Untersuchung zur Veränderung der Aktionspotentialmuster während der Reifung von Forellen Retina Ganglienzellen (Oncorhynchus mykiss) unter besonderer Berücksichtigung Kv 3.1 und B K verwandter Kaliumkanäle Dissertation zur Erlangung des naturwissenschaftlichen Doktorgrades des Fachbereichs Biologie/Chemie der Universität Osnabrück vorgelegt von Jutta Henne aus Osnabrück. Osnabrück 2004 1
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Oncorhynchus mykiss) unter besonderer Berücksichtigung Kv ...nbn:de:gbv:700... · Der pH Wert von 7,2 bei 16° C wurde mit HCl eingestellt. Bei Versuchen mit Sf21 Zellen muss der
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Untersuchung zur Veränderung der Aktionspotentialmuster
während der Reifung von Forellen Retina Ganglienzellen
(Oncorhynchus mykiss) unter besonderer Berücksichtigung
Kv 3.1 und BK verwandter Kaliumkanäle
Dissertation
zur Erlangung des
naturwissenschaftlichen Doktorgrades
des Fachbereichs Biologie/Chemie
der Universität Osnabrück
vorgelegt von
Jutta Henne
aus Osnabrück.
Osnabrück 2004
1
I Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung 4
2 Material und Methoden 7
2.1.1 Versuchstiere 7
2.1.2 Eukaryontische Zellkulturlinie 7
2.2 Medien 7
2.2.1 Lösungsansätze für die Zellisolierung und Zellkultur 8
2.2.2 Lösungsansätze für die Elektrophysiologie 8
2.2.3 Puffer und Systeme 10
2.2.4 Primer 10
2.3 Immunologische Methoden 11
2.4 Molekularbiologische Methoden 11
2.4.1 mRNA Isolierung aus einzelnen RGZ 11
2.4.2 Reverse Transkription 12
2.4.3 Polymerase Kettenreaktion (PCR) 12
2.4.4 Agarosegelelektrophorese 13
2.5 Baculovirus-Technik 13
2.6 Isolierung der Retinaganglienzellen (RGZ) 14
2.7 Zellkultur von Retinaganglienzellen (RGZ) 15
2.8 Materialnachweis 15
2.9 Versuchsaufbau des Patch-Clamp Messtandes 16
2.9.1 Mechanisch optischer Aufbau 16
2.9.2 Verstärker 17
2.9.3 Spannungsklemmen Modus (Voltage-Clamp, VC) 18
2.9.4 Search-Modus 19
2.9.5 Stromklemmen (Current Clamp; CC) und CC + COMM Mode 19
2.9.6 Pipetten und Elektroden 20
2.9.7 Versuchssteuerung und Erfassung der Messdaten 20
2.9.8 Kapazitäts - und Serienwiderstandskompensation 21
Tab.3: Die maximale Depolarisation des 1. Ap´s bei einer Stromapplikation von 50 pA über 30 ms in verschiedenen RGZ Stadien. Die maximale Depolarisation steigt kontinuierlich von 0 mV bei Stadium 26-29 auf
+20 mV in den adulten Zellen. Die Höhe der Aktionspotentiale steigt parallel mit dem
Entwicklungsstand der Zellen. Als zweiter Parameter bei der Auswertung wurde die
Dauer bzw. die Breite der einzelnen Aktionspotentiale ermittelt, indem die Zeit
zwischen dem Startpunkt und dem Repolarisationsmaximum ausgemessen wurde.
27
0
1
2
3
4
5
6
26-28 29 30-31 32 33 34 35 36 adult
Stadium
Dau
er d
er A
p´s
[ms]
Abb. 8: Die Dauer
des 1. Aktionspotentiales
gemessen vom
Startpunkt zum
Repolarisationsmaximum
bei einer Stromgebung von
100 pA über 30 ms.
Von Stadium 26 bis 32 zeigt sich keine signifikante Veränderung in der Breite der
Aktionspotentiale. Zwischen Stadium 32 und 33 verkürzt sie sich sprunghaft von 4,6
auf 2,9 ms. Danach sinkt der Wert kontinuierlich bis auf 2,2 ms bei den adulten RGZ.
Die Aktionspotentiale werden schmaler und es können folglich mehr
Aktionspotentiale in reifen RGZ pro Zeiteinheit generiert werden als in unreifen. Die
starke Verkürzung der Aktionspotentiale zwischen Stadium 32 und 33 deutet auf eine
drastische Veränderung der zugrundeliegenden Ströme in dieser Phase der
Entwicklung hin. Da die Aktionspotentiale im Zuge der Reifung schmaler und höher
werden, muss die aufsteigende (Slope up) oder die absteigende (Slope down)
Flanke des Aktionspotentiales steiler werden.
Stadium 26 –30 Adult
Slope up [mV/ms] 74,6 ±9,3 124 ±13
Slope down [mV/ms] 73 ± 7,5 86 ±11
Tab. 4: Slope up und Slope down Werte von RGZ bei einer Stromgebung von 50 pA über 30 ms.
Im Vergleich von RGZ, vor dem Schlupf (26-30), und adulten Zellen steigt der Slope
up um 66 %, wobei der Slope down um 18 % zunimmt. Die zeitliche Verkürzung und
stärkere Depolarisation der Aktionspotentiale während der Reifung wird
hauptsächlich durch den steileren Anstieg bedingt. Dadurch können in adulten RGZ
mehr Aktionspotentiale innerhalb eines bestimmten Zeitraums im Vergleich zu
28
frühen Stadien generiert werden. Diese Unterschiede müssen durch die den Ap´s
zugrunde liegenden Ströme erklärt werden.
3.3 Charakterisierung spannungsabhängiger Summeneinströme Als erster Schritt bei der Generation eines Aktionspotentiales fließt ein
spannungsabhängiger Natriumstrom in die Zelle und erzeugt eine Depolarisation.
Zeitverzögert werden Kaliumkanäle geöffnet und wirken dem Natriumstrom
entgegen. Aus dem Zusammenspiel von spannungsabhängigen Natrium - und
Kaliumkanälen entsteht ein Aktionspotential. Neben den Natriumionen wird der Strom
in die Zelle noch von weiteren Ionen, vornehmlich von Kalzium, getragen.
Vorhergehende Experimente mit dem Natriumkanalblocker TTX und der Substitution
von Natrium durch Tris zeigten, dass der Hauptanteil des Einstromes in adulten RGZ
durch Natrium getragen wird (Vent , Diplomarbeit). Diese Untersuchungen wurden
durch den Einsatz des Kalziumkanalblockers CoCl2 bestätigt. Die Höhe des
Summeneinstromes wurde für verschiedene RGZ Stadien bestimmt.
Tab. 5: Höhe des maximalen Summeneinstromes in RGZ bei einen Haltepotential von –80 mV und
einem Spannungspuls von –20 mV.
Bei der Höhe des maximalen Summeneinstromes ist keine deutliche Veränderung für
die verschiedenen Entwicklungsstadien festzustellen. In den Stadien vor dem
Schlupf werden schon die adulten Werte erreicht. In allen Stadien beträgt der
Einstrom ca. 1 nA. Für einen genaueren Vergleich wurden die I/U (Strom /
Spannung) Kennlinien des Summeneinstroms verschiedener Entwicklungsstadien
zusammengefasst.
29
-1300
-1100
-900
-700
-500
-300
-100
100
-80 -60 -40 -20 0 20 40
Spannung [mV]S
trom
[pA
]
Abb.9: I/U Diagramm des Summeneinstroms von RGZ verschiedener Stadien (Blau 26-28; Rot 32;
Schwarz adult). Die Zellen wurden von einem Haltepotential von –80 mV aus in 10 mV Schritten über
30 ms bis auf +50 mV gereizt.
Stadium 28 Stadium 32 Adult
Abb. 10 Originalregistrierung der Summeneinströme von RGZ der Stadien 28, 32 und Adult. Die
Zellen wurden von einem Haltepotential von –80 mV aus in 10 mV Schritten über 30 ms bis auf + 50
mV gereizt.
Bei der Betrachtung dieser I/U Kennlinien und Originalregistrierungen sind keine
signifikanten Unterschiede zwischen den RGZ Stadien erkennbar. Die Höhe und der
Verlauf des Summeneinstromes ist folglich nicht für die unterschiedlichen
Aktionspotentiale während der Reifung der RGZ verantwortlich. Deshalb betrachtete
ich ausführlich die Summenausströme.
30
3.4 Charakterisierung von passiven Membraneigenschaften und
Kaliumkanalmustern
Für die Charakterisierung von Neuronen sind die passiven Membraneigenschaften
der Zelle, wie Größe und Membranpotential, von Bedeutung. Die Größe einer Zelle
kann auf verschiedenen Wegen festgestellt werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde
sie indirekt über die Höhe der Zellkapazität bestimmt.
Stadium 26 30 32 33 35 Adult
Zellkapazität
[pF]
4,7
±0,6
5,2
±0,48
5,7
±0,46
4,96
±0,36
5,79
±0,27
5,62
±0,45
Tab. 6 Zellkapazität von RGZ in verschiedenen Entwicklungsstadium
Die Kapazität der Zellen beträgt in allen Stadien zwischen 4,7 und 5,7 pF. Es ist
keine signifikante Veränderung im Rahmen der Reifung der RGZ festzustellen. Das
Größenwachstum ist bei dem jüngsten für die Messungen zugänglichen Stadium
schon abgeschlossen. Neben der Größe ist das Membranpotential (VM) ein wichtiges
Kriterium bei der Beschreibung von Neuronen.
Stadium 26 28 30 32 34 Adult
VM [mV] -41,3
±1,6
-39,8
±2,4
-41,8
±1,1
-45,1
±2,2
-46,6
±2,1
-51,1
±1,1
Tab. 7 Membranpotential von RGZ in verschiedenen Entwicklungsstadien
In den Stadien 26 –30 beträgt das Membranpotential konstant ca. -41 mV. Es erhöht
sich signifikant bei Stadium 32 auf –45 mV und zwischen Stadium 34 und 37 von –46
auf –51 mV. Diese Untersuchungen zeigen die Altersabhängigkeit des
Membranpotentials. Je jünger die Zellen sind, desto positiver ist ihr Potential. Neben
der Ermittlung der passiven Eigenschaften sind die aktiven Membraneigenschaften
von Bedeutung. Zu diesen zählen die bereits dargestellten spannungsabhängigen
Summeneinströme. Diesen wirken die spannungsabhängigen Summenausströme
31
entgegen. Die Maxima der Ausströme von RGZ in verschiedenen
mm zusammengefasst.
Entwicklungsstadien sind im nachfolgenden I/U Diagra
bb. 11: Maximum des
ummenausstroms von RGZ
Zuge der Reifung der Zellen ist ein Anstieg des maximalen Summenausstroms
on 1734 pA ±165 bei Stadium 26 auf 2320 pA ±138 bei adulten Zellen zu
29 31 33 35 Adult
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
26-28 29-30 31 32 33 35 adult
Entwicklungsstadium
Stro
m [p
A]
A
S
verschiedener Entwicklungsstadien
bei einem Haltepotential von –80 mV
und einer gegebenen Spannung von
+100 mV über 500 ms.
Im
v
beobachten. Die signifikanteste Stromzunahme ist kurz nach dem Schlupf zwischen
den Stadien 30 und 31 zu beobachten. Danach steigt der Strom nicht mehr deutlich
an. Eine genauere Methode für den Vergleich der Strommaxima von Zellen stellt die
Ermittlung der Stromdichte der Zellen dar. Dabei wird der Strom im Verhältnis zur
Zellgröße betrachtet.
Stadium 27
Stromdichte 329
364
413
470
447
464
[pA/pF] ±65 ±59 ±34 ±46 ±58 ±44
Tab.8: Stromdich Spa und Ha ential von –80 mV in
denen Entwicklungsstadien.
t nach dem Schlupf der Fische an. Bei Stadium 33 ist
er Wert der adulten Zellen erreicht. Im Summenausstrom zeigt sich im Gegensatz
te der RGZ ermittelt bei +100 mV nnung einem ltepot
verschie
Die Stromdichte der RGZ steig
d
zum Summeneinstrom eine drastische Veränderung im Rahmen der Entwicklung der
RGZ. Somit sind die Summenausströme für die Veränderung der Aktionspotentiale
während der Entwicklung verantwortlich. In der nachfolgenden Betrachtung wurde
32
die Frage untersucht, ob die Stromerhöhung durch vermehrten Einbau der
vorhandenen Ionenkanäle oder durch den zusätzlichen Einsatz von neuen Kanälen
erreicht wird. Da jeder Kanal ein für ihn typisches Strommuster aufweist, kann bei der
Betrachtung der Summenausströme ein erster Hinweis auf unterschiedliche, dem
Strom zugrunde liegenden Kanäle gezeigt werden. Bei der Betrachtung der
Originalregistrierungen von Summenausströmen verschiedener RGZ Stadien zeigen
erste Anzeichen dafür.
Abb.12: Originalregistrierung der Summenausströme von RGZ Stadium 30 (A), 35 (B) und eine
dulten (C) Zelle. Die RGZ wurden auf ein Haltpotential von –80 mV geklemmt. Die Spannungspulse
s sind erhebliche Unterschiede zwischen den Summenströmen zu erkennen. Das
dulte Strombild zeigt einen typischen, nicht inaktivierenden KD Strom, wohingegen
r
a
wurden davon ausgehend in 10 mV Schritten stufenförmig über 500 ms bis auf +100 mV gegeben.
E
a
das juvenile Strombild einen großen Anteil inaktivierenden IA Strom aufweist. Dies
deutet auf unterschiedliche Kaliumkanäle, die den Strömen zu Grunde liegen hin.
Der Anteil des nicht inaktivierenden KD-Stroms wurde im Rahmen der Reifung der
RGZ ermittelt. Beträgt der Wert 100 %, so handelt es sich um einen nicht
inaktivierenden Strom. Beträgt er 50 %, so inaktiviert der Strom um die Hälfte.
33
bb.13: Anteil des nicht
aktivierenden Stromes in
In den Stadien vor dem Schlupf ist keine signifikante Veränderung festzustellen. Ab
tadium 31 steigt der Anteil des nicht inaktivierenden Stromes kontinuierlich an.
A
40
50
60
70
80
90
100
26 27 29 30 31 32 33 34 35 36 adult
Stadium
Nic
ht in
aktiv
iere
nder
Stro
m [%
in
verschiedenen RGZ
Entwicklungsstadien. Der
Strom wurde bei einem
Haltepotential von –80 mV
und einer 500 ms
dauernden Messspannung
von 100 mV gemessen.
Der Stromwert von 200 ms
wurde durch den Wert bei
15 ms geteilt.
S
Wobei ein sprunghafter Anstieg zwischen Stadium 33 und 34 zu beobachten ist. Dies
deutet auf unterschiedliche Kaliumkanäle in den verschiedenen RGZ
Entwicklungsstadien hin. Neben der Morphologie des Stromes ist die Kinetik ein
weiteres, wichtiges Charakteristikum für die Zuordnung von Strömen zu den
zugrunde liegenden Kaliumkanälen. In den nachfolgenden Versuchen wurde das
Öffnungs- und Schließungsverhalten der Kanäle, nach unterschiedlicher
Spannungsgebung untersucht. Die Strommaxima wurden beim Testpuls ermittelt und
in einem I/U Diagram dargestellt.
34
Abb.14: Originalregistrierungen der Kinetik. Links Stadium 29, rechts Stadium 34. Ein Vorpuls wurde
über 500 ms von –120 auf + 40 mV in 10 mV Schritten appliziert. Der Testpuls betrug +60 mV über
500 ms.
Zeigen sich Unterschiede im Verlauf der Kurven, so liegen den Summenströmen
unterschiedliche Kanäle zugrunde. Neben dem Kurvenverlauf ist die halbmaximale
Inaktivierung des Summenstromes zu betrachten. Dieser IC 50 Wert gibt die
Spannung an, bei der die Hälfte der Kanäle geschlossen ist.
-120 -80 -40 0 400,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Stro
m [I
/Imax
]
Vorpuls [mV] Abb.15: Ergebnisse der Kaliumkanalkinetik. (Schwarz Stad. 29/30; Rot = 31; Grün 34/35; Blau = adult) Die Zellen
wurden auf ein Haltepotential von – 60 mV geklemmt. Ein Vorpuls über 500 ms von –120 auf + 40 mV wurde in
10 mV Schritten stufenförmig appliziert. Der Testpuls betrug +60 mV über 500 ms. Das Strommaximum wurde
nach den verschiedenen Vorpulsen ermittelt und der Strom normiert dargestellt. Die IC 50 Werte sind mit den
gestrichelten Linien gezeigt. Die Kurven wurden durch eine modifizierte Boltzmann Gleichung angenähert.
35
Der Kurvenverlauf verschiebt sich signifikant mit jedem weiteren
Entwicklungsstadium in den positiveren Bereich. Dabei berühren sich die Kurven
nicht. Die Auswertung der IC 50 Werte verdeutlicht dieses.
Stadium 29 31 33/34 36
IC 50 [mV] -45 -31,7 -13,3 -1,6
Tab.9: Errechnete IC 50 Werte der Kaliumkanalkinetik.
Die IC 50 Werte verschieben sich deutlich von –45 mV bei Stadium 29 auf –1,6 mV
bei Stadium 36. Dabei ist eine kontinuierliche Verlagerung der Werte in positiver
Richtung zu beobachten. Zusammen mit der I/U Auswertung der Kinetik kann
angenommen werden, dass in jüngeren Stadien Kanäle expremiert werden, die bei
negativeren Spannungen schließen als die der weiter entwickelten RGZ. Die
vorhergehenden Auswertungen zeigten deutlich, dass in der Entwicklung der RGZ
der Summenausstrom steigt und die Zusammensetzung der zugrunde liegenden
Kanäle sich verändert. Welche Ionenkanäle hierbei eine Rolle spielen soll in einer
weiterführenden pharmakologischen Untersuchung geklärt werden.
3.4.1 Hauptklassen von Kaliumkanälen
Die Summenausströme der adulten RGZ wurden in vorhergehenden Arbeiten
untersucht (Pöttering, Vent, Stegmann). Sie werden hauptsächlich von zwei
verschiedenen Kaliumkanalpopulationen getragen. Den spannungsabhängigen
Kaliumkanälen wie den Shaker und Shaw und den kalziumabhängigen
Kaliumkanälen. Diese sind in adulten RGZ durch Iberiotoxin blockierbar und gehören
folglich der Gruppe der BK Kaliumkanäle an. Durch den Austausch von CoCl2 für
CaCl2 in der Badlösung kann der Kalziumeinstrom in die Zelle unterbunden und die
kalziumabhängigen Kaliumkanäle indirekt blockiert werden. Um den Anteil von
kalziumabhängigen Kaliumkanälen am Summenausstrom der RGZ während der
Reifung zu bestimmen, wurde der Summenausstrom in TaCSF bestimmt und
anschließend 0,2 mM CoCl2 oder 100 µM Iberiotoxin eingespült.
36
0
5
10
15
20
25
30
35
Stad 29-31 Stad 32-33 adult
Entwicklungsstadium
Red
uktio
n de
s S
umm
enau
sstro
mes
[%]
Abb.16: Die Reduktion des maximalen Summenausstromes durch 0,2 mM CoCl2 (Blau) und 100 µM
Iberiotoxin (Rot) bei einer Spannung von 100 mV über 500 ms und einem Haltepotential von –80 mV.
Die Reduktion des Summenausstromes durch CoCl2 und Iberiotoxin erreicht in allen
drei untersuchten Stadien die gleichen Werte. Die kalziumabhängigen
Summenströme werden durch Kaliumkanäle der BK Familie getragen. Dabei erreicht
die Hemmung in den verschiedenen Stadien ein verschiedenes Niveau. In juvenilen
RGZ vor dem Schlupf erfolgt keine signifikante Hemmung durch Iberiotoxin oder
CoCl2. Erst nach dem Schlupf steigt bei Stadium 32/33 der Anteil des
kalziumabhängigen Stromes am Gesamtstrom an und erreicht in adulten RGZ einen
Wert von ca. 30 %. Um festzustellen, ob die BK Kanäle eher den IA oder den KD
Stromanteil des Summenausstromes beeinflussen, wurde die Hemmung durch CoCl2
für unterschiedliche Zeitpunkte bestimmt.
37
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
27-30 33 adult
Stadium
Stro
mre
dukt
iom
[%]
Abb.17: Die Reduktion des maximalen Summenausstromes durch 0,2 mM CoCl2 bei einer Spannung
von 100 mV über 500 ms und einem Haltepotential von –80 mV. Der Peakstrom (schwarz) wurde bei
15 ms der KD-Strom (rot) bei 200 ms ermittelt.
Der Peak und KD Strom werden im gleichen Maße durch CoCl2 gehemmt. Der Anteil
von kalziumabhängigen Kaliumkanälen ist somit beim inaktivierenden und nicht
inaktivierendem Strom gleich.
3.4.2 Spannungsabhängige Kaliumkanäle
3.4.2.1 Charakterisierung des IA Stroms in adulten RGZ
Der Summenausstrom der adulten RGZ besteht aus 2 unterschiedlichen
Komponenten. Der langsam aktivierende und nicht inaktivierende Stromanteil wird
als KD Strom bezeichnet. In Gegensatz dazu steht der IA Strom, welcher schnell
aktiviert und schnell inaktiviert. Aus der Addition dieser Ströme ergibt sich das
Summenausstrommuster. Durch den Einsatz der Kaliumkanalblocker Chinin und
Iberiotoxin wurde der Hauptanteil des KD Strom blockiert. Bei diesen Experimenten
wurde ein IA Strom sichtbar. Aufgrund vorhergehender Arbeiten (Pöttering 2000)
könnte es sich um einen Kv. 3.4 Kaliumkanal handeln. Dessen Strom wird durch das
Seeanemonengift BDS-l blockiert (Diochot et al1998)
38
Abb.18: Der Summenausstrom einer adulten RGZ wurde in
100 µM Chinn und 0,2 mM CoCl2 bei einem Haltepotential
von –80 mV gemessen (A). Die Spannung wurde vom
Haltepotential ausgehend in 10 mV Schritten stufenförmig
bis auf +100 mV appliziert. Der Summenausstrom der
selben Zellen (B) mit 100 µM Chinin, 0,2 mM CoCl2 und
100 nM BDS. Bei C ist der Subtraktionsstrom der
Stromspuren von A-B dargestellt. 150 pA40 ms
A
B
C
Deutlich wird die IA Komponente des
Summenausstromes in Anwesenheit von Chinn
und CoCl2 hervorgehoben. Durch den Einsatz
des Blocker BDS l wurde keine signifikante
Reduktion des IA Stromes erreicht. Dieser Anteil
des Stromes kann folglich nicht durch Kv 3.4
Kanäle getragen werden.
3.4.2.2 Charakterisierung des Summenausstromes in RGZ
In RGZ vor dem Schlupf kann ein Summenausstrom um 1,7 nA gemessen werden.
Dieser Strom wird nicht durch kalziumabhängige Kaliumkanäle verursacht. Er kann
jedoch, wie in den adulten Zellen gezeigt (Vent 1999; Pötteing 2000; Stegmann
1998) durch spannungsabhängige Kaliumkanäle getragen werden. Durch den
Einsatz des Kaliumkanalblockers TEA (Grissmer et al 1994) in einer hohen
Konzentration können viele spannungsabhängige Kaliumkanäle, z.B. einige des
Shaker Typs gehemmt werden.
Peakstrom KD-Strom
Reduktion durch 2 mM
TEA [%]
78,4 ± 5 73 ± 3,6
Tab. 10: Reduktion des maximalen Summenausstroms von RGZ Stadium 29 und 30 durch 2 mM TEA.
Die Zellen wurden auf ein Haltepotential von –80 mV geklemmt und über 500 ms die Reizspannung
von 100 mV appliziert. Der Peakstrom wurde bei 15 ms, der KD bei 200 ms ermittelt.
39
Über 70 % des Summenausstromes von RGZ der Stadien 29 und 30 wird durch den
Einsatz von 2 mM TEA blockiert. Dabei werden IA und KD Strom gleichstark
gehemmt. Der Anteil des durch spannungsabhängige Kaliumkanäle getragen
Stromes kann noch weit höher liegen, da einige dieser Kanäle TEA insensitiv sind.
Für die genaue Zuordnung der Ströme zu einem bestimmten Kaliumkanal müssen
spezifische Blocker eingesetzt werden. In vorhergehenden Untersuchungen wurden
Kaliumkanäle aus dem ZNS der Forelle heterolog expremiert (Ngyuen et al 2000)
und elektrophysiologisch gemessen. Die dabei durchgeführte pharmakologische
Charakterisierung zeigte für den Shaker Kaliumkanal Tsha 2 die vollständige
Blockierung durch 100 µM TEA. Kann in Vorschlupf RGZ ein auf 100 µM TEA
reagierender Strom nachgewiesen werden, so kann dieser durch Tsha 2
Kaliumkanäle getragen werden.
Stadium 29
Stadium 34
Abb. 19: Originalregistrierungen des Summenausstromes von 2 RGZ Stadium 29 (oben) und 34
(unten). Die Zellen wurden auf ein Haltepotential von –80 mV geklemmt. Davon ausgehend wurden
die Spannungspulse in 10 mV Schritten stufenförmig über 500 ms bis auf + 100 mV gegeben. Die
Messungen wurden in TaCSF (links) durchgeführt und anschließend in 100 µM TEA (Mitte)
wiederholt. Der Subtraktionsstrom (TaCSF - 100 µM TEA) ist Rechts dargestellt.
40
0
10
20
30
40
50
60
70
26-28 29-30 31-32 33-34 35 adult
Stadium
Red
uktio
n de
s Su
mm
enau
sstro
ms
[%]
Abb. 20: Reduktion des maximalen Summenausstromes durch 100 µM TEA gemessen bei einem
Haltpotential von –80 mV und einer Spannung von 100 mV über 500 ms. Blau = Peakstrom bei 15 ms;
Rot = KD Strom bei 200 ms
Durch die geringe Dosierung von TEA wird im Gegensatz zum Einsatz von 2 mM
TEA ein höherer Anteil an KD Strom gehemmt. Eine deutliche Reduktion des
Summenausstromes durch 100 µM TEA erfolgt erst nach dem Schlupf bei Stadium
32. In RGZ vor dem Schlupf wird folglich kein signifikanter Anteil des Stromes durch
Tsha 2 Kaliumkanäle getragen. Neben Tsha 2 wurde ein weiterer Shakerkanal aus
dem ZNS der Forelle (Tsha 1) in vorhergehenden Untersuchungen heterolog
expremiert sowie elektrophysiologisch und pharmakologisch charakterisiert (Nguyen 2000). Seine Expression in adulten RGZ wurde mit dem Einsatz des für Tsha 1
spezifischen Blockers DTX nachgewiesen. Die Reduktion des Summenausstromes in
verschiedenen RGZ Stadien durch den Einsatz von 1 µM DTX wurde untersucht.
41
Stadium 30 / 31
Stadium 34 / 35
TaCSF DTX Subtraktionsstrom
Abb. 21: Originalregistrierungen des Summenausstromes von RGZ Stadium 30 / 31 (oben) und 34 /
35 (unten). Die Zellen wurden auf ein Haltepotential von –80 mV geklemmt. Davon ausgehend wurden
die Spannungspulse in 10 mV Schritten stufenförmig über 500 ms bis auf + 100 mV gegeben. Die
Messungen wurden in TaCSF (links) durchgeführt und anschließend in 1 µM DTX (Mitte) wiederholt.
Der Subtraktionsstrom (TaCSF - 1 µM DTX) ist Rechts dargestellt.
0
10
20
30
40
26/27 30/31 32 34/35
Stro
mre
dukt
ion
[%]
Abb.22: Reduktion des Summenausstromes von RGZ durch 1 µM DTX. Der maximale
Summenausstrom wurde bei einem Haltepotential von –80 mV und einer Spannungsgebung von 100
mV über 500 ms in TaCSF und in Anwesenheit von 1 µM DTX ermittelt.
42
In den Stadien vor dem Schlupf ist durch den Einsatz von 1 µM DTX nur eine geringe
Reduktion des Summenausstromes um 6 % feststellbar. Nach dem Schlupf steigt der
Anteil auf 15 % bei Stadium 32 und weiter auf 26 % bei Stadium 34/35 an. Der
Summenausstrom in RGZ vor dem Schlupf wird nicht hauptsächlich durch Tsha 1
und Tsha 2 Kaliumkanäle getragen, da sonst eine höhere Stromreduktion mit DTX
und 100 mM TEA erreicht werden müsste. Bei adulten RGZ wird 80 % des
spannungsabhängigen Summenausstromes durch 100 µM Chinin gehemmt (Henne
et al 2000). Sollte dieser Blocker eine Reduktion des Stromes bei Vorschlupf RGZ
verursachen, so könnte dem Ausstrom ein spezifischer Kaliumkanal zugeordnet
werden.
TaCSF Chinin Subtraktionsstrom
Stadium 28
Stadium 34 / 35
Abb. 23 Originalregistrierungen des Summenausstromes von RGZ Stadium 28 (oben) und 34 / 35
(unten). Die Zellen wurden auf ein Haltepotential von –80 mV geklemmt. Davon ausgehend wurden
die Spannungspulse in 10 mV Schritten stufenförmig über 500 ms bis auf + 100 mV gegeben. Die
Messungen wurden in TaCSF (links) durchgeführt und anschließend in 100 µM Chinin (Mitte)
wiederholt. Der Subtraktionsstrom (TaCSF - 100 µM Chinin) ist Rechts dargestellt.
43
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
27/28 31/30 32/33 34/35 adult
Stadium
Red
uktio
n de
s S
umm
enau
sstro
mes
[%]
Abb.24: Reduktion des Summenausstroms von RGZ durch 100 µM Chinin. Die Zellen wurden auf ein Haltepotential von –80 mV geklemmt und der maximale Ausstrom in TaCSF und 100 µM Chinin bei einem Spannungspuls von 100 mV über 500 ms gemessen. Der Peakstrom (blau) wurde bei 15 ms, der KD Strom (rot) bei 200 ms ermittelt.
In keiner RGZ konnte vor dem Zeitpunkt des Schlüpfens eine Reduktion des Stromes
durch Chinin festgestellt werden. Nach dem Schlupf steigt der Anteil des chinin-
sensitiven Stromes bei Stadium 30 / 31 sprunghaft auf 49 % Peak und 73 % KD an.
Diese Werte verändern sich im Rahmen der Reifung nicht signifikant. Die Reduktion
bei adulten RGZ beträgt am Peak gemessen 50 % und die des KD Stroms 73 %. In
allen Stadien blockiert Chinin den KD Strom deutlich stärker als den Peakstrom.
Durch die Experimente mit den spezifischen Kaliumkanalblockern, TEA, Chinin und
DTX wurde gezeigt, dass die Zusammensetzung der Kaliumkanäle in RGZ vor und
nach dem Schlupf bzw. in adulten Zellen völlig verschieden ist. Um den Zeitpunkt des
Schlüpfens findet ein völlige Neuzusammensatzung der Kaliumkanäle und deren
daraus resultierenden Ströme statt.
44
3.4.2.3 Heterologe Expression von Kv3.1 in Sf21 Zellen
Ein wesentlicher Teil des spannungsabhängigen Summenausstromes wird in adulten
RGZ von einem chininsensitiven Kaliumkanal getragen. Kaliumkanäle der Shaw
Familie zeigen dieses pharmakologische Profil. In früheren Studien wurde ein Shaw
Kaliumkanal (Trout Shaw = Traw1) aus dem ZNS der Forelle isoliert (Panofen et al
2000). Dieser Traw1 wurde in das Baculovirus-Expressionssystem kloniert und Viren
mit einem C-terminalen GFP-Fusionsprotein generiert. Die damit infizierten Sf21
Zellen konnten leicht über ihre grüne Fluoreszenz identifiziert werden. Die
Verwendung von Sf21 Zellen für die heterologe Expression von
spannungsabhängigen Kaliumkanälen bietet viele Vorteile. Die Zellen sind in der
Zellkultur sehr anspruchslos und einfach zu vermehren. Sie sind relativ groß, rund
und bilden keine Zellausläufer wie z.B. CHO Zellen. Dies erleichtert die Messungen
erheblich. Sf21 Zellen zeigen zusätzlich nur einen geringen Eigenstrom von ca. 200-
300 pA. Bei der Expression von Traw1 wurden Ströme von 10 bis 20 nA gemessen.
Der Eigenstrom der Zelle konnte vernachlässigt werden.
Chinin [mM]
Nor
mie
rter S
trom
[I/I
]m
ax
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
0.0110-1
10-210-3
Abb. 25: Dosis Wirkungskurve von
Chinin auf den in Sf21 Zellen
heterolog expremierten Kaliumkanal
Traw1. Die Zellen wurden auf ein
Haltepotential von –60 mV geklemmt
und der Maximalausstrom bei einer
Spannungsgebung von 100 mV vor
und nach der Zugabe von Chinin
gemessen.
Diese Dosis - Wirkungskurve zeigt die hohe Sensitivität des Traw 1 Kaliumkanals
gegenüber Chinin. Der Strom wird durch den Einsatz von 0,1 mM Chinin vollständig
blockiert. Da der Kanal in seiner Primässequenz am C-Terminus 5
Konsensussequenzen zur Phosphoryliering durch Proteinkinase C (PKC
Phosphorylierung) enthält, lag es nahe, den Einfluss des Phorbolesters TPA auf den
Strom zu untersuchen. Zu diesem Zweck wurden 50 nM TPA in die Badlösung
45
gespült. Dies führte zu einer zeitabhängigen Reduktion des Kaliumstromes. Nach 10
min wurde die Stromamplitude um 50 % reduziert. Bei einer vorherigen Inkubation
der Zellen mit dem Proteinkinaseinhibitor H7 wurde keine Reduktion des Stroms
gemessen.
Abb. 26: Effekt von 50 nM TPA auf die
Stromamplitude von Traw 1 expremiert in Sf21
Zellen. Der maximale Ausstrom wurde bei einem
Haltepotential von –60 mV und einer Stromgebung
von 100 mV in 50 nM TPA (Quadrat) und nach
vorheriger Inkubation mit 100 µM H7 (Kreise)
gemessen. 0,40
0,50
0,60
0,70
0,80
0,90
1,00
1 3 5 7 9Zeit [min]
Rel
ativ
er S
trom
[I/I
max
]
Der chininsensitive Summenausstrom in RGZ wird durch den Shaw Kaliumkanal
Traw 1 getragen. Die Beeinflussung des Kanals durch Phosphorilierung kann in der
Zelle erfolgen und damit eine weitere Möglichkeit der Regulation von Kaliumkanälen
darstellen.
3.5. Einsatz von Antikörpern in der Elektrophysiologie
3.5.1 Wirkung von Antikörpern auf den Summenausstrom von Kv3.1 und RGZ
Die den Summenausströmen von adulten RGZ zugrunde liegenden Kanäle sind
zu einem großen Teil zugeordnet. Diese Arbeiten wurden größtenteils mit
spezifischen Kanalblockern durchgeführt. Das Einbringen dieser Blocker in die
Badlösung geht jedoch mit einer starken mechanischen Belastung der Zellen einher
und ist mit einer möglichen Schädigung verbunden, daraus kann eine verfälschte
Messung resultieren. Ein weiteres Problem besteht darin, dass nicht für alle Kanäle
spezifische Blocker vorhanden sind. Um die mechanische Belastung der Zellen zu
minimieren, besteht die Möglichkeit, Kanäle über Giftgabe in der Pipettenlösung vom
Zellinneren her zu blockieren. Eine Kontrollmessung ohne Blocker kann dabei nicht
an der selben Zelle durchgeführt werden, da ein Austausch der Pipettenlösung
46
während der Messung nicht möglich ist. In den folgenden Untersuchungen sollte die
Frage geklärt werden, ob ein spezifischer Antikörper in der Pipettenlösung den
zugehörigen Kanal blockieren kann. Der Antikörper Traw 03, der gegen einen Teil
des N-Terminus von Traw 1 gerichtet ist, wurde dazu getestet. Der Kaliumkanal
wurde in Sf21 Zellen expremiert. In die Pipettenlösung wurden Antikörper gegen
Traw 1 oder Tsha 1 gegeben.
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1
0 2 4 6 8 10 12Zeit [min]
I/Im
ax
Abb. 27: Die Wirkung von 2 Antikörpern Tsha1 (schwarze Quadrate) und Traw 03 (rote Quadrate) auf
den Kv3.1 Strom in Sf21 Zellen. Sie wurden in einer Konzentration von 1:100 in der Pipettenlösung
eingesetzt. Die Zellen wurden auf ein Haltepotential von –60 mV geklemmt. Der Maximalstrom wurde
alle 60 Sekunden bei einer Spannungsgabe von +100 mV ermittelt. Der Strom wurde normiert
dargestellt.
Der Traw 03 Antikörper in der Pipettenlösung bewirkt eine kontinuierliche,
zeitabhängige Reduktion des Kv3.1 Stroms. Die maximale Hemmung von 64% wird
nach 10 Minuten erreicht. Der Einsatz des Tsha 1 Antikörpers zeigt keine signifikante
Wirkung auf die Höhe des Ausstroms. Nach 10 Minuten beträgt dieser 87% des
Maximalwertes. In den nachfolgenden Originalregistrierungen wird die Wirkung der
beiden Antikörper exemplarisch aufgezeigt.
47
0 Minuten 6 Minuten
Tsha 1
Traw 03
Abb.28: Originalregistrierungen von Kv3.1 expremiert in Sf21 Zellen. Die Zellen wurden von dem
Haltepotential von –60 mV aus in 10 mV Schritten auf bis 100 mV über 500 ms gereizt. Bei den
oberen Stromspuren wurde eine Pipettenlösung mit 1:100 Tsha1 Antikörper in den unteren Spuren
eine Pipettenlösung mit Traw 03 Antikörper 1:100 verwendet. Die Messungen wurden nach 0 Minuten
(links) und nach 6 Minuten (rechts) durchgeführt.
Der Einsatz von Traw 03 in der Pipettenlösung bewirkt eine Reduktion des Traw 1
Stroms bei der heterologen Expression des Kanals. Diesem Kanal liegt in adulten
RGZ ein großer Teil des spannungsabhängigen Summenausstromes zu Grunde. In
diesem System kann geklärt werden, ob der Kanal in seinem physiologischen
Kontext durch den Einsatz eines spezifischen Antikörpers blockiert wird. Dabei wird,
wegen der geringern Größe der RGZ gegenüber dem Sf21 Zellen, eine geringere
Konzentration des Antikörpers in der Pipettenlösung verwendet.
48
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1 3 5 7 9 11
Zeit [min]
I / I
max
Abb.29: Wirkung von Tsha1 (Schwarz) und Traw 03 (Rot) Antikörpern 1:350 in der Pipettenlösung auf
den spannungsabhängigen Summenausstrom von adulten RGZ.. Alle Messungen wurden in einer
Badlösung mit 0,2 mM CoCl2 durchgeführt. Die RGZ wurden von einem Haltepotential von –80 mV
aus über 500 ms mit 100 mV gereizt. Alle 60 Sekunden wurde der Maximalstrom bestimmt. Der Strom
wurde normiert dargestellt.
Traw 03 reduziert deutlich den spannungsabhängigen Summenausstrom der RGZ.
Innerhalb der ersten 3 Minuten sinkt die Amplitude um 50 %. Das Maximum der
Hemmung wird nach 4 Minuten mit ca. 60 % erreicht. Danach sinkt der Strom nicht
weiter ab. Beim Einsatz des Tsha 1 Antikörpers in der Pipettenlösung erfolgt
ebenfalls eine Reduktion des Stromes. Sie ist mit ca. 20 % deutlich geringer als mit
Traw 03. Durch diese Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass der
spannungsabhängige Kaliumkanal Traw 1 in RGZ durch den Einsatz eines
spezifischen Antikörpers gehemmt werden kann. Dabei entspricht die Reduktion des
Stromes in etwa dem Werten, die mit dem Blocker Chinin erzielt wurden.
3.5.2 Wirkung von Antikörpern auf Aktionspotentialmuster
Die Reduktion des Traw 1 Stromes durch einen spezifischen Antikörper ist in der
vorhergehenden Untersuchung beschrieben. Mit Hilfe einer geringen Konzentration
des Antikörpers in der Pipettenlösung soll der Einfluss des Traw 1 Stromes auf die
Aktionspotentiale untersucht werden.
49
Abb.30: Originalregistrierungen einer adulten RGZ bei Reizung mit 60 pA. In der Pipettenlösung wurde
der Antikörper Traw 03 1:1000 eingesetzt. Die Messungen wurden nach 0 (links) einer (Mitte) und
zwei (rechts) Minuten durchgeführt.
0
20
40
60
80
100
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 5 5,5
Messzeit [min]
Anz
ahl d
er A
ktio
nspo
tent
iale
[%]
Abb.31: Die Wirkung von Traw 03 Antikörpern bei einer Verdünnung von 1:1000 in der
Pipettenlösung. Die Zellen wurden bei einem Strom von 60 pA über 500 ms all 30 Sekunden
gemessen.
Der Traw 03 Antikörper wurde in einer geringeren Konzentration als in den
Experimenten zum spannungsabhängigen Summenausstrom eingesetzt. Eine
Wirkung ist jedoch ähnlich schnell zu beobachten. Die Anzahl der Aktionspotentiale
reduziert sich innerhalb der ersten 2 Minuten um 68 %. Anschließend ist keine
signifikante Reduktion der Peaks zu beobachten. Dies deutet auf die Rolle des Traw
1 Stromes bei der Generation eines regelmäßigen Feuermusters hin. Die Reduktion
50
der Anzahl der Aktionspotentiale kann nicht über die Dauer der Messung uns eine
damit verbundene Schädigung der Zelle erklärt werden. Wie aus den folgenden
Originalregistrierungen zu ersehen, tritt keine Reduktion der Ap Anzahl nach
5 Minuten Messzeit ein.
15 mV20 ms
Abb.32: Ausschnitt aus einer Originalregistrierung einer RGZ Stadium 35 bei einer Stromgebung von
40 pA über 500 ms. Die Messung erfolgte nach 0 (links) und 5 (rechts) Minuten.
In den nachfolgenden Untersuchungen wurde die Wirkung des Antikörpers auf ein
einzelnes Aktionspotential bestimmt. Die maximale Depolarisation der
Aktionspotentiale wurde bei induzierter und bei Spontanaktivität gemessen.
Minuten 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4
Höhe des
1.Ap´s [mV]
9
±4,4
7,3
±4
5,7
±3,4
4
±2,7
2,8
±2,8
1,5
±3
0
±2,8
-0,5
±2
-1
±3,2
Höhe Ap [mV]
Spontanaktivität
6 -4 2 -1 -6
Tab. 11: Wirkung des Traw 03 Antikörpers in einer Verdünnung von 1:1000 auf die
Aktionspotentialhöhe von adulten RGZ bei einem Strom von 60 pA über 30 ms (oben) oder in einer
Verdünnung von 1:350 bei 500 ms Messung ohne Stromgebung (unten). Die Höhe der
Aktionspotentiale wurde alle 30 bzw. 60 sec bestimmt.
Trotz der unterschiedlich hohen Antikörperkonzentration in der Pipettenlösung zeigt
sich bei beiden Messreihen ein ähnliches Bild. Die Höhe der Aktionspotentiale sinkt
kontinuierlich mit zunehmender Messzeit. Dabei zeigt sich kein signifikanter
Unterschied zwischen spontanen und induzierten Aktionspotentialen. Die Reduktion
51
beträgt 10 bzw. 12 mV in 4 Minuten. Neben der maximalen Depolarisation ist die
Breite bzw. Dauer eines Aktionspotentiales von großer Bedeutung.
Minuten 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4
Breite des Ap´s
[ms] induziert
0,69
±0,07
0,69
±0,09
0,76
±0,16
0,71
±0,09
0,71
±0,06
0,71
±0,04
0,73
±0,06
0,72
±0,08
0,73
±0,07
Breite des Ap´s
[ms] spontan
0,8
1,4
1,2
1,4
2,4
Tab. 12: Wirkung des Traw 03 Antikörpers in einer Verdünnung von 1:1000 auf die
Aktionspotentialbreite von adulten RGZ bei einem Strom von 60 pA über 30 ms (oben) oder in einer
Verdünnung von 1:350 bei 500 ms Messung ohne Stromgebung (unten). Die Dauer der
Aktionspotentiale wurde alle 30 bzw. 60 sec bestimmt. Die Messpunkte wurden auf halber Höhe
zwischen Aktionspotentialmaximum und Repolarisationsmaximum gesetzt.
Die Wirkung des Traw 03 Antikörpers auf die Breite des Aktionspotentiales ist bei
spontaner und induzierter Aktivität verschieden. Im Fall der Spontanaktivität zeigt
sich eine Verlängerung der Ap Dauer innerhalb von 4 Minuten um den Faktor 3,
während bei der induzierten Aktivität keine signifikante Verlängerung festzustellen ist.
Dieses deutet auf eine mögliche unterschiedliche Rolle des Traw Stroms bei der
Generation von Aktionspotentialen nach Strominduzierung oder bei Spontanaktivität
hin.
3.6 Ergebnisse der PCR Studien
Der Einsatz von spezifischen Blockern und die Verwendung von Antikörpern in der
Pipettenlösung ermöglicht die Blockierung eines bestimmten Kanals oder einer
Kanalpopulation. Damit ist eine Untersuchung des zugrunde liegenden Stromes und
seiner Wirkung auf die Aktionspotentiale möglich. Die Expression verschiedener
Kanäle ist jedoch nicht nachvollziehbar. Bei der Verwendung der Einzel Zell RT PCR
Methode kann die Transkription mehrerer Kaliumkanäle in einer Zelle nachgewiesen
werden. In Fall der RGZ wurden diese Untersuchungen zum Nachweis der
Transkription von 4 Shaker (Tsha1-4) und 2 Shaw Kanälen (Traw1/2= Kv3.1 R/C) in
verschiedenen Entwicklungsstufen durchgeführt.
52
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Stad 27-30 n= 9 Stad 33-35n= 12 Stad 36-adult n= 24
Anz
ahl d
er Z
elle
n [%
]
Abb.33: Auswertung der RT PCR Untersuchungen. Nachweis der Transkription von 6 Kaliumkanälen
in verschiedenen RGZ Entwicklungsstadien (Gelb=Tsha1; Rot = Tsha2; Schwarz = Tsha3; Blau =
with a specific Blocking Activity against the Fast Inactivating Potassium
Channel Kv3.4; The Journal of Biological Chemistry; vol 273,
No 12, 6744-6749
Dudel, J., Menzel, R., Schmidt, R.F. (1996): Neurowissenschaft, Springer Verlag,
Heidelberg
Fohlmeister, J.F. and Miller, R.F. (1997): Impulse Encoding Mechanisms of Ganglion
cells in the Tiger Salamander Retina: J. Neurophysiology; 78: 1935-1947
Fohlmeister, J.F. and Miller, R.F. (1997a): Mechanisms by Which Cell Geometry
Controls Repetitive Impulse firing in Retinal Ganglion Cells.
J. Neurophysiology; 78: 1948-1964
Garcia ML, Galvez A, Garcia-Calvo M, King VF, Vazquez J, Kaczorowski G.(1991): Use of toxins to study potassium channels. J Biomembr Bioenerg 23:615-646.