Open Archive TOULOUSE Archive Ouverte (OATAO)oatao.univ-toulouse.fr/15881/1/Quignon_15881.pdf · 3 REMERCIEMENTS A Monsieur le Professeur Hugues CHAP, Professeur des Universités-Praticien

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To cite this version : Quignon, Lucie. tude prospective secondaire visant prciser linfluence de la temprature de conservation des urines sur le profil lectrophortique des protines urinaires sur gel dagarose chez le chien protinurique. Thse d'exercice, Mdecine vtrinaire, Ecole Nationale Vtrinaire de Toulouse - ENVT, 2015, 100 p.

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REMERCIEMENTS

A Monsieur le Professeur Hugues CHAP,

Professeur des Universits-Praticien Hospitalier de lUniversit Paul Sabatier de Toulouse

Biochimie et Biologie Molculaire

Qui nous a fait lhonneur daccepter la prsidence du jury de thse. Hommages respectueux

***

A Madame le Docteur Rachel LAVOUE,

Maitre de Confrences lEcole Nationale Vtrinaire de Toulouse Mdecine Interne Qui a accept dencadrer ce projet et pour mavoir guid dans la ralisation de cette thse.

Quelle trouve ici toute lexpression de ma reconnaissance

***

A Madame le Professeur Catherine TRUMEL,

Professeur lEcole Nationale Vtrinaire de Toulouse Pathologie Mdicale des Equids et Carnivores

Pour avoir accept de prendre part ce jury de thse. Sincres remerciements

***

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TABLE DES MATIERES REMERCIEMENTS .................................................................................................................................... 1

TABLE DES MATIERES .............................................................................................................................. 5

TABLE DES ILLUSTRATIONS ..................................................................................................................... 9

LISTE DES ABREVIATIONS ...................................................................................................................... 11

INTRODUCTION ..................................................................................................................................... 13

PARTIE I : ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE .................................................................................................... 15

I. Le rein et lexcrtion des protines ........................................................................................... 17

A. Anatomie descriptive rnale ................................................................................................. 17

1. Macrostructure ................................................................................................................. 17

a. Capsule fibreuse ............................................................................................................ 17

b. Sinus rnal ..................................................................................................................... 17

c. Parenchyme rnal ......................................................................................................... 17

2. Microstructure .................................................................................................................. 19

a. Le nphron .................................................................................................................... 19

b. Les tubes collecteurs ..................................................................................................... 21

B. Gestion rnale des protines ................................................................................................ 22

1. Filtration glomrulaire ...................................................................................................... 22

a. Structure de la membrane filtrante .............................................................................. 22

b. Filtration glomrulaire selon la taille des molcules plasmatiques .............................. 23

c. Filtration glomrulaire selon la charge ionique des molcules plasmatiques .............. 24

2. Gestion tubulaire ............................................................................................................... 25

a. Rabsorption tubulaire ................................................................................................. 25

b. Scrtion tubulaire ........................................................................................................ 25

3. Composition physiologique des urines ............................................................................. 25

II. Protinurie ................................................................................................................................ 27

A. Dfinition ............................................................................................................................... 27

B. Etiophysiopathologie ............................................................................................................ 27

1. Physiopathologie ............................................................................................................... 27

2. Etiologies des protinuries pathologiques du chien ......................................................... 28

a. Protinuries pr-rnales ................................................................................................ 28

b. Protinuries rnales ...................................................................................................... 28

c. Protinuries post-rnales .............................................................................................. 31

6

C. Intrts de la caractrisation de la protinurie rnale persistante ....................................... 32

D. Mthodes de dtection dune protinurie pathologique ..................................................... 32

III. Electrophorse unidimensionnelle des protines urinaires .................................................. 35

A. Intrts de la qualification dune protinurie pathologique par lectrophorse

unidimensionnelle des protines urinaires ................................................................................... 35

1. Intrt pratique ................................................................................................................. 35

2. Intrt diagnostique .......................................................................................................... 35

3. Intrt thrapeutique ....................................................................................................... 36

B. Dfinition et technique de mesure ....................................................................................... 36

1. Dfinition ........................................................................................................................... 36

2. Techniques de mesure ...................................................................................................... 37

a. Bases physico-chimiques ............................................................................................... 37

b. Protocole gnral .......................................................................................................... 38

c. Mthode ........................................................................................................................ 38

C. Interprtation des profils lectrophortiques unidimensionnels ......................................... 39

1. Principe de linterprtation ............................................................................................... 39

2. Facteurs de variation pr-analytiques ............................................................................... 41

a. Lis la technique ......................................................................................................... 41

b. Lis lanimal ................................................................................................................ 43

3. Facteurs de variation analytiques ..................................................................................... 45

PARTIE II : ETUDE EXPERIMENTALE ....................................................................................................... 48

I. Contexte .................................................................................................................................... 49

II. Etude prliminaire observationnelle ......................................................................................... 51

A. Objectifs ................................................................................................................................ 51

B. Matriel et mthode ............................................................................................................. 51

1. Spcimens urinaires .......................................................................................................... 51

a. Critres dinclusion ........................................................................................................ 51

b. Critres dexclusion ....................................................................................................... 52

2. Etapes pr-analytiques ...................................................................................................... 52

a. Prlvements urinaires ................................................................................................. 52

b. Etapes prliminaires ...................................................................................................... 53

c. Conservation des urines ................................................................................................ 53

d. Prparation des urines .................................................................................................. 54

e. Examen cytologique du sdiment ................................................................................. 55

7

3. Etapes analytiques immdiates ........................................................................................ 57

a. RPCU initial .................................................................................................................... 57

b. SDS-AGE initiale ............................................................................................................. 57

4. Etude analytique ............................................................................................................... 58

a. Dconglation et homognisation des spcimens ...................................................... 58

b. Ralisation des RPCU et des SDS-AGE ........................................................................... 58

C. Rsultats ................................................................................................................................ 59

1. Animaux slectionns ....................................................................................................... 59

2. Influence de la dure de stockage -20C ........................................................................ 59

3. Influence de la nature du tube .......................................................................................... 60

D. Conclusions prliminaires ..................................................................................................... 60

III. Etude principale .................................................................................................................... 61

A. Objectifs ................................................................................................................................ 61

B. Matriel et Mthode ............................................................................................................. 61

1. Spcimens urinaires .......................................................................................................... 61

2. Etapes pr-analytiques ...................................................................................................... 61

a. Prparation des spcimens ........................................................................................... 62

b. Stockage des urines entre collecte et analyses ultrieures .......................................... 62

3. Influence de la dure de conservation des urines la temprature de -20C .................. 62

a. Dconglation et homognisation des spcimens ...................................................... 62

b. Ralisation des RPCU et des SDS-AGE ........................................................................... 63

4. Etude statistique ............................................................................................................... 63

C. Rsultats de ltude principale .............................................................................................. 64

1. Animaux slectionns ....................................................................................................... 64

2. Profils lectrophortique J0 ........................................................................................... 64

3. Modification des profils aprs conservation -20 C ........................................................ 64

4. Effet des diffrentes variables sur lapparition de modification de profil ......................... 66

a. Effets des paramtres dmographiques sur la prsence dune modification du profil 66

b. Effets des facteurs de lanalyse urinaire sur la prsence dune modification du profil 67

c. Effet du type de profil sur lapparition de la modification ............................................ 68

IV. Discussion et limites .............................................................................................................. 71

A. Analyse des rsultats ............................................................................................................. 71

B. Limites ................................................................................................................................... 72

CONCLUSION ......................................................................................................................................... 75

8

ANNEXES ............................................................................................................................................... 76

BIBLIOGRAPHIE ..................................................................................................................................... 99

9

TABLE DES ILLUSTRATIONS

TABLE DES FIGURES

Figure 1 : dessin schmatique de l'organisation anatomique rnale [A. PITMANN (2015).

Nphropathie familiale. European familial nephropathy fund. ] .......................................................... 18

Figure 2 : dessin schmatique de la structure du corpuscule rnal [31] .............................................. 20

Figure 3 : dessin schmatique de la microstructure rnale [A. PITMANN (2015). Nphropathie

familiale. European familial nephropathy fund.] .................................................................................. 21

Figure 4 : dessin schmatique de la structure de la membrane filtrante [18] ...................................... 22

Figure 5 : dessin schmatique de la structure de la membrane filtrante mettant en vidence ses

diffrentes proprits de filtration [18] ................................................................................................ 24

Figure 6 : schma de la dnaturation des protines par le SDS [N.OSWALD (2008). How SDS-PAGE

works. Protein analysis, detection and assay.] ..................................................................................... 38

Figure 7 : SDS-AGE du spcimen PROCON 20 de l'tude prsentant l'interprtation possible dun

profil lectrophortique ........................................................................................................................ 40

Figure 8 : gel lectrophortique de PROCON 13 J5 mettant en vidence la bande spermatique ........ 44

Figure 9 : Rsultats de ltude THERON et collaborateurs [39] ......................................................... 49

Figure 10 : Modifications du profil lectrophortique du spcimen PROCON 6 en fonction de la dure

de conservation -20C ........................................................................................................................ 65

Figure 11 : rpartition de la protinurie en fonction de la prsence ou de l'absence de modification du

profil J15. ........................................................................................................................................... 68

Figure 12 : nombre de chien prsentant ou non une modification du profil en fonction du type de profil

aprs 15 jours de conservation des urines -20C ............................................................................... 69

Figure 13 : comparaison de l'intensit d'une coloration entre deux profils d'un mme animal ............ 73

TABLE DES TABLEAUX

Tableau 1 : analyse cytologique du sdiment urinaire ......................................................................... 56

Tableau 2 : planning prvisionnel de l'tude prliminaire ................................................................... 59

Tableau 3 : planning prvisionnel de l'tude principale ....................................................................... 63

Tableau 4 : p-value des modles des tudes de leffet de lge et du sexe sur la modification du profil

lectrophortique aprs 1,2 ou 5 jours de conservation des urines -20C ......................................... 66

Tableau 5 : p-values des diffrents paramtres analytiques pour l'effet sur la prsence d'une

modification du profil lectrophortique aprs diffrents dlais de conservation des urines -20C . 67

Tableau 6 : p-value des modles des tudes de leffet du type de profil sur la modification du profil

lectrophortique aprs 1,2, 5 ou 15 jours de conservation des urines -20C ................................... 69

10

11

LISTE DES ABREVIATIONS

SDS-PAGE: Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis

SDS-AGE: Sodium dodecyl sulfate agarose gel electrophoresis

IRIS: International renal interest society

GFR: Glomerular filtration rate

Alb: Albumine

GBM: Glomerular basement membrane

ESL: Endothelial cell surface layer

Qi: Plasma flow rate

A: Angstrom

HMM: High molecular mass

LMM: Low molecular mass

ACVIM: American college of veterinary internal medicine

RBP: Retinol binding protein

RPCU: Rapport protine sur cratinine urinaires

pH: potentiel hydrogne

pHi: potentiel hydrogne isolectrique

SDS: Sodium dodecyl sulfate

Da: Dalton

EUG: European Urinalysis Guidelines

TA: Temprature ambiante

DU : densit urinaire

ENVT: Ecole nationale vtrinaire de Toulouse

CLSI: Clinical and laboratory standards institute

RCF: Relative centrifugal force

MRC : maladie rnale chronique

12

IRA : insuffisance rnale aigue

G : profil lectrophortique glomrulaire

T : profil lectrophortique tubulaire

M : profil lectrophortique mixte

P : profil lectrophortique physiologique

13

INTRODUCTION

Lanalyse qualitative des protines urinaires est une tape essentielle en nphrologie, car elle

permet une dtection prcoce des nphropathies tant chez lhomme que chez lanimal [21,

28, 36]. Par ailleurs, la dtermination de la nature des protines urinaires par migration

lectrophortique sur gel polyacrylamide sodium sulfate dodecyl (SDS-PAGE) ou sur gel

dagarose sodium sulfate dodcyl (SDS-AGE) chez le chien aiderait prciser la structure

rnale lse [5, 37, 42] avec une bonne sensibilit. La migration SDS-AGE est prfre la

SDS-PAGE du fait dune capacit suprieure sparer les protines de haute masse

molculaire et dune moindre toxicit [42]. La technique SDS-AGE a t pralablement

valide chez le chien [42] et ses proprits analytiques (sensibilit et spcificit pour identifier

des chiens protinuriques selon la classification IRIS (International Renal Interest Society))

[19] ont galement t rcemment dcrites [14].

Une tude rcemment dirige par les units de Biologie Mdicale Animale et Compare et de

Mdecine Interne de lEcole Nationale Vtrinaire de Toulouse a mis en vidence des

modifications des profils lectrophortiques des protines urinaires (SDS-AGE) de chiens,

mme de perturber linterprtation de cet examen, lorsquil tait ralis sur des urines

conserves -20C [39]. Ces modifications ont t constates ds la premire ralisation des

lectrophorses sur urines congeles -20C, cest--dire aprs 15 jours de conservation. Ces

rsultats peuvent avoir des consquences importantes sur les schmas exprimentaux de toute

tude prospective qui utiliserait la mthode SDS-AGE pour caractriser les protines urinaires

du chien et pourrait remettre en question la validit des rsultats de certaines tudes

rtrospectives. Il est donc important de pouvoir vrifier si ces dernires sont objectivables

lorsque la dure de conservation -20C est infrieure 15 jours et dexplorer certaines

hypothses concernant lorigine de ces modifications.

14

15

PARTIE I : ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE

16

17

I. Le rein et lexcrtion des protines

A. Anatomie descriptive rnale

Les reins sont des organes pairs situs dans la partie rtropritonale de labdomen. Ils sont

appliqus contre la paroi dorsale de la cavit abdominale, en rgion lombaire crniale [10].

1. Macrostructure

Le rein est constitu dune capsule fibreuse, dun sinus, dun tissu parenchymateux, dun

rseau vasculaire et dun pdicule rnal.

a. Capsule fibreuse

La capsule fibreuse, mince et blanchtre, entoure compltement le rein et pntre par le hile

pour staler dans le sinus rnal. Elle est facilement dtachable du parenchyme sous-jacent

chez un chien sain [2, 25].

b. Sinus rnal

Le sinus rnal est une cavit profonde et allonge dans le grand axe rnal. Il comprend le

bassinet ou cavit pylique et les principaux vaisseaux et nerfs de lorgane. De multiples

orifices permettent lurine dtre dverse dans le bassinet [2, 25].

c. Parenchyme rnal

Le parenchyme rnal prsente deux zones de structures diffrentes bien visibles en coupe

sagittale, savoir : le cortex priphrique brun fonc occupant un tiers de la hauteur et la

mdulla rnale blanc rose.

18

Figure 1 : dessin schmatique de l'organisation anatomique rnale [A. PITMANN (2015). Nphropathie familiale. European familial nephropathy fund. ]

Le cortex contient de multiples structures coniques dont la pointe soriente vers la surface de

lorgane, les rayons mdullaires ou parties radies. Chacune de ces structures est entoure

dune substance corticale, riche en corpuscules rnaux et tubes contourns, le labyrinthe

cortical ou partie contourne. La zone dans laquelle se dveloppent ces structures constitue le

cortex profond. Cette disposition disparat prs de la capsule, au niveau du cortex superficiel.

La mdulla est scinde en une rgion externe, voisine du cortex, et une rgion interne. Le

parenchyme cortical sengage dans la mdulla et forme des traves jusquau sinus rnal. Ces

colonnes isolent des massifs de mdulla appel pyramides rnales (pyramides de Malpighi)

qui constituent la mdulla externe. Les sommets des pyramides forment un relief arrondi dans

le sinus rnal, les papilles rnales. Elles forment la mdulla interne et sont coiffes par un

diverticule du bassinet appel calice rnal [31]. Les bases des pyramides de Malpighi

marquent la limite cortico-mdullaire. Lassociation dune pyramide rnale et du tissu cortical

correspondant forme le lobe rnal [2].

19

Chez les carnivores domestiques, les lobes rnaux sont entirement confondus. Les colonnes

rnales nexistent plus ou sont trs fines. Les pyramides sont fusionnes en une couche

mdullaire continue.

2. Microstructure

a. Le nphron

i. Corpuscule rnal

La partie initiale du nphron est constitue par le corpuscule rnal (Figure 2). Ce corpuscule

est une sphre prsentant un ple urinaire o sinsre le tube contourn proximal et un ple

vasculaire o pntre lartriole affrente et do merge lartriole effrente. Il est constitu

de deux parties, le glomrule qui est la partie vasculaire et la capsule de Bowman qui est la

partie pithliale.

Le glomrule rnal est form dune artriole affrente qui forme quelques anses capillaires

(les flocules), collectes ensuite par lartriole effrente. Ce systme vasculaire est soutenu

par un tissu conjonctif aussi appel msangium car riche en cellules msangiales lorigine

de la synthse dun grand nombre de molcule (enzymes, hormones et 21 cytokines, lipides

bioactifs, radicaux oxygns).

La capsule glomrulaire (capsule de Bowman), est constitue dune couche de cellules

pithliales, les podocytes, reposant sur une lame basale qui va former deux feuillets. Le

feuillet interne longe les capillaires partageant sa lame basale avec ces derniers. Le feuillet

externe est en continuit avec le tube contourn proximal. Lespace constitu entre les deux

feuillets dlimite la chambre glomrulaire o saccumule lultrafiltrat primitif [10, 31].

20

Figure 2 : dessin schmatique de la structure du corpuscule rnal [31]

Il existe donc une contigut entre lendothlium vasculaire, la lame basale et les podocytes.

Cet ensemble constitue la membrane filtrante dont le fonctionnement sera dtaill plus bas

(cf. partie I. B.).

ii. Tubule rnal

La partie distale du nphron correspond au tubule rnal. Trois parties sont distinctes : le

tubule proximal qui succde au corpuscule rnal, le tubule grle et le tubule distal qui se jette

dans les canaux collecteurs. Les tubules proximaux et distaux sont dots dun tubule droit et

dun tubule contourn. Lanse de Henl correspond la partie compose du tubule droit

proximal (branche descendante large de lanse), du tubule grle et du tubule droit distal

(branche ascendante large de lanse). Lanse de Henl dessine une boucle plus ou moins

profonde dans la mdulla. Ce trajet dfinie deux types de nphrons :

- Les nphrons anse courte (nphrons courts) : ils reprsentent 80 90% de la totalit des

nphrons. Ils ont une faible capacit de rabsorption.

21

- Les nphrons anse longue (nphrons longs) : ils reprsentent 10 20% de la totalit.

Ils ont une capacit de filtration et de rsorption importante. Ils participent la constitution du

gradient osmotique cortico-mdullaire [6, 31].

Figure 3 : dessin schmatique de la microstructure rnale [A. PITMANN (2015). Nphropathie familiale. European familial nephropathy fund.]

b. Les tubes collecteurs

Les tubes collecteurs reoivent lurine des nphrons et la conduisent au bassinet. Chaque tube

draine plusieurs tubes contourns distaux et descend dans la mdulla o plusieurs tubes

fusionnent pour donner les conduits papillaires qui souvrent dans le bassinet au sommet de la

papille [10, 31].

22

B. Gestion rnale des protines

1. Filtration glomrulaire

La filtration est un phnomne passif qui rsulte de la diffrence de pression hydrostatique

entre les capillaires glomrulaires et la capsule de Bowman. Au sein des capillaires

glomrulaires la pression hydrostatique est leve car elle est transmise par lartre

glomrulaire. Elle dpend de la pression artrielle systmique, des facteurs locaux tenant la

vasomotricit des artres glomrulaires affrente et effrente et de la contractilit des cellules

msangiales. Le glomrule, de par sa structure dtaille ci-dessous (cf. partie I.B.1.a), va

constituer une membrane filtrante.

a. Structure de la membrane filtrante

La membrane de filtration glomrulaire possde 3 couches, ce qui lui confre des proprits

de permabilit slective.

Figure 4 : dessin schmatique de la structure de la membrane filtrante [18]

Lgende:

GFR (Glomerular

filtration rate) : dbit

de filtration

glomrulaire

[Alb] : concentration

en albumine

GBM (Glomerular

basement membrane) :

membrane basale

glomrulaire

ESL (Endothelial cell

surface layer) : cellules

endothliales

Qp (plasma flow rate)

: taux de filtration du

plasma

23

Lendothlium vasculaire est constitu des cellules endothliales et dun revtement

glycoprotidique. Les capillaires du glomrule rnal sont de type fenestr et possdent des

pores denviron 60 nm de diamtre, ce qui est bien trop grand pour intervenir dans la

permabilit slective des protines (le diamtre de lalbumine tant 3.6 nm). A la surface de

lendothlium, se trouve une couche de glycoprotines charge ngativement dune paisseur

denviron 0.5 m.

La membrane basale est un rseau de collagne de type 4, de la laminine et des glycoprotines

charges ngativement sur une paisseur de 240-370 nm (beaucoup plus paisse que la

membrane basale dautres endothliums avec une paisseur moyenne de 40-80 nm).

Les podocytes sont de larges cellules prsentant de multiples longs prolongements

cytoplasmiques espacs de fentes de filtrations dont la structure est semblable des pores de

rayon compris entre 35-50 A (Angstrom). Ils participent aussi la slectivit de taille. A leur

surface, une couche de glycoprotines charges ngativement, participant la slectivit de

charge, permet un maintien de la structure [18].

b. Filtration glomrulaire selon la taille des molcules

plasmatiques

La membrane filtrante possde 2 types de pores visibles en microscopie lectronique. Les

fenestrations de lendothlium vasculaire et les fentes de filtration podocytaire. La

microscopie lectronique a dmontr que la lame basale qui spare lendothlium capillaire de

lpithlium urinaire possde galement des pores de taille nettement infrieure aux espaces

dcrits prcdemment. Ces pores ont t valus un diamtre de 20 40 A.

Par consquent, les molcules protiques de masse molculaire suprieure 70 kDa, appeles

protines de haute masse molculaire (HMM), restent dans le compartiment sanguin [31].

Seules les protines de faible masse molculaire (LMM) passent librement le filtre

glomrulaire.

Une tude a cependant montr que deux protines de masse molculaire quivalente ne sont

pas filtres de la mme manire en fonction de leur conformation. En effet, la bikunine qui a

la mme masse molculaire que lalbumine passe 80 fois plus vite la membrane filtrante. Cela

serait d sa conformation allonge [18].

24

c. Filtration glomrulaire selon la charge ionique des

molcules plasmatiques

La couche endothliale et la membrane des podocytes sont constitues de glycoprotines

charges ngativement favorisant le passage des molcules neutres et des cations. Les

protines circulantes sont charges ngativement, par consquent, elles sont repousses vers la

lumire vasculaire. Ces phnomnes lectrostatiques sont considrs comme plus importants

que les phnomnes purement mcaniques dans la filtration glomrulaire [31].

Figure 5 : dessin schmatique de la structure de la membrane filtrante mettant en vidence ses diffrentes proprits de filtration [18]

Lgende : VEGFR1 : rcepteur lintgrine de type1, VEGFR2 : rcepteur lintgrine de

type 2, ESF : couche de la surface endothliale, GBM : membrane basale glomrulaire,

En rsum, 3 proprits des protines sont importantes pour leur passage travers la

membrane filtrante : la charge, la masse molculaire et la conformation [18].

25

2. Gestion tubulaire

a. Rabsorption tubulaire

Aprs fixation spcifique au niveau de la bordure en brosse des cellules tubulaires proximales,

les protines prsentes dans la lumire tubulaire sont absorbes par un mcanisme actif

dendocytose. Ces protines se retrouvent dans les lysosomes o elles sont dgrades en

acides amins, utiliss in situ ou reconduits dans la circulation sanguine.

b. Scrtion tubulaire

Les protines plasmatiques, filtres par le glomrule ne reprsentent que 20 40 % des

protines urinaires physiologiques. Diffrentes protines sont donc scrtes par les voies

urinaires comme la mucoprotine de Tamm-Horsfall (uromoduline), de masse molculaire

leve, scrte par le tube distal et les tubes collecteurs, des immunoglobulines scrtes par

les tubes et lpithlium rnaux ou des glycoprotines de poids molculaire infrieur 30 kDa

dorigine rnal et/ou urinaire.

3. Composition physiologique des urines

Le systme urinaire est destin liminer les dchets organiques sous forme liquide. Lurine

est initialement un ultrafiltrat du plasma. Il est ensuite vid de diffrentes molcules

ncessaires lhomostasie comme les protines qui sont rabsorbes. Lurine primitive est

ensuite charge avec des ions. Cest cette urine dfinitive, dosmolarit leve (3

000mOsm/L), qui est limine par le bas appareil urinaire. Lurine limine de lorganisme

contient donc des substances organiques et inorganiques solubles en nombre et en quantit

variables retires du sang par les reins pour maintenir lhomostasie.

Les urines contiennent des protines LMM (faible masse molculaire) comme les produits du

catabolisme cellulaire, une faible concentration dalbumine et des protines HMM (haute

masse molculaire) scrtes par les tubules rnaux comme les mucoprotines et les

immunoglobulines. Il va donc tre important de dfinir et caractriser une protinurie

pathologique.

26

27

II. Protinurie

A. Dfinition

La protinurie se dfinit comme la prsence de protines dans les urines. Elle peut tre

physiologique (cf. partie I.B.3.) lorsquelle est transitoire et/ou infrieure un certain seuil.

Elle est considre comme pathologique lorsquelle est persistante et suprieur ce seuil.

Une protinurie est considre comme physiologique lorsquelle est quantitativement

infrieure un seuil qui varie selon les auteurs et les mthodes de dosages utiliss : 0.640 g/L

0.950 g/L [3] ou encore 20 mg/kg/j [15]. Cette variabilit du seuil de dcision rsulte

notamment des techniques de dosages et de la variabilit intra-individuelle.

Elle peut aussi se caractriser par une limination de protines qualitativement anormales. Par

exemple, la protinurie de Bence Jones se dfinit par la prsence de ces petites protines (22

000 44 000 D) qui portent le nom du mdecin anglais (Henry Bence Jones) qui les a

dcouvertes. Ces protines sont des chaines lgres dimmunoglobulines et peuvent tre

observes dans les urines de patients souffrant de mylome multiple.

B. Etiophysiopathologie

1. Physiopathologie

Trois mcanismes principaux peuvent expliquer une augmentation pathologique de

lexcrtion protique urinaire : laugmentation de la filtration glomrulaire, la diminution de

la rabsorption tubulaire, et une lvation de la scrtion par lensemble du tractus urinaire.

Ces trois mcanismes peuvent sassocier.

28

2. Etiologies des protinuries pathologiques du chien

Un consensus nord-amricain de lACVIM (American college of veterinary internal

medecine) [24] classe les protinuries en trois catgories : pr-rnales, rnales et post-rnales.

a. Protinuries pr-rnales

La protinurie pr-rnale fait rfrence une protinurie rsultant dune anomalie dun

appareil autre que lappareil gnito-urinaire. On parle dune protinurie de surcharge qui peut

tre dorigine tubulaire lorsque la capacit de rabsorption est dpasse ou dorigine

glomrulaire par hyperprotidmie.

Cette dernire fut initialement dcouverte en induisant exprimentalement de fortes

concentrations de protines plasmatiques chez le chien en les administrant par voie

parentrale. Lorsque la concentration srique protique augmente et devient suprieur 90

g/L, la morphologie glomrulaire est altre, et de grandes quantits dalbumine et dautres

protines de haute masse molculaire sont excrtes dans les urines. Cette protinurie est

rversible lors de rtablissement de la protidmie dans les valeurs usuelles [32].

La nature de ces protines urinaires varie selon le processus pathologique mis en cause. Ainsi,

on dtecte des protines de Bence Jones lors de mylome multiple, du lysozyme lors de

leucmie lymphoplasmocytaire, de protines de linflammation lors des grands syndromes

inflammatoires (septicmie, abcs multiples, etc), de lhmoglobine lors dhmolyse

intravasculaire, ou encore de la myoglobine lors de rhabdomyolyse [15].

b. Protinuries rnales

Les protinuries rnales sont le plus gnralement persistantes. Elles peuvent tre classes en

quatre catgories selon la nature du trouble sous-jacent : fonctionnelles, glomrulaires,

tubulaires ou lies une inflammation du parenchyme rnal.

29

i. Fonctionnelles

Les protinuries dites fonctionnelles seraient en partie dues une augmentation de la pression

de filtration dans le glomrule [32].

Parmi les causes possibles des protinuries fonctionnelles, on trouve des protinuries

pathologiques (persistantes) comme la congestion passive chronique du rein lors

dinsuffisance cardiaque congestive droite, de thrombose de la veine rnale et de pricardites

constrictives. La stnose de lartre rnale, en activant le systme rnine-angiotensine, et le

phochromocytome, par laction des catcholamines, sont aussi susceptibles de provoquer des

dsordres hmodynamiques de nature engendrer des protinuries fonctionnelles [32].

Une protinurie fonctionnelle physiologique (non persistante) peut tre due la

vasoconstriction rnale lors de stress, de fivre, dexercice intense ou dexposition des

tempratures extrmes.

ii. Glomrulaires

La classification des lsions glomrulaires chez le chien est dfinie par le dernier consensus

du World small animal veterinary association renal pathology initiative (WSAVARI) [7]. Elle

sappuie sur des critres histologiques obtenus suite une analyse des coupes de biopsies

rnales par microscopie optique, microscopie lectronique transmission et

immunofluorescence. Ces critres ont permis de rpartir les affections glomrulaires en 3

groupes principaux : la glomrulosclrose segmentaire focale, lamylodose rnale et les

glomrulonphrites mdiation immune.

La glomrulosclrose segmentaire focale est la maladie glomrulaire la plus frquente chez le

chien. Elle se caractrise par une atteinte des podocytes qui se fragmentent et se dtachent de

la membrane basale. Une hypertrophie et un remaniement des podocytes restants permettent

de combler et protger la membrane basale. Elle peut tre primaire ou secondaire toute

MRC (maladie rnale chronique), aux glomrulonphrites mdiation immune et une

hypertension.

30

Lamylodose rnale est la seconde maladie glomrulaire chez le chien. Les lsions observes

sont dues un dpt de substance amylode ractive. Elles sobservent lors de diabte ou

dhypothyrodisme [35], lors de syndromes inflammatoires chroniques (abcs, ostomylite,

pyomtre, lupus rythmateux systmique, pylonphrite, etc) ou encore de processus

noplasique (mylome multiple, lymphome). Il existe aussi des cas damylodose familiale

sans cause identifie [35].

Les glomrulonphrites mdiation immune sont dues au dpt dimmuns complexes

diffrents niveau de la structure du glomrule. Les origines possibles de cette catgorie sont

varies. Des causes infectieuses sont impliques comme lendocardite, la brucellose, la

dirofilariose, lehrlichiose, la leishmaniose, le pyomtre, la borrliose ou toute infection

bactrienne chronique (gingivite, pyodermite). Des affections non infectieuses sont aussi

impliques comme des affections inflammatoires (pancratite, prostatite, ), des maladies

mdiation immune (Lupus rythmateux systmique),

Il existe deux sous-catgories de glomrulonphrites mdiation immune :

- la glomrulonphrite membranoprolifrative caractrise par le dpt sous-

endothliale dimmuns complexes et une hypercellularit de lendothlium

- la glomrulonphropathie membraneuse caractrise par le dpt sous-pithlial

dimmuns complexes et un remodelage de la membrane basale.

Les lsions glomrulaires provoquent frquemment des protinuries suprieures 50 mg/kg/j

et des rapports cratinine urinaire sur protines urinaires suprieurs 3 [17].

iii. Tubulaires

Les protinuries tubulaires, moins frquentes que les protinuries glomrulaires, sexpliquent

par un dfaut de rabsorption des protines filtres, ou bien par la libration excessive de

protines dans la lumire tubulaire. Ces lsions ou dysfonctions tubulaires sont prsentes lors

dintoxications (mtaux lourds, thylne glycol, antifongiques tels que lamphotericine B,

antibiotiques tels que les aminosides, les ttracyclines), de cystinurie et de lysinurie, de

calcinose hypercalcmique, de tubulite infectieuse (leptospirose, cytomgalovirose) ou encore

lors dacidose rnale tubulaire. Lors de protinurie glomrulaire persistante, les mcanismes

31

de rabsorption tubulaire sont insuffisants et du fait des phnomnes de comptition, une

protinurie tubulaire peut se dvelopper.

Lanalyse qualitative des protines urinaires excrtes permet une certaine localisation des

lsions. Ainsi, il a t montr que, chez le chien comme chez lhomme, la protine de liaison

au rtinol (Retinol Binding Protein, RBP) et la protine de Tamm Horsfall pouvaient tre

utilises respectivement comme marqueurs de lsions ou dysfonctions tubulaires proximales

ou distales. En effet, la RBP est normalement totalement rabsorbe par le tubule contourn

proximal : sa prsence dans les urines rvle une dysfonction de cette structure. La protine

de Tamm Horsfall est synthtise uniquement par les cellules tubulaires de la portion distale

du nphron et sa scrtion est donc diminue lors datteinte du tubule contourn distal [12].

iv. Inflammation du parenchyme rnal

Le parenchyme rnal peut tre le sige dune inflammation provoquant une protinurie lors de

tumeur rnale, de traumatisme ou de pylonphrite [15].

c. Protinuries post-rnales

La protinurie post-glomrulaire provient de la partie du tractus gnito-urinaire situe aprs le

parenchyme rnal et est, le plus gnralement, non persistante.

Parmi les causes des protinuries post-rnales on trouve les urolithiases, les inflammations du

tractus urognital (pyomtre, prostatite, cystite bactrienne ou mdicamenteuse avec les

cyclophosphamides), les traumatismes et les noplasies (carcinome transitionnel de la vessie).

Ces protinuries sont gnralement associes un sdiment urinaire anormal pouvant reflter

la cause spcifique [15, 17].

32

C. Intrts de la caractrisation de la protinurie rnale

persistante

Depuis longtemps chez le chien, la mise en vidence et la caractrisation de la protinurie

sont considres comme des tapes cls des dmarches diagnostique et thrapeutique lors de

maladie rnale [16].

La prcocit du diagnostic dune protinurie rnale persistante est un facteur pronostique

important de lvolution de la maladie rnale. En effet, lorsque lexcrtion protique urinaire

est importante lors du diagnostic de linsuffisance rnale chronique, les risques de dvelopper

des crises urmiques, ainsi que le taux de mortalit sont plus levs [20].

Cest aussi un marqueur plus prcoce que dautres variables (diminution de la densit urinaire

ou augmentation de la cratinine) dans le diagnostic des maladies rnales surtout lors de

glomrulopathies familiales.

Le dpistage et la caractrisation de la protinurie savrent donc indispensables lors de

ltablissement du diagnostic, du pronostic et lors du choix du traitement mettre en place. Le

vtrinaire doit donc disposer doutils efficaces pour la dtection de cette anomalie, mais

aussi connatre leurs limites afin dinterprter correctement les rsultats obtenus.

D. Mthodes de dtection dune protinurie

pathologique

Parmi les mthodes de dtection de la protinurie, certaines permettent une semi-

quantification ou quantification comme la bandelette urinaire, le RPCU (rapport protine sur

cratinine urinaires) ou lexcrtion de protines sur 24h et dautres permettent une

qualification comme llectrophorse des protines urinaires unidimensionnelle (cf. III.) ou la

biopsie rnale. Seul le RPCU, considr comme le gold standard pour la quantification de la

protinurie en mdecine vtrinaire, sera dtaill dans cette partie compte tenu de ltude

exprimentale de cette thse. Il a t tabli dans la plupart des tudes quune mesure du RPCU

33

partir dun spcimen prlev au hasard sur la journe est bien corrle la production

protique urinaire journalire chez le chien [40]. En effet, on estime que llimination de la

cratinine par le rein est peu prs constante en raison de la stabilit de sa concentration

plasmatique.

LIRIS [24] a dfini des valeurs seuil considrant quun chien est :

o Non protinurique si la valeur de son RPCU est strictement infrieure 0,2.

o Douteux pour toute valeur de RPCU comprise entre 0,2 et 0,5.

o Protinurique si la valeur de son RPCU est suprieure ou gale 0,5.

Ces recommandations ne sont valables que pour une protinurie rnale persistante et non pour

une valeur de protinurie isole.

34

35

III. Electrophorse unidimensionnelle des protines

urinaires

A. Intrts de la qualification dune protinurie

pathologique par lectrophorse unidimensionnelle

des protines urinaires

1. Intrt pratique

Llectrophorse unidimensionnelle des protines urinaires permet une qualification des

protines urinaires faible cout et immdiate (dure totale dune lectrophorse denviron 2-

3h). Cest une mthode disponible et ne ncessitant pas un manipulateur expriment.

2. Intrt diagnostique

Diffrentes tudes vtrinaires rcentes [5, 42] incluant respectivement 49 et 70 chiens

atteints de diverses affections rnales, ont dmontr une bonne corrlation entre les profils

lectrophortiques des protines urinaires et la prsence de lsions lexamen

histopathologique par biopsies rnales (gold standard pour la qualification dune protinurie).

Elles ont mis en vidence que la sensibilit de llectrophorse des protines urinaires pour

prdire la prsence de lsions glomrulaires est de 100% et 97%, tandis que sa spcificit est

de 40% et 60%. De mme, elles ont montr que la sensibilit de llectrophorse des protines

urinaires pour prdire les lsions tubulaires tait de 82% et 93%, tandis que sa spcificit tait

de 50 et 63% respectivement, et selon ltude.

Nanmoins, ces tudes ont considr que la prsence dune bande isole correspondant

lalbumine sur les profils lectrophortiques de chiens protinuriques (RPCU>0.5) devait tre

secondaire une lsion glomrulaire. Or, cette bande isole peut tre retrouve chez les

36

chiens non protinuriques avec une intensit plus faible, mais aussi dans le cas de lsion

glomrulaire ou tubulaire dbutante.

En rsum, llectrophorse des protines urinaires semble avoir des performances

satisfaisantes tout en tant moins invasive que la biopsie rnale. Elle offre ainsi une

alternative pour le dpistage de lsion glomrulaire ou tubulaire.

3. Intrt thrapeutique

Les recommandations internationales [38] prconisent actuellement de traiter les chiens

prsentant une protinurie glomrulaire ds lors que le RPCU est suprieur 0.5 quelle que

soit la valeur de la cratininmie. Il est donc important de diagnostiquer prcocement les

chiens protinuriques prsentant des lsions glomrulaires. Llectrophorse des protines

urinaires ayant des performances satisfaisantes, le recours cette technique peut se rvler

intressant lorsque la biopsie rnale ne peut tre ralise afin de conforter lorigine

glomrulaire dune protinurie.

B. Dfinition et technique de mesure

1. Dfinition

Llectrophorse est une technique permettant la migration et la sparation des particules

charges en solution sous linfluence dun champ lectrique en fonction de la charge et pour

des charges identiques, en fonction de leur masse molculaire. Lors de ltude, seule

llectrophorse unidimensionnelle des protines urinaires sera dtaille.

37

2. Techniques de mesure

a. Bases physico-chimiques

i. Ionisation des protines

Les protines sont des molcules amphotres qui possdent des fonctions acides (avec les

groupements carboxyles) et des fonctions basiques (avec des groupements amines). Selon le

pH (potentiel hydrogne) du milieu, elles se comportent comme un anion (charge globale

ngative) ou comme un cation (charge globale positive).

Il existe un pH isolectrique (pHi) pour chaque protine qui correspond au pH pour lequel la

molcule possde autant de charges positives que ngatives. Trois cas de figues sont donc

envisageables en fonction du pH de la solution :

o pH< pHi : la protine se comporte comme un cation

o pH=pHi : la charge globale de la protine est nulle

o pH > pHi : la protine se comporte comme un anion

Le pHi des protines se situe entre 2.7 et 7.3. Les solutions tampons utilises sont

gnralement alcalines (pH entre 7.6 et 9.8). Donc, les protines se comportent comme des

anions et le sens de migration se fait de la cathode vers lanode lors de llectrophorse.

ii. Migration lcrophortique

La migration lectrophortique, qui correspond la distance parcourue lors de

llectrophorse par une protine, est fonction du champ lectrique appliqu (intensit et

dure daction qui sont des variables constantes) et de la mobilit lectrophortique () de la

protine.

La mobilit lectrophortique correspond la vitesse de dplacement de la protine sous

leffet dun champ lectrique unitaire. Elle est dfinie par :

= q / 6rR

q : charge lectrique de la protine

r : viscosit du milieu

R : rayon de la particule

38

Donc, la migration lectrophortique va dpendre de la charge lctrique de la protine (q)

ainsi que de son rayon (R), la viscosit du milieu tant constante.

b. Protocole gnral

Llctrophorse des protines urinaires suit un schma gnral quelque soit la technique

utilise. Suite au prlvement des urines, une centrifugation est ralise pour laliquotage.

Ensuite, les urines subissent une migration puis une rvlation grce des colorants intenses

comme par exemple le violet acide, qui possdent un seuil de dtection de 15 mg de protine

/bande, soit par rvlation spcifique permettant la mise en vidence des dpts de protines

obtenus. Enfin, les profils lctrophortiques sont lus directement et/ou par spectromtrie

permettant ainsi une apprciation qualitative et semi-quantitative.

c. Mthode

La migration lectrophortique est fonction uniquement de la masse molculaire des

protines, elle est donc linaire ou unidimensionnelle. Pour ce faire, deux composantes sont

utiles.

Les conditions dnaturantes par interaction avec le solvant, le dodcyl sulfate de sodium

(SDS) sont la premire composante. Il est un dtergent fort qui fait perdre aux protines leur

structure native tridimensionnelle en se fixant par des interactions hydrophobes (une molcule

de SDS pour deux acides amins). Des micelles charges ngativement dune taille

proportionnelle la masse molculaire de la protine dorigine se forment ainsi.

Figure 6 : schma de la dnaturation des protines par le SDS [N.OSWALD (2008). How SDS-PAGE works. Protein analysis, detection and assay.]

39

Les gels rticuls, ayant des pores calibrs, ajoutent un effet de tamisage molculaire celui

de la migration lectrophortique. Ils freinent les molcules dautant plus que leur masse

molculaire est leve. Il existe diffrents types de gels :

o SDS-PAGE qui utilise un gel polyacrylamide constitu de longues chanes formes de

monomres acrylamide unis par des pontages. La viscosit du milieu, sa densit et son

lasticit sont fonction de la dimension des mailles du rseau et sont donc inversement

proportionnelles au nombre de pontages. Le gel est donc form dun gradient de

polyacrylamide aux mailles de plus en plus serres.

Ce gel est peu utilis en pratique car la sparation des diffrentes protines nest pas

trs fine et le gel a des effets toxiques potentiels [42].

o SDS-AGE qui utilise un gel dagarose form de longues chaines o alternent deux

monomres (D galactose et 3-6 anhydro-L-galactose). Ces chaines sont unies par

des ponts hydrogne. La concentration en monomres augmente en continu dans

ltalement en couche mince et engendre un gradient de porosit.

Les gels rticuls possdent donc des pores calibrs qui crent un gradient de porosit,

freinant ainsi les micelles dautant plus quelles sont de haut poids molculaire.

C. Interprtation des profils lectrophortiques

unidimensionnels

1. Principe de linterprtation

Linterprtation est fonde sur la prsence ou labsence de bande qui reprsente une quantit

de protines dune masse molculaire donne.

Pour calibrer les masses molculaires et permettre les comparaisons, un mlange de quelques

protines de masses molculaires connues, aussi appel marqueur molculaire, est soumis

dans les mmes conditions, la migration. Le marqueur molculaire regroupe le lysozyme de

14.3 kDa (kilo Dalton), la tri-phosphate isomrase de 26.6 kDa, lalbumine bovine de 66kDa

et limmunoglobine G humaine de 150 kDa. Il permet davoir une chelle de masse

molculaire connue dont sa comparaison avec les profils de migration permet destimer les

masses molculaires des protines contenues dans les urines testes.

40

Une interprtation qualitative pour lvaluation de la taille des diffrentes protines prsentes

dans les urines est possible, permettant ventuellement de prciser la possible origine

glomrulaire et/ou tubulaire de la protinurie.

Pour rappel, une atteinte glomrulaire engendre une augmentation de lexcrtion urinaire de

protines de masse molculaire suprieure ou gale la masse molculaire de lalbumine

(68kDa), aussi appeles les protines HMM. Sur les profils lectrophortiques, une atteinte

glomrulaire se traduit donc par une ou plusieurs bandes au niveau ou en dessous de

lalbumine. De la mme faon, une atteinte tubulaire engendre une augmentation de

lexcrtion urinaire des protines LMM (masse molculaire infrieure 68kDa) qui se traduit

par une ou plusieurs bandes au-dessus de lalbumine sur les profils lectrophortiques.

Lorsque latteinte est glomrulaire et tubulaire, elle se traduit par un profil lectrophortique

mixte avec des bandes de protines HMM et LMM (Figure 7). Un profil lectrophortique

nayant quune bande dalbumine ou aucune bande est considr comme physiologique.

Figure 7 : SDS-AGE du spcimen PROCON 20 de l'tude prsentant l'interprtation possible dun profil lectrophortique

Lysozyme (14.3 kDa)

Tri-phosphate isomrase (26.6 kDa)

Albumine bovine (66 kDa)

Immunoglobuline G humaine

(150 kDa)

Protines LMM dorigine tubulaire

Protines HMM

dorigine glomrulaire

41

Cette technique permet aussi une valuation semi-quantitative grce lintensit de la

coloration des diffrentes bandes qui est proportionnelle la quantit de protines. Cette

valuation peut tre visuelle ou par spectromtrie mais cette dernire nest pas recommande

et semble peu fiable pour les protines urinaires.

2. Facteurs de variation pr-analytiques

a. Lis la technique

i. Mthode de prlvement

Les urines peuvent tre rcoltes par cystocentse, par miction spontane ou par sondage

(cathtrisation de lurtre).

Le prlvement par miction spontane est la seule mthode totalement atraumatique [30] mais

elle comporte de nombreux inconvnients. Notamment, elle expose le prlvement une

contamination par le bas appareil urinaire, lappareil gnital et la peau. On peut donc

potentiellement retrouver la prsence de dbris cellulaires voire de bactries et de cellules

inflammatoires dans le spcimen rcolt [21]. De plus, lurine nest pas de composition

homogne tout au long de la miction.

Le prlvement par cathtrisme de lurtre peut tre ncessaire pour un diagnostic ou une

thrapie (syndrome urinaire flin). Il prsente linconvnient majeur de modifier la

composition urinaire cause de microtraumatismes induits par le cathtrisme (do la

prsence de sang et de cellules la cytologie urinaire), sans oublier que les lsions causes

lurothlium associes un non-respect des rgles strictes dasepsie sont une cause frquente

dinfections du tractus urinaire bactrienne (20% de risque chez la femelle) [11]. Cette

technique est la plus chre [31].

Le prlvement par cystocentse permet dobtenir des urines striles ( condition de respecter

les rgles dasepsie). Cependant, Il existe quelques contre-indications la ralisation de cette

mthode : lors de distension anormale de la vessie [9], une vessie trop petite ou une chirurgie

42

rcente de la vessie. Les urines prleves sont frquemment contamines par du sang, do

une hmaturie microscopique lie la mthode de prlvement [27] qui pourrait nanmoins

induire une augmentation de la quantit de protines.

Cependant, peu de donnes sur linfluence du mode de prlvement des urines sur les profils

lectrophortiques nont t rpertories en mdecine humaine ou vtrinaire. Le choix du

mode de prlvement des urines dans notre protocole na donc pas t motiv par linfluence

possible sur llectrophorse mais pour saffranchir de contamination du prlvement par des

cellules du bas appareil urinaire.

ii. Moment du prlvement

En mdecine humaine, il est dcrit que lexcrtion protique varie de 100 500% au cours de

la journe et dpend de diffrents facteurs comme la prise de boisson, le taux de filtration

glomrulaire, lexercice, le repos et le rgime alimentaire [34].

Il semble donc prfrable de prlever les urines du matin, ce qui permet de saffranchir dune

dilution occasionne par une consommation deau importante au cours de la journe [27].

iii. Variation la prparation des urines

Daprs lEUG (European Urinalysis Guidelines) et une tude rcente [23], il est conseill de

centrifuger les urines faible vitesse (1000 1500g) afin dviter la prsence de dbris

cellulaires et ainsi prvenir le dveloppement de bactries et une modification du profil

protique de lurine.

Une autre tude rcente [42] prconise la dilution des urines dont la protinurie est suprieure

2000mg/L avec de leau distille ou du NaCl 0.9%. En effet, la mthode de colorimtrie est

linaire jusqu ce seuil, au-del la lecture du profil et la distinction des diffrentes bandes

deviennent difficiles.

Enfin, il est conseill de mesurer la densit urinaire du spcimen prlev car la proportion

dapparition de bandes sur un profil de chien sain est significativement (p= 0,0049) plus

frquente avec des urines concentres quavec des urines non concentres [14].

43

iv. Stockage et dlai danalyse

Lexposition des urines la temprature ambiante sur une dure de 0, 4, 8 et 24h naffecte pas

la stabilit du profil lectrophortique des protines urinaires [23]. De mme la quantit de

protine nest pas altre temprature ambiante sur 24h.

Une autre tude a montr que lurine ne doit pas tre conserve plus de 8h temprature

ambiante par risque dune augmentation de la contamination bactrienne et quil est

prfrable de la conserver 4C entre son prlvement et la ralisation de llectrophorse.

Sur une dure plus longue, une rcente tude vtrinaire a tudi les modifications des profils

lectrophortiques SDS-AGE des protines urinaires conserves temprature ambiante, 4C,

-20C et -80C. A -20C, partir de 15 jours, une bande de haut poids molculaire apparait

ou est renforce dans 65% des chiens protinuriques mais aussi dans 60% des chiens non

protinuriques. Cependant, les profils obtenus pour les urines conserves jusqu 5 jours

temprature ambiante et 4Cne semblent pas altrs. Enfin, cette tude a montr labsence

de modification du profil lors de stockage -80C [39].

Par ailleurs, lexposition 2 cycles de conglation (-80C)/dconglation (temprature

ambiante), na pas dmontr deffet notable sur linterprtation qualitative des profils [23].

b. Lis lanimal

i. Le sexe

Diffrentes tudes rapportent que chez le chien, il nexiste pas de diffrence significative de la

concentration en protines urinaires en fonction du sexe, si le prlvement est effectu par

sondage ou cystocentse. Par ailleurs, lexcrtion protique urinaire est suprieure chez le

mle si le prlvement est effectu par miction [3, 15, 41].

Une tude prliminaire rcente sur 20 chiens adultes sains (RPCU

44

protines urinaires en fonction du sexe. En effet, une bande de faible intensit et de faible

masse molculaire nest visible que chez les chiens males entiers lgrement en dessous de la

tri-phosphate isomrase (26.6 kDa) avec ou sans spermatozodes visibles lanalyse

cytologique du culot urinaire. Cette tude suggre que cette bande soit due une

contamination sminale et non une atteinte tubulaire [33].

Figure 8 : gel lectrophortique de PROCON 13 J5 mettant en vidence la bande spermatique

ii. Protinurie fonctionnelle

De nombreux facteurs physiologiques et environnementaux influencent lexcrtion de

protines dans lurine crant ainsi une protinurie physiologique transitoire et ne correspond

pas une affection rnale. Elle peut avoir lieu lors dexercice physique intense [13], de

dshydratation importante, dhmaturie si le volume de sang est suprieur 10% du volume

urinaire total [1], de temprature extrieure leve ou encore de stress [9].

Par consquent, si le prlvement unique lieu lors de ce genre de situation, on peut avoir une

protinurie interprte tort comme pathologique. Lvaluation sur 24 heures permet de

45

limiter ces erreurs dinterprtation. La protinurie dtecte aura donc moins de chance dtre

dorigine physiologique.

Bien quaucune donne actuelle ne soit disponible, on pourrait supposer quune protinurie

fonctionnelle puisse perturber linterprtation dun profil lectrophortique.

3. Facteurs de variation analytiques

Parmi les facteurs de variations analytiques non spcifiques de llectrophorse des protines

urinaires SDS-AGE, on retrouve classiquement la temprature ambiante du laboratoire, ainsi

que les instruments, le lot de ractif et le manipulateur. En effet, ce dernier paramtre est

important puisque la prparation des gels inclus la manipulation de petits volumes (5L).

Certains facteurs de variations analytiques plus spcifiques sont prendre en compte. Lors de

la ralisation des lectrophorses il est important de slectionner le mode de migration

spcifique aux protines urinaires. En effet, si la vitesse de migration est trop leve, il y aura

une mauvaise sparation des protines et inversement, si la vitesse de migration est trop

faible, les protines ont tendance diffuser latralement sur le gel.

La coloration est aussi trs importante pour la lecture des profils. La prparation dun colorant

permet de raliser dix gels par SDS-AGE et au fil des lectrophorses, la coloration devient

moins intense. Ceci peut diminuer la sensibilit de llectrophorse puisque certaines bandes

de faible intensit seront moins visibles ou ne seront pas rvles par la coloration.

46

47

48

PARTIE II : ETUDE EXPERIMENTALE

I. Contexte

Cette partie exprimentale permet de prciser les rsultats de ltude de THERON et

collaborateurs [39] dans laquelle une modification du profil lectrophortique suite une

conservation des urines -20C pendant 15 jours a t mise en vidence. Lapparition ou le

renforcement dune bande de haute masse molculaire (Figure 9) est note en comparaison

avec le profil lectrophortique obtenu immdiatement aprs le prlvement.

Figure 9 : Rsultats de ltude THERON et collaborateurs [39]

En pratique vtrinaire, les lectrophorses des protines urinaires sont souvent ralises dans

un second temps, suite au diagnostic dune protinurie rnale persistante, afin de prciser la

localisation de la lsion, adapter le traitement et permettre de raliser un suivi adapt. Les

urines peuvent donc tre conserves pour une dure variable -20C ou 4C avant la

ralisation de cette lectrophorse, le temps de dterminer le RPCU.

J0 J15 Marqueur molculaire

-20C -80C

Modification

du profil -

20C par

rapport J0

50

Par ailleurs, en cas dtude rtrospective et pour prvoir le protocole dune tude prospective,

il est important de maitriser les facteurs de variations pr analytiques.

Cette tude exprimentale a pour but de prciser les modifications du profil lors dune

conservation des urines -20C en abordant diffrents points :

- la dure minimale de conservation des urines -20C aprs laquelle on peut voir

apparaitre ces modifications

- linfluence de la nature du tube dans lapparition des modifications.

51

II. Etude prliminaire observationnelle

A. Objectifs

Ltude prliminaire observationnelle a pour objectif dvaluer :

- leffet dune dure courte de stockage des urines -20C sur linterprtation de SDS-

AGE urinaire de chiens protinuriques en comparant des profils obtenus aprs

conservation des urines -20C J5 et J15 par rapport au profil obtenu J0.

- linfluence de la nature du tube choisi pour la conservation des urines sur

linterprtation de SDS-AGE urinaire de chiens protinuriques en comparant des

profils obtenus aprs conservation des urines -20C J5 et J15 par rapport J0.

Cette tude se fait en 2 temps avec la comparaison de profils lectrophortiques

obtenus sur urines conserves dans des tubes Eppendorf classiques et des tubes

Nunc Cryotubes puis la comparaison des profils obtenus partir de spcimens

conservs dans des tubes Eppendorf classiques et des tubes Eppendorf Protein

Lobind.

B. Matriel et mthode

1. Spcimens urinaires

a. Critres dinclusion

Les animaux sont inclus uniquement aprs complte information du propritaire et la

signature du Formulaire de consentement clair (Annexe 1).

Tout chien prsent en consultation lENVT (Ecole nationale vtrinaire de Toulouse)

ncessitant pour raison mdicale (investigation dune maladie rnale ou avec potentielle

implication rnale) la ralisation dune analyse durine complte et lvaluation du RPCU

peut tre inclus dans ltude.

52

Chaque animal inclus dans l'tude a une fiche d'accompagnement de prlvement (sur laquelle

est inscrit le nom du propritaire, son nom dusage, son numro d'identification ENVT et son

numro didentification pour l'tude) et une fiche d'analyse (sur laquelle nest mentionne que

son numro d'tude) visibles en annexes 2, 3 et 4.

Dans le cadre de la phase 1 comparant les tubes Eppendorf classiques et les Nunc

Cryotubes, les chiens sont identifis de la faon suivante ; de CONG 1 CONG X . Pour

prserver l'anonymat, seul lidentification de l'tude est prsente sur les rsultats d'analyses.

Dans le cadre de la phase 2 comparant les Eppendorf classiques et les Eppendorf Protein

Lobind , les chiens sont identifis de la faon suivante ; de EP PROCON1 EP PROCON

X . Pour prserver l'anonymat, seul lidentification de l'tude est prsente sur les rsultats

d'analyses.

b. Critres dexclusion

Aucun critre dexclusion initiale nest tabli. Plusieurs critres dexclusion au laboratoire

sont dfinis :

- prsence dun sdiment urinaire inflammatoire (nombre de cellules inflammatoires par

champ > 5)

- prsence dune bactriurie

- prsence dune protinurie quantitative linclusion < 500 mg/L

- prsence dun RPCU initial < 0,2

- prsence dun RPCU initial compris entre 0.2 et 0.5 associ une protinurie < 800

mg/L.

2. Etapes pr-analytiques

a. Prlvements urinaires

Le prlvement urinaire est effectu par cystocentse choguide par Le Dr V. Fabres ou L.

Quignon, tudiante en 5me anne, sous la supervision dun Dr vtrinaire, au sein de lENVT.

En effet, bien que le RPCU ne soit que minimalement affect par le mode de rcupration en

53

cas dabsence de inflammation [4], le prlvement par cystocentse permet de saffranchir

dune contamination par le bas appareil urinaire et lappareil gnital.

Pour chaque chien, un volume total de 6 mL minimum durine est collect.

b. Etapes prliminaires

i. Bandelette urinaire

Une analyse chimique urinaire est ralise pour chaque animal, au moyen dune bandelette

urinaire (Urine Reagent Strip for urinalysis URS-10, Teco Diagnostics, Anaheim CA, USA)

dont les rsultats sont reports dans la fiche analytique (Annexes 3 et 4) de chaque individu.

ii. Densit urinaire (DU)

Une goutte durine est dpose sur la zone de lecture du rfractomtre optique Atago T2-NE

(Atago Co. Ltd., Tokyo, Japan) avant la centrifugation afin de permettre la mesure de la

densit urinaire. La valeur obtenue est consigne dans la fiche analytique (Annexes 3 et 4).

c. Conservation des urines

Dans la priode immdiate suivant la rcupration, les urines sont conserves dans la seringue

plastique de 10 mL puis portes au Laboratoire Central de lENVT accompagnes du

consentement clair (Annexe 1) et des fiches de prlvement et danalyse (Annexes 2, 3 et

4). Les urines collectes par cystocentse sont alors transfres dans des tubes fond conique.

Ces derniers sont pr-identifis par le numro CONG X pour ltude comparant les tubes

Eppendorf classiques et les Nunc Cryotubes et par le numro EPPROCON X pour

ltude comparant les tubes Eppendorf classiques et les tubes Eppendorf Protein Lobind.

Un dlai maximal de deux heures est respect entre collecte et analyse ainsi que recommand par le

CLSI (Clinical and laboratory standrards institute) [8]. Dans tous les cas, le dlai le plus court possible

est recherch.

54

d. Prparation des urines

i. Centrifugation

La centrifugation est effectue aprs la ralisation des bandelettes urinaires et la mesure de la

densit urinaire. Les tubes fonds coniques remplis durine sont centrifugs dans la

centrifugeuse ROTOFIX 32A (Andreas HettichGmbH and Co. KG D- 78532 Tuttlingen)

1500 tours/min (RCF (relative centrifugal force)=250g) pendant 5 minutes ((rayon de

centrifugation = 10.00 cm ; 13.5 3.5 ; rfrence des godets : 1741) selon les

recommandations du CLSI [8]. Le surnageant est extrait pour prparer les spcimens liquides.

ii. Extraction du surnageant et prparation des

spcimens

Lextraction du surnageant se fait laide de pipette usage unique pastette (Pipette

pasteur plastique pointe fine, Copan, Brescia, Italia). Une petite partie du surnageant est

conserv pour la ralisation des analyses immdiates (RPCU et SDS-AGE initiaux).

Le surnageant est rparti dans 2 tubes Eppendorf classiques et dans 2 Nunc Cryotubes

pralablement identifis CONG 1 CONG X assortis de la mention 5 ou 15 pour le jour de

ralisation de lanalyse.

De la mme manire, il est rparti dans 2 tubes Eppendorf classiques et dans 2 tubes

Eppendorf protein lobind pralablement identifis EPPROCON 1 EPPROCON X .

Afin de constituer des chantillons tmoins, 0.5 mL deau distille est rparti de la mme

manire dans 2 tubes Eppendorf classiques et 2 tubes Eppendorf Protein Lobind

pralablement identifis EP PROCON T1 EP PROCON TX, assortis de la mention J0

dans le cas dune analyse immdiate et J15 lors dune conservation -20C durant 15 jours.

Une autre pastette est utilise aprs lextraction du surnageant pour la remise en

suspension du sdiment du spcimen destin lanalyse cytologique ralise par une

alternance de pressions-dpressions lentes de la pipette plonge dans lurine rsiduelle.

Lhoraire de rpartition du surnageant est report sur la feuille analytique et est assimil T0.

55

iii. Stockage des urines entre collecte et analyses

ultrieures

Tous les tubes Eppendorf classiques, les Nunc Cryotubes et les tubes Eppendorf Protein

Lobind sont placs dans une boite de stockage SARSTEDT identifie ETUDE

CONGELATION SDS-AGE -20C et stocks dans un conglateur dont la temprature est

contrle et stable -20C.

e. Examen cytologique du sdiment

Une goutte (environ 6 L) du sdiment remis en suspension est transfre sur une lame

(lames bords coups et plage dpolie (Thermo Scientific Menzel-Glser)) et recouverte

dune lamelle (lamelles 22 x 22 mm Menzel-Glser).

Lexamen cytologique est ralis au moyen dun microscope Nikon Eclipse E200 avec les

objectifs correspondants x10, x20, x40. Lintensit lumineuse, la fermeture du diaphragme et

la descente du condensateur sont rgls leur maximum.

i. Analyse prliminaire au faible grossissement

Une premire analyse semi-quantitative du spcimen se fait au faible grossissement (10x)

dans le but dapprcier la richesse du prlvement et la prsence ventuelle et la

quantification des cristaux et des cylindres. La surface de la lamelle est observe dans son

intgralit en faisant varier la vis micromtrique afin deffectuer un premier tri entre les

lments dintrt (cellules, cristaux, cylindres) et les artfacts de prparation (bulles, dbris

de verre, fibres ou poils).

ii. Analyse au fort grossissement

Dix champs distincts sont slectionns en prenant soin dviter leur chevauchement afin de ne

pas compter plusieurs fois le mme lment.

Sur chacun des champs, les lments dintrt sont dnombrs individuellement et relevs

dans une colonne du tableau (Tableau 1) qui sert de modle pour toutes les analyses

56

microscopiques de ltude. Une moyenne sur les dix champs est effectue la fin de lexamen

et constitue la donne brute exploite par la suite.

La nature des cristaux, cylindre ou bactrie est prcis si ncessaire.

iii. Examen cytologique aprs coloration

En cas de suspicion de bactriurie, un examen du sdiment urinaire aprs coloration est

effectu si ncessaire.

iv. Enregistrement des donnes brutes

Les donnes de lanalyse cytologique du sdiment urinaire sont rpertories dans un tableau

(Tableau 1).

Tableau 1 : analyse cytologique du sdiment urinaire

Elments

compts

Champ 1

Champ 2

Champ 3

Champ 4

Champ 5

Champ 6

Champ 7

Champ 8

Champ 9

Champ10

Moyenne

par champ

Cristaux

Hmatie

Leucocytes

Cylindres

Bactrie

Spermatozo

des

Cellules

pithliales

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3. Etapes analytiques immdiates

a. RPCU initial

Le RPCU initial est ralis partir des tubes Eppendorf classiques identifis CONG X 0 A

et EP PROCON X 0 A.

La cratinine urinaire est mesure par la mthode de Jaff (CreatinineMonoractif liquide

stable PAE, Kitvia, Labarthe Inard, France) et les protines urinaires par la mthode au rouge

pyrogallol (ElitechMicroprotein, Seppim, Ses, France) au moyen du K-Bio 2 (K.Bio 2,

Kitvia, Labarthe Inard, France).

Les valeurs des protines et cratinine urinaires sont reportes sur la feuille analytique

(Annexe 3 et Annexe 4). Le RPCU est ensuite calcul et sa valeur est reporte sur la fiche

analytique correspondante. Les impressions originales des rsultats sont conserves au

Laboratoire Central dans un dossier ddi.

b. SDS-AGE initiale

Le spcimen initial sur urines liquides est ralis partir du tube Eppendorf classique

identifi CONG X 0 TA et reprsente la SDS-AGE de rfrence (Tableau 2).

i. Migration lectrophortique et coloration

Les urines dont la concentration en protines du surnageant est > 1500 mg/L sont dilues au

1 :1 avec de leau distille, celles dont la concentration est > 2000 mg/L sont dilue au 1 :2.

80 L du surnageant issu du prlvement initial est mlang avec 20 L de diluant inclus

dans le kit du fabricant et contenant du SDS et du bleu de bromophnol (Hydragel 5

proteinuria, Sebia Italia SRL, Bagno a Ripoli, Firenze Italy). Lanalyseur lectrophortique

correspondant (Hydrasys 2, Sebia Italia SRL, Bagno a Ripoli, Firenze Italy) est prpar selon

les recommandations du fabricant en plaant les ponges pralablement imbibes de la

solution tampon adquate (pH = 8.5) sur les lectrodes.

Aprs avoir retir lexcs de solution tampon prsente sur le gel, 5L des urines dilues

comme dcrit prcdemment sont places dans le puit de migration de la feuille de gel, le gel

58

est plac dans la chambre de migration et la procdure dbute ensuite en utilisant le

programme spcifique fourni par le fabricant.

La migration lectrophortique se droule puissance constante de 10W 20C pour

accumuler 60 volts /h pendant approximativement 15 minutes.

La feuille de gel est ensuite transfre dans la chambre de coloration de lanalyseur et

automatiquement colore au moyen dacide violet, puis rince, traite la glycrine et sche.

ii. Stockage des rsultats

La feuille de gel est identifie par le numro dtude, lannotation J0 pour le jour 0 : CONG

X J0 TA. La date est aussi inscrite sur la feuille. Une photocopie couleur de la feuille est

ralise et agrafe la feuille analytique correspondante.

Les originaux de la feuille de gel et du le film transparent sont conservs dans un classeur

ddi et gard au Laboratoire Central.

4. Etude analytique

a. Dconglation et homognisation des spcimens

Aprs dconglation TA pendant approximativement 20 minutes, les tubes Eppendorf

classiques, les Nunc Cryotubes et les Eppendorf Protein Lobind sont r-homogniss

au moyen dun vortex et sont ensuite centrifugs 45 000 tours par min pendant 5 minutes.

b. Ralisation des RPCU et des SDS-AGE

Les RPCU et les SDS-AGE sont raliss comme dcrits prcdemment sur le surnageant des

spcimens pralablement dcongels aux dates regroupes dans le planning prvisionnel ci-

dessous :

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Phase de

ltude

Spcimens utiliss Analyses

J0 Urine initiale

Densit urinaire, bandelette urinaire,

analyse cytologique du sdiment

urinaire

Eppendorf classique EP PROCON X J0

Eppendorf Protein Lobind EP PROCON X J0

RPCU et SDS-AGE

J0 + 5 Eppendorf classique CONG X 5

Nunc cryoTube CONG X 5

RPCU et SDS-AGE

J0 + 15 Eppendorf classique CONG X 15

Nunc cryoTube CONG X 15

RPCU et SDS-AGE

Eppendorf classique EP PROCON X J15

Eppendorf Protein Lobind EP PROCON X J15

Tableau 2 : planning prvisionnel de l'tude prliminaire

C. Rsultats

1. Animaux slectionns

Huit chiens dges diffrents (ge mdian : 6.75 [1-16] ans), une femelle entire, 2 femelles

strilises et 5 mles entiers, ont t inclus dans ltude prliminaire aprs une admission ou

une hospitalisation lENVT pour diffrents motifs en lien avec une protinurie (mylome

multiple, leptospirose, leishmaniose, hypercorticisme et MRC) et un RPCU suprieur 0.5

(RPCU mdian : 2.14 [1.13-8.06] ans) (Annexe 6).

2. Influence de la dure de stockage -20C

Seul le chien CONG 1 prsente une modification de son profil lectrophortique J5 et J15

par rapport J0. En effet, on note lapparition dune bande de haute masse molculaire

(lgrement suprieur limmunoglobuline G de 150 kDa). Cette observation permet de

prciser ltude prcdente [39] et de rduire la dure minimale de conservation des urines au

bout de laquelle peut apparaitre une modification du profil 5 jours au lieu de 15 jours.

60

3. Influence de la nature du tube

Sur les 8 animaux inclus, 5 prsentent des modifications de leur profil lectrophortique J15

et les modifications sont identiques quel que soit le tube utilis (lEppendorf classique, le

Nunc Cryotube et lEppendorf Protein Lobind).

.

D. Conclusions prliminaires

Les modifications du profil lectrophortique sont visibles ds 5 jours de conservation des

urines -20C et la nature du tube choisi naffecte pas ces modifications.

61

III. Etude principale

A. Objectifs

Ltude principale a pour objectif :

1- De prciser la dure limite de conservation des urines -20C avant quil y ait

apparition de modification du profil lectrophortique en ralisant des

lectrophorses aprs 1, 2, 5 et 15 jours en comparant au profil obtenu J0.

2- Danalyser linfluence de certains facteurs sur lapparition de ces modifications

(e.g. la nature du profil, le sexe, lge, la protinurie initiale,).

Compte tenu des rsultats de ltude prliminaire, seuls des tubes Eppendorf classiques ont

t utiliss pour ltude principale.

B. Matriel et Mthode

1. Spcimens urinaires

Les animaux inclus dans ltude principale rpondent aux mmes critres que ceux de ltude

prliminaire (cf. partie I. B. 2 de la partie exprimentale).

Chaque animal inclus dans l'tude possde une fiche d'accompagnement de prlvement (sur

laquelle est inscrit le nom du propritaire, son nom dusage, son numro d'identification

ENVT et son numro didentification pour l'tude) et une fiche d'analyse (sur laquelle nest

mentionne que son numro d'tude) visibles en annexes 2 et 5. Les chiens sont identifis de

la faon suivante ; de PROCON 1 PROCON X . Pour prserver l'anonymat, seul

lidentification de l'tude est prsente sur les rsultats d'analyses.

2. Etapes pr-analytiques

Les tapes pr-analytiques sont identiques aux phases prliminaires, en effet le pr