P10 高速液体クロマトグラフィー P181高速液体クロマトグラフィー High Performance Liquid Chromatography (HPLC)...

高速液体クロマトグラフィーHigh Performance Liquid Chromatography (HPLC)

高速液体クロマトグラフィー（HPLC）は、適当な固定相を用いて均一に充填したカラムに試料混合物を注入し、移動相として液体を用い、試料中の各成分の固定相に対する保持力の差を利用して分離・分析する方法である。

日本薬局方では、「液体クロマトグラフ法」として、確認試験、純度試験および定量法が収載されている。

実習書 P10教科書 P181

固定相

A

B

C

移動相

カフェイン、テオフィリン、テオブロミンの混合試料のクロマトグラム

C

BA

Inject

時間

それぞれのピークの保持時間は、同一条件において物質に固有の値となる。標品との保持時間の比較により、物質を同定できる。

定性分析

質量分布比 k’ =固定相に存在する量

移動相に存在する量

保持時間 tR = (1 + k’) tot0：カラム通過時間

HPLC の利用分離分析

A+B+C

A

B

C

A

B

C

ピークが充分に分離していれば、混合物から各成分を単離することができる。（ピークの完全分離：分離度 1.5 以上）

各ピークのピーク面積またはピーク高さは試料量に比例する。標品を用いて検量線を作成することにより定量を行うことができる。

→内部標準法，絶対検量線法

定量分析

分離分析

クロマトグラフィー

移動相が

気体

液体

ガスクロマトグラフィー

液体クロマトグラフィー

薄層クロマトグラフィー（TLC）

ペーパークロマトグラフィー

カラムクロマトグラフィー

高速液体クロマトグラフィー（HPLC）

順相クロマトグラフィー

固定相：シリカゲル移動相：クロロホルム-エタノール （9 : 1）

（CHCl3-EtOH）

アルミ板

固定相

（シリカゲル）

移動相

sample

順相クロマトグラフィー

固定相：シリカゲル移動相：クロロホルム-エタノール （9 : 1）

固定相のシリカゲルは水酸基（シラノール基）で覆われている。極性の高い物質ほど固定相との親和性が大きくなり、R f 値は小さくなる。

・ ・ ・A B C

極性

A < B < C

Si

O

Si

OH

移動相固定相

OH OH

OH

OH

HO

HO

C

OHA

CHCl3-EtOH

O

逆相クロマトグラフィー

固定相：ODS（オクタデシルシリルシリカゲル）移動相：メタノール-水 （3 : 1）

固定相の ODS は炭素数 18 のオクタデシルシリル基が多く存在する。極性の低い物質ほど固定相との親和性が大きくなり、R f 値は小さくなる。

・ ・ ・A B C

極性

A < B < C

Si

Si

移動相固定相

OH

A

MeOH-H2O

O

O Si

H3C

H3C

O Si

H3C

H3C

OH

OH

OH

HO

HO

C

C18

O

移動相送液ポンプ

インジェクター

カラム

記録計

廃液だめ

高速液体クロマトグラフィー (HPLC)

試料注入

検出器

固定相

A

B

C

移動相

（シリカゲル、ODS など）

移動相

送液ポンプ

インジェクター

カラム

検出器

記録計廃液だめ

移動相送液ポンプ

インジェクター

カラム

記録計

廃液だめ

検出器

ろ過カラムにゴミが入ると目詰まりを起こしてしまう。移動相溶媒は使用前に必ず蒸留し、充填剤の粒径よりも目の細かいメンブランフィルターでろ過しておく。

移動相溶媒の調製 (実習書 P10)

脱気移動相溶媒に空気が多量に溶解していると、ポンプに気泡が入り送液しなくなったり、検出器で気泡が発生してベースラインが安定しなくなる。溶媒をろ過後、必ず脱気をしておく。

メンブランフィルター (0.45 mm)

移動相送液ポンプ

インジェクター

カラム

記録計

廃液だめ

検出器

送液ポンプ

数十 kg/cm2 ～ 数百 kg/cm2 の吐出力をもち，移動相溶媒を一定流量で

送ることができる。

プランジャー

日本分光 HPLC PUMP TWINCLE

送液方式

・ピストン型 ：ダンパー使用で脈流を抑制

・シリンダー型

分析法

・アイソクラティック方式 ：単一の溶液で分析

・グラジエント方式 ：数種の溶媒を連続的に組成を変え

て送液する

移動相送液ポンプ

インジェクター

カラム

記録計

廃液だめ

検出器

HPLCカラムの種類

一定温度で分析する場合はカラムオーブンを用いる

カラム充填剤

粒子径数mm の充填剤（固定相）

順相クロマトグラフィー

・シリカゲル -Si-OH

・アミノプロピル基 –(CH2)3-NH2 を結合させたシリカゲル

逆相クロマトグラフィー

・様々な官能基で化学修飾させたシリカゲル

オクチル基 -(CH2)7CH3

オクタデシル基（ODS） -(CH2)17CH3

フェニル基 -Ph

シアノプロピル基 -(CH2)3CN

イオン交換クロマトグラフィー

陽イオン交換基修飾：スルホプロピル基 -(CH2)3SO3H

陰イオン交換基修飾：ジエチルアミノエチル基 -C2H4N(C2H5)2

ゲル（分子ふるい）クロマトグラフィー

多孔質シリカゲルなど

移動相送液ポンプ

インジェクター

カラム

記録計

廃液だめ

検出器

検出器

示差屈折計 (RI) ：移動相との屈折率の差を検出。多くの化合物を検出できる。

紫外吸光光度計 (UV) ：紫外部に吸収を持つ化合物に適用。→吸収域の波長を選択する感度が高い。

蛍光光度計 ：蛍光物質を検出。あるいは蛍光標識試薬で目的物をラベル化して検出。感度が高い。

質量分析計 (LC/MS) ：化合物の分子量がわかる。

UV スペクトル

230 270 nm

吸光度

A B

同じ量の A と B を HPLC で分析

・測定波長 230 nm

・測定波長 270 nm

UV 検出器 －測定波長の選択－

A

A

B

B

A+B

A+BUV 検出器を用いた場合、ピーク面積は

その成分の吸光度の影響を受けるため、

ピーク面積比 ≠ 各成分の含量比 となる。

試料注入

マイクロシリンジで 3 ～ 5 mL とる。

空気が入らないように！

１．注入試料のろ過

フィルターカートリッジ

試料には目に見えない沈殿浮遊物が存在するので、必ずメンブランフィルターでろ過しておく。

２．試料を取る

バルブ：LOAD バルブ：LOAD バルブ：INJECT

バルブを LOAD にしてマイクロシリンジを挿入

（奥まで！！）

マイクロシリンジのプランジャーを押して試料注入

バルブを INJECT の方向に回し、同時に検出器の MARK ボタンを押す

３．試料を注入する

LOAD の状態 INJECT の状態

インジェクター：レオダイン式六方バルブ

LOAD INJECT

ポンプから

カラムへ

排出サンプルループ

ポンプから

カラムへ

排出サンプルループ

Sample

移動相

三種混合標品（カフェイン + テオフィリン + テオブロミン）

N

NN

N

O CH3

H3C

O

CH3

N

NN

HN

O

H3C

O

CH3

HN

NN

N

O

O

CH3

CH3

caffeine theophylline theobromine

カフェイン標品テオフィリン標品テオブロミン標品 それぞれ HPLC 分析

HPLC 分析

茶葉から単離したアルカロイドの分析→標品との保持時間の比較、標品との重ね打ち

レポートに書くこと (実習書 P8)

・測定機種

日本分光 HPLC ポンプ PU-980

日本分光 UV 検出器 UV-970

・条件

カラム名およびサイズ

移動相溶媒

流速

測定波長

感度

チャート速度

・測定試料名、濃度

・注入量

・ピークの保持時間

・理論段数、シンメトリー係数

・分離度、分離係数

tR

t0

tRt0

：保持時間：移動相のカラム通過時間