UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS INSTITUTO DE QUÍMICA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA QUÍMICA OTIMIZAÇÃO NUMÉRICA DA PRODUÇÃO DE GLUTATIONA POR Saccharomyces cerevisiae UTILIZANDO SUBPRODUTOS INDUSTRIAIS KÉSIA DE SOUZA CRUZ ORIENTADOR: Prof.º Dr.º Gabriel Luis Castiglioni COORIENTADOR: Prof.º Dr.º Robson Maia Geraldine DISSERTAÇÃO DE MESTRADO GOIÂNIA – 2016
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
INSTITUTO DE QUÍMICA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA QUÍMICA
OTIMIZAÇÃO NUMÉRICA DA PRODUÇÃO DE GLUTATIONA POR
Saccharomyces cerevisiae UTILIZANDO SUBPRODUTOS
INDUSTRIAIS
KÉSIA DE SOUZA CRUZ
ORIENTADOR: Prof.º Dr.º Gabriel Luis Castiglioni
COORIENTADOR: Prof.º Dr.º Robson Maia Geraldine
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
GOIÂNIA – 2016
UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
INSTITUTO DE QUÍMICA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA QUÍMICA
OTIMIZAÇÃO NUMÉRICA DA PRODUÇÃO DE GLUTATIONA POR
Saccharomyces cerevisiae UTILIZANDO SUBPRODUTOS
INDUSTRIAIS
KÉSIA DE SOUZA CRUZ
ORIENTADOR: Prof.º Dr.º Gabriel Luis Castiglioni
COORIENTADOR: Prof.º Dr.º Robson Maia Geraldine
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química do Instituto de Química da Universidade Federal de Goiás, como requisito parcial para a obtenção do título de mestre em Engenharia Química. Área de concentração: Desenvolvimento de processos.
GOIÂNIA – 2016
UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
INSTITUTO DE QUÍMICA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA
QUÍMICA
-
“Mudam-se os tempos, mudam-se
as vontades, Muda-se o ser, muda-
se a confiança; Todo o mundo é
composto de mudança, Tomando
sempre novas qualidades”.
(Luís de Camões)
Dedico ao Criador pela bênção
concedida;
E a todos que contribuíram para a
realização deste trabalho. Não pelo
documento, mas sim pela
importância associada à dissertação.
AGRADECIMENTOS
Primeiramente agradeço-te meu Senhor por colocar pessoas maravilhosas
na minha vida, por abençoar-me com a vida delas e por fazer delas
instrumentos em Suas mãos para colaborarem com a conclusão desse
trabalho.
Obrigada também Senhor por colocar amor e companheirismo nos meus
pais Elias Cruz e Maria Cruz que não mediram esforços para realizar meus
sonhos que financiaram meus estudos desde sempre e que estiveram
comigo nos momentos de desânimo e euforia. Porque quando eu precisava
eles deixavam os problemas deles de lado para se importaram com os
meus, prestando solidariedade e colo.
Ao Professor Gabriel por tudo que fez por mim nesse período do mestrado,
sua orientação, suas dicas, observações foram cruciais para o trabalho.
Agradeço também pelo incentivo, confiança e amizade. Que Deus te dê em
dobro tudo que fez por mim, você para mim será referência no meio
acadêmico.
Ao Professor Robson, por todo suporte ofertado quando dá ausência física
do Gabriel no Campus. O qual com cordialidade ajudou a resolver todas as
dificuldades que surgiram.
Ao André Dias, meu esposo exemplar, obrigada por ser porto seguro para
mim e para a Geovana, nossa bênção. Todo apoio e carinho que destes nos
momentos de angústia foram fundamentais para nosso relacionamento e
evidenciou o sentido do cordão de três dobras.
A Geovana que é tão pequena de estatura, mas de coração enorme de
alegria. Obrigada minha princesa porque nos teus pequenos braços me
envolve na hora de dormir, com voz doce ora por nós e diz que me ama.
Você trouxe alegria e força para meus dias, te amo Geovaninha.
A UFG pela estrutura e recursos oferecidos para a realização deste trabalho,
e a CAPES pelo auxílio financeiro.
Aos meus tios Derly, Domingos, Bento, Luiz, Batista, Sinésio, Reis e Antenor
que incentivaram sempre e desejam que venha o Doutorado.
Aos professores Dr.ª Fernanda Ferreira (UFG) e Dr.º Fernando Ferrari
(UNESP) que sugeriram contribuições valiosas para a conclusão do
trabalho.
Aos professores Dr.º Flávio Colmati (UFG), Dr.ª Andreia Anshau e Drª.
Lucielen Santos pela parceria no trabalho. E aos professores dos seminários
Dr.º Flávio (UFG), Dr.º Cláudio (UFG) e Dr.ª Caridad (UFG) pelas
orientações durante os seminários que aprimoraram o trabalho.
As minhas irmãs Andressa Cruz e Jéssica Cruz pelo apoio, carinho,
incentivo e parceria durante o curso. E a graciosa Maria Heloisa que mesmo
com a distância e o cansaço físico e mental gerado pelo mestrado, sempre
relembrava minhas raízes, incentivando a dar valor na amizade, no carinho e
principalmente na família.
Aos colegas do mestrado Vitor, Danielle, Rodrigo, Carolina, Rowander,
Lorena, Camila, Henrique e Hannah que lutaram junto comigo pela
conclusão do curso, sempre ofertando apoio uns aos outros. Aos colegas de
laboratório Jéssica, André, Camila, Carol, Pablo, Maria Carolina, Monah e
Leandro pelas manhãs que choraram e sorriram junto comigo nesses últimos
meses. Sucesso na carreira de vocês.
A minha amiga Mayara que colaborou muito com seus conhecimentos,
amizade e lanchinhos no decorrer da última etapa do curso, obrigada pela
pessoa divertida e insubstituível que você se tornou na minha vida.
Aos técnicos Bruno, Deives, Ana, Jussara, Hugo, Rangel e Gustavo que
auxiliaram na pesquisa e partilharam experiências e conhecimentos
técnicos, levarei para sempre comigo tudo que aprendi.
As minhas tias Marlene, Célia e Sandra que apoiaram e incentivaram esse
sonho. E porque acima de tudo posso contar com amor de vocês sempre. E
a Fati, por estar tão longe e tão perto zelando da minha família.
As colegas de viagem Dayane, Luana e Stephane, no percurso Anápolis-
Goiânia por serem companhia e amigas no decorrer do mestrado.
Essa vitória é nossa!
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS .................................................................................... xii
LISTA DE TABELAS ................................................................................... xiv
LISTA DE QUADROS ................................................................................ xvii
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ................................................... xviii
LISTA DE SÍMBOLOS ................................................................................. xx
NOMENCLATURAS .................................................................................... xxi
4.11. VALIDAÇÃO DO MODELO .......................................................... 66
4.11.1. Cálculos e fórmulas utilizados durante as análises da etapa de validação........................................................................67
4.12. ALTERNATIVA DE MEIO DE CULTIVO PARA MINIMIZAÇÃO DE CUSTOS DA PRODUÇÃO DE GLUTATIONA. ..................................... 68
4.12.1. Processo fermentativo.......................................................68
4.12.2. Determinação da concentração celular............................69
4.12.3. Determinação da glutationa total......................................70
4.12.4. Determinação do consumo de açúcares e produtos do metabolismo celular.....................................................................71
5. RESULTADOS E DISCUSSÕES .......................................................... 73
5.1. POLIMORFISMO NO COMPRIMENTO DE FRAGMENTOS DE RESTRIÇÃO DO DNA MITOCONDRIAL..............................................73
5.2. DESENVOLVIMENTO DO MODELO.............................................74
Figura 1 – Estrutura da Glutationa (GSH), Tripeptídeo Composto de Ácido Glutâmico, L-Cistéina e Glicina (ANDERSON, 1998). .......................... 29
Figura 2 – Interconversão de Glutationa nas suas Formas Reduzida (GSH) e Oxidada (GSSG) Pela Ação das Enzimas Glutationa Peroxidase (GSH-Px), Glutationa Oxidase (GO) e Glutationa Redutase (GR) (MEISTER; ANDERSON , 1983). ............................................................................ 29
Figura 3 – Biossíntese da Glutationa e Enzimas Envolvidas: (a) γ-glutamilcisteína sintetase, (b) glutationa sintetase, (c) γ-glutamilciclotransferase e butioninasulfoximina, inibidor da síntese de glutationa (HUBER et al., 2008). ........................................................... 33
Figura 4 – Representação Esquemática do Ciclo Catalítico da Glutationa (HUBER et al., 2008). ........................................................................... 34
Figura 5 – Via Metabólica Da Glutationa Nas Leveduras (SHIMIZU et al.,1991). ............................................................................................... 38
Figura 6 - Reação Entre Glutationa Reduzida e DTNB (Reagente De Ellman) Para a Determinação de Hidroperóxidos Empregando a Enzima Glutationa Peroxidase (Rover Junior et al., 2011). ............................... 49
Figura 7 - Reação Entre Glutationa Reduzida e TPNH Para a Determinação De GSH (MARZAL, 2005)..................................................................... 49
Figura 8 – Fluxograma De Obtenção Do Modelo Hibrido ............................ 65
Figura 9 - Perfis Moleculares De S. Cerevisiae ATCC 7754 Isoladas A Partir De Placas Com Meio GPY, Obtidos Através Da Análise De Polimorfismo No Comprimento De Fragmentos De Restrição Do DNA Mitocondrial. Na Pista M: Marcador De Peso Molecular E Nas Pistas De 1 A 4 Perfis Moleculares Referentes À Cepa ATCC 7754. ...................................... 73
Figura 10 - Velocidade Específica De Formação De Produto Obtida A Partir Do DCCR 2². ......................................................................................... 75
Figura 11 - Esquema Onde Moléculas De Piruvato Formadas Na Glicólise São Convertidas Em Moléculas De Etanol Durante A Fermentação Alcóolica ............................................................................................... 76
Figura 12 - Ajuste Polinomial De Segunda Ordem Adotado Para Representar O Modelo Matemático Do Processo Fermentativo De Produção De GSH Para Os 165 Valores De Glutationa Obtidos De Acordo Com O DCCR 2². As Barras De Erro Indicam O Desvio Padrão Da Média De 4 Repetições (n = 11). ............................................................................. 77
Figura 13 - Resultados Experimentais e Preditos Encontrados Durante 96 Horas De Fermentação Para os Ensaios 1, 2 e 3 ................................. 84
Figura 14 – Resultados Experimentais e Preditos Encontrados Durante 96 Horas De Fermentação Para os Ensaios 4, 5 e 6 ................................. 84
Figura 15 – Resultados Experimentais E Preditos Encontrados Durante 96 Horas De Fermentação Para Os Ensaios 7, 8, 9, 10 e 11 .................... 85
xiii
Figura 16 - Resultado Dos Valores Estimados Pelo Modelo De Otimização Numérica, Usando 70 g L-1 De Melaço De Cana-De-Açúcar e 40 g L-1 De Glicerol. ........................................................................................... 86
Figura 17 - Acompanhamento Dos Resultados Das Concentrações De Biomassa (g L-1), Obtidos Pelo Delineamento Fatorial Completo 2² Para Validação Do Modelo ............................................................................ 88
Figura 18 - Resultados Da Concentração De GSH (mg L-1) Obtidos Pelo Delineamento Fatorial Completo 2² Para Validação Do Modelo. .......... 89
Figura 19 – Acompanhamento Da Concentração Celular (g L-1), Obtidos Pelo Delineamento Composto Central Rotacional 2² Para Minimização De Custos Na Produção De GSH, Durante 117 Horas De Fermentação ... 94
Figura 20 - Acompanhamento Do Consumo De Glicose (g L-1), Durante 117 h De Processo Fermentativo. ............................................................... 95
Figura 21 - Acompanhamento Do Consumo De Frutose (g L-1), Durante 117 h De Processo Fermentativo. ............................................................... 95
Figura 22 - Acompanhamento Da Concentração De Etanol Obtido Pelo Delineamento Composto Central Rotacional 2² Para Minimização Dos Custos Da Produção De Glutationa. ..................................................... 96
Figura 23 – Acompanhamento Da Concentração De Glicerol Adicionada Ao Meio De Fermentação De Acordo Com O Delineamento Composto Central Rotacional 2² Para Minimização Dos Custos Da Produção De Glutationa. ............................................................................................ 98
Figura 24 - Acompanhamento Da Concentração De Ácido Acético Obtido Pelo Delineamento Composto Central Rotacional 2² Para Minimização Dos Custos Da Produção De Glutationa. ............................................. 99
Figura 25 – Resultados Da Concentração De GSH (mg L-1) Obtidas Pelo Delineamento Composto Central Rotacional 2², Durante 117 h De Processo Fermentativo ....................................................................... 102
Figura 26 – Perfil Da Curva De Calibração De Biomassa .......................... 117
Figura 27 – Perfil Da Curva De Calibração De Glutationa ......................... 118
Figura 28 – Perfil Da Curva De Calibração De Biomassa .......................... 126
Figura 29 - Perfil Da Curva De Calibração De Glutationa .......................... 128
xiv
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Composição média do melaço de cana-de-açúcar .................... 40
Tabela 2 – Matriz dos ensaios do DCCR 2² com níveis codificados e reais das variáveis estudadas. ...................................................................... 61
Tabela 3 – Matriz dos ensaios do Delineamento Fatorial Completo 2² com níveis de variação codificados e reais para as variáveis estudadas. .... 67
Tabela 4 – Matriz dos ensaios do Delineamento Composto Central Rotacional 2² com os níveis codificados e descodificados ................... 69
Tabela 5 – Condições utilizadas para obtenção da curva padrão de glutationa. ............................................................................................. 71
Tabela 6 – Mistura (Mix) de reagentes utilizados para determinação de glutationa total. ..................................................................................... 71
Tabela 7 - Resultados das velocidades específicas de formação de produto (h-1) para os ensaios realizados de acordo com o DCCR 2² nos tempos de 24 a 96 horas de fermentação. ........................................................ 74
Tabela 8 – Coeficientes A1, A2 e A3, referentes a Equação 9, obtidos pelo ajuste polinomial de segunda ordem dos resultados experimentais da produção de glutationa a partir do DCCR 2². ........................................ 79
Tabela 9 – Resultados dos coeficientes Bi e Bj, dos parâmetros g1 e g2 e dos coeficientes de determinação. ....................................................... 80
Tabela 10 – Resultado comparativo da produção de GSH entre os dados experimentais e os dados preditos pelo modelo no tempo de 72 horas. .............................................................................................................. 81
Tabela 11 - Resultado ANOVA para os dados preditos e os dados experimentais no tempo de 24 horas .................................................... 82
Tabela 12 - Resultado ANOVA para os dados preditos e os dados experimentais no tempo de 48 horas .................................................... 82
Tabela 13 - Resultado ANOVA para os dados preditos e os dados experimentais no tempo de 72 horas .................................................... 82
Tabela 14 - Resultado ANOVA para os dados preditos e os dados experimentais no tempo de 96 horas .................................................... 82
Tabela 15 – Resultado do índice de concordância de Willmontt (d), o qual relaciona os dados preditos e os dados experimentais para cada ensaio realizado de acordo com o Delineamento Composto Central Rotacional 2² .......................................................................................................... 83
Tabela 16 – Resultados do estudo comparativo entre os ensaios do Delineamento Fatorial Completo 2² em 72 horas de fermentação. ....... 91
Tabela 17 – Resultados de crescimento celular, consumo de açúcares, concentração de glicerol adicionada ao meio e produtos do metabolismo celular da S. cerevisiae ATCC 7754, em 40 horas de fermentação,
xv
obtidos de acordo com Delineamento Composto Central Rotacional 2². .............................................................................................................. 93
Tabela 18 – Resultados das concentrações de glutationa, em g L-1, obtidos pelo Delineamento Composto Central Rotacional 2² durante as 117 horas de fermentação. ........................................................................ 101
Tabela 19 – Resultados médios das absorbâncias e concentração celular (g L-1), referente a curva padrão. ............................................................ 117
Tabela 20 – Resultados médios das absorbâncias e concentração de glutationa (mg L-1), referente a curva padrão. ..................................... 118
Tabela 21 – Quantidade dos componentes pertencentes a solução de oligoelementos empregadas no meio sintético, mosto de uva............ 124
Tabela 22 – Quantidade dos componentes pertencentes a solução de minerais empregado no meio sintético, mosto de uva. ....................... 125
Tabela 23 – Quantidade dos componentes pertencentes a solução de minerais empregado no meio sintético, mosto de uva. ....................... 125
Tabela 24 – Resultados médios das absorbâncias e concentração celular (g L-1), referente a curva padrão ............................................................. 126
Tabela 25 – Resultados médios das absorbâncias e concentração de GSH (µM) referente à curva padrão ............................................................ 128
Tabela 26 – Resultado das concentrações de GSH (mg L-1) preditas pelo modelo híbrido para os 11 ensaios do DCCR 2² nos tempos de fermentação de 0,24, 48, 72 e 96 horas. ............................................ 129
Tabela 27 – Resultado da concentração de GSH (mg L-1) para ensaio utilizado para expressar a otimização numérica. ................................ 129
Tabela 28 – Resultados da concentração de glutationa (mg L-1) obtidas no Delineamento Fatorial Completo 2². ................................................... 130
Tabela 29 - Resultados da concentração de biomassa (g L-1) obtida no Delineamento Fatorial Completo 2². ................................................... 130
Tabela 30 – Resultado da etapa de validação para os valores da concentração intracelular de GSH (%) para os tempos de 0, 24, 48 e 72 horas. .................................................................................................. 131
Tabela 31 – Resultado da etapa de validação para os valores da Produtividade celular (g L-1 h-1) para os tempos de 0, 24, 48 e 72 horas. ............................................................................................................ 131
Tabela 32 - Resultado da etapa de validação para os valores da Produtividade de GSH (mg L-1 h-1) para os tempos de 0, 24, 48 e 72 horas. .................................................................................................. 131
Tabela 33 - Resultados da concentração de biomassa (g L-1) obtida no Delineamento Composto Rotacional 2² durante 117 h de fermentação. ............................................................................................................ 132
xvi
Tabela 34 - Resultados da concentração de ácido acético (mg L-1) obtida no Delineamento Composto Rotacional 2² durante 117 h de fermentação. ............................................................................................................ 132
Tabela 35 - Resultados da concentração de glicerol (g L-1) adicionada ao meio de fermentação de acordo com o Delineamento Composto Rotacional 2². ...................................................................................... 133
Tabela 36 – Resultados da porcentagem de etanol formado durante as 117 h de fermentação. .................................................................................. 133
Tabela 37 – Resultados do consumo de glicose adicionado ao meio de fermentação em g L-1. ......................................................................... 134
Tabela 38 - Resultados do consumo de frutose adicionado ao meio de fermentação em g L-1. ......................................................................... 134
Tabela 39 – Resultados de concentração de GSH (mg L-1) obtidos no DCCR 2². ....................................................................................................... 135
Tabela 40 – Resultados da concentração de biomassa (mg L-1) obtidos no DCCR 2². ............................................................................................ 135
Tabela 41 – Composição da água de maceração de milho (AMM) utilizada como substrato para o meio de fermentação...................................... 136
xvii
LISTA DE QUADROS
Quadro 1 – Evolução das pesquisas para a produção de glutationa............33
Quadro 2 – Meio de cultura para manutenção da cepa Saccharomyces cerevisiae ATCC 7754............................................................................54
Quadro 3 – Composição do meio GPY.........................................................55
µGSH Velocidade específica de formação de produto [h-1]
A1 Coeficiente da equação polinomial [h-1]
A2 Coeficiente da equação polinomial [h-2]
A3 Coeficiente da equação polinomial [h-3]
t Tempo de fermentação [h]
D Função trigonométrica parametrizada [g L-1]
C Equação linear parametrizada em função de D [g L-1]
B1 Coeficiente da equação linear [h-1]
B2 Coeficiente da equação linear [h-1 g L-1]
B3 Coeficiente da equação linear [h-1]
g1 Parâmetro da função trigonométrica [adimensional]
g2 Parâmetro da função trigonométrica [adimensional]
R² Coeficiente de determinação [adimensional]
xxii
Otimização numérica da produção de glutationa por Saccharomyces cerevisiae utilizando subprodutos industriais
RESUMO
Estudos recentes mostram que as patologias mediadas por espécies reativas de oxigênio (ERO) estão frequentes. As EROs associam-se ao estresse oxidativo nas células, e para o corpo defender-se das consequências advindas desse processo, utiliza os antioxidantes. Um exemplo de antioxidante com variadas funções no organismo é a glutationa (GSH). Trata-se de um tiol celular de baixa massa molecular, que pode ser sintetizada por via química, enzimática e fermentativa. Devido sua viabilidade ambiental e econômica, o uso de processos fermentativos tem ganhado visibilidade científica. O emprego de modelos matemáticos é uma alternativa que auxilia na predição deste antioxidante. Tendo em vista estas observações o presente trabalho teve como objetivo elaborar um modelo matemático de predição da produção de GSH por S. cerevisiae, bem como validar experimentalmente sua otimização numérica. Para a confecção do modelo matemático utilizou-se um Delineamento Composto Central Rotacional 2², tendo como resposta os valores de GSH e biomassa em função das concentrações de melaço e glicerol durante 96 horas de fermentação. A partir desses resultados foi confeccionado um modelo híbrido, tendo como resposta a velocidade específica de formação de GSH. O modelo final foi ajustado a uma função polinomial utilizando metodologia dos Mínimos Quadrados. Experimentalmente a máxima produção de GSH foi encontrada em 72 horas (119,6 mg L-1) utilizando 76,9 g L-1 de melaço e glicerol, respectivamente. Aplicando o modelo para as mesmas condições estimou-se 118,6 mg L-1. Os resultados experimentais e preditos foram analisados estatisticamente para verificar a similaridade dos mesmos. A otimização numérica foi feita fixando o tempo em 72 horas. Nessa etapa variaram-se as concentrações de melaço e glicerol até obter a melhor condição para produzir GSH. A otimização estimou que 70 g L-1de melaço de cana-de-açúcar e 40 g L-1 de glicerol podem garantir uma produção de 126 mg L-1 de GSH. Tendo em conta esta constatação, essas condições foram utilizadas como ponto central de um Delineamento Fatorial Completo 2² para validação do modelo. O resultado encontrado nas mesmas condições do ponto central do delineamento proposto para validação foi de 127,3 mg L-1 de GSH em 72 horas. A validação do modelo matemático por meio de otimização numérica comprovou que o uso da modelagem foi eficaz para a predição da produção de glutationa por Saccharomyces cerevisiae utilizando subprodutos industriais.
Numerical optimization of glutathione production by Saccharomyces cerevisiae using industrial by-products
ABSTRACT Recent studies show that often, pathologies are caused by Reactive oxygen species (ROS). The ROS are associated with the oxidative stress in the cells. The body uses the antioxidants to defend itself from the consequences of this process. An example of an antioxidant with different functions in an organism is the Glutathione (GSH). It is a cellular thiol with low molecular mass, that’s synthesized by chemical, enzymatic and fermentative methods. Since it is environmentally and economically viable, the use of the fermentative process has gained scientific visibility. The use of mathematical models is an alternative that helps in the production of Glutathione. Considering these observations, the present study's aimed to elaborate a mathematical model for production and prediction of GSH for Saccharomyces cerevisiae, as well as to validate its numerical optimization experimentally. For the mathematical model in this process, was used the Central Composite Rotational Design 2², having as an answer, the GSH and biomass values in function with the concentration of molasses and glycerol during a period of 96 hours of fermentation. Based on these results, a hybrid model was made, having as a result, the specific rate of GSH formation. The final model was adjusted to a polynomial function using the method of least squares. Experimentally, the maximum production of GSH was found to be, in 72 hours (119,6 mg L-1) using 76,9 g L-1of molasses and glycerol, respectively. Applying the model for similar conditions, it was estimated to a 118,6mg L-1. The experimental results were then statistically analyzed to verify their similarity. The numerical optimization was made by setting the clock for 72 hours. At this step, the concentration of molasses and glycerol were varied until the best conditions to produce GSH were met. The optimization helped to derive an estimate that 70 g L-1of sugar cane molasses and 40 g L-1of glycerol can guarantee the production of 126 mg L-1of GSH. Based on the accuracy of the observations, the same conditions were used as a central point for the validation of the model - Factorial Design2². The results obtained under these conditions helped establish that the central point of the proposed design for the validation of the model, is 127,3mg L-1of GSH in 72 hours. The validation of this mathematical model by the numerical optimization proved that it was effective for the production and prediction of Glutathione by Saccharomyces cerevisiae, using industrial by-products. Keywords: mathematical modeling, waste, GSH, S.cerevisiae, hybrid model.
24
1. INTRODUÇÃO
A partir da segunda metade do século XX, o conhecimento científico
proporcionou o desenvolvimento de novas tecnologias consideradas
capazes de impactar radicalmente a ciência, a produção e,
consequentemente, a sociedade (REIS et al., 2009), influenciando nos
padrões socioeconômicos e gerado melhorias para a qualidade de vida
(PEREIRA; DUQUE-ESTRADA, 2014).
Uma melhor qualidade de vida remete à atenção privilegiada para a
saúde, entretanto quando as doenças surgem há uma preocupação para as
suas causas e seus processos fisiológicos, neste aspecto tem-se verificado
que a incidência de patologias mediadas por espécies reativas de oxigênio
(ERO) é frequente e notória para que se desenvolvam estudos na área
(NETO, 2010).
As ERO são em sua maioria mais associadas a danos oxidativos do
que à modulação de fenômenos biológicos, os danos oxidativos
caracterizam uma intoxicação por radicais livres, ou seja, estresse oxidativo.
Para combater esse estresse e as consequências advindas desse processo,
o corpo utiliza os antioxidantes (CARDOSO et al., 2006)
Um exemplo de antioxidante é a glutationa ou GSH (ᵞ-L-glutamil-L-
cistenilglicina) esta biomolécula é um tripeptídeo composto por ácido
glutâmico, L-cisteína e glicina, caracterizado provavelmente como o mais
abundante tiol de baixa massa molecular encontrado nos sistemas
biológicos (WEN et al., 2005). A GSH possui várias funções metabólicas nas
células, sendo que a principal está relacionada ao seu alto poder
antioxidante (PIEDRAHÍTA-AGUIRRE, 2008), além de estar envolvida em
reações de biorredução, processos de transporte e destoxitificação de
diferentes xenobióticos (WEN et al., 2005).
A GSH no organismo é sintetizada em duas etapas enzimáticas
consecutivas dependentes de Adenosina trifosfato (ATP) (HUBER et al.,
25
2008). Segundo Navarro et al. (1999) baixas concentrações de glutationa
nos seres humanos podem ser associadas a várias patologias, tais como a
cirrose do fígado, diabetes, doenças pulmonares, degenerativas,
inflamações gastrointestinais, pancreáticas e envelhecimento e outras.
Porém, a existência de patologias associadas a radicais livres
demonstra que este tipo de espécie não apresenta nenhum componente
etiológico na globalidade das doenças, mas sim uma responsabilidade direta
na alteração fisiopatológica dos mecanismos que determinam a proliferação
da anomalia (NETO, 2010).
A produção sintética de GSH pode ser realizada por três formas:
enzimática, química e fermentativa. Por fermentação as
leveduras Saccharomyces cerevisiae e Candida utilis são empregadas para
produzir a GSH em escala industrial (NAVARRO et al., 1999). A
Saccharomycess sp é um microrganismo aeróbio facultativo, isto é, tem a
habilidade de se adaptar metabolicamente, tanto em condições aeróbias
quanto anaeróbias (LIMA et al., 2001). Segundo Wen et al., (2005) a
fermentação com leveduras é um método eficiente comercialmente e de fácil
aplicação prática do processo.
De acordo com Silva et al. (2009) em escala industrial com uma
relação custo-benefício satisfatória por fermentação de levedura, as fontes
de carbono e nitrogênio mais econômicos devem ser investigadas, desta
maneira o glicerol e o melaço de cana (1,2,3 propanodiol) surge como uma
promissora fonte de carbono já que são oriundas de substratos industriais.
Uma alternativa que pode garantir a predição da glutationa e
minimizar tempo e custos com a sua obtenção é o uso das técnicas de
modelagem matemática. A modelagem esta associada a processos reais
sujeitos a experimentações, processo no qual as informações obtidas
experimentalmente podem ser transformadas em modelos preditivos
(FAHOR, 2009).
26
Vale ressaltar que um dos objetivos da engenharia bioquímica é o
desenvolvimento de metodologias para maximizar a capacidade metabólica
de microrganismos de interesse industrial. A fim de alcançar esses objetivos
o uso de processos de manipulação genética do metabolismo celular e
também programar as condições de operação dos processos são fatores
essenciais (WEICHERT, 2002).
Sies (1999) enfatiza que esta biomolécula é vista como a esperança
de transmitir uma ideia de onde os desenvolvimentos futuros podem ir, em
virtude das diversas funções inerentes a glutationa. E segundo Li et al.,
(2004) as indústrias se interessaram pelas funções e propriedades da
glutationa e agora está é sendo alvo de estudos.
Levando em consideração todas essas informações, a abordagem
deste tema torna-se justificável. Dessa maneira este trabalho teve por
objetivo elaborar um modelo matemático de predição da biomolécula
glutationa oriunda de processo fermentativo utilizando subprodutos
industriais.
A organização desta dissertação apresenta-se da seguinte forma:
Na primeira seção realizou-se uma introdução sobre o tema abordado na
pesquisa, as etapas seguintes referem-se ao desenvolvimento do trabalho.
Na seção dois abordam-se os objetivos da pesquisa, na seção três trata-se
de uma revisão bibliográfica. Na etapa quatro são descritas as metodologias
de caracterização da cepa, condução do processo fermentativo, modelagem,
simulação, otimização numérica e validação do modelo híbrido desenvolvido
e uma metodologia para minimizar os custos de produção de GSH. Na
seção cinco apresentam-se os resultados encontrados e discutidos. E por
fim as considerações finais sobre a pesquisa e sugestões de trabalhos
futuros.
27
2. OBJETIVOS
2.1. OBJETIVO GERAL
Modelar matematicamente o processo de produção de glutationa
utilizando Saccharomyces cerevisiae e subprodutos industriais.
2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Estudo de verificação da pureza da cepa Saccharomyces cerevisiae
ATCC 7754.
Modelagem matemática dos dados obtidos para a produção de
glutationa;
Otimizar numericamente a produção de glutationa por Saccharomyces
cerevisiae;
Validar o modelo matemático de predição da produção de glutationa por
Saccharomyces cerevisiae;
Iniciar estudos para minimização de custos da produção de glutationa por
Saccharomyces cerevisiae;
28
3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
3.1. DEFINIÇÃO, FUNÇÃO E APLICAÇÃO DA GLUTATIONA
A glutationa recebe as seguintes denominações: GHS - abreviação
em inglês - ou ʟ-γ-glutamil-ʟ-cisteinilglicina (PENNINCKX, 2002) sua massa
molar é de 307 g mol-1 (C10H17N3O6S). É definida como um tripeptídeo linear,
hidrossolúvel, sendo composto dos seguintes aminoácidos: ácido glutâmico,
L-cisteína e glicina (WEN et al., 2005).
Segundo Li et al. (2004) o grupo tiol da cisteína é o local ativo
responsável por suas propriedades bioquímicas. E de acordo com Shan
(1990) a GHS possui duas características indispensáveis para a sua
participação em diversas funções: a ligação γ-glutamil e o grupo sulfidrila.
Em 2016, completa-se 128 anos (1888 – 2016) que J. de Rey-
Pailhade descobriu a glutationa. Ele observou que as células continham uma
substância responsável pela formação de sulfetos na presença de enxofre e
que essa substância estava presente em quase todas as células animais.
Em virtude da alta afinidade em reagir com o enxofre, Rey-Pailhade nomeou
esta substância de “philothion” (philo=atração; thion=enxofre) (MEISTER,
1988).
Em 1921, Hopkins observou que a substância denominada
“philothion” era constituída por glutamato e L-cisteína, sendo um dipeptídeo
denominado glutationa. Mais tarde, um grupo de pesquisadores descobriu
que a GSH é um tripeptídeo composto por três aminoácidos: glutâmico, L-
cisteína e glicina e que seu sítio ativo era representado por um grupo tiol,
sulfidrila ou SH de um resíduo de cisteína (MEISTER, 1988). A Figura 1
apresenta a composição da glutationa.
29
Figura 1 – Estrutura da Glutationa (GSH), Tripeptídeo Composto de Ácido
Glutâmico, L-Cistéina e Glicina (ANDERSON, 1998).
Nas células, a glutationa pode ser encontrada sob a forma de
glutationa reduzida (também denominada de monomérica) e na forma
oxidada (também designada de dimérica – GSSG) (NETO, 2010) e
diferentes mistos dissulfetos como, por exemplo, GS-S-CoA e GS-S-Cys
(PENNINCKX; ELSKENS, 1993). A Figura 2 ilustra a interconversão da
glutationa nas formas GSH e GSSG.
Figura 2 – Interconversão de Glutationa nas suas Formas Reduzida (GSH) e
Oxidada (GSSG) Pela Ação das Enzimas Glutationa Peroxidase (GSH-Px),
Glutationa Oxidase (GO) e Glutationa Redutase (GR) (MEISTER;
ANDERSON , 1983).
30
A GSH possui várias funções metabólicas nas células, sendo que a
principal está relacionada ao seu alto poder antioxidante (PIEDRAHÍTA-
AGUIRRE, 2008), além de estar envolvida em reações de biorredução,
processos de transporte, proteção contra radicais livres e destoxitificação de
xenobióticos e de metabólitos tóxicos endógenos além de estar relacionado
com atividade de enzimas, enxofre e metabolismo do nitrogênio
(PENNINCKX, 2002). Atua como um intensificador imunológico (PASTORE
et al., 2003) por meio da produção de glóbulos brancos (WU et al., 2004).
Gharieb; Gadd (2004) citaram que a GSH desempenha função de
proteção da célula contra biocidas e certos íons metálicos. Portanto um
tripeptídeo fundamental no acúmulo e na desintoxicação de Cd (cádmio) e
Se (selênio).
A glutationa é uma biomolécula determinante em diversos processos
celulares por desempenhar múltiplas funções, fato que dificulta atribuir uma
causa direta para determinada patologia por alterações dos níveis de GSH
ou do estado redox, somente se pode inferir que existe uma participação da
GSH para a manifestação e progressão de doenças (BALLATORI et al.,
2009; BONNEFOY et al., 2002).
A resistência de muitas células contra o estresse oxidativo está
associada com elevados níveis intracelular de glutationa em sua forma
reduzida. O estresse oxidativo pode causar mudanças no estado redox da
glutationa aumentando a liberação de glutationa oxidada (dissulfeto) no
organismo. Assim, alguns estudos têm direcionado o interesse no
monitoramento de glutationa em amostras biológicas com o propósito de
estudar se algumas doenças estão relacionadas ao estresse oxidativo
Após 45 horas de fermentação, notou-se que os níveis de GSH
caíram drasticamente (Figura 25), e as concentrações de biomassa
oscilaram bastante. Tal observação coincide com o completo consumo dos
açucares do meio de cultivo antes de 40 horas. A provável explicação é que
as leveduras estão consumindo a glutationa como fonte de nutriente, mais
preferencialmente que o glicerol.
102
Figura 25 – Resultados Da Concentração De GSH (mg L-1) Obtidas Pelo
Delineamento Composto Central Rotacional 2², Durante 117 h De Processo
Fermentativo
Segundo Li et al. (2004) e Cha et al. (2004) aumentar a produtividade
é uma estratégia eficiente para reduzir os custos na produção de GSH. E de
acordo com Wen et al. (2005) aprimorar as metodologias de produção de
glutationa, minimizando custos na produção tende a reduzir o preço desta
biomolécula
Com os resultados obtidos nesse estudo, verifica-se que o objetivo
de iniciar estudos para propor um meio alternativo com o intuito de minimizar
os custos da produção de glutationa foi atingido, visto que foi possível
produzir em 40 horas de fermentação 10,23 g L-1 de GSH, empregando
matérias-primas que tendem a diminuir os custos da produção que é o uso
de mosto de uva natural (com composição similar ao mosto sintético
utilizado para o presente experimento), melaço de cana-de-açúcar e o
glicerol.
103
Os últimos dados relacionados a produtividade da cana-de-açúcar
da safra de 2015/16 informam aumento de 9,1%. Originando um incremento
de 4,9% na produção de cana-de-açúcar em relação à safra de 2014/15,
totalizando uma produção de 665,6 milhões de toneladas de cana-de-açúcar
nesta safra (CONAB, 2016).
Nessa perspectiva, verifica-se que matéria prima como o melaço
(resíduo de fabricação do açúcar cristalizado, do melado ou da refinação do
açúcar bruto) não precisará ser importada, já que o Brasil é o maior produtor
de cana-de-açúcar, fato que auxilia na etapa de minimizar os custos da
produção de GSH.
E tratando-se do glicerol que atua como coprodutor no processo de
produção de biodiesel. Correspondendo cerca de 10% do volume total de
biodiesel produzido, torna-se interessante o aproveitamento direto do
glicerol, pois permite a viabilidade do processo produtivo de biodiesel, e
auxilia para que esteja sendo competitivo no mercado.
Para complementação do presente estudo foi realizada uma cotação
dos materiais para desenvolver o processo fermentativo alternativo. A
primeira metodologia proposta foi a descrita no item 4.5, a segunda esta no
item 4.12. O estudo revelou que com o primeiro procedimento gastasse R$
10,29 por litro de meio fermentado. Entretanto, o segundo método
envolvendo mosto sintético de uva, o custo com o meio de fermentação foi
estimado em R$ 1,92 por litro de meio.
Então, optando-se por dar uma nova aplicação comercial aos
subprodutos melaço e glicerol os quais são utilizados por inúmeros
microrganismos como fonte de carbono originando produtos, auxiliando em
aumentar as produções e minimizar os custos operacionais e de capital
(YAZDANI; GONZALEZ, 2007). Assim, constata-se que o estudo utilizando
mosto de uva pode diminuir significativamente os gastos econômicos
envolvidos na descrição do item 4.5, referente à produção da GSH.
104
6. CONCLUSÕES
Os resultados obtidos permitiram concluir que a cepa estava pura.
O modelo hibrido conseguiu predizer o bioprocesso, pois quando
experimentalmente a máxima produção de GSH foi encontrada em 72 horas
(119,6 mg L-1) utilizando 76,9 g L-1 de melaço e glicerol, respectivamente.
Aplicando o modelo para as mesmas condições estimou-se 118,6 mg L-1. Os
resultados experimentais e preditos foram analisados estatisticamente para
verificar a similaridade dos mesmos, não havendo diferenças significativas
entre as respostas experimental e predita. Isso enfatiza que o uso de
modelos matemáticos polinomiais parametrizados é uma ferramenta
importante para prever a produção de GSH.
A partir do modelo gerado foi possível validar experimentalmente a
otimização numérica desenvolvida para maximizar a produção de glutationa.
A otimização estimou uma produção de 126 mg L-1 de GSH. E o resultado
obtido a partir do Delineamento Fatorial Completo 2² foi de 127,3 mg L-1 de
GSH em 72 horas, o resultado obtido experimentalmente corresponde 1% a
mais do que o valor estimado pela otimização numérica.
Nos estudos para minimização de custos da produção de glutationa
por Saccharomyces cerevisiae ATCC 7754, parceria com o Instituto de
Agroquímica e Tecnologia de Alimentos (IATA). Os resultados obtidos foram
satisfatórias a pesquisa, pois somente de GSH em um tempo menor de
fermentação obteve-se aproximadamente 10,23 g L-1, sendo possível
relacionar a elevada concentração de GSH com o ciclo bioquímico da
levedura. Além de que o estudo revelou que o processo fermentativo
proposto tem um valor de custo 5,36 vezes inferior a metodologia descrita
por Anshau (2010), evidenciando sua viabilidade econômica.
105
7. SUGESTÕES DE TRABALHOS FUTUROS
- Trabalhar com cepas recombinantes a partir de engenharia metabólica;
- Construir modelos matemáticos que relacionem a concentração de
biomassa de foma independente no modelo;
- Verificar se com outras cepas de leveduras é possível melhorar os
resultados de produção de GSH usando o mosto de uva;
- Controlar as concentrações de etanol formadas no meio a fim de deixá-las
a niveis baixos, melhorando a concentração de GSH;
- Desenvolver estudos com redes neurais para predizer a produção de GSH;
- Construir modelos fenomenológicos a partir de fermentações conduzidas
em batelada alimentada empregando subprodutos industriais como fonte
adicional de carbono.
106
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117
APÊNDICES
A. RESULTADOS CURVA DE CALIBRAÇÃO: BIOMASSA
Tabela 19 – Resultados médios das absorbâncias e concentração celular (g
L-1), referente a curva padrão.
Média das absorbâncias
Concentração celular em (g L-1)
0,078 0,18
0,119 0,22
0,237 0,24
0,384 0,32
0,423 0,34
0,561 0,40
0,650 0,42
0,837 0,48
0,880 0,52
Figura 26 – Perfil Da Curva De Calibração De Biomassa
y = 0,4026x + 0,1602 R² = 0,9896
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
0,45
0,50
0,55
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
Co
nc
en
tra
çã
o c
elu
lar
(g L
-1)
Absorbância (600 nm)
118
B. RESULTADOS CURVA DE CALIBRAÇÃO: GLUTATIONA
Tabela 20 – Resultados médios das absorbâncias e concentração de
glutationa (mg L-1), referente a curva padrão.
Média das absorbâncias
Concentração celular em (mg L-1)
0,071 5
0,183 10
0,472 20
0,552 25
0,643 30
0,731 35
0,796 40
0,908 45
Figura 27 – Perfil Da Curva De Calibração De Glutationa
C. PROGRAMAÇÕES
y = 47,753x + 0,2484 R² = 0,9862
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1
Co
ncen
tração
de
GS
H
(mg
L-1
)
Absorbância (412 nm)
119
Exemplo 1: Ajuste Polinomial dos resultados das velocidades específicas de
produção de glutationa para o Ensaio 1, utilizando 13,1 g L-1 de melaço de
cana-de-açúcar e 13,1 g L-1 de glicerol.
clear all clc % entrada de dados; tempo de fermentação X(1) = 0; X(2) = 24; X(3) = 48; X(4) = 72; X(5) = 96; % entrada com os valores de velocidade especifica de GSH para ensaio 1 y(1)= 0.00000; y(2)= 1.47E-04; y(3)= 7.00E-05; y(4)= 2.07E-05; y(5)= -1.83E-04; % y = f(y) % m é o número de pontos m = 5; % inicializando os valores dos somatórios que serão os elementos da matriz A SX1 = 0; SX2 = 0; SX3 = 0; SX4 = 0; Sy = 0; Sy2 = 0; SXy = 0; SX2y = 0; % Somatório dos elementos da matriz A for i = 1: m SX1 = SX1 + X(i);
120
SX2 = SX2 + X(i).*X(i); SX3 = SX3 + X(i)^3; SX4 = SX4 + X(i)^4; Sy = Sy + y(i); Sy2 = Sy2 + y(i).*y(i); SXy = SXy + X(i).*y(i); SX2y = SX2y + X(i).*X(i).*y(i); end % matriz A A = [ m SX1 SX2 SX1 SX2 SX3 SX2 SX3 SX4]; % matriz B transposta para poder obter a solução do sistema B = [Sy, SXy, SX2y]'; % Resolução do sistema C = A\B; % Calculo de R2 Sn1 = C(1)* (Sy - m * Sy/m); Sn2 = C(2)* (SXy - SX1 * Sy/m); Sn3 = C(3)* (SX2y - SX2 * Sy/m); R2 = (Sn1+Sn2+Sn3)/(Sy2-Sy * Sy/m); y1 = C(1) + C(2).* X + C(3).* X.^2; plot(X,y,X,y1) disp(' '); fprintf('R2=%d',R2); disp(' '); fprintf('C(1)=%d',C(1)); disp(' '); fprintf('C(2)=%d',C(2)); disp(' '); fprintf('C(3)=%d',C(3)); disp(' '); Exemplo 2: Ajuste Linear dos resultados das velocidades específicas de
produção de glutationa para o conjunto de coeficientes A2, a partir do qual
121
se obtém também os valores dos parâmetros g1 e g2, relacionadas à função
y(8) = 5.66345e-6; y(9) = 5.81904e-6; % m é o numero de pontos m = 9; % inicializando os valores dos somatórios que serão os elementos da matriz A SX = 0; SX2 = 0; SXy = 0; Sy = 0; Sy2 = 0; % somatórios dos Elementos da matriz A for i = 1:m SX = SX + X(i); SX2 = SX2 + X(i).*X(i); SXy = SXy + X(i) .* y(i); Sy = Sy + y(i); Sy2 = Sy2 + y(i) .* y(i); end %Matriz A A = [ m SX SX SX2]; % Matriz B transposta para poder obter a solução do sistema B = [Sy, SXy]'; % Resolução do Sistema C = A\B; %Calculo de R2 R2 = (SXy - SX * Sy / m)^2 / ((SX2 - SX^2/m) * (Sy2 - Sy^2 / m)); if r2new < R2; r2new = R2; a2new = a2; a1new = a1; end end end
Tabela 21 – Quantidade dos componentes pertencentes a solução de
oligoelementos empregadas no meio sintético, mosto de uva.
Oligoelemento Quantidade (g. L-1)
MnSO4.H20 4
ZNSO4.7H20 4
CuSO4.5H20 1
KI 1
CoCl25H20 0,4
H3BO3 1
(NH4)6Mo7O24 1
125
Tabela 22 – Quantidade dos componentes pertencentes a solução de
minerais empregado no meio sintético, mosto de uva.
Minerais Quantidade (g L-1)
MyO-Inositol 2
Pantotenato 0,15
Tiamina Hidroclor
0,025
Ácido nicotinico 0,2
Pirodoxina 0,025
Biotina 0,0003
Tabela 23 – Quantidade dos componentes pertencentes a solução de
minerais empregado no meio sintético, mosto de uva.
Aminoácidos Quantidade (g L-1)
Tirosina 1,5
Triptofano 13,4
Isoleucina 2,5
Ácido Aspartico 3,4
Ácido Glutâmico 9,2
Arginina 28,3
Leucina 3,7
Treonina 5,8
Glicina 1,4
Glutamina 38,4
Alanina 11,2
Valina 3,4
Metionina 2,4
Fenilanina 2,9
Serina 6
Histidina 2,6
Lisina 1,3
Cisteina 1,5
Proteina 46,1
F. RESULTADOS CURVA DE CALIBRAÇÃO: BIOMASSA
126
Tabela 24 – Resultados médios das absorbâncias e concentração celular (g
L-1), referente a curva padrão
Média das absorbâncias
Concentração celular em (g L-1)
0,11 0,08
5,78 4,4
10,27 7,6
14,63 9,7
15,40 10,7
Figura 28 – Perfil Da Curva De Calibração De Biomassa
G. METODOLOGIA PARA QUANTIFICAR GSH POR
MÉTODOLOGIA ENZIMÁTICA
1. MES 2X (para 100 mL)
MES Pm: 195,24 g/mol. Deve estar a 0,4 M: Cálculo: 195,24 g/mol x 0,4mol/L = 78,096 g/L
0,1L x 78,096 = 1L x PESO PESO = 7,81 gramas de MES em 100 mL de tampão fosfato sódico 0,1M pH 7,4. 2mM EDTA: 2x 10-³ M = 2x 10-3 mol/L Pm = 292,25 g/mol Cálculo: 2x10-3 mol/L x 292,25 g/mol = 0,58 g/L
0,58 g x 0,1 L
y = 0,6738x + 0,2731 R² = 0,9936
0,00
2,00
4,00
6,00
8,00
10,00
12,00
0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00
Co
nce
nta
ção
ce
lula
r (
g L-1
)
Absorbância (600 nm)
127
PESO = 0,058 gramas de EDTA em 100 mL de tampão fosfato 0,1 M pH 7,4. Ajustar o pH para 6 com NaOH. 2. MES 1X
Se dilui o tampão MES 2X no tampão fosfato sódico pH 7,4 0,1M. 3. Tampão fostato EDTA
Tampão fosfato sódico 0,01M EDTA 0,005 M Em 10 mL de tampão fosfato deve ser adicionado 0,0146g de EDTA com Pm = 292,25 g/mol.
4. GSH
0,003 g/1 mL de MES 1X para tê-lo a 10 mM, mas deve ser a 50 µM. Asssim é preciso fazer duas diluições: 100 µL do que foi pesado e dissolvido em 1 mL + 900 µL de MES1X de modo que é a 1 mM. Para se chegar a 50 µM pegar 50 µL da última dissolução e adicionar 950 µL de MES 1X.
5. G6P
0,0064 g/mL tampão fosfato + EDTA.
6. DTNB
Dissolver 0,00396 g/50 mL MES1X (Estará a 200µM), dissolver no momento
do uso.
7. NADP+
(adicionar ao coquetel de ensaio final): 0,016 g/ 1mL tampão fosfato +
EDTA.
8. G6PDH:
Utiliza-se a 0,125 mg/mL e o estoque (a 4ºC) é de 8,4 mg/mL em 14,88 µL
fazendo um balanço adicione 985,11 µL de tampão fosfato edta.
9. GSH redutase
Como é necessário 192 unidades/mL, e o estoque é de 160 unidades/mL, é
preciso dissolver 12 µL de enzima em 988 µL de tampão fosfato edta.
128
H. RESULTADOS CURVA DE CALIBRAÇÃO: GLUTATIONA
Tabela 25 – Resultados médios das absorbâncias e concentração de GSH
(µM) referente à curva padrão
Média das absorbâncias
Concentração de GSH (µM)
0 0
0,125 2
0,251 4
0,446 8
0,72 12
Figura 29 - Perfil Da Curva De Calibração De Glutationa
I. RESULTADO DOS DADOS MODELADOS
y = 16,69x + 0,0234 R² = 0,9981
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2
Co
nce
ntr
ação
de
GSH
(µ
M)
Absorrbância (412 nm)
129
Tabela 26 – Resultado das concentrações de GSH (mg L-1) preditas pelo
modelo híbrido para os 11 ensaios do DCCR 2² nos tempos de fermentação
de 0,24, 48, 72 e 96 horas.
Ensaios GSH (mg L-1)
0 24 48 72 96
1 0 33,82 43,63 66,41 27,91
2 0 30,43 77,41 95,43 40,32
3 0 45,35 83,4 121,38 45,31
4 0 49,8 106,56 118,6 58,64
5 0 41,89 57,19 71,12 40,98
6 0 45,09 87,27 78,78 13,88
7 0 44,51 62,11 79,94 40,46
8 0 36,62 61,81 75,4 31,84
9 0 47,98 95,61 104,01 48,55
10 0 47,98 95,61 104,01 48,55
11 0 47,98 95,61 104,01 48,55
J. RESULTADO OTIMIZAÇÃO NUMÉRICA
Tabela 27 – Resultado da concentração de GSH (mg L-1) para ensaio
utilizado para expressar a otimização numérica.
Ensaio 6 GSHExp* GSHPre*
Tem
po
(h
) 0 7,9 0,0
24 44,9 50,7
48 84,2 110,2
72 117,8 126,0
96 25,7 52,1 *GSHExp: Valores da concentração de glutationa determinados experimentalmente, GSHPred:
Valores de concentração de Glutationa preditas pela otimização numérica através do
modelo híbrido.
K. RESULTADOS PARA GLUTATIONA E BIOMASSA OBTIDOS NA
ETAPA DE VALIDAÇÃO
130
Tabela 28 – Resultados da concentração de glutationa (mg L-1) obtidas no
Delineamento Fatorial Completo 2².
Ensaio
Tempo
0 24 48 72
GS
H (
mg
L-1)
1 34,6 64,8 80,8 82,5
2 34,6 71,6 67,9 65,8
3 34,6 60,3 81,3 68,3
4 34,6 51,4 61,1 63,1
5 34,6 75,2 85,7 127,3
6 34,6 74,8 74,2 120,1
7 34,6 71,1 79,3 114,7
8 34,6 77,7 79,8 113,0
Tabela 29 – Resultados da concentração de biomassa (g L-1) obtida no
Delineamento Fatorial Completo 2².
Ensaio Tempo
0 24 48 72
Bio
ma
ss
a (
g L
-1)
1 0,38 2,62 4,77 4,85
2 0,38 4,22 2,06 2,20
3 0,38 1,21 0,31 1,80
4 0,38 0,48 0,36 0,44
5 0,38 3,99 4,59 4,65
6 0,38 3,50 3,63 3,88
7 0,38 3,71 4,48 4,22
8 0,38 3,74 3,45 4,89
L. RESULTADOS DAS CONDIÇÕES ESTUDADAS PARA OS TEMPOS
DE 0, 24, 48 E 72 HORAS.
131
Tabela 30 – Resultado da etapa de validação para os valores da
concentração intracelular de GSH (%) para os tempos de 0, 24, 48 e 72
horas.
Ensaio Tempo
0 24 48 72
1 9,09 2,47 1,69 1,70
2 9,09 1,70 3,30 3,00
3 9,09 4,99 26,24 3,81
4 9,09 10,83 17,22 14,34
5 9,09 1,89 1,87 2,74
6 9,09 2,14 2,04 3,10
7 9,09 1,92 1,77 2,72
8 9,09 2,08 2,31 2,31
Tabela 31 – Resultado da etapa de validação para os valores da
Produtividade celular (g L-1 h-1) para os tempos de 0, 24, 48 e 72 horas.
Ensaio Tempo
0 24 48 72
1 0,00 0,09 0,09 0,06
2 0,00 0,16 0,04 0,03
3 0,00 0,03 0,00 0,02
4 0,00 4E-03 -5E-04 8E-04
5 0,00 0,15 0,09 0,06
6 0,00 0,13 0,07 0,05
7 0,00 0,14 0,09 0,05
8 0,00 0,14 0,06 0,06
Tabela 32 – Resultado da etapa de validação para os valores da
Produtividade de GSH (mg L-1 h-1) para os tempos de 0, 24, 48 e 72 horas.
Ensaio Tempo
0 24 48 72
1 0,00 1,26 0,96 0,67
2 0,00 1,54 0,69 0,43
3 0,00 1,07 0,97 0,47
4 0,00 0,70 0,55 0,40
5 0,00 1,69 1,06 1,29
6 0,00 1,68 0,83 1,19
7 0,00 1,52 0,93 1,11
8 0,00 1,80 0,94 1,09
132
M. RESULTADOS PARA A CONCENTAÇÃO CELULAR (g L-1),
CONCENTRAÇÃO DE ÁCIDO ACÉTICO (mg L-1), CONCENTRAÇÃO DE
GLICEROL (g L-1), ETANOL (%) E CONSUMO DE GLICOSE E FRUTOSE
(g L-1)
Tabela 33 – Resultados da concentração de biomassa (g L-1) obtida no
Delineamento Composto Rotacional 2² durante 117 h de fermentação.
Ensaio Tempo (h)
0 24 40 72 96 117
1 0,08 5,69 7,18 5,01 4,47 4,60
2 0,08 3,95 6,73 4,64 4,25 4,65
3 0,08 5,46 7,43 4,51 5,76 6,58
4 0,08 4,58 6,59 5,73 6,06 6,01
5 0,08 1,35 1,34 1,44 1,65 1,81
6 0,08 3,54 7,03 6,15 5,99 5,83
7 0,08 6,89 6,98 7,08 6,34 6,04
8 0,08 5,00 7,22 5,87 6,21 5,81
9 0,08 6,43 6,96 5,44 5,83 5,91
10 0,08 5,59 7,54 5,47 5,87 6,19
11 0,08 6,20 6,93 5,86 6,76 5,90
12 0,08 5,98 7,80 6,26 6,59 6,60
Tabela 34 – Resultados da concentração de ácido acético (mg L-1) obtida no
Delineamento Composto Rotacional 2² durante 117 h de fermentação.
Ensaio Tempo (h)
0 24 40 72 96 117
1 0 377,41 715,77 780,33 780,86 781,39
2 0 616,08 835,66 927,27 930,00 931,60
3 0 363,97 332,48 378,33 382,15 380,73
4 0 897,34 520,55 600,99 598,20 610,37
5 0 1390,78 850,00 865,07 941,21 895,00
6 0 473,78 465,47 519,68 539,33 540,64
7 0 317,37 165,33 196,21 202,17 204,68
8 0 452,11 450,84 508,92 504,45 512,88
9 0 335,44 308,89 347,10 353,64 354,46
10 0 291,30 297,17 330,99 331,64 332,39
11 0 248,70 264,26 317,62 319,53 320,51
12 0 249,63 301,18 319,23 323,50 323,39
133
Tabela 35 – Resultados da concentração de glicerol (g L-1) adicionada ao
meio de fermentação de acordo com o Delineamento Composto Rotacional
2².
Ensaio Tempo (h)
0 24 40 72 96 117
1 8,79 12,68 13,75 13,58 13,74 13,73
2 51,21 51,66 48,70 48,01 48,00 48,40
3 8,79 14,14 14,77 15,19 14,78 14,85
4 51,21 49,98 47,39 47,59 46,08 47,40
5 30,00 32,49 30,00 31,00 31,82 30,30
6 30,00 31,74 31,27 30,86 31,24 31,31
7 0,00 6,75 7,37 7,75 7,61 7,79
8 60,00 53,15 55,50 55,23 53,37 54,83
9 30,00 29,01 31,76 31,23 31,52 32,39
10 30,00 30,38 31,00 32,00 31,61 31,90
11 30,00 30,07 32,24 31,96 32,07 32,16
12 30,00 31,03 32,32 31,90 32,05 32,01
Tabela 36 – Resultados da porcentagem de etanol formado durante as 117 h
de fermentação.
Ensaio Tempo (h)
0 24 40 72 96 117
1 0 9,77 11,50 11,83 11,91 11,95
2 0 10,68 10,64 11,46 11,50 11,55
3 0 10,86 11,70 11,90 11,92 11,90
4 0 11,00 10,98 11,43 11,33 11,45
5 0 9,49 3,98 5,93 7,02 7,74
6 0 8,53 10,93 11,62 11,35 11,41
7 0 10,34 11,90 12,17 12,17 12,16
8 0 10,56 10,96 11,67 11,51 11,64
9 0 9,96 11,24 11,65 11,98 11,93
10 0 9,82 11,00 11,98 12,06 11,92
11 0 9,08 11,37 12,02 12,02 12,04
12 0 10,62 11,31 11,96 12,04 12,00
134
Tabela 37 – Resultados do consumo de glicose adicionado ao meio de
fermentação em g L-1.
Ensaio Tempo (h)
0 2 17 40 72
1 100,00 90,94 48,75 25,56 0,00
2 100,00 88,20 56,19 32,87 0,00
3 100,00 97,40 52,23 31,21 0,00
4 100,00 104,89 69,20 39,43 2,21
5 100,00 90,33 72,21 62,09 34,02
6 100,00 95,54 63,92 20,83 0,00
7 100,00 92,34 47,74 14,98 0,00
8 100,00 90,05 56,10 16,32 0,00
9 100,00 93,24 51,28 15,35 0,00
10 100,00 94,75 52,55 16,14 0,00
11 100,00 95,00 54,37 15,87 0,00
12 100,00 94,54 56,11 15,93 0,00
Tabela 38 – Resultados do consumo de frutose adicionado ao meio de
fermentação em g L-1.
Ensaio Tempo (h)
0 2 17 40 72
1 100,00 87,09 69,22 57,32 0
2 100,00 84,18 70,45 59,39 2,45
3 100,00 86,25 63,77 54,78 1,41
4 100,00 107,47 72,57 64,65 1,24
5 100,00 86,96 80,21 69,36 44,48
6 100,00 81,76 68,44 59,32 1,01
7 100,00 83,70 65,74 50,21 0,09
8 100,00 81,66 67,31 48,29 1,46
9 100,00 84,77 65,72 50,98 1,21
10 100,00 86,03 66,53 52,48 0
11 100,00 86,27 67,80 51,83 0,41
12 100,00 79,99 67,81 51,61 0
135
ANEXOS
A. RESULTADOS CONCENTRAÇÃO DE GLUTATIONA
Tabela 39 – Resultados de concentração de GSH (mg L-1) obtidos no DCCR