Organismi geneticamente modificati: i trangenici Modificazione genetica: introduzione stabile di un gene in un altro organismo Modificazione genetica di: Batteri Eucarioti unicellulari, come i lieviti Saccharomyces Linee cellulari, processo facile, ma finalizzato e limitato ad un determinato scopo Organismi pluricellulari (animali, piante) processo complesso. Introduzione del transgene clonato in: cellule somatiche per terapia genica cellule germinali per la produzione di piante ed animali transgenici cellule germinali consentendo la trasmissione alle generazioni successive: clonazione di piante ed animali Introduzione di un transgene (dalla stessa specie o specie diversa): colmate distanze evolutive (gene di pesce in una pianta di pomodoro, per la resistenza al freddo)
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Organismi geneticamente modificati: i trangenici
Modificazione genetica: introduzione stabile di un gene in un altro organismo
Modificazione genetica di:
Batteri
Eucarioti unicellulari, come i lieviti Saccharomyces
Linee cellulari, processo facile, ma finalizzato e limitato ad un determinato scopo
Organismi pluricellulari (animali, piante) processo complesso.
Introduzione del transgene clonato in:
cellule somatiche per terapia genica
cellule germinali per la produzione di piante ed animali transgenici
cellule germinali consentendo la trasmissione alle generazioni successive: clonazione di piante ed animali
Introduzione di un transgene (dalla stessa specie o specie diversa):
colmate distanze evolutive (gene di pesce in una pianta di pomodoro, per la resistenza al freddo)
Specie modello utilizzate per la produzione dei trangenici
Facile manipolazione
Estensione dei risultati a specie più complesse
• Muffe mucillaginose (dictyostelium discoideum), in abbondanza di nutrienti si
comporta come organismo unicellulare, ma in carenza di cibo diventa un
organismo multicellulare, strisciante e contenente un corpo fruttifero e uno
stelo
• Il nematode Caenorhabditis elegans, contiene esattamente 959 cellule, facile
da mantenere in laboratorio, molto utilizzato negli esperimenti di iRNA
• Drosophila elanogaster, moscerino della frutta, molti sistemi comuni all’uomo
(differenze: colonna vertebrale/esoscheletro)
• Danio renio (Zebrafish), facile da usare in laboratorio, geni dello sviluppo
embrionale e del sistema immunitario correlati ai processi osservati nell’uomo.
Modello di studio anche per il ciclo circadiano e per gli effetti di farmaci
• I topi: modello d’elezione, nonostante i costi e limiti etici
• A livello commerciale: piante, ma anche animali usati come «bioreattori» per il
pharming
Produzione di animali trangenici
Introduzione del costrutto transgenico nella linea germinale per la
trasmissione alla progenie che ne conterrà almeno una copia in tutte le sue cellule:
• Iniezione diretta in ovociti (micromanipolazione)
• Utilizzo di vettori retrovirali
• Colture di cellule staminali embrinali
SCOPO:
inattivare un gene specifico (knock out);
oppure introdurre un gene esogeno all’interno di una cellula (knock in).
Produzione di animali transgenici: iniezione diretta
Introduzione del costrutto transgenico:
• Stimolazione e preparazione della cellula uovo fecondata in cui introdurre il costrutto
• La microiniezione può causare danni e alcune cellule uovo non sopravvivono, altre sopravvivono ma non si sviluppano, inoltre sono una
parte conterrà il transgene, quindi sarà necessario analizzare il transgene
• La cellula verrà coltivata in vitro ed impiantata in una madre pseudogravida
• Una madre pseudogravida è ottenuta facendo accoppiare una femmina con un maschio vasectomizzato, per assicurare uno stato
ormonale ricettivo)
Produzione di animali trangenici: iniezione diretta
Analisi del transgene per valutare la presenza del gene esogeno:
Screening della progenie
Iniezione diretta: metodo più utilizzato, garantisce una risposta “tutto o nienete”, se è presente il transgene
esso sarà contenuto in tutte le cellule dell’animale e può essere applicabile ad una varietà di animali
Produzione di animali trangenici: iniezione diretta
efficienza
Produzione di animali trangenici: utilizzo di vettori virali
Vantaggi:• Tecnicamente più facile, riduce la perdita
di uova a causa della non sopravvivenza
all’iniezione
• Alta efficienza di trasduzione
• Massimo inserto 8 kb di DNA
• Ha bisogno di un virus helper per essere
infettivo
Applicazioni dell’iniezione diretta:
animali transgenici come “bioreattori”
Problematiche:
• Integrazione non mirata: gene integrato nel genoma in modo
casuale. Ciò potrebbe distruggere un altro gene o alterarne
l’espressione, se si integra in regioni regolative. A volte può essere
anche letale.
• Non tutte le regioni della cromatina saranno in grado di sostenere
la sua espressione.
• Numero di copie integrate sarà variabile da una a centinaia/cellula
• Espressione del gene dovrebbe essere ristretta a tessuti specifici
• Bassa efficienza in molte specie animali
• Possibile reinfezione, possibilità di generare nuovi virus patogeni
per ricombinazione
• Reazioni immunitarie
Gene targeting: ricombinazione omologa in embrionic stem (ES) cells
SCOPO
Inserzione mirata:
inattivare un gene specifico (knock out); oppure introdurre un gene esogeno all’interno di una cellula (knock in).
Preparazione del costrutto, introduzione in ES cells,
selezione positiva o negativa
Infezione a 8 cellule, non tutte le cellule potrebbero essere infettate, possibile mosaicismoIn tal caso saranno necessari reincroci
Gene targeting: ricombinazione omologa in embrionic stem (ES) cells
Alcune cellule isolate da animali adulti possono essere facilmente
manipolate ed mantenute in coltura per periodi limitati di tempo, ma particolari
condizioni possono essere mantenute in laboratorio per periodi di tempo
indefiniti dando origine a linee cellulari stabilizzate.
Trasfettare queste cellule è più facile dell’introduzione di materiale
genetico in una cellula fecondata. Tuttavia queste cellule non possono
essere usate per produrre un animale completo.
Mentre le cellule staminali possono essere indotte a differenziare in molti tipi
di cellule diverse a seconda del grado di differenziamento:
• Multipotenti possono differenziare in diversi tipi di cellule Pluripotenti
possono differenziare in molti tipi di cellule
• Totipotenti possono differenziare in tutti i tipi di cellule
Per la produzione di animali transgenici si utilizzano le cellule
pluripotenti, che possono originare tutti i tipi cellulari dell’embrione, ma
non gli extra-embrionali, chiamate cellule staminali embrionali (cellule
ES)
Le cellule ES sono isolate dalle cellule embrionali di una blastocisti, possono
essere coltivate in vitro per un periodo di tempo e trasfettate col
transgene. Nel costrutto è possibile inserire un marcatore per la selezione dei
ricombinanti in coltura, da impiantare poi in una nuova blastocisti in stadio
precoce di sviluppo e trasferite in una madre pseudogravida.
Gene targeting: ricombinazione omologa in embrionic stem (ES) cells
Gene targeting: ricombinazione omologa in embrionic stem (ES) cells
La progenie sarà chimerica, non conterrà il transgene in
tutte le cellule, e sarà eterozigote, in genere solo uno dei
cromosomi avrà inserito il transgene.
Sarà necessario effettuare degli incroci per poter isolare
un topo mutante eterozigote. E reincrociare gli eterozigoti
per ottenere l’omozigote mutato.
A questa strategia è applicabile il gene editing per
effettuare un’inserzione mirata: Molto usata per
produrre topi transgenici.
Vantaggi del gene editing in cellule ES:
• integrazione diretta verso specifiche sequenze geniche,
• selezione rapida delle cellule ES in coltura, con il
transgene in posizione specifica, prima di impiantarle
nell’embrione (eticamente più accettabile),
Svantaggi del gene editing in cellule ES:
• Possibile mortalità degli omozigoti durante lo sviluppo
• Migliorabile se l’espressione del transgene viene resa
tempo e tessuto specifica
Knock out: INATTIVAZIONE dell’espressione di un gene
• Il gene bersaglio è interrotto con l’introduzione del gene neo, che nei batteri da la
resistenza alla neomicina, ma nelle cellule animali si usa il G418 (antibiotico