอ Pss

9 คอ เชอ Pss ทบรสทธ 10 คอ กรรมวธควบคม (Negative control)

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

25

3. การทดสอบความจ าเพาะเจาะจงของแอนตซรม IgY-Pss ดวยวธ Indirect ELISA ดดแปลงวธการจาก จฑาเทพ (2550) เมอน าแอนตบอด IgY-Pss ทไดมาจากการผลตในใก ตรวจสอบความจ าเพาะเจาะจงกบเชอ Pss และเชอแบคทเรยทแยกไดจากเมลดขาวโพด พบวา IgY-Pss เกดปฏกรยาขามกบเชอแบคทเรยชนดอนๆ จงท าการลดปฏกรยาขาม จ านวน 4 ครง และน าแอนตซรม IgY-Pss ทผานการลดปฏกรยาขามมาทดสอบความจ าเพาะเจาะจงกบเชอแบคทเรยทแยกไดจากเมลดขาวโพดอกครงโดยม PBS, pH 7.4 และ เชอ Pss เปนกรรมวธควบคม (negative control และ positive control ตามล าดบ) โดยใชแอนต IgY-Pss ทคาการเจอจาง 1: 1,000 ใน PBS, pH 7.4 ดวยเทคนคขางตน พบวา IgY-Pss เกดปฏกรยาขามกบเชอ XE7, Erwinia chrysanthemi, E. coli DH5α, P. agglomerans DMST 4045, และ P. agglomerans DMST 20596 ซงมคาการดดกลนแสงเฉลยท 405 nm เทากบ 0.364, 0.349, 0.255, 0.223 และ 0.492 ตามล าดบ (ตารางท 4) ซงผลทไดสอดคลองกบการรายงานของจฑาเทพ (2550) ทพบวา IgY-Pss ทไดจากการฉดกระตนในไกดวย life cell นนสามารถท าปฏกรยาขามกบเชอแบคทเรยสายพนธทแยกไดจากขาวโพดในประเทศไทย

26

ตารางท 4 ผลการทดสอบความจ าเพาะเจาะจงของแอนตซรม (IgY-Pss) กบเชอ แบคทเรย 6 ชนด ดวยเทคนค Indirect ELISA

ตวอยางททดสอบ คาเฉลยคาการดดกลนคลนแสงท 405 nm 1

XE 7 (+) 0.364

E. chrysanthemi (+) 0.349

Pag 4045 (+) 0.223

Pag 20596 (+) 0.492

E. coli DH5α (+) 0.255

Pss. LMG2715 (+) 0.520

PBS, pH 7.4 (-) 0.086

1 คา O.D.เฉลยจากการทดลอง 2 ซ า (-) คอ ไมเกดปฏกรยา (+) คอ เกดปฏกรยาได มคาการดดกลนแสงมากกวา 2 เทาของตวอยางกรรมวธควบคม (negative control)

27

4. การทดสอบความจ าเพาะเจาะจงของเทคนค ในการตรวจสอบเชอ Pss จากการทดสอบคาความจ าเพาะเจาะจงของเทคนคทง 3 เทคนค ไดแก เทคนค SPR biosensor , เทคนค Indirect ELISA และ TAS- ELISA (Agdia®) ทใชในการตรวจสอบเชอ Pss โดยทดสอบกบเชอแบคทเรยทแยกไดจากขาวโพดในประเทศไทย พบวาเทคนค SPR biosensor เกดปฏกรยาขาม (cross reaction) นอยทสดเมอเปรยบเทยบกบเทคนคอนๆโดยเกดปฏกรยาขามกบเชอแบคทเรยเพยงแค 3 ชนด (ภาพท 6) ไดแก Erwinia chrysanthemi, P. agglomerans DMST 4045 และ E. coli DH5α พจารณาจากคาเฉลยการเปลยนแปลงมม SPR ของเชอทง 3 ชนดทมคาสงอยในระดบเดยวกน ไมมความแตกตางกนทางสถต เมอเปรยบเทยบกบเชอ Pss และใหคาเฉลยการเปลยนแปลงมม SPR แตกตางจากเชอ Pag 20596 และ XE7 อยางมนยส าคญทางสถต สวนเทคนค Indirect ELISA เกดปฏกรยาขาม (cross reaction) กบเชอแบคทเรยจ านวน 4 ชนด ไดแก E. chrysanthemi, P. agglomerans DMST 4045, XE7 และ P. agglomerans DMST 20596 นอกจากนเทคนค TAS- ELISA (Agdia®) เกดปฏกรยาขาม (cross reaction) กบเชอทกชนด (ตารางท 5)

28

ตารางท 5 ผลการทดสอบความจ าเพาะเจาะจงของเทคนคตางๆตอการตรวจเชอ Pss

1 คอ เปรยบเทยบความแตกตางทางสถตของคาเฉลยผลการทดสอบความจ าเพาะเจาะจงระหวาง เทคนคกบเชอแบคทเรยชนดตางๆโดยเปรยบเทยบผลของตวอยางททดสอบภายใน เทคนคเดยวกน (-) คอ ไมเกดปฏกรยา (+) คอ เกดปฏกรยาได มคาการดดกลนแสงมากกวา 2 เทาของตวอยางกรรมวธควบคม (negative control)

ตวอยาง คาเฉลยการดดกลนคลนแสงท 405 nm1 คาเฉลยการเปลยนแปลงมม SPR m° 1 Indirect ELISA TAS-ELISA

Pag 20596 (+) 0.836

(+) 1.734

16.0b

XE 7 (+) 1.583

(+) 1.273

4.0b

E.chrysanthemi (+) 0.680

(+) 2.409

42.5a

E.coli (DH5α) (-) 0.390

(+) 1.981

40.0a

Pag 4045 (+) 0.736

(+) 2.620

40.0a

Pss (LMG 2715) (+) 3.076

(+) 3.632

55.0a

Peptone buffer (-) 0.280

(-) 0.151 8.5b

1

ภาพท 6 คาการเปลยนแปลงมม SPR เมอทดสอบความจ าเพาะเจาะจงของเทคนค SPR biosensor ในการตรวจสอบเชอแบคทเรยชนดตางๆ ทเจอจางใน peptone buffer

Pag. 20596 O.D.= 0.2 ใน Peptone buffer Peptone buffer E. coli DH5α O.D.= 0.2 ใน Peptone buffer E. chrysanthemi O.D.= 0.2 ใน Peptone buffer Pss (LMG 2715) O.D.= 0.2 ใน Peptone buffer Pag. 4045 O.D.= 0.2 ใน Peptone buffer XE7 O.D.= 0.2 ใน Peptone buffer

29

30

5. การตรวจสอบเชอ Pss ในเมลดขาวโพดทผานการปลกเชอ จากการเตรยมตวอยางส าหรบตรวจสอบเชอ Pss ในเมลดขาวโพดทผานการปลกเชอดวยวธการตางๆ พบวาวธการแชเมลดขาวโพดใน peptone buffer เขยาบนเครอง shaker ดวยความเรวรอบ 60 rpm เปนเวลา 12 ชวโมง ทอณหภมหองเปนวธการทดทสดในการน าเชอออกจากเมลดขาวโพด เนองจากใหคาความแตกตางของ positive control และ negative control แตกตางกนอยางมนยส าคญทางสถต เมอเปรยบเทยบกบการตรวจเชอ Pss จากเมลดดวยเทคนคตางๆ ดงนนจงเลอกใชวธการดงกลาวในการตรวจเชอ Pss ในเมลดขาวโพดเพอทดสอบความไวตอไป ส าหรบวธการแชเมลดขาวโพดทปลกเชอใน Peptone buffer และน ามาบดพบวาใหคาผลการทดลองระหวาง positive control และ negative control ในระดบทสงทง 3 เทคนค และไมมความแตกตางทางสถต ซงคาดวาเกดจากการท าปฏกรยาทไมจ าเพาะของสารจ าพวกแปงและน าตาลในเมลดขาวโพด ทปะปนมาในระหวางการบดตวอยาง และการแชเมลดขาวโพดทปลกเชอใน GEB buffer แลวน ามาบดนนพบวามคาของผลการทดลองระหวาง positive control และ negative control ของเทคนค indirect ELISA และ SPR biosensor อยในสงเชนกน ซงคาดวาเกดจากสารประกอบจ าพวก Albumin ทเปนสวนประกอบหนงของ GEB buffer (ตารางท 6, ภาพท 7)

31

ตารางท 6 การตรวจเชอ Pss (LMG 2715) ในเมลดขาวโพด

1 คอ เปรยบเทยบความแตกตางทางสถตของคาเฉลยผลการทดลองระหวางตวอยางทมเชอ Pss กบตวอยางทเปนกรรมวธควบคม (ไมมเชอ Pss) โดยเปรยบเทยบผลการทดลองของ ตวอยางทน ามาทดสอบภายในเทคนคเดยวกน

ตวอยาง คาเฉลยการดดกลนคลนแสงท 405 nm 1

คาเฉลยการเปลยนแปลงมม SPR

m° 1 Indirect ELISA TAS-ELISA เมลดขาวโพดทผานการปลกเชอและแชใน GEB

0.803a

2.171a

825.0a

เมลดขาวโพดปกตทแชใน GEB 0.772a

0.443b

540.0a

เมลดขาวโพดทผานการปลกเชอและแชใน peptone

1.472a

3.042a

107.5a

เมลดขาวโพดปกตทแชใน peptone 0.610b

0.391b

24.0b

เมลดขาวโพดทผานการปลกเชอแชใน peptone และบด

0.829a

1.544a

160.0a

เมลดขาวโพดปกตทแชใน peptone และบด

0.585a

1.390a

220.0a

สารแขวนลอยเซลลเชอ Pss (O.D.=0.2) ใน PBS, pH 7.4

3.088a

3.602a

33.5a

PBS, pH 7.4 0.148b

0.424b

9.0b

31

ภาพท 7 คาการเปลยนแปลงมม SPR ในการตรวจเชอ Pss (LMG 2715) จากเมลดขาวโพดดวยเทคนค SPR biosensor

PBS pH 7.4 ใน Peptone buffer

เมลดขาวโพดปกตแชใน Peptone buffer

Pss (LMG 2715) O.D.= 0.2 ใน Peptone buffer

เมลดขาวโพดปกตในแชใน GEB buffer

เมลดขาวโพดปลกเชอแชใน Peptone buffer เมลดขาวโพดปกตแช-บดใน Peptone buffer เมลดขาวโพดปลกเชอแช-บดใน Peptone buffer Pss (LMG 2715) O.D.= 0.2 ใน GEB buffer

32

33

6. การทดสอบความไว (sensitivity) ในการตรวจเชอ Pss ในเมลดขาวโพดดวยเทคนคตางๆ การทดสอบความไวในการตรวจเชอ Pss ในเมลดขาวโพดดวยเทคนคตางๆ พบวาเทคนค SPR biosensor และเทคนค TAS-ELISA สามารถตรวจสอบเชอ Pss ในเมลดขาวโพดไดทอตราสวน 1: 100, 1:1,000 และ 1:5,000 (เมลดขาวโพดทปลกเชอ Pss : เมลดขาวโพดปกต สวนเทคนค Indirect-ELISA ไมสามารถตรวจเชอ Pss ในเมลดขาวโพด (ตารางท 7) มคาของ positive control และ negative control ใกลเคยงกน ซงคาดวาเปนผลจากการเกดปฏกรยาทไมจ าเพาะเจาะจงระหวางแอนตบอด IgY ททดสอบกบเชอแบคทเรยชนดอนๆ ทปะปนมาอยในเมลดขาวโพดทใชในการทดลอง เนองจากในขนตอนการทดลองไมไดมการท าความสะอาดเมลดขาวโพดกอน เพอตองการทดสอบกรรมวธเสมอนวธการตรวจตวอยางเชอทปนเปอนในเมลดจรง

34

ตารางท 7 เปรยบเทยบผลการทดสอบความไวในการตรวจสอบเชอ Pss ระหวางเทคนค Indirect ELISA, TAS-ELISA และ SPR biosensor

ตวอยาง คาเฉลยการดดกลนคลนแสงท 405 nm1

คาเฉลยการเปลยนแปลงมม SPR

m°1 Indirect ELISA TAS-ELISA เมลดทมเชอ:เมลดปกต (1:100)2 (-) 0.560 (+) 3.677 147.0ab

เมลดทมเชอ:เมลดปกต (1:1,000)2 (-) 0.362 (+) 1.008 332.5a เมลดทมเชอ:เมลดปกต (1:5,000)2 (-) 0.435 (+) 1.211 300.0a เมลดปกตทแชใน Peptone buffer (-) 0.571 (-) 0.480 84.0c เมลดทมเชอ:เมลดปกต (1:100)3 (+) 0.478 (+) 1.015 240.0a เมลดปกตทแชและบดใน GEB buffer (+) 0.755 (+) 0.713 220.0a

เชอ Pss ใน GEB buffer4 (+) 0.485 (+) 3.734 22.5a GEB buffer (-) 0.209 (-) 0.390 21.0a

เชอ Pss ใน Peptone buffer5 (+) 2.357 (+) 3.710 45.5a Peptone buffer (-) 0.291 (-) 0.613 1.5b

1 คอ เปรยบเทยบความแตกตางทางสถตของคาเฉลยผลการทดลอง โดยเปรยบเทยบผลการ ทดลองของตวอยางททดสอบภายในเทคนคเดยวกน 2 คอ เมลดขาวโพดทผานการปลกเชอ Pss ในสภาพสญญากาศ 6 ชวโมง ผสมกบเมลด ขาวโพดปกตทแชใน Peptone buffer 3 คอ เมลดขาวโพดทผานการปลกเชอ Pss ในสภาพสญญากาศ 6 ชวโมง ผสมกบเมลด ขาวโพดปกตทแชและบดใน GEB buffer 4 คอ สารแขวนลอยเชอ Pss ใน GEB buffer O.D. = 0.2 5 คอ สารแขวนลอยเชอ Pss ใน Peptone buffer O.D. = 0.2 (-) คอ ไมเกดปฏกรยา (+) คอ เกดปฏกรยาได มคาการดดกลนคลนแสงมากกวา 2 เทาของตวอยางกรรมวธควบคม (negative control)

35

7. เปรยบเทยบประสทธภาพการตรวจสอบเชอ Pss ในเมลดขาวโพดทปลกเชอ เปรยบเทยบประสทธภาพการตรวจสอบเชอ Pss ในเมลดขาวโพดทปลกเชอระหวางเทคนค Indirect ELISA, TAS-ELISA และ SPR biosensor โดยวเคราะหจากขอมลตางๆ พบวา เทคนค SPR biosensor มความไวในการตรวจสอบเชอ Pss ในเมลดขาวโพดทปลกเชอทอตราสวนเมลดขาวโพดทปลกเชอ : เมลดขาวโพดปกต เทากบ 1:5,000 เชนเดยวกบเทคนค TAS-ELISA ในขณะทเทคนค Indirect ELISA ไมสามารถใชในการตรวจเชอได สวนความจ าเพาะเจาะจงของเทคนคทง 3 เทคนค พบวาเทคนค SPR biosensor เกดปฏกรยาขามกบเชอแบคทเรยเพยงแค 3 ชนด เทคนค Indirect ELISA เกดปฏกรยาขามกบเชอแบคทเรย 4 ชนด ในขณะทเทคนค TAS-ELISA เกดปฏกรยาขามกบเชอแบคทเรยทกชนดทน ามาทดสอบ

จากการทดสอบประสทธภาพการตรวจเชอ Pss ดวยเทคนคทง 3 เทคนค ในการทดลองครงน แสดงใหเหนวา เทคนค SPR biosensor สามารถตรวจสอบเชอ Pss ในเมลดขาวโพดไดดทสดเมอเปรยบเทยบกบเทคนค Indirect ELISA และ TAS-ELISA

36

สรปผลการทดลอง

การทดลองนไดพฒนาวธการตรวจเชอ Pss ในเมลดขาวโพดดวยเทคนค Surface Plasmon Resonance (SPR) Biosensor และเปรยบเทยบประสทธภาพการตรวจสอบเชอ Pss ในเมลดขาวโพด ระหวางเทคนคมาตรฐาน TAS-ELISA ของ Agdia® , เทคนค SPR biosensor และเทคนค Indirect ELISA โดยปลกเชอ Pss ลงในเมลดขาวโพดพนธอนทรย 2 และตรวจสอบเปอรเซนตการตดเชอของเมลดขาวโพดทปลกเชอดวยเทคนค Bio-PCR ดวยไพรเมอร HRP1d และ HRP3c ทมความจ าเพาะตอยน hrpS ของเชอ Pss พบวาเมลดขาวโพดตดเชอ Pss 100 เปอรเซนต จากนนทดสอบการน าเชอออกจากเมลดขาวโพด พบวาการแชเมลดขาวโพดดวย Peptone buffer เปนวธการทดทสดในการน าเชอออกจากเมลด และจากการเปรยบเทยบการทดสอบความจ าเพาะเจาะจงของการตรวจเชอทง 3 เทคนค พบวาเทคนค SPR biosensor ใหผลดทสด เนองจากเกดปฏกรยาขามนอยทสดเมอเปรยบเทยบกบเทคนคอน โดยเกดปฏกรยาขามกบเชอ Erwinia chrysanthemi, Escherichia coli (DH5α) และ Pantoea agglomerans DMST 4045 และมความไวในการตรวจสอบเชอ Pss ในเมลดขาวโพดทอตราสวน 1:5,000 (เมลดขาวโพดทมเชอ : เมลดขาวโพดปกต) เชนเดยวกบเทคนค TAS-ELISA ของ Agdia® แตไมสามารถตรวจสอบเชอ Pss ทอตราสวนดงกลาวดวยเทคนค Indirect-ELISA

37

เอกสารอางอง

จฑาเทพ วชระไชยคปต. 2550. การศกษาโรคเหยวจากแบคทเรยของขาวโพดในประเทศ ไทย. วทยานพนธปรญญาเอก, มหาวทยาลยเกษตรศาสตร. จฑาเทพ วชระไชยคปต วฒนกร เทพโพธา สจนต ภทรภวดล ณฎฐพร อทยมงคล นพนธ ทวชย และวชย โฆสตรตน. 2550. ขอจ ากดเทคนคของเทคนคในการตรวจเชอ Pantoea

stewartii subsp. stewartii. แหลงทมา: http://kucon.lib.ku.ac.th/fulltext/ KC4501034.pdf บญสง สตะพนธ. ม.ป.ป. ไบโอเซนเซอรโดยใชเทคนคคลนผวพลาสมอน. แหลงทมา: http//www.researchgate.net/publication/39031640, 17 มนาคม 2554. พระราชบญญตกกพช พ.ศ. 2507 แกไขเพมเตมโดย พระราชบญญตกกพช (ฉบบท 2) พ.ศ. 2542. แหลงทมา: http://www.doa.go.th/code/sum_code/pq_act.pdf, 20 มนาคม 2548. วารรตน สมประทม. 2554. การพฒนาเทคนค Surface Plasmon Resonance (SPR) Biosensor

ส าหรบตรวจสอบเชอ Chilli veinal mottle virus (ChiVMV). วทยานพนธ ปรญญาโท, มหาวทยาลยเกษตรศาสตร. วชย โฆสตรตน. 2549. การวนจฉยโรคพชทเกดจากเชอแบคทเรย. ภาควชาโรคพช คณะเกษตร ก าแพงแสน มหาวทยาลยเกษตรศาสตร วทยาเขตก าแพงแสน, นครปฐม. Autolab application note. n.d. Autolab SPR immunosensor for fibrinogen in human plasma. Available Source: www.autolab-instruments.com, October 10, 2009. Coplin, D.L. and C.I. Kado. 2000. Pantoea. 73-83. In N. Schaad, J. Jones and W. Chun. Laboratory Manual for the Identification of Plant Pathogenic Bacteria. American Phytopathological Society Press, St.Paul, MN.

38

Coplin, D.L., D.R. Majerczak, Y. Zhang, W.S. Kim, S. Jock and K. Geider. 2001. Identification of Pantoea stewartii subsp. stewartii by PCR and strain differentation by PFGE. Plant Disease 86:304-311. Coplin DL and Majerczak DR. 2002. Identification of Pantoea stewartii subsp. stewartii by PCR and strain differentiation by PFGE. Plant Disease 86, 304–311. Fahriye, C.D. and I.H. Boyac. 2008. Rapid and label-free bacteria detection by surface Plasmon resonance (SPR) biosensor. Biotechnol. 4:1003-1011. Glaser, R.W. and G. Hausdorf. 1996. Bindind kinetic of an antibody against HIV p24 core protein measured with real-time biomolecular interaction analysis suggest a slow conformation change in antigen p24. J. Immunol. Methods 189:1-14. Katsamba, P.S., S. Park and I.A.L.Offinga. 2002. Kinetic studies of RNA-protein interaction using surface Plasmon resonance. Meth. 26:95-104. Jarupat, D. 2005. Development of surface plasmon resonance spectroscopy as a biological sensor. M.Sc. Thesis, Mahidol University. Moonil, K., S.H. Han, Y.B. Shin and B.H. Chung. 2007. Surface Plasmon resonance biosensor chips. Biochip. 2:81-89. Nutter-Jr., F.W. and P.D. Esker. 2003. Temporal dynamics of corn flea beetle populations infested with Pantoea stewartii, casual agent of Sterart’s disease of corn. Phytopathology 93:210-218. Pataky, J.K. and R. Ikin. 2003. Pest Risk Analysis: The Risk of Introducing Erwinia

stewartii in Maize Seed. The International Seed Federation, Switzerland.

39

Pepper, E.H. 1967. Stewart's bacteria wilt of corn. The American Phytopathological Society, United States of America. Puttharugsa,C, WangkamT, Nongluck Huangkamhang, Oraprapai Gajanandana,Orawan Himanan to, Sutapun B, Amarit R, Armote Somboonkaew, Toemsak Srikhirin. 2011. Development of surface plasmon resonance imaging for detection of Acidovorax avenae subsp. citrulli (Aac) using specific monoclonal antibody. Biosensors and Bioelectronics. 26(5) : 6. Ross, J. and J. Robert. 2009. R program. Available Source: http://www.rober- tjross.org/-LightNEasy.php?page=publications., March 10, 2009. Stenberg, E., B. Persson,H. Roos and C. Urbaniczky. 1991. Quantitative determination of surface concentration of protein with surface plasmon resonance using radiolabeled protein. J. Colloid Interface Sci. 143: 513-526. Sutula, C.L., J.M. Glilett, S.M. Morrissey and D.C. Ramsdell. 1986. Interpreting ELISA data and establishing the positive-negative threshold. Plant Disease 70:722-726.

40

ภาคผนวก

41

ภาคผนวก ก การเตรยมสารตางๆ ทใชในการทดลอง

42

1. การเตรยมสารละลายส าหรบตรวจสอบเชอ Pss (LMG 2715) ดวยเทคนค Indirect ELISA 1.1 Carbonate coating buffer, pH 9.6 NaHCO3 2.93 g Na2CO3 1.59 g ละลายในน ากลน 800 ml ปรบ pH ใหได 9.6 แลวปรบปรมาตรดวยน ากลนจนครบ 1,000 ml 1.2 Phosphate buffer saline (PBS), pH 7.4 NaCl 8.0 g Na2HPO4.12H2O 2.9 g KH2PO4 0.2 g KCl 0.2 g ปรบ pH ใหได 7.4 แลวปรบปรมาตรดวยน ากลนจนครบ 1,000 ml 1.3 Washing buffer (PBST) PBS 1,000 ml Tween-20 0.5 ml 1.4 Substrate buffer, pH 9.8 Diethanolamine 97 ml Sodium azide 0.2 g MgCl2.6H2O 0.1 g น ากลน 800 ml

43

ปรบ pH ใหได 9.8 แลวปรบปรมาตรดวยน าจนครบ 1,000 ml เกบในภาชนะทบแสงทอณหภม 4 C° 2. การเตรยมสารละลายส าหรบตรวจสอบเชอ Pss (LMG 2715) ดวยเทคนค TAS-ELISA 2.1 Carbonate coating buffer, pH 9.6 NaHCO3 2.93 g Na2CO3 1.59 g NaN3 0.2 g ละลายในน ากลน 800 ml ปรบ pH ใหได 9.6 แลวปรบปรมาตรดวยน ากลนจนครบ 1,000 ml เกบทอณหภม 4 C° 2,2 Washing buffer (PBST) NaCl 8.0 g Na2HPO4.12H2O 1.15 g KH2PO4 0.2 g KCl 0.2 g Tween-20 0.5 ml ปรบ pH ใหได 7.4 แลวปรบปรมาตรดวยน ากลนจนครบ 1,000 ml 2.3 ECI buffer (1x) Bovine serum albumin (BSA) 2.0 g Polyvinylpyrrolidone (PVP) 20.0 g NaN3 0.2 g

44

ปรบ pH ใหได 7.4 แลวปรบปรมาตรดวยน ากลนจนครบ 1,000 ml เกบทอณหภม 4 C° 2.4 PNP buffer (1x) Magnesium chloride hexahydrate 0.1 g NaN3 0.2 g Diethanolamine 97.0 ml ปรบ pH ใหได 9.8 ดวย hydrochloric acid แลวปรบปรมาตรดวยน าจนครบ 1,000 ml เกบในภาชนะทบแสงทอณหภม 4 C° 2.5 General Extract Buffer (GEB 1x) Sodium sulfite 1.3 g Polyvinylpyrrolidone (PVP) 20.0 g NaN3 0.2 g Powered egg (chicken) albumin, 2.0 g Grade II Tween-20 0.5 ml ปรบ pH ใหได 7.4 แลวปรบปรมาตรดวยน ากลนจนครบ 1,000 ml เกบทอณหภม 4 C° 3. การเตรยมอาหารเลยงเชอ Nutrient Agar (NA) Beef axtract 3.0 g Peptone 5.0 g Agar 15.0 g ปรบปรมาตรดวยน ากลนจนครบ 1,000 ml

45

4. Peptone buffer KH2PO4 5.3 g Na2HPO4 8.61 g Peptone 1 g ปรบปรมาตรดวยน ากลนจนครบ 1,000 ml