UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DE PERNAMBUCO DEPARTAMENTO DE PESCA E AQUICULTURA PROGRAMA DE PÓS -GRADUAÇÃO EM RECURSOS PESQUEIROS E AQUICULTURA Beatriz Regina Brito de Oliveira Beatriz Regina Brito de Oliveira Orientadora: Prof a Dr a Emiko Shinozaki Mendes Recife/PE Agosto, 2008 VALIDAÇÃO E APLICAÇÃO DE MÉTODO PARA VALIDAÇÃO E APLICAÇÃO DE MÉTODO PARA DETERMINAÇÃO DE OXITETRACICLINA POR DETERMINAÇÃO DE OXITETRACICLINA POR CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA (CLAE) EM CAMARÃO CULTIVADO (CLAE) EM CAMARÃO CULTIVADO
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UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DE PERNAMBUCODEPARTAMENTO DE PESCA E AQUICULTURA
PROGRAMA DE PÓS -GRADUAÇÃO EM RECURSOS PESQUEIROS E AQUICULTURA
Beatriz Regina Brito de OliveiraBeatriz Regina Brito de Oliveira
Orientadora: Profa Dra Emiko Shinozaki Mendes
Recife/PEAgosto, 2008
VALIDAÇÃO E APLICAÇÃO DE MÉTODO PARA VALIDAÇÃO E APLICAÇÃO DE MÉTODO PARA DETERMINAÇÃO DE OXITETRACICLINA POR DETERMINAÇÃO DE OXITETRACICLINA POR
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA (CLAE) EM CAMARÃO CULTIVADO(CLAE) EM CAMARÃO CULTIVADO
Cultivo de camarão no BrasilCultivo de camarão no Brasil (FAO, 2007) (FAO, 2007)
Oxitetraciclina (OTC)Oxitetraciclina (OTC) Prevenir ou tratarPrevenir ou tratar
Exigências dos mercados: segurança Exigências dos mercados: segurança alimentaralimentar
Europa (RASFF)Europa (RASFF) Análise de resíduosAnálise de resíduos Utilização de metodologias validadas Utilização de metodologias validadas Técnicas conceituadasTécnicas conceituadas
Objetivou-se validar um método para Objetivou-se validar um método para
determinação de OTC em camarão cultivado, determinação de OTC em camarão cultivado,
utilizando a técnica de cromatografia líquida de utilizando a técnica de cromatografia líquida de
alta eficiência (CLAE), e avaliar os níveis de alta eficiência (CLAE), e avaliar os níveis de
resíduos da droga resíduos da droga in vivoin vivo..
IntroduçãoIntrodução
Revisão de literaturaRevisão de literatura
Produção de camarõesProdução de camarões
* (Bahamas, Belize, Costa Rica, Cuba, El Salvador, Guatemala, Honduras, Jamaica, Nicarágua, Panamá, Porto Rico, República Dominicana) Fonte: FAO (2007)
Figura 2. Lesão no hepatopâncreas Figura 2. Lesão no hepatopâncreas Fonte: Lightner (1996) Fonte: Lightner (1996)
Figura 1. Camarão em grampo Figura 1. Camarão em grampo Fonte: Lightner (1996) Fonte: Lightner (1996)
Revisão de literaturaRevisão de literatura
EnfermidadesEnfermidades Vírus e bactériasVírus e bactérias
Revisão de literaturaRevisão de literatura
Antibióticos na aquiculturaAntibióticos na aquicultura
Uso disseminadoUso disseminado Ecotoxicidade em ambientes aquáticosEcotoxicidade em ambientes aquáticos Formas de administraçãoFormas de administração Oxitetraciclina Oxitetraciclina (LALUMERA et al., 2004; DIETZE et al., 2005; (LALUMERA et al., 2004; DIETZE et al., 2005;
LYLE-FRITCH et al., 2006; CHRISTENSEN et al., 2006) LYLE-FRITCH et al., 2006; CHRISTENSEN et al., 2006)
Figura 3. Estrutura molecular da OTC. Fonte: (USP, 2005)
Revisão de literaturaRevisão de literatura
OxitetraciclinaOxitetraciclina
Ação e locais de ligação Ação e locais de ligação (ALIABADI e LEES, (ALIABADI e LEES, 2000; COUTO, 2000; OKA et al., 2000)2000; COUTO, 2000; OKA et al., 2000)
CIM vibrioses: 0,2 a 100 ppm ou mg LCIM vibrioses: 0,2 a 100 ppm ou mg L-1-1 (RUANGPAN e KITAO, 1992; LIGHTNER, 1997)(RUANGPAN e KITAO, 1992; LIGHTNER, 1997)
Concentração OTC na ração:Concentração OTC na ração:1,5 g Kg-1 por 14 dias (MOHNEY et al., 1997)
4,5 a 22,5 g Kg-1 por 14 dias (BRAY et al., 2006)
4,5 g Kg-1 por 14 dias (NOGUEIRA-LIMA et al., 2006)
Sintomas (efeitos tóxicos para humanos)Sintomas (efeitos tóxicos para humanos)
Revisão de literaturaRevisão de literatura
Resistência bacteriana e implicaçõesResistência bacteriana e implicações
Subdosagens e superdosagens Subdosagens e superdosagens (MENDES et (MENDES et al., 2004)al., 2004)
Bactérias resistentes: Bactérias resistentes: Seleção e propagação de genes de resistência Seleção e propagação de genes de resistência
(MORIARTY, 2004);(MORIARTY, 2004);Isolamento de cepas em áreas de aquicultura Isolamento de cepas em áreas de aquicultura (TENDÊNCIA e DE LA PENA, 2001; LE et al., 2005);(TENDÊNCIA e DE LA PENA, 2001; LE et al., 2005);
Efeitos dos fármacos em organismos não-Efeitos dos fármacos em organismos não-alvo alvo (HALLING-SORENSEN et al. 2000)(HALLING-SORENSEN et al. 2000)
Uso restritivo e consequências Uso restritivo e consequências (HOLMSTRÖM, (HOLMSTRÖM, 2003)2003)
Revisão de literaturaRevisão de literatura
Legislação para utilização de fármacos Legislação para utilização de fármacos em espécies animaisem espécies animais
BRASILBRASIL
PCRP PCRP (BRASIL, 2006)(BRASIL, 2006)
PAMVet PAMVet (BRASIL, 2003)(BRASIL, 2003)
LMR para OTCLMR para OTC
FDA (1998): 2000 FDA (1998): 2000 µg kgµg kg-1-1 em alimentos frescos em alimentos frescos
EMEA (1990): 100 µg kgEMEA (1990): 100 µg kg-1-1 de OTC de OTC
CODEX (2006): 200 µg kgCODEX (2006): 200 µg kg-1-1 de OTC em músculo de de OTC em músculo de pescadopescado
Revisão de literaturaRevisão de literatura
Métodos de análise de OTC em matrizes Métodos de análise de OTC em matrizes animaisanimais
Métodos oficiaisMétodos oficiais
CLAE - músculo de bovinos e suínos (AOAC, 1995)CLAE - músculo de bovinos e suínos (AOAC, 1995)
Litopenaeus vannamei Litopenaeus vannamei ((NOGUEIRA-LIMA et al., 2006*NOGUEIRA-LIMA et al., 2006*; ;
FROONGSARNG et al., 2007; GOMEZ-JIMENEZ et al., 2008)FROONGSARNG et al., 2007; GOMEZ-JIMENEZ et al., 2008)
Revisão de literaturaRevisão de literatura
Validação de métodos analíticosValidação de métodos analíticos
Resultados confiáveis e qualidade analíticaResultados confiáveis e qualidade analítica
Exigência dos mercadosExigência dos mercados
ISO, USP, FDA, AOACISO, USP, FDA, AOAC
DocumentaçãoDocumentação
Características de desempenho ou parâmetros de Características de desempenho ou parâmetros de validação (INMETRO, 2007) validação (INMETRO, 2007)
De acordo com o exposto, fatores De acordo com o exposto, fatores econômicos, aspectos sanitários e econômicos, aspectos sanitários e ambientais da utilização de OTC na ambientais da utilização de OTC na carcinicultura ainda são pouco conhecidos carcinicultura ainda são pouco conhecidos e, portanto, faz-se necessária a validação e e, portanto, faz-se necessária a validação e a implantação de metodologias para análise a implantação de metodologias para análise de OTC por CLAE. de OTC por CLAE.
Revisão de literaturaRevisão de literatura
Ferramenta:Ferramenta:
Métodos validadosMétodos validados
Ferramenta:Ferramenta:
Métodos validadosMétodos validadosQualidade processo Qualidade processo
e produtoe produtoQualidade processo Qualidade processo
e produtoe produto
Consolidação do Consolidação do consumoconsumo
Consolidação do Consolidação do consumoconsumo
Saúde pública Saúde pública
Estudos ambientaisEstudos ambientais
Saúde pública Saúde pública
Estudos ambientaisEstudos ambientais
Artigo científico Artigo científico
“ “ DETERMINAÇÃO DE OXITETRACICLINA DETERMINAÇÃO DE OXITETRACICLINA
POR CLAE-DAD EM CAMARÃO MARINHO POR CLAE-DAD EM CAMARÃO MARINHO
Artigo científico – Material e MétodosArtigo científico – Material e Métodos
Material e MétodosMaterial e Métodos
Material Material
Solventes e reagentes grau CLAESolventes e reagentes grau CLAEPadrões de referência da USP (OTC e TC)Padrões de referência da USP (OTC e TC)
Artigo científico – Material e MétodosArtigo científico – Material e Métodos
Material Material
OTC comercial contendo 50% (m/m) de OTC baseOTC comercial contendo 50% (m/m) de OTC base
Ração contendo 35% de proteína brutaRação contendo 35% de proteína bruta
Camarões isentos de OTC e adicionados Camarões isentos de OTC e adicionados in vitroin vitro para os para os testes de validaçãotestes de validação
Artigo científico – Material e MétodosArtigo científico – Material e Métodos
Preparação da amostraPreparação da amostra
Nogueira-Lima et al. (2006) com modificações: amostras Nogueira-Lima et al. (2006) com modificações: amostras de músculo e carapaçade músculo e carapaça
Artigo científico – Material e MétodosArtigo científico – Material e Métodos
Técnica de extração da OTC Técnica de extração da OTC
C18 Phenomenex (250 x 4,0 mm; 5 µm)C18 Phenomenex (250 x 4,0 mm; 5 µm)
Injeção: 50 µLInjeção: 50 µL
Detecção: 365 nmDetecção: 365 nm
FM (75:18:7):FM (75:18:7):(A)(A)OXA 0,01 M OXA 0,01 M (B)(B)ACNACN(C)(C)MeOHMeOH
Fluxo: 1 mL minutoFluxo: 1 mL minuto-1-1
Artigo científico – Material e MétodosArtigo científico – Material e Métodos
Validação da metodologia de análiseValidação da metodologia de análise
Laboratório de Contaminantes Químicos e BiológicosLaboratório de Contaminantes Químicos e Biológicos(LEMI/ITEP)(LEMI/ITEP)
INMETRO (2007) INMETRO (2007)
Tempo de retençãoTempo de retençãoLinearidadeLinearidadeFaixa de trabalhoFaixa de trabalhoRecuperaçãoRecuperaçãoLimites de Detecção e Quantificação do Método (LDM e Limites de Detecção e Quantificação do Método (LDM e
LQM) LQM) Seletividade Seletividade
Artigo científico – Material e MétodosArtigo científico – Material e Métodos
Desenho experimentalDesenho experimental
Estação Experimental Prof. Johei Koike (UFRPE)Estação Experimental Prof. Johei Koike (UFRPE)
Camarões de fazenda aclimatados por 30 dias em tanques de 500 L Camarões de fazenda aclimatados por 30 dias em tanques de 500 L contendo água marinha tratadacontendo água marinha tratada
Artigo científico – Material e MétodosArtigo científico – Material e Métodos
Desenho experimentalDesenho experimental
Densidade: 28 cam/tanqueDensidade: 28 cam/tanque
Tratamentos (duplicata): Tratamentos (duplicata): OTC na ração por 14 diasOTC na ração por 14 dias
Artigo científico – Material e MétodosArtigo científico – Material e Métodos
Desenho experimentalDesenho experimental
Animais coletadosAnimais coletados
Carapaça e músculo: congeladas para análise de OTCCarapaça e músculo: congeladas para análise de OTCHepatopâncreas: análise de Hepatopâncreas: análise de VibrioVibrio spp spp
Artigo científico – Material e MétodosArtigo científico – Material e Métodos
Avaliados todos os tanques diariamenteAvaliados todos os tanques diariamente
OxímetroOxímetro
Artigo científico – Material e MétodosArtigo científico – Material e Métodos
RaçãoRação
Fornecida a aproximadamente 4% biomassa por dia e Fornecida a aproximadamente 4% biomassa por dia e dividida em duas alimentações diáriasdividida em duas alimentações diárias
Concentração teórica de OTC fornecida na ração para Concentração teórica de OTC fornecida na ração para cada tratamento:cada tratamento:
3000 µg g3000 µg g-1-1 120 µg g120 µg g-1-1
5000 µg g5000 µg g-1 -1 200 µg g200 µg g-1-1
7000 µg g7000 µg g-1 -1 280 µg g280 µg g-1-1
Artigo científico – Material e MétodosArtigo científico – Material e Métodos
Análise de Análise de VibrioVibrio spp spp
Silva et al. (1997)Silva et al. (1997)
Remoção dos hepatopâncreasRemoção dos hepatopâncreas
Diluição, inoculação, incubação e leituraDiluição, inoculação, incubação e leitura
Artigo científico – Material e MétodosArtigo científico – Material e Métodos
Análise estatística Análise estatística
Experimento OTC:Teste de Tukey com p< 0,05 Experimento OTC:Teste de Tukey com p< 0,05
Bacteriologia: técnica dos máximos e mínimosBacteriologia: técnica dos máximos e mínimos
ResultadosResultados Metodologia e parâmetros de validaçãoMetodologia e parâmetros de validação
Tempo de retenção OTC: Tempo de retenção OTC: 6,2 – 6,9 minutos (Figuras 1 e 2)6,2 – 6,9 minutos (Figuras 1 e 2)
Linearidade (coeficiente de correlação linear) na faixa de trabalho de Linearidade (coeficiente de correlação linear) na faixa de trabalho de 0,02 a 0,4 µg mL0,02 a 0,4 µg mL-1-1 ou g ou g-1-1 : :Em solução: 0,9998Em solução: 0,9998Em extrato da matriz: 0,9997Em extrato da matriz: 0,9997
Recuperação relativa e incerteza de medição a 0,1 µg gRecuperação relativa e incerteza de medição a 0,1 µg g -1-1::106,0 ± 17,1%106,0 ± 17,1%
Repetitividade (coeficiente de variação):Repetitividade (coeficiente de variação): 16,1% 16,1%
LDM e LQM: LDM e LQM: 0,006 e 0,019 µg g0,006 e 0,019 µg g-1-1, respectivamente., respectivamente.
Seletividade:Seletividade: sem interferentes no TR do analito (Figura 2) sem interferentes no TR do analito (Figura 2)
Figura 2. Cromatogramas para OTC: Figura 2. Cromatogramas para OTC: (A) solução padrão OTC 0,1 µg mL(A) solução padrão OTC 0,1 µg mL-1-1 (B) extrato do músculo do camarão (B) extrato do músculo do camarão fortificado a 0,1 µg gfortificado a 0,1 µg g-1 -1 e e (C) extrato do músculo de camarão (C) extrato do músculo de camarão isento de OTC. isento de OTC.
Figura 3. Cromatogramas Figura 3. Cromatogramas para carapaça isenta de OTC para carapaça isenta de OTC (A) e para carapaça com (A) e para carapaça com OTC (B). OTC (B).
DiscussãoDiscussão LDM abaixo do LMR de 0,1 µg gLDM abaixo do LMR de 0,1 µg g-1 -1 (EMEA, 1990) e o (EMEA, 1990) e o
mais baixo para um método que utiliza CLAE-DAD mais baixo para um método que utiliza CLAE-DAD
Nogueira-Lima et al. (2006): Nogueira-Lima et al. (2006): 0,05 µg g0,05 µg g-1-1
Uno, 2004; Uno, 2004; Reed et al., 2004; Uno et al., 2006; Reed et al., 2006; Reed et al., 2004; Uno et al., 2006; Reed et al., 2006; Froongsarng et al., 2007; Gomez-Jimenez et al., 2008: Froongsarng et al., 2007; Gomez-Jimenez et al., 2008: entre entre 0,008 e 0,5 µg g0,008 e 0,5 µg g-1-1. .
Recuperação relativa e repetitividade aceitáveis pelo Recuperação relativa e repetitividade aceitáveis pelo Codex (2002) e recuperação maior que a obtida no Codex (2002) e recuperação maior que a obtida no método originalmétodo original
Nogueira-Lima et al. (2006): Nogueira-Lima et al. (2006): 81,68 ± 1,54%81,68 ± 1,54%
Os coeficientes de correlação linear em solução e no Os coeficientes de correlação linear em solução e no extrato da matriz fortificado foram aceitáveis segundo extrato da matriz fortificado foram aceitáveis segundo INMETRO (2007);INMETRO (2007);
As concentrações reais de OTC fornecidas nas rações As concentrações reais de OTC fornecidas nas rações se encontraram abaixo da administração indicada por se encontraram abaixo da administração indicada por Lightner (1996) de 45 a 150 µg gLightner (1996) de 45 a 150 µg g-1-1 por camarão/dia por camarão/dia devido a baixa concentração do fármaco comercial devido a baixa concentração do fármaco comercial utilizado;utilizado;
ECOSSISTEMAS ECOSSISTEMAS SAÚDE HUMANASAÚDE HUMANAECOSSISTEMAS ECOSSISTEMAS SAÚDE HUMANASAÚDE HUMANA
Holmström et al., 2003; Lalumera et al., 2004; Xuan Le et al., 2005; Christensen Holmström et al., 2003; Lalumera et al., 2004; Xuan Le et al., 2005; Christensen et al., 2006; Lyle-fritch et al., 2006et al., 2006; Lyle-fritch et al., 2006
Observou-se que o número de Observou-se que o número de VibrioVibrio spp no spp no hepatopâncreas foi, em média, superior ao verificado hepatopâncreas foi, em média, superior ao verificado na água; na água;
Não foi verificada diferença estatística entre os Não foi verificada diferença estatística entre os tratamentos em relação aos resultados tratamentos em relação aos resultados bacteriológicos, assim como também não foi possível bacteriológicos, assim como também não foi possível estabelecer relação entre estes e os níveis de OTC na estabelecer relação entre estes e os níveis de OTC na carapaça e no músculo;carapaça e no músculo;
O tempo de depleção da OTC na carapaça (13 dias) O tempo de depleção da OTC na carapaça (13 dias) foi maior que no músculo (5 dias); foi maior que no músculo (5 dias);
Nogueira-Lima et al. (2006): Nogueira-Lima et al. (2006): 25 dias 25 dias (4500 µg g(4500 µg g-1-1))Gómez-Jimenez et al. (2008): Gómez-Jimenez et al. (2008): 10 dias 10 dias (4500 µg g(4500 µg g-1-1))
Os níveis de OTC na carapaça podem diminuir em até Os níveis de OTC na carapaça podem diminuir em até 20% quando aplicou-se processos com elevadas 20% quando aplicou-se processos com elevadas temperaturas;temperaturas;
Quando o mesmo processo é aplicado em músculo, Quando o mesmo processo é aplicado em músculo, observou-se uma diminuiç4ao de até 80% (uno et al., observou-se uma diminuiç4ao de até 80% (uno et al., 2006); 2006);
Necessidade de avaliar o camarão inteiro e não Necessidade de avaliar o camarão inteiro e não somente o músculo, como recomendado pelo FDA e somente o músculo, como recomendado pelo FDA e pela CE, que estabeleceram LMR de 0,1 e 0,2 para pela CE, que estabeleceram LMR de 0,1 e 0,2 para OTC em tecidos animais (EMEA, 1990; Codex, 2006).OTC em tecidos animais (EMEA, 1990; Codex, 2006).
Ficou demonstrado que o método definido e validado Ficou demonstrado que o método definido e validado atende ao uso pretendido, por apresentar um dos atende ao uso pretendido, por apresentar um dos mais baixos limites de detecção definidos para mais baixos limites de detecção definidos para métodos que empregam a CLAE-DAD; Os resultados métodos que empregam a CLAE-DAD; Os resultados de coeficientes de correlação para OTC em solução de coeficientes de correlação para OTC em solução e no extrato da matriz fortificado, faixa de trabalho, e no extrato da matriz fortificado, faixa de trabalho, recuperação relativa e repetitividade foram recuperação relativa e repetitividade foram satisfatórios de acordo com as normas vigentes. O satisfatórios de acordo com as normas vigentes. O acúmulo de resíduo de OTC, quando administrada acúmulo de resíduo de OTC, quando administrada na ração, é maior na carapaça que no músculo na ração, é maior na carapaça que no músculo devido sobretudo à composição estrutural da devido sobretudo à composição estrutural da carapaça. carapaça.