REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE UNIVERSITE KASDI MERBAH-OUARGLA FACULTE DES SCIENCES DE LA NATURE ET DE LA VIE ET SCIENCES DE LA TERRE ET DE L’UNIVERS Département des Sciences de la Nature et de la Vie Mémoire Présenté en vue de l’obtention du Diplôme de MAGISTER Spécialité : Biologie. Option : Microbiologie Appliquée. Par : BOUDERHEM Amel. THEME : Soutenu publiquement le : / /2011 Devant le jury: Président Mr HAMDI AISSA B. Professeur (U.K.M.O) Examinateur Mr HACINI M. Maitre de conférences A (U.K.M.O) Examinateur Mme SIBOUKEUR O. Maitre de conférences A (U.K.M.O) Encadreur Mme OULD EL HADJ-KHELIL A. Maitre de conférences A (U.K.M.O) Invité Mr ARROUSSI A. Chef département Analyses CRD (HMD) UTILISATION DES SOUCHES BACTERIENNES TELLURIQUS AUTOCHTONES DANS LA BIODETECTION ET LA BIOREMEDIATION DES SOLS POLLUES PAR LES HYDROCARBURES. Année universitaire : 2010 / 2011
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REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE
MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE
UNIVERSITE KASDI MERBAH-OUARGLA
FACULTE DES SCIENCES DE LA NATURE ET DE LA VIE ET
SCIENCES DE LA TERRE ET DE L’UNIVERS
Département des Sciences de la Nature et de la Vie
Mémoire
Présenté en vue de l’obtention du Diplôme de
MAGISTER Spécialité : Biologie. Option : Microbiologie Appliquée.
Par : BOUDERHEM Amel.
THEME :
Soutenu publiquement le : / /2011
Devant le jury:
Président Mr HAMDI AISSA B. Professeur (U.K.M.O)
Examinateur Mr HACINI M. Maitre de conférences A (U.K.M.O)
Examinateur Mme SIBOUKEUR O. Maitre de conférences A (U.K.M.O)
Encadreur Mme OULD EL HADJ-KHELIL A. Mait re de conférences A (U.K.M.O)
Invité Mr ARROUSSI A. Chef département Analyses CRD (HMD)
UTILISATION DES SOUCHES BACTERIENNES TELLURIQUS AUTOCHTONES DANS LA
BIODETECTION ET LA BIOREMEDIATION DES SOLS POLLUES PAR LES HYDROCARBURES.
Année universitaire : 2010 / 2011
REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE
MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE
UNIVERSITE KASDI MERBAH-OUARGLA
FACULTE DES SCIENCES DE LA NATURE ET DE LA VIE ET
SCIENCES DE LA TERRE ET DE L’UNIVERS
Département des Sciences de la Nature et de la Vie
Mémoire
Présenté en vue de l’obtention du Diplôme de
MAGISTER Spécialité : Biologie. Option : Microbiologie Appliquée.
Par : BOUDERHEM Amel.
THEME :
Soutenu publiquement le : / /2011
Devant le jury:
Président Mr HAMDI AISSA B. Professeur (U.K.M.O)
Examinateur Mr HACINI M. Maitre de conférences A (U.K.M.O)
Examinateur Mme SIBOUKEUR O. Maitre de conférences A (U.K.M.O)
Encadreur Mme OULD EL HADJ-KHELIL A. Mait re de conférences A (U.K.M.O)
Invité Mr ARROUSSI A. Chef département Analyses CRD (HMD)
UTILISATION DES SOUCHES BACTERIENNES TELLURIQUS AUTOCHTONES DANS LA
BIODETECTION ET LA BIOREMEDIATION DES SOLS POLLUES PAR LES HYDROCARBURES.
Année universitaire : 2010 / 2011
TABLEAU DES MATIERES
Remerciements Résumé Abstarat Liste des figures Liste des photos Liste des tableaux
Introduction
PARIE 1: Synthèse bibliographique
I. Hydrocarbures pétroliers………………………………………………………………….. I.1. Définition………………………………………………………………………………... I.2. Classification……………………………………………………………………………. I.2.1. Hydrocarbures saturés…………………………………………………………………
a. Alcanes linéaires……………………………………………………………………. b. Alcanes ramifiés…………………………………………………………………….. c. Cycloalcanes………………………………………………………………………...
I.2.2. Hydrocarbures aromatiques…………………………………………………………... I.2.3. Composés polaires……………………………………………………………………. I.2. 4.Asphaltènes…………………………………………………………………………… I.3. Devenir des hydrocarbures dans l'environnement…………………………………….. I.3.1.Evaporation……………………………………………………………………………. I.3.2.Solubilisation………………………………………………………………………….. I.3.3.Emulsification…………………………………………………………………………. I.3.4.Sédimentation…………………………………………………………………………. I.3.5.Photo-oxydation……………………………………………………………………….. I.3.6.Biodégradation………………………………………………………………………… I.4. Pollution par les hydrocarbures et leurs impacts………………………………………. I.5. Biodétection de la pollution du sol par les hydrocarbures……………………………… I.6.Traitement des sols pollués par les hydrocarbures…………………………………….. I.6.1. Traitements physiques………………………………………………………………... I.6.2. Traitements thermiques……………………………………………………………….. I.6.3. Traitements chimiques………………………………………………………………... I.6.4.Traitements biologiques……………………………………………………………….. a. Traitement in situ…………………………………………………………………………… b. Traitement en réacteur……………………………………………………………… c. Biotertre et Landfarming…………………………………………………………… d. Phytoremédiation…………………………………………………………………... II. Biodégradation des hydrocarbures………………………………………………………. II.1. Définition de la biodégradabilité………………………………………………………. II.2. Types de biodégradation……………………………………………………………….. II.2.1. Biodégradation aérobie………………………………………………………………. II.2.2. Biodégradation anaérobie……………………………………………………………. II.3. Microorganismes dépolluants le sol…………………………………………………… II.4. Facteurs influençant la biodégradation des hydrocarbures…………………………….
II.4.1.Structure et nature du sol……………………………………………………………... II.4.2.Composition chimique des hydrocarbures…………………………………………… II.4.3.Humidité……………………………………………………………………………… II.4.4.Température…………………………………………………………………………... II.4.5.Salinité………………………………………………………………………………... II.4.6. Potentiel d’hydrogène (pH)………………………………………………………….. II.4.7.Taux d'oxygène……………………………………………………………………….. II.4.8. Contenu en nutriments……………………………………………………………….. II.5. Mécanisme d’accession aux hydrocarbures………………………………………….... II.5.1. Utilisation de la phase dissoute……………………………………………………… II.5.2. Transfert interfacial direct (TID)…………………………………………………….. II.5.3. Transfert interfacial assisté par les biosurfactants (TIA)……………………………. II.5.4. Transfert micellaire (Pseudosolubilisation)…………………………………………. II.6. Biodégradation par type d'hydrocarbures……………………………………………… II.6.1. Biodégradation des hydrocarbures saturés…………………………………………... II.6.2. Biodégradation des hydrocarbures aromatiques……………………………………...
PARTIE 2: Matériel et méthodes
I. Biodétection……………………………………………………………………................. I.1. Matériel biologique……………………………………………………………………... I.2. Méthodes………………………………………………………………………………... I.2.1. Echantillonnage………………………………………………………………………. I.2.2. Caractérisation des sols……………………………………………………………….. a. Analyse physiques…………………………………………………………………. a1. Analyse granulométrique……………………………………………………….. a2. Hygrométrie …………………………………………………………………….. b. Analyses physico-chimiques ……………………………………………………… b1. Potentiel d’hydrogène (pH)……………………………………………………. b2. Conductivité électrique (CE)…………………………………………………... c. Analyses chimiques ……………………………………………………………….. c1. Dosage du phosphore ………………………………………………………….. c2. Dosage des nitrates …………………………………………………………….. c3. Dosage des nitrites …………………………………………………………….. c4. Dosage des hydrocarbures totaux ……………………………………………... d. Evaluation du taux de biodégradabilité des hydrocarbures………………………... d1. Détermination de la demande chimique en oxygène (DCO)…………………... d2. Détermination de la demande biologique en oxygène (DBO5)………………... e. Analyses microbiologiques ………………………………………………………... e1. Dénombrement de la microflore bactérienne…………………………………… e2. Isolement des bactéries susceptibles de dégrader les hydrocarbures……………
e3. Purification et conservation des bactéries……………………………………… α. Purification……………………………………………………………………. β. Conservation des souches purifiées…………………………………………...
β1. Études des enzymes respiratoires…………………………………………. β2. Métabolisme des glucides…………………………………………………. β3. Étude du métabolisme protéique…………………………………………… γ. Sélection des bactéries par utilisation de milieux de culture spécifiques……..
γ1.Croissance sur Cétrimid agar………………………………………………. γ2.Croissance sur milieu King (King A et King B)…………………………...
a. Sélection d'isolats………………………………………………………………… b. Préparation de l'inoculum………………………………………………………….
PARTIE 3 : Résultats et discussions
I. Caractéristiques des sols………………………………………………………………….. I.1. Analyses physiques……………………………………………………………………... I.2. Analyses physico-chimiques…………………………………………………………… I.3. Analyses chimiques…………………………………………………………………….. I.4. Evaluation de la biodégradabilité des hydrocarbures…………………………………... I.5. Etude microbiologique………………………………………………………………….. I.5.1. Dénombrement de la microflore bactérienne…………………………………………. I.5.2. Isolement de souches bactériennes susceptibles de dégrader les hydrocarbures……... a. Etude macroscopique………………………………………………………………. b. Etude microscopique……………………………………………………………….
c. Tests biochimique…………………………………………………………………... d. Préidentification des souches bactériennes isolées………………………………… I.5.3.Répartition de souches bactériennes préidentifiées dans les sols étudiés……………. I.5.4. Etude statistique………………………………………………………………………. II. Bioremédiation…………………………………………………………………………... II.1. Cinétique de croissance des souches isolées…………………………………………... II.2. Evolution des concentrations en biomasses bactériennes…………………………….. II.3. Evolution des hydrocarbures résiduels………………………………………………… II.4. Rendements d'élimination des hydrocarbures…………………………………………. II.5. Evolution du pH……………………………………………………………………….. Conclusion et perspectives Références bibliografiques Annexes
L’impact de la pollution des sols par les hydrocarbures sur la distribution des bactéries
telluriques (Biodétection) et l’évaluation de leur pouvoir dégradant de ces polluants (Bioremédiation)
ont fait l’objet de notre travail.
Le diagnostic bactériologique des sols étudiés révèle la présence de 9 souches bactériennes
correspondant à une biomasse de 6,4.108 UFC/g de sol dans l’échantillon le moins pollué. Cette
biodiversité est inversement proportionnelle à l’augmentation de la teneur en hydrocarbures. En effet,
dans l’échantillon le plus contaminé, une seule souche à été isolée avec une biomasse de 1,1 .104UFC/kg
de sol. Cette souche est d’ailleurs présente dans tous les échantillons de sols étudiés.
L’application du bioprocédé « Landferming » dans la bioremédiation de l’échantillon E1
contaminé par 123,7g d’hydrocarbures/kg de sol, en présence de la souche autochtone Bacillus
megaterium a aboutit à une forte dégradation des polluants expliquée, par une diminution de leur
concentration. Cette souche choisie pour son temps de génération court est aussi performante vu les
meilleurs rendements d’élimination d’hydrocarbures évalués à 98.43% en 28 jours d’expérimentation
dans l’échantillon bioaugmenté et biostimulé par le biosurfactant, 98, 22% en 35 jours dans
l’échantillon bioaugmenté et biostimulé par l'urée, et 86,1% en 35 jours dans l’échantillon bioaugmenté
et biostimulé par la solution nutritive.
L’utilisation des souches bactériennes telluriques autochtones dans des conditions favorables
(aération, humidité ….) pourrait contribuer à la bioremédiation des sols contaminés par les
hydrocarbures dans les zones d’exploitations pétrolières.
Mots clés: Sol, Hydrocarbures, Pollution, Biodétection, Bioremédiation, Microccocus luteus,
Bacillus megateruim, Biosurfactant, Urée.
Utilisation des souches bactériennes telluriques autochtones dans la biodétection
et la bioremédiation des sols pollués par les hydrocarbures
ملخص
وتقدير ) ا+كتشاف الحيوي(على توزع البكتيريا الترابية بالنفطاثر تلوث التربة عنيتمحور حول البحث ھذا موضوع عملنا).معالجة بيولوجية(استطاعتھا ا+ستھ1كية لھذه الملوث
س1+ت 9 كشف التشخيص البيولوجي للتربة عن وجود /وم م 108 6.4بكتيرية ممثلة بكتلة حيوية في العينة ) غ من التر بةفي التربة الملوثة حيث تم عزل س1لة واحدة فقط في العينة النفطاHقل تلوث وھذا التنوع البيولوجي يتناسب عكسيا مع زيادة نسبة
(ممثلة بكتلة حيوية قدرھا Micrococcus luteus اHكثر تلوث 1.1.104/ .المدروسةوھي متواجدة في جميع عينات التربة ) غ/ م وم
(تطبيق الطريقة البيولوجية Landfarmimg من التربة لعينةفي المعالجة البيولوجية ) E1 الملوثة بـ النفطمن كغ /غ123.4باستعمال الس1لة الترابية اHصلية أدى إلى استھ1ك كبير للملوثات توضح بانخفاض تركيزھم اختيرت ھذه الس1لة الترابية اHصلية
Bacillus megaterium ثرھا باWضافة أدى إلى استھ1ك كبير للملوثات توضح بانخفاض تركيزھم اختبرت ھذه الس1لة لقصر مدة تكا 98.43 النفط إلى كفاءتھا العالية نظرا لنسب إزالة جزيئاتيوم من التجريب في العينة المزودة بيولوجيا و المحرضة بـ 28خ1ل %
98.22 السطح , يوم في العينة المزودة بيولوجيا 35خ1ل % 86.1يوم في العينة المزودة بيولوجيا و المحرضة باليوري ، 35خ1ل % .حرضة بمحلول مغذيو الم
يساھم في المعالجة البيولوجية ...) الرطوبة –التھوية (استعمال الس1+ت البكتيرية اHرضية اHصلية في ظل ظروف مواتية .في مناطق التنقيب عن النفط بالنفطللتربة الملوثة
معالجة بيولوجية - الحيوي ا+كتشاف -تلوث –محروقات –تربة : الكلمات الدالة Micrococcus luteus– Bacillus megaterium . اليوري -جزيئات السطح
استعمال س'!ت بكتيرية ترابية اصلية في ا!كتشاف الحيوي و المعالجة البيولوجية للتربة الملوثة بالنفط
Abstract
The impact of soil pollution by oil on the distribution of soil bacteria (Biodetection) and
evaluation of their power degrading these pollutants (bioremediation) have been the subject of our work.
Bacteriological diagnosis of soils studied revealed the presence of 9 bacterial strains
corresponding to a biomass 6, 4. 108 CFU / g of soil in the least polluted soil sample. This biodiversity is
inversely proportional to the increase in oil content. Indeed, in the most contaminated sample, only one
strain was isolated Micrococcus luteus with a biomass of 1.1 .104 CFU / kg of soil. This strain is also
present in all soil samples studied.
The application of bioprocess "Landfarming" in the bio remediation of sample E1 contaminated
by 123.4 g oil / kg of soil in the presence of native strain Bacillus megaterium has led to severe
degradation of pollutants explained by a decrease in their concentration. This strain chosen for its short
generation time is so powerful best removal of oil valuated at 98,43% in 28 days of experimentation in
the bioaugumented and biostimulated sample by biosurfactant, 98,22 % in 35 days in the bioaugumented
and biostimulated sample by urea and 86,1 % in 35 days in the bioaugumented and biostimulated
sample by nutrient solution.
The use of terrestrial indigenous bacterial strains under favorable conditions (ventilation,
humidity ....) Could contribute to the bioremediation of contaminated soils by hydrocarbons in the areas
G4,Ralstonia pickettii PKO1), mais également Gram positives du groupe des
Corynebacterium, Mycobacteruim et Nocardia (CMN) (HANSON et al., 1999 ; BALLERINI
et VANDECASTEELE, 1999 ; PARALES et al., 2000 ; CHABLAIN et al., 2001 ;
SUENAGA et al., 2001).
PARTIE : 1 Synthèse bibliographique
19
Le mode d’attaque dépend des groupements alkyles substituant mais pour un même composé va dépendre également de la souche bactérienne. Cinq voies distinctes ont été
PARTIE : 1 Synthèse bibliographique
11
Figure 3 : Schéma général des voies métaboliques de dégradation des n-alcanes et des
isoalcanes (BALLERINI et VANDECASTEELE, 1999).
PARTIE : 1 Synthèse bibliographique
11
Figure 4:Différents produits issus de l’oxydation du toluène
(PARALES et al., 2000).
Figure 5 : La voie de l’oxydation du toluène
(SAKAMOTO et al., 2001).
Toluène
PARTIE : 1 Synthèse bibliographique
décrites pour la dégradation aérobie du toluène. Toutes les voies démarrent avec
l’oxydation du toluène, mais cinq produits différents d’oxydation sont formés (figure 4). Le
mode d’attaque très utilisé par une dioxygénase sur le noyau aromatique est la voie de
dihydrodiol, avec la molécule du toluène (figure 5).
Quelques HAP sont classés comme polluants prioritaires par la plupart des agences de
protection de l’environnement et en particulier, celle des Etats-Unis et ceci en raison de leur
persistance dans l’environnement (KANALY et al., 2000 ; KANALY ET HARAYAMA,
2000 ; WANG et al., 2000 ; KANALY et al., 2002 ; ERIKSSON et al., 2003).
Bien que les HAP puissent subir l'oxydation chimique, la photodécomposition et la
volatilisation, la dégradation microbienne reste le processus principal affectant la persistance
des HAP dans l’environnement (POTIN et al., 2004b).
Il a été observé que la dégradation des HAP dans le sol est dominée par des souches
bactériennes appartenant à un nombre très limité de groupes taxonomiques, tels que
Sphingomonas, Burkholderia, Pseudomonas et Mycobactérie ; y compris d’autres genres
comme Acidovorax, Bordetella, Bacillus et Variovorax (JOHNSEN et al., 2005 ; YU et al.,
2005). Parmi ces groupes taxonomiques, des isolats appartenant aux Sphingomonadaceae
représentent la proportion la plus élevée. Ces isolats ont été classés dans différents genres :
Sphingomonas, Sphingobium, Novosphingobium et Sphingopyxis. Les membres de ces genres
apparaissent êtres spécialisés dans la dégradation des produits chimiques aromatiques, et dont
certains sont même considérés comme des oligotrophes strictes (JOHNSEN et al., 2005).
En revanche, la majorité des travaux ont porté sur l’étude des espèces de
mycobactéries. La raison principale est leur capacités à dégrader les HAP ; soit par
cométabolisme, ou alors par minéralisation. Dans ce cadre, la plupart des voies biochimiques
des mycobactéries et de leurs métabolites ont été identifiés (KANALY et HARAYAMA,
2000; CHEUNG et KINKLE, 2001; KHAN et al., 2001; MOODY et al., 2001 ; REHMANN
et al., 2001; VILA et al., 2001; BOGAN et SULLIVAN, 2003).
Les voies de dégradation des HAP ont été caractérisées sur la base des structures des produits intermédiaires de dégradation identifiés. Le schéma général est comparable à celui des hydrocarbures monoaromatiques. Après la double hydroxylation du premier noyau, une étape d’oxygénation supplémentaire est nécessaire pour chaque ouverture de cycle (MENN et al., 1993 ; SANSEVERINO et al., 1993 ; WANG et al., 2000 ; MOODY et al., 2001 ;FERRERO et al., 2002).
Partie : 2
Matériel et méthodes
Figure 6: Localisation des sites d’étude (google maps 2011).
بركاويBerkaoui
Partie 2 Matériel et méthodes
22
I. Biodétection
La microbiodétection est réalisée grâce à la microflore bactérienne prélevée de
l’horizon superficiel des sols pollués ou non par les hydrocarbures afin de caractériser les
éventuels impacts toxiques de ce polluant sur la qualité et la quantité de la microflore
bactérienne.
I.1. Matériel biologique
Pour la réalisation de nos expériences, nous avons utilisé des échantillons de sols
prélevés de trois bourbiers pollués par des rejets de forage au niveau des champs de Hassi
Messaoud, Haoud Berkaoui et un échantillon accidentellement pollué au niveau de Bamendil.
D'autres échantillons sont prélevés de deux sols n'ayant pas subit de rejets pétroliers, il s'agit
de Bamendil et l''exploitation agricole de l'université de Ouargla (figure 6).
Afin de déterminer la répartition des bactéries telluriques en fonction du degré de
pollution du sol par les hydrocarbures, des prélèvements d’échantillons de sol sont effectués
dans les différents sites (tableauIV).
Tableau IV: Présentation des différents sites de prélèvements.
Echantillons Origines Localisation ■ Age de la contamination Date de prélèvement
E1 Haoud Elhamra 80km 1an (2010) 23 - 03 – 2011
E2 HBK 35km 1 mois (4/2011) 08 - 04 – 2011
E3 C.I.S 80km 4 ans 02 - 03 – 2011
E4 Bamendil 1 7km 6 ans 14- 04 – 2011
E5 Explio-univer 2km - 03 - 04 - 2011
E6 Bamendil 2 7km - 14 - 04 – 2011
HBK: Haoud Berkaoui. C.I.S: Centre Industriel Sud.
■ Localisation des sites par rapport le centre de ville de Ouargla.
I.2. Méthodes
I.2.1. Echantillonnage
L'échantillonnage est effectué à l’entrée, au centre et à la sortie de chaque site. Les
prélèvements ont été réalisés à l'aide d'une spatule stérile à une profondeur de 20 cm. Pour
chaque échantillon, 1Kg de sol prélevé est mis dans des flacons en verre stériles.
Les échantillons de sols obtenus sont ensuite tamisés à 5 mm puis à 2 mm pour
éliminer les éléments grossiers et les débris organiques. En attendant les analyses, les
Partie 2 Matériel et méthodes
23
échantillons de sols sont conservés au frais (environ 4°C) car un stress hydrique peut
perturber les mesures biologiques (CHAUSSOD et al, 1992 ; FARDOUX et al, 2000).
I.2.2. Caractérisation des sols
a. Analyse physiques
a1. Analyse granulométrique
La texture d’un sol est révélée par son analyse granulométrique dont le principe est
basé sur la vitesse de sédimentation des particules séparées et dispersées par destruction de la
matière organique par une attaque à l’eau oxygénée. Le fractionnement de ces particules se
fait par l’intermédiaire de la pipette de Robinson qui permet la détermination des fractions
argileuses et limoneuses fines. Ensuite, les sables fins et grossiers sont mesurés par tamisage
(BAIZE, 2000).
a2. Teneur en eau ou humidité
Nous avons procédé à la détermination de la teneur pondérale en eau du sol par la
méthode gravimétrique selon la norme NF ISO 1146. Elle s'exprime en % c'est-à-dire en
gramme d'eau pour 100 g de sol déshydraté à 105°C. Le taux d’humidité s’exprime en %
selon la formule suivante : H% = P 1 - P 0 / P 0
- P 0 : poids de la prise d'essai du sol (g).
- P 1 : poids de la prise d'essai de sol après séchage à 105°C (g).
b. Analyses physico-chimiques
b1. Potentiel d’hydrogène (pH)
Le pH est déterminé selon la norme AFNOR X 31-103 (AFNOR, 1994) par la mesure
du pH d'une suspension de sol dans l'eau à 2/5 (rapport masse/volume) après 1 heure
d'agitation puis décantation à l'aide d’un pH mètre de type Inolab MLM .
b2. Conductivité électrique (CE)
La conductivité électrique est mesurée sur l’extrait de sol dilué au 1/5. Elle doit être
exprimée en dicisiemens par mètre (ds/m) (BAIZE, 2000). Elle a été déterminée par un
conductimètre de type Inolab cond 720.
c. Analyses chimiques
c1. Dosage du phosphore
Partie 2 Matériel et méthodes
24
Le phosphore en solution se trouve sous forme de phosphates. La seule forme de
phosphate pouvant être détectée est l'orthophosphate. Toutes les autres formes doivent subir
un prétraitement afin d’être transformées en orthophosphate avant d'être analysées.
Le dosage de ce dernier nécessite une mise en œuvre d'une réaction colorée spécifique
de l'élément recherché selon le schéma suivant (Norme NFT 90-032):
Molybdate Acide ascorbique
Orthophosphate Complexe phosphomolybdate Complexe
Coloré (bleu de molybdène)
Le dosage s'effectue à l'aide d'un spectrophotomètre (DR2000) à une longueur d'onde
de 890 nm. L’intensité de la coloration sera proportionnelle à la concentration en phosphore.
c2. Dosage des nitrates
Le dosage des nitrates nécessite une mise en œuvre préliminaire d'une réaction colorée
spécifique de l'élément recherché selon la réaction suivante (Normes NFX 31 160):
Ce dosage par spectrophotomètre est effectué à une longueur d'onde de 400nm pour
les faibles concentrations et de 500nm pour les fortes concentrations.
Le dosage s'effectue à l'aide d'un spectrophotomètre (DR2000) à une longueur d'onde
de 500 nm. L’intensité de la coloration est proportionnelle à la concentration en nitrate.
c3. Dosage des nitrites
Le dosage des nitrites nécessite une mise en œuvre préliminaire d'une réaction colorée
spécifique de l'élément recherché. Dans ce cas, la réaction dépend de la teneur en nitrites.
Pour les faibles concentrations, la réaction est la suivante (Norme NFT 90-013):
Pour les fortes concentrations, la réaction est:
Nitrite Sel de déazomium
Acide chromotropique Acide sulfanilique
Complexe rose
Nitrates
Cadmium métallique
Sel de déazonium Nitrites Complexe colorée
Acide sonalique Acide genticique
"Réduction"
Partie 2 Matériel et méthodes
25
L'intensité de la coloration est proportionnelle à la concentration en nitrites.
Le dosage s'effectue à l'aide d'un spectrophotomètre (DR2000) à une longueur d'onde
de 580 nm. L’intensité de la coloration est proportionnelle à la concentration en nitrite.
c4. Dosage des hydrocarbures totaux (HCT)
Les teneurs des sols en hydrocarbures sont mesurées par Retord qui est un four
conçu pour déterminer la saturation en huile et en eau des échantillons solides (roches, déblais
de forage) par un procédé thermique dans lequel l'huile et l'eau contenue dans un échantillon
frais de matériau broyé sont vaporisés, condensés et recueillis dans un tube en verre gradué.
Les échantillons sont progressivement chauffés pour éliminer l'eau et ensuite l’huile à une
température allant jusqu’à jusqu'à 650°C (1200°F)(ANONYME, 2001) (figure 07).
La détermination de la concentration des HCT est effectuée selon la formule suivante :
d. Evaluation du taux de biodégradabilité des hydrocarbures
Evaluation du taux de biodégradabilité des hydrocarbures est un test normalisé
(Norme ISO 9 408, 1991) qui consiste à évaluer ou estimer la biodégradation ultime des
composés organiques par voie biologique en aérobiose.
Selon la norme ISO 9 408, le taux de biodégradabilité est calculé selon la formule
suivante:
B (%) =DBO / DCO
B%: taux de biodégradabilité.
Concentration des hydrocarbures (g /kg de sol) = Vhuil (ml) x 0,8 x 10
Nitrite Sulfate ferreux
Complexe brun Oxyde nitreux
L'ion ferreux
Figure 7 : Principe de détermination des teneurs en HCdans un four
Principe de détermination des teneurs en HCT dans le sol dans un four(ANONYME, 2001)
dans le sol par distillation
Partie 2 Matériel et méthodes
26
d1. Détermination de la demande chimique en oxygène (DCO)
Le test de la DCO selon la norme NFT 90-101 consiste en la mesure de l'oxygène
équivalent à la quantité des matières organiques oxydables par le dichromate de potassium
(K2Cr2O7). Dans une solution d'acide sulfurique à 50%, un composé à base d'argent est ajouté
comme catalyseur et un autre mercurique est ajouté pour réduire les interférences dues à
l'oxydation des ions chlorures par le dichromate, d’après la réaction:
Selon ECKFORD et al. (2002), la pollution des sols par les hydrocarbures a pour
conséquence un déficit en azote et en phosphore, ce qui peut limiter la biodégradation des
hydrocarbures. Pour tout traitement biologique, un enrichissement du sol avec ces éléments
sera donc nécessaire. L’azote et le phosphore sont des facteurs limitant la biodégradation des
hydrocarbures dans les sols (MOHN et STEWART, 2000).
Par ailleurs, il est connu que la flore microbienne a besoin d’éléments minéraux pour
sa croissance, en particulier d’azote et de phosphore, dont les proportions optimales,
généralement admises, sont de 10g d’azote et 1g de phosphore pour 100g de carbone
(BALLERINI, 1999). Ces éléments rentrent dans l’édification des constituants cellulaires lors
de la multiplication des microorganismes (synthèse d’ADN, protéines…etc.).
SCOW et al. (2003) rapportent que dans les environnements aérobies les éléments
limitant les plus susceptibles sont l’azote et le phosphore. Ainsi, dans de telles conditions, il
est probable quel a biodégradation soit limitée
Partie 3 : Résultats et discusion
Figure16: Concentrations en hydrocarbures dans les six échantillons de sols
.
Figure 17: Valeurs de taux de biodégradabilité (B%) dans les échantillons pollués.
0
50
100
150
200
250
300
E1 E2 E3 E4 E5 E6
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2
4
6
8
10
12
E1 E2 E3 E4
B(%
)
Echantillons
Partie 3 : Résultats et discusion
42
� Teneurs des hydrocarbures dans les sols étudiés
Les résultats de dosage des hydrocarbures totaux obtenus sont représentés par la figure
16.
D'après la figure 16, nous constatons que l’échantillon E2 (HBK) est le plus chargé en
hydrocarbures totaux (247.12g/kg de sol) comparé aux échantillons E1 (HH), E3 (C.I.S) et
E4 (B1) qui ont des concentrations en hydrocarbures de 123.43g/kg de sol, 156.02g/kg de sol
et 134.4g/kg de sol respectivement. Les échantillons E5 et E6 n'ont révélé que des traces
d'hydrocarbures totaux.
Les teneurs en hydrocarbures totaux des échantillons (E1, E2, E3 et E4) sont
largement supérieures à la valeur fixée par la norme hollandaise (0.1 g/kg de sol) (GABET,
2004). Ces résultats confirment bien la pollution de ces sols par les hydrocarbures, sachant
que la variation du taux de pollution des échantillons par les hydrocarbures peut être attribuée
à l'historique de contamination.
Par railleur, les faibles teneures en hydrocarbures inferieures à 0,1g/kg de sol indique
que les échantillons E5 et E6 ne sont pas pollués.
I.4. Evaluation de la biodégradabilité des hydrocarbures
La mesure de taux de biodégradabilité des hydrocarbures dans les échantillons pollués
a donné les résultats regroupés dans la figure 17.
Nous pouvons constater que les taux de biodégradabilité (B%) des hydrocarbures
dans les échantillons pollués varient de 2.26 à 9.6% (figure 17).
La détermination de la biodégradabilité aérobie des hydrocarbures dans les conditions
naturelles nous a permis de constater que les hydrocarbures sont faiblement biodégradables
dans tous les échantillons. En effet, dans le même type de sol, OUDOT (2000) rapporte un
taux de biodégradabilité de 65% pour le pétrole d’arabain light et 11% pour le fuel.
La complexité des rejets de production pétrolière (bourbier), de pétrole brut (E4), et
les conditions du milieu expliqueraient les difficultés rencontrées par les microorganismes
pour dégrader le polluant.
I.5. Etude microbiologique
I.5.1. Dénombrement de la microflore bactérienne
Les résultats du dénombrement sur gélose nutritive obtenus pour les différents échantillons des sols étudiés testés, sont représentés par la figure 18.
Partie 3 :
Figure18 : Densité de la microflore bactérienne des six échantillons de sols.
Figure 19: Concentrations de
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
E1
Co
nce
ntr
ati
on
ba
cté
rie
nn
e(l
og
UF
C /
g d
e s
ol)
0
50
100
150
200
250
300
E1
Co
nce
ntr
ati
on
de
s H
CT
(g/k
g d
e s
ol)
Densité de la microflore bactérienne des six échantillons de sols.
Concentrations de la biomasse bactérienne et des hydrocarbures dans les
échantillons du sol étudiés.
E2 E3 E4 E5
Echantillons
E2 E3 E4 E5 E6
Echantillons
HCT
Biomasse bacterienne
Résultats et discusion
Densité de la microflore bactérienne des six échantillons de sols.
bactérienne et des hydrocarbures dans les
E6
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Bio
ma
sse
(lo
g U
FC/g
)
Partie 3 : Résultats et discusion
43
Il en ressort de cette figure qu’il y a présence d’une microflore dans les six
échantillons, mais la comparaison des concentrations en microflore bactérienne totale des
sols nous permet d’avancer que l'échantillon E2 étant le plus récemment pollué présente la
plus faible microflore avec une valeur de 1,1 .104UFC/g de sol par rapport aux échantillons
E1, E3 et E4 présentant des concentrations bactériennes de 6,41.108 UFC/g de sol, de 2,29 107
UFC/g de sol et de 3,1 .108 UFC/g de sol respectivement. Les échantillons E5 et E6 (sols non
pollués) ont des valeurs de 3,09.106UFC/g de sol et 3, 38.107 UFC/g de sol respectivement
(figure18).
On registre une variation nette de la densité bactérienne dans les deux échantillons
E4 (HCT: 137.4g /kg de sol) et E6 (non pollué) sachant que ces derniers sont prélevés de
même zone (Bamendil) (figure19)
Selon DOMMERGUES et MANGENOT (1970), les densités bactériennes dans les
sols soumis à des conditions écologiques dures (régions arides et régions polaires), sont
faibles mais elles ne tombent rarement en dessous de 104 - 105 germes /g de sol sec dans les
horizons superficiels, ce qui est confirmé par nos résultats.
Les bactéries capables de dégrader les hydrocarbures sont observées dans le sol en
quantité non négligeables, c'est –à- dire supérieures à 104UFC/g de sol (TUHACKOVA et
al.2001).
La différence de biomasses bactérienne de deux échantillons E4 et E6 peut être
expliquée par la présence de source de carbone supplémentaire dans l’échantillon E4.
Le rejet des produits pétroliers dans les milieux marins ou terrestres entraîne une
prolifération des microorganismes aptes à se développer sur les hydrocarbures et leurs
produits de dégradation. Leur nombre est beaucoup plus important dans les zones polluées de
façon chronique et s’accroît après un apport d’hydrocarbures dans les sites dépourvus de
contamination (ATLAS, 1993).
La différence de la biomasse bactérienne entre les deux échantillons E5 et E6 (non
pollués) est due à l'effet de salinité de l'échantillon E5 qui sembles avoir affecter la
prolifération bactérienne.
Partie 3 : Résultats et discusion
Tableau 05 : Aspect macroscopique des colonies isolées
Consistance Surface Opacité Contour Elévation Forme Chromogénèse Diamètre (mm)