Optické metody - cvut.cztpm.fsv.cvut.cz/vyuka/ychm/optickemetody.pdfmikroskop • druh optického mikroskopu, výhodou je vyšší rozlišovací schopnost daná detekcí světla pouze

OptickOptickéé metodymetody

•

Soubor fyzikálních metod

•

Společný mechanismus –

interakce hmoty a elektromagnetického záření

•

Dělení:•

Metody spektroskopické

–

adsorpce či emise záření

•

Metody nespektroskopické

–

změna vlastností

při průchodu světla

•

Objektivní

–

fotografiský

aparát, promítače, zvětšování

•

Subjektivní

–

brýle, lupa, mikroskop, dalekohled atd.

•

Rozdělení

optických metod

ElektromagnetickElektromagnetickéé zzáářřeneníí•

kombinace příčného postupného vlnění

magnetického a

elektrického pole tedy elektromagnetického pole•

Elektromagnetickým zářením se zabývá

obor fyziky nazvaný

elektrodynamika, což

je podobor elektromagnetismu

•

Infračerveným zářením, viditelným světlem a ultrafialovým zářením se zabývá

optika.

•

Na elektromagnetické

záření

se stejně

jako na cokoliv jiného dá

nahlížet jako na vlnu nebo proud částic (fotonů)

Část viditelného spektra

Druhy elektromagnetickDruhy elektromagnetickéého zho záářřenenííElektromagnetické

záření

se rozděluje podle vlnových délek:

•

Rádiové

vlny

o Dlouhé

vlny

o Střední

vlny

o Krátké

vlny

o Velmi krátké

vlny

o Ultra krátké

vlny

o Centimetrové

vlny a kratší, také

nazývané

mikrovlnné

záření

•

Infračervené

záření

•

Viditelné

světlo

•

Ultrafialové

záření

•

Rentgenové

záření

•

Gama záření

Příklady spekter:a) spojité

spektrumb) čárové

(emisní) spektrumc) pásové

spektrumd) absorpční

čárové

spektrum

Barva Vlnová

délka Frekvence

červená

~ 625 až

740 nm

~ 480 až

405 THz

oranžová

~ 590 až

625 nm

~ 510 až

480 THz

žlutá

~ 565 až

590 nm

~ 530 až

510 THz

zelená

~ 520 až

565 nm

~ 580 až

530 THz

azurová

~ 500 až

520 nm

~ 600 až

580 THz

modrá

~ 430 až

500 nm

~ 700 až

600 THz

fialová

~ 380 až

430 nm

~ 790 až

700 THz

Lupa Lupa •

optický systém používaný na optické

zvětšení

pozorovaného předmětu, který je dostatečně

malý a nachází

se v blízkosti pozorovatele.

•

Skládá

se ze spojné

čočky, vyrobené

typicky ze skla nebo průhledného plastu a držátka, které

může mít mnoho různých podob, od prosté

tyčky, za kterou lze lupu držet, přes různé

stojany, až

po pouzdra, do kterých lze lupu zároveň

uschovat.

•

Princip:

a) Pozorování

předmětu bez lupy, kde α

označuje zorný úhel.b) Pozorování

stejného předmětu s lupou. Zorný úhel α´ je větší

než

úhel α

při pozorování

bez lupy.

Dalekohled Dalekohled •

přístroj sloužící

k optickému přiblížení

pomocí

soustavy čoček nebo i zrcadel.

•

Dělí

se na reflektory, jejichž

objektiv je tvořen zrcadlem a refraktory, jejichž

objektiv je tvořen jednou čočkou, nebo jejich soustavou.

•

První

dalekohled si 2. října 1608 nechal patentovat holandský optik Hans Lippershey. Jeho poznatky použil již

o rok později známý italský vědec Galileo Galilei

a pomocí

zdokonaleného dalekohledu za použití

spojky a rozptylky učinil plno převratných objevů, jako jsou Jupiterovy měsíce nebo skvrny na Slunci. Bohužel při pozorování

Slunce si nechránil zrak a později oslepl.

•

Dále přispěl ke zdokonalení

dalekohledu Johannes

Kepler

který vytvořil první

dalekohled pomocí

dvou spojek. Získal tak sice převrácený, ale ostřejší

obraz.

•

Také

Isaac

Newton

přispěl ke zdokonalení

dalekohledu, když

při konstrukci použil zrcadlo a zbavil se tak běžné

vady dalekohledů

a to barevného rozkladu světla.

•

Moderní

triedr používá

soustavu čoček a hranolů.

•

Největším dalekohledem na světě

je v současné

době

jihoafrický SALT.

Optický mikroskopOptický mikroskop•

česky též

drobnohled

•

optický přístroj pro zobrazení

malého sledovaného objektu ve větším zvětšení

•

Pod označením mikroskop je obvykle myšlen optický mikroskop

•

pro zobrazení

využívá

světelných paprsků

Historie Historie •

Podle některých zdrojů

první

drobnohled sestavil v roce 1590 v

Holandsku Zacharias

Jansen.

•

V roce 1610 se na základě

Jansenovy

konstrukce mikroskopií

zabýval Galileo Galilei.

•

Jeden z jednoduchých mikroskopů

sestavil v roce 1676 holandský

obchodník a vědec Anton van Leeuwenhoek, jehož

práce patřily

k vrcholům mikroskopického pozorování

17. století.

•

Významné

bylo dílo Roberta Hooka

Micrographia, v němž

popsal

v roce 1665 konstrukci mikroskopu s odděleným objektivem, okulárem a osvětlovacím zařízením.

•

Jako první

zahájila výrobu mikroskopů

firma Carl

Zeiss

v roce

1847.

Popis mikroskopuPopis mikroskopu•

Čočky -

tvoří

objektiv a okulár (často výměnné)

•

Jednoduchý mikroskop složen ze dvou spojných soustav čoček, které

mají

společnou optickou osu:

•

Objektiv

-

malá

ohnisková

vzdálenost (řádově

v milimetrech)

–

Pozorovaný předmět se umisťuje blízko před předmětové

ohnisko, takže vzniká

skutečný, zvětšený a převrácený obraz.

•

Tento obraz vzniká

mezi druhou částí

mikroskopu, tzv. okulárem, a jeho předmětovým ohniskem.

–

Vzniklý obraz pak pozorujeme okulárem podobně

jako lupou, čímž

získáváme další

zvětšení.

–

Ohnisková

vzdálenost okuláru se pohybuje v řádech centimetrů. Obrazové

ohnisko objektivu a předmětové

ohnisko okuláru nesplývají, ale jsou od sebe vzdáleny o hodnotu optického intervalu, jehož

hodnota se u mikroskopu pohybuje mezi 15 cm a 20 cm.

Grafická

konstrukce optického zobrazení

mikroskopem.

Pro úhlové

zvětšení

mikroskopu platí

vztah

kde γ

a γ0

označuje zvětšení

objektivu a okuláru, f je obrazová

ohnisková

vzdálenost objektivu, f0 je předmětová

ohnisková

vzdálenost okuláru, Δ

je optický interval mikroskopu a d je konvenční

zraková

vzdálenost.Optickým mikroskopem se běžně

dosahuje zvětšení

50×

až

1000×. Maximální

teoretické

zvětšení

je asi 2000×

a to již

naráží

na fyzikální

bariéry kvůli omezení

délky světelných vln.

ElektronovElektronováá mikroskopiemikroskopie•

Elektronový mikroskop -

obdobou optického mikroskopu, kde jsou

fotony nahrazeny elektrony a optické

čočky elektromagnetickými

čočkami, což

je vlastně

vhodně

tvarované

magnetické

pole.

•

Využívá

se toho, že vlnové

délky urychlených elektronů

jsou o

mnoho řádů

menší

než

fotonů

viditelného světla. Proto má

elektronový mikroskop mnohem vyšší

rozlišovací

schopnost a

může tak dosáhnout mnohem vyššího zvětšení

(až

1 000 000×).

•

Jeho vynálezce Ernst Ruska

obdržel za svůj objev Nobelovu

cenu.

•

Preparáty -

ultratenké

řezy (30-60 nm), výbrusy

Typy Typy

•

transmisní

elektronový mikroskop

(TEM) - nepohyblivý elektronový svazek, detekce

elektronů

prošlých vzorkem (TE) na fluorescenčním stínítku nebo detektorem.

•

rastrovací

elektronový mikroskop

(SEM) - pohyblivý svazek, zobrazení

povrchu vzorku

pomocí

sekundárních elektronů

(SE), odražených elektronů

(BE), případně

signálu z jiných

detektorů.

Detektory SEMDetektory SEM•

SE detektor

-

detektor sekundárních elektronů

•

BSE detektor

-

detektor odražených elektronů

•

TE detektor

-

detektor prošlých elektronů

•

EDX / WDX mikroanalýza-

detekce RTG záření, rentgenová

spektroskopie

•

EBSD

-

difrakce odražených elektronů (kanálovací

efekt)

KonfokKonfokáálnlníí mikroskopmikroskop•

druh optického mikroskopu, výhodou je vyšší

rozlišovací

schopnost daná

detekcí

světla pouze z ohniskové

roviny mikroskopu, tzv. konfokál.

•

Známy jsou tyto typy mikroskopu:

–

rastrující

konfokální

mikroskop

- skenující zařízení

zařizuje posun ohniska excitujícího laserového paprsku

–

konfokální

mikroskop s rotujícím diskem

-

místo skenujícího zařízení

obsahuje rotující

Nipkowovův kotouč, na kterém je mnoho navzájem oddělených clonek

•

Princip rastrovacího konfokálního mikroskopu:

•

Laserový paprsek (intenzivní

bodový zdroj světla) je fokusován na clonku, dále prochází

objektivem až

na vzorek, kde je obraz clonky fokusován do bodu, jehož

průměr odpovídá

difrakční

mezi (rozlišovací

mez).

•

Přes stejný objektiv jde zpětně

i světlo na vzorku odražené

či rozptýlené, případně

fluorescence. Sekundární

světlo putující

zpět prochází

opět clonkou, jejichž

bodový obraz je s pomocí

děliče paprsků

lokalizován před fotonásobič, kde.je umístěna druhá

konfokální

bodová

clonka, která

filtruje světlo pocházející

z oblasti mimo ohniskovou rovinu mikroskopu.

•

Obraz celé

zaostřené

roviny lze pak získat rastrováním bod po bodu některým z těchto postupů:

–

rozmítání

laserového paprsku

–

příčný posuv vzorku před objektivem

–

posuv objektivu nad vzorkem.

•

Rozlišovací

schopnost:

–

Při použití

objektivu o NA (numerická

apertura) cca 1,3 a s využitím modrozelené

čáry Ar laseru (λ

= 488 nm) by odpovídala tloušťka optických řezů

asi 0,4 mikrometru.

–

Dále při maximálním průměru konfokální

clonky odpovídajícímu 1/4 průměru centrálního maxima Airyho

kroužku, lze tvrdit, že rozlišovací

schopnost konfokálního mikroskopu je přibližně

1,4x lepší

než

klasického mikroskopu o téže NA objektivu.

PolarizaPolarizaččnníí mikroskopmikroskop•

řídí

se Biotovými

zákony:–

Velikost stočení

polarizační

roviny je úměrná

vzdálenosti, kterou světlo v látce urazilo.–

Velikost pravotočivého a levotočivého stočení

stejné

látky se odlišuje pouze znaménkem.–

Velikost stočení

způsobené

několika vrstvami látky se algebraicky sčítá.–

Velikost stočení

klesá

s rostoucí

vlnovou délkou světla úměrně

druhé

mocnině.

•

V dnešní

době

má

uplatnění

především v mineralogii, biologické

aplikace po zavedení

elektronové

mikroskopie ztratily na významu.

•

Vedle ultramikroskopu

bylo použití

polarizačního mikroskopu základem tzv. submikroskopické

morfologie protoplasmy.

•

Použití:

•

V biologii se používá

v případech, kdy je potřeba vyloučit chyby vzniklé

dvojlomem, při některých cytofotometrických

experimentech či v patologii.

•

Ve forenzní

chemii se polarizační

mikroskop používá

k podrobnějšímu zkoumání, především vláken a vlasů.

Mikroskopie atomMikroskopie atomáárnrníích silch sil•

(AFM z anglického atomic

force

microscopy) -

mikroskopická

technika, která

se používá

k trojrozměrnému zobrazování

povrchů.

•

Prvně

ji realizovali v roce 1986 a Binnig, Quate

Gerber.

•

Obraz povrchu se zde sestavuje postupně, bod po bodu.

•

Metoda dosahuje velmi vysokého rozlišení

–

může zobrazovat i atomy.

•

Techniku AFM lze použít nejen k zobrazování, ale také

k tvorbě

struktur či zpracování

povrchů

v nanometrové

oblasti.

•

V principu je AFM podobná

metoda jako tunelová

mikroskopie.

•

K detekci však neslouží

elektrický proud, ale vzájemná

meziatomová

přitažlivost. Detekuje se pohyb zkoumacího hrotu při průchodu nad vzorkem. Umí

zobrazovat i nevodivé

vzorky.

•

Nazývá

se někdy také

SFM (scanning

force

microscopy).

Popis metodyPopis metody•

Základem AFM je velmi ostrý hrot, který je upevněn na ohebném nosníku (angl. cantilever, tento termín se používá

i v čestině). Hrot je mírně

vtlačován do vzorku a následkem působících sil je nosník ohnutý, v souladu s Hookovým

zákonem. Během měření

se hrot pohybuje po povrchu vzorku v pravidelném rastru (skenuje) tak, že výška druhého konce nosníku je konstantní. Je-li povrch vzorku nerovný, má

nosník v různých místech vzorku různou velikost ohnutí

a sledováním závislosti ohnutí

na poloze na vzorku můžeme sestavit zvětšený obraz vzorku.

•

Předchozí

způsob měření

však vede k poškození

hrotu, pokud by nerovnost vzorku byla příliš

velká. Proto se častěji používá

režim využívající

zpětné

vazby, tzv. režim s konstantním ohnutím, ve kterém se v každém bodě

rastru porovná

současná

hodnota ohnutí

s přednastavenou hodnotou, a pokud se liší, nosník s hrotem se přiblíží

nebo oddálí

od vzorku o takovou vzdálenost z, aby se hodnota ohnutí

opět shodovala s přednastavenou hodnotou. Místo velikosti ohnutí

se pak k sestavení

obrazu použijí

hodnoty z. Konstantní

hodnota ohnutí

zároveň

znamená, že na vzorek působí

konstantní

síla. Uvedený režim může zobrazovat i drsnější

vzorky, ale je pomalejší

(sběr obrázku trvá

delší

dobu).

•

Oba uvedené

režimy, tzv. kontaktní, však mohou vést k poškození

vzorku, protože během přesunu z jednoho bodu do druhého působí

mezi hrotem a vzorkem velké

třecí

síly. Proto se používají

tzv. bezkontaktní

režimy, v nichž

není

mezi hrotem a vzorkem přímý mechanický kontakt. Hrot a vzorek na sebe působí

především skrze van der Waalsovu

sílu. Protože tato síla je velmi malá, provozuje se bezkontaktní

režim tak, že je nosník rozkmitáván a místo jeho ohnutí

se měří

velikost amplitudy. Protože velikost amplitudy závisí

na vzdálenosti mezi hrotem a vzorkem, lze sledováním změn amplitudy sestavit obraz povrchu vzorku.

PPřřesnostesnost•

podmíněna přesností

udržování

polohy hrotu, přesností

jeho pohybu a schopností

detekce ohnutí.

•

Pro pohybování

hrotem se používají

výhradně

piezoelektrické

skenery, které

jsou schopny realizovat pohyby menší

než

desetina nanometru.

•

Aby bylo možno udržet přesnou polohu hrotu, staví

se mikroskopy AFM mechanicky velmi pevné

a bývají

umístěny na antivibračních

stolech.

•

Detekce ohnutí

nosníku se provádí

nejčastěji pomocí

laseru. Laserový svazek z laserové

diody se nechá

dopadat na nosník, od něho se odráží

podle zákona odrazu a dopadá

na fotodetektor.

•

Změní-li se ohnutí

nosníku, změní

se i úhel dopadu svazku na nosník a proto svazek dopadne do jiného místa fotodetektoru. Bude-li fotodetektor

citlivý na místo dopadu svazku, může se z jeho výstupu určit ohnutí

nosníku.

Vlastnosti Vlastnosti •

AFM může zobrazovat pouze povrch vzorků, nikoliv jejich objemovou strukturu (vzorek vyžaduje fixaci, nemůže například plavat v roztoku).

•

Ve srovnání

s optickou mikroskopií

však dosahuje značně

většího rozlišení, které

je srovnatelné

s rozlišením elektronové

mikroskopie.

•

AFM však poskytuje trojrozměrný obraz, kdežto elektronová

mikroskopie dvojrozměrnou projekci.

•

AFM zpravidla nevyžaduje, aby se vzorek speciálně

připravoval

(např. pokovením) ani nevyžaduje vysoké

vakuum.

•

AFM může dokonce pracovat v kapalném prostředí, což

je výhodné

především pro studium biologických vzorků, které

mohou být při zobrazování

ve svém fyziologickém prostředí

a lze v některých případech sledovat jejich funkci nebo reakci na změnu prostředí

(změna pH, teploty, chemického složení).

•

Nevýhodou

AFM je velmi omezený rozsah velikosti obrázku a pomalost snímání. Maximální

velikost obrazu bývá

řádově

stovky mikrometrů

a sestavení

jednoho obrazu trvá

řádově

minuty.

•

Dále je v AFM omezen i vertikální

rozsah

(maximální

výška vzorku), který bývá

typicky desítky mikrometrů. Problémy způsobuje také

blízkost hrotu a vzorku (silná

interakce, možnost zachycení

hrotu, znečištění

hrotu, poškození

vzorku) a nenulová

šířka hrotu, která

vede k deformaci obrazu.

Refraktometr Refraktometr •

Slouží

k měření

indexu lomu

•

Pomocí

lomu světla•

Pomocí

interference světla

Index lomuIndex lomu•

bezrozměrná

fyzikální

veličina popisující

šíření

světla a všeobecně

elektromagnetického záření

v látkách

•

V nejjednodušším případě

– pro průhledné

a čiré

látky –

lze index lomu n považovat za konstantu, vztahující

se k celému rozsahu viditelného světla.

•

V tom případě

je index lomu vždy větší

než

1 a rychlost šíření

světla v dané

látce v je určena vztahem

•

kde c je rychlost světla ve vakuu. Takto definovaný index lomu se označuje jako absolutní

index lomu.

•

Pro přechod mezi z prostředí

s indexem lomu n1 do prostředí

s indexem lomu n2 se často používá

relativní

index lomu n21, který je definován jako:

•

Pro přechod vlnění

opačným směrem je index lomu

•

Pomocí

absolutního indexu lomu lze psát

•

kde v1 je rychlost šíření

vln v prvním prostředí

(s indexem lomu n1) a v2 je rychlost šíření

ve druhém prostředí

(s indexem lomu n2).

•

Na rovinném rozhraní

dvou látek s různými indexy lomu dochází

k lomu světla dle Snellova

zákona.

AbsolutnAbsolutníí

index lomu nindex lomu něěkterých lkterých láátektek

Látka

index lomuvakuum 1vzduch (normální

tlak) 1,0003

led 1,31voda 1,33etanol 1,36sklo 1,5 až

1,9

sůl 1,52safír 1,77diamant 2,42

Interference svInterference svěětlatla•

vzájemné

ovlivňování, prolínání

nebo střetání

jevů či

hmoty.

•

Nejčastěji se jedná

o charakteristickou vlastnost vln.

•

Při jejich pohybu a prolínání

se v určitém bodě

vzájemně zesilují, zatímco v jiných bodech vzájemně

ruší.

•

Tyto jevy se zobrazují

pomocí

interferenčního obrazu (interferenčního obrazce), kde je vidět střídající

se projevy

zesilování

a zeslabování.

Příklad interference rovinných vln. Příklad kruhových vln.

SpektrSpektráálnlníí ppřříístrojestroje•

umožňují

oddělení

světla o určité

vlnové

délce

(tedy určité

barvy světla) a následné

zkoumání

vlastností

světla i jeho zdroje.

•

Při zkoumání

se využívá

lomu, ohybu nebo interference světla.

•

Spektrální

přístroje, které

jsou vybaveny dalekohledem, a umožňují

subjektivní

pozorování, se nazývají

spektrometry.

•

Přístroje se záznamovým zařízením jsou označovány jako spektrografy.

•

Ke spektrální

analýze slouží

také

různé

druhy optických hranolů, či spektroskopů, jejichž

konstrukce je podobná

spektrometrům.

Totální

reflexe na hranolu.

InterferenInterferenččnníí ppřříístrojestroje•

Interferometry využívají

interference světla, a to především k velmi přesnému měření

vzdáleností.

•

Přesné

interferometry

využívají

zdrojů

koherentního

záření, tzv. laseru.

•

Interferometry však slouží

také

např. ke zjišťování

koncentrace metanu v dolech apod.

Konstrukce Laseru:1. Aktivní

prostředí2. Zdroj záření3. Odrazné

zrcadlo4. Polopropustné

zrcadlo5. Laserový paprsek

FotometrickFotometrickéé ppřříístrojestroje•

Fotometrické

přístroje slouží

ke zjišťování

fotometrických veličin

(svítivost zdroje, světelný tok, světelnou energii nebo osvětlení), především intenzity světla.

•

Podle hodnot intenzity dopadajícího, odraženého či prošlého světla lze určit některé

vlastnosti

zkoumané

látky.