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OMICS. 2013 Feb;17(2):61-70. doi: 10.1089/omi.2012.0082.
EMERGING TRENDS IN GENOMIC APPROACHES FOR MICROBIAL
BIOPROSPECTING. Akondi KB, Lakshimi VV. Main aspects 1.
Microorganisms constitute two out of the three domains of life on
earth.
2. They exhibit vast biodiversity and metabolic versatility.
This enables the microorganisms to inhabit and thrive in even the
most extreme environmental conditions, making them all pervading.
3. The magnitude of biodiversity observed among microorganisms
substantially supersedes that exhibited by the eukaryotes. 4. These
characteristics make the microbial world a very lucrative and
inexhaustible resource for prospecting novel bioactive
molecules.
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Over 99% of the microbial world still remains to be
explored.
The primary reason for this is that the culture-dependent
methods
used in the laboratories are grossly insufficient, as they
support the growth of under 1% of the microorganisms found in
nature.
This limitation necessitated the development of techniques to
circumvent culture dependency and gain access to the outstanding
majority of the
microorganisms. The development of culture-independent
techniques has essentially reshaped the study of microbial
diversity and community
dynamics. Application of genomic and metagenomic approaches
is
contributing substantially towards characterization of the real
microbial diversity.
The amenability of these techniques to high throughput has
opened the doors to explore the vast number of "uncultivable"
microbial forms in
substantially lesser time..
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I MICROORGANISMI e il loro AMBIENTE NATURALE
In natura le cellule vivono in associazione con altre
cellule
L’insieme di più popolazioni che occupano lo stesso habitat e
sono metabolicamente correlate
CONSORZIO MICROBICO
POPOLAZIONI INSIEME DI NUMEROSI ORGANISMI DELLA STESSA
SPECIE
Composte da gruppi di cellule che derivano da divisioni
cellulari successive a partire da una singola cellula parentale
Si definisce habitat il luogo in cui una popolazione microbica
vive
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sono costituite da diverse popolazioni microbiche (consorzi) che
interagiscono tra di loro in un
determinato ambiente.
COMUNITA’ MICROBICHE
I componenti e il num di cellule che costituiscono una comunità
microbica dipendono dalle risorse e dalle condizioni presenti in
quel determinato habitat
ECOSISTEMA è costituito dagli organismi viventi unitamente
ai
costituenti chimici e fisici dell’ambiente di cui fanno
parte
Le popolazioni in una comunità microbica interagiscono tra loro
in modo benefico e/o dannoso
In molti casi vi è cooperazione: per esempio i prodotti di
scarto delle attività metaboliche di alcune cellule possono fungere
da nutrienti per altre cellule
Gio
vanni V
allin
i © 2
006
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I MICROORGANISMI e il loro AMBIENTE NATURALE
Un ECOSISTEMA è controllato in modo significativo dalle
TRASFORMAZIONI
MICROBICHE
I microorganismi, conducendo i loro processi metabolici,
rimuovono nutrienti dall’ambiente circostante.
Allo stesso tempo, liberano nell’ambiente i loro prodotti di
scarto
Nel tempo, un ECOSISTEMA gradualmente cambia, sia CHIMICAMENTE
che FISICAMENTE
attraverso le trasformazioni microbiche dei nutrienti
ECOLOGIA MICROBICA studio dei microrganismi nei loro habitat
naturali
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MAIN QUESTIONS
1. CHE TIPO DI MICROORGANISMI SONO PRESENTI 2. CHE COSA FANNO 3.
IN CHE MODO LE LORO ATTIVITA’
SONO COLLEGATE ALLE FUNZIONI DELL’ECOSISTEMA?
4. COME POSSO UTILIZZARLI?
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METODI per l’ANALISI dei MICROORGANISMI e delle COMUNITA’
MICROBICHE
Metodi
CULTURE-DEPENDENT Metodi
CULTURE-INDEPENDENT
Permettono l’ISOLAMENTO dei microrganismi mediante l’impiego di
terreni selettivi specifici per la
crescita seguito da una CARATTERIZZAZIONE mediante
saggi fisiologici e metabolici
Tecniche che prescindono dalla coltivabilità di un
microrganismo.
Consentono di monitorare la COMPOSIZIONE e le DINAMICHE di
popolazione delle comunità microbiche presenti in varie matrici
(acqua, suolo, reflui, alimenti etc.) senza ricorrere a
isolamenti preventivi
convenzionali molecolari
Permettono di analizzare le caratteristiche biochimiche e
genetiche delle cellule che compongono la comunità
Metodi MICROSCOPICI Utilizzando sonde fluorescenti permettono
l’identificazione in situ dei microrganismi (FISH)
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Le tecniche molecolari permettono la caratterizzazione sia della
frazione coltivabile che di quella non coltivabile presente in un
campione ambientale. Con le tecniche di coltivazione standard è
invece possibile identificare solo quei microorganismi capaci di
crescere su determinati terreni selettivi
La quantità di campione necessaria per lo studio della comunità
microbica utilizzando tecniche molecolari è minore rispetto a
quella necessaria per l’approccio classico
Solo con le tecniche culture-dependent è possibile avere a
disposizione il microorganismo isolato per studi di carattere
fisiologico e metabolico. È importante cercare di ottimizzare le
tecniche di pre-arricchimento e arricchimento selettivi per
riuscire a recuperare le popolazioni microbiche meno dominanti,
stressate e non coltivabili, che sono presenti a bassa carica
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http://www.google.it/url?sa=i&rct=j&q=&esrc=s&frm=1&source=images&cd=&cad=rja&docid=fGdQMsTwYbqIHM&tbnid=t_qhzJzamMQTKM:&ved=0CAUQjRw&url=http%3A%2F%2Fwww.frontiersin.org%2FJournal%2F10.3389%2Ffmicb.2012.00351%2Ffull&ei=ZwqBUvyFOMqo0wWquICwDg&psig=AFQjCNEQg7_94w7iDxYmLu-drTehEyJlSQ&ust=1384274905102714
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CULTURE-INDEPENDENT methods
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i) Direct lysis of bacterial cells in soil
ii) The extraction of the nucleic acids from the matrix
iii) The analysis of targeted sequences or of the whole body of
genetic information
Two main types of molecular technique are available to study
bacterial communities using DNA directly extracted from the soil
(figure 1): — molecular approaches which usually investigate parts
of this information by focusing on genome sequences which are
targeted and amplified by PCR that are called ‘partial community
DNA analysis’; — molecular approaches which try to investigate all
the genetic information in the extracted DNA and that are called
‘whole community DNA analysis’
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CULTURE-INDEPENDENT methods
1. RICOSTRUIRE L’EFFETTIVA COMPOSIZIONE DI UNA COMUNITA’
MICROBICA
2. SEGUIRE L’EVOLUZIONE E IL COMPORTAMENTO DI UN CONSORZIO
MICROBICO NEL TEMPO (MONITORAGGIO DIACRONICO) O NELLO SPAZIO
3. MONITORARE in situ LA PERSISTENZA DI UNO SPECIFICO TARGET
MICROBICO
4. VALUTARE LA SICUREZZA MICROBIOLOGICA TRAMITE MONITORAGGIO in
situ DI MICROORGANISMI PATOGENI
TECNICHE MOLECOLARI
Permettono di rilevare sia microorganismi presenti a basse
concentrazioni che microorganismi non coltivabili in
laboratorio
Acidi nucleici/Proteine/Lipidi
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ACIDI NUCLEICI
A. Tecniche che si basano sull’analisi delle sequenze di DNA
indipendentemente da conoscenze pregresse circa la struttura della
comunità microbica di interesse. In particolare le tecniche che si
basano sulla PCR si sono rivelate un mezzo estremamente veloce ed
efficace per l’identificazione, la caratterizzazione e il
monitoraggio dei microorganismi in generale e dei batteri in
particolare
B. Tecniche di ibridazione che impiegano sonde molecolari,
utilizzate quando esistono informazioni pregresse riguardo alla
comunità microbica di interesse
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Schematic representation of the different molecular approaches
for assessing the genetic diversity and structure of soil bacterial
communities. DNAs are directly extracted from soil samples and
subsequently analysed either by characterizing particular sequences
targeted and amplified by PCR (approaches called ‘partial community
DNA analysis’) or by characterizing all the genetic information
(approaches called ‘whole community DNA analysis’). PCR products
can be analysed by cloning or genetic fingerprint. Genetic
fingerprint consists in a rapid and simple electrophoretic analysis
of the PCR products enabling the analysis of the genetic structure
of the community. Characterization of cloned sequences enables
assessment of the genetic diversity of a community and can reveal
the phylogenetic affiliation of the community members. Similarly,
the sequencing of bands of fingerprint profiles can lead to
identification of particular populations. Whole community DNA
analyses such as cross-DNA hybridization and DNA fractionation by
density gradient can help to assess the genetic structure of a
community, whereas reassociation kinetics estimates genetic
diversity in terms of the number of different genomes present in a
community.
figure 1
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PARTIAL & WHOLE COMMUNITY ANALYSIS TECHNIQUES
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PARTIAL COMMUNITY ANALYSIS METHODS
These approaches consist in the analysis of PCR-amplified
sequences.
The most commonly used target sequences are the genes of the
ribosomal operon, and particularly the rrs gene (16S rRNA) and
the
spacer between the rrs and rrl genes (intergenic spacer (IGS)
16S-23S).
These methods include:
— ‘genetic fingerprinting’, which provides a global picture of
the genetic
structure of the bacterial community;
— PCR fragment cloning followed by restriction and/or
sequencing
analysis, which enable assessment of the diversity of the
community in
terms of the number of different species and, to a lesser
extent, the relative
abundance of these species.
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TECNICHE DI PCR FINGERPRINTING
In generale le metodiche molecolari basate sull’utilizzo della
PCR permettono di distinguere entità microbiche strettamente
correlate dal punto di vista genetico attraverso l’ottenimento di
specifiche impronte molecolari (molecular fingerprinting)
PCR con primers per marker genici di interesse TASSONOMICO
16S rRNA, 23S rRNA, regione intergenica 16S-23S
18S e 26S rRNA, ITS
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rRNA RIBOSOMALI
I rRNA possono essere considerati dei veri e propri CRONOMETRI
MOLECOLARI
perché caratterizzati dalla presenza al loro interno di zone più
o meno conservate,soggette a differente variabilità durante il
processo evolutivo.
L’informazione contenuta nei rRNA fa si che il sequenziamento
dei geni (rDNA) che codificano per le suddette macromolecole
permetta l’individuazione,su base genetica, di generi e specie,
anche nel caso di batteri di difficile classificazione
Molecole essenziali per la vita delle cellule Costituiscono la
parte non proteica dei ribosomi
Elementi chiave della sintesi proteica
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IL GENE 16S rRNA
LA SEQUENZA DEL GENE CHE CODIFICA PER IL16S rRNA NEI
MICROORGANISMI PROCARIOTI (EUBATTERI E
ARCHEBATTERI) SI E’ RIVELATA UN OTTIMO STRUMENTO TASSONOMICO
È una sequenza universale tra i batteri Non è soggetta a
trasmissione orizzontale Presenta regioni conservate e regioni
variabili intersperse discriminanti le diverse specie
batteriche
Le regioni al 5’ e 3’ del 16S rDNA sono fortemente conservate
mentre quelle interne presentano una maggiore variabilità. I
primers per le reazioni di PCR possono essere disegnati su tutte e
due le regioni fornendo informazioni differenti: -Se disegnati al
5’ e 3’ permettono amplificazione e sequenziamento di regioni
conservate che consentono l’identificazione del genere -Se
disegnati sulle regioni ipervariabili è possibile ottenere anche
l’identificazione della specie
RDP – Ribosomal Database Project – allineamento e
identificazione
-
http://www.google.it/url?sa=i&rct=j&q=&esrc=s&frm=1&source=images&cd=&cad=rja&docid=TH2fT935fp1xVM&tbnid=FsZDCTLTjwjpFM:&ved=0CAUQjRw&url=http%3A%2F%2Fwww.foodsafetywatch.org%2Ffeatures%2Fa-revolution-in-the-microbiology-laboratory%2F&ei=qg2BUrGlM-eU0AX2tIG4CA&bvm=bv.56146854,d.ZGU&psig=AFQjCNGk5vSH5TkNDv-5gg42mmKrrLP90A&ust=1384275719311743
-
The genetic fingerprints provide complex band profiles (i.e. a
high number of different bands per profile) which yield a
representative of the genetic structure of the community as a whole
or of a section of it, defined by the selected primers. These
profiles are not directly interpretable in terms of richness and
evenness, since one band may originate from different species and
one cell may be represented by several bands. This is particularly
true with ribosomal sequences, since a single bacterial species may
have several different rRNA sequences and different bacterial
species may have closely related rDNA sequences.
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ARDRA – Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis
Consiste nello studio dei profili elettroforetici ottenuti dopo
digestione con enzimi di restrizione
della sequenza di 16S rDNA ottenuta mediante PCR
Tecnica efficace, veloce, semplice ed economica per
l’identificazione della composizione di comunità microbiche
complesse
• Permette analisi simultanea di un elevato numero di
microorganismi • Fornisce importanti informazioni sulle popolazioni
microbiche presenti in ambienti differenti descrivendo il loro
grado di biodiversità e il loro comportamento nel tempo • Riesce a
discriminare i microorganismi a livello di specie
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ARDRA – Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis
L’ARDRA può essere utilizzata per lo screening di microorganismi
coltivabili e non coltivabili
1. Isolamento dei batteri dall’ambiente naturale mediante le
tradizionali tecniche di coltura/ottenimento del DNA totale dalla
matrice
2. Amplificazione del 16S/18S rDNA dei singoli isolati via PCR
3. Digestione degli ampliconi ottenuti mediante l’impiego di
endonucleasi 4. Separazione elettroforetica dei prodotti della
digestione per
ciascun amplicone e ottenimento di profili elettroforetici
tipici (impronta) per ciascun amplicone digerito
5. Suddivisione dei profili ottenuti per ciascun amplicone in
gruppi definiti OTU (Operational Taxonomic Units)
6. Sequenziamento del 16S/18S rDNA per il capostipite di ogni
OTUs
7. Allineamento delle sequenze ottenute con quelle presente in
banca dati mediante programma BLAST
8. Assegnazione dell’appartenenza a genere e specie
Su 16S/18S/26S
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COSTRUZIONE DI LIBRARY di 16S/18S rDNA
1. Estrazione del DNA totale dalla matrice ambientale di
interesse 2. Amplificazione dell’intero gene16S/18S rDNA o di una
regione
interna di interesse 3. Inserimento del gene in vettore di
clonaggio (pGEM, pBS) e
ottenimento di un numero di cloni compreso tra 100 e 200 4.
Screening dei cloni ottenuti mediante analisi RFLP sull’inserto
(metodica ARDRA)
CLONAGGIO E SEQUENZIAMENTO DEL 16S/18S rDNA
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Profili ARDRA ottenuti dagli isolati
da matrice ambientale
100bp 1kb
PbIsol 1 2 3 4 5 6 7 8
PbIsol 1 2 3 4 5 6 7 8
100bp 1kb
AluI
HhaI
-
http://www.google.it/url?sa=i&rct=j&q=&esrc=s&frm=1&source=images&cd=&cad=rja&docid=k7mPwo2WzDNc3M&tbnid=SAfOuPrKqZfU4M:&ved=0CAUQjRw&url=http%3A%2F%2Fwww.scielo.br%2Fscielo.php%3Fpid%3DS1517-83822012000100037%26script%3Dsci_arttext&ei=qwWBUvwiqsrRBbLxgPgN&bvm=bv.56146854,d.ZGU&psig=AFQjCNGDDQJekc4I_pfu5lxTpHDXrdP7Ig&ust=1384273704099379
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T-RFLP (Terminal-Restriction Fragment Lenght Polymorphism)
È una tecnica che si basa sulla digestione con endonucleasi di
restrizione di prodotti di PCR ottenuti direttamente dal DNA totale
estratto dalla matrice ambientale
Detti frammenti vengono generati da primers complementari a
sequenze consenso del 16S rRNA gene, entrambi marcati all’estremità
‘5 Gli ampliconi digeriti provenienti da tutti i batteri presenti
all’interno di una comunità sono separati o con elettroforesi su
gel o con elettroforesi capillare. Solo i frammenti che portano
l’estremità marcata vengono rilevati e contemporaneamente
analizzati da un sequenziatore automatico.
La T-RFLP unisce il vantaggio di poter essere facilmente
applicabile per l’analisi di più campioni con quello di fornire in
breve tempo informazioni a carattere tassonomico mediante il
diretto sequenziamento degli ampliconi
Svantaggio: tecnica molto costosa
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//upload.wikimedia.org/wikipedia/en/c/c5/Step-by-step_procedure_of_using_T-RFLP_analysis_in_microbiology.pdf
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http://www.google.it/url?sa=i&rct=j&q=&esrc=s&frm=1&source=images&cd=&cad=rja&docid=C-TilxEukH5pIM&tbnid=GXSRqQAp3EZVsM:&ved=0CAUQjRw&url=http%3A%2F%2Fcme.msu.edu%2FRES_PROG%2Fhector.html&ei=egeBUrOdIMTI0QXvioCYDw&bvm=bv.56146854,d.ZGU&psig=AFQjCNGv5nxz2PQO8kDc1MD_arGRvFQuFQ&ust=1384274165522709
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http://www.google.it/url?sa=i&rct=j&q=&esrc=s&frm=1&source=images&cd=&cad=rja&docid=mHmbGFZe_Nqo5M&tbnid=YaTZm0iHoRpQoM:&ved=0CAUQjRw&url=http%3A%2F%2Fnodens.ceab.csic.es%2Ft-rfpred%2Fmethod&ei=NweBUoHfG5O10QXgk4GgDA&bvm=bv.56146854,d.ZGU&psig=AFQjCNGcrn96OSLRwSaT1822evAT89SixQ&ust=1384274037190930
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ARISA (Automated Ribosomal Intergenic Spacer Analysis)
Tecnica di fingerprinting molecolare delle comunità microbiche
basato sul polimorfismo di lunghezza della regione spaziatrice
compresa tra i geni codificanti il 16S e il 23S rRNA (ITS –
Internal Transcribed Spacers)
16S rDNA, 23S rDNA, regione intergenica 16S-23S
I primers vengono disegnati su regioni conservate in modo da
garantire l’amplificazione di un ampio spettro tassonomico
Un primer viene marcato al 5’ con un fluoroforo → per
rilevare
presenza e dimensioni dell’amplicone mediante sequenziatore
automatico
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ARISA (Automated Ribosomal Intergenic Spacer Analysis)
Gli operoni ribosomali (anche gli ITS) son presenti in un ceppo
microbico in copie multiple
Le singole copie possono differire nelle regioni ITS a causa di
inserzioni e delezioni di una o poche basi o anche di interi geni
per tRNA
Ceppi diversi appartenenti ad una stessa specie batterica
possono differire per la
lunghezza delle regioni ITS
Specie batteriche diverse avranno regioni intergeniche di
lunghezza diversa
1. STIMARE NUMERO DI SPECIE DIVERSE 2. STIMARE LA VARIABILITA’
ESISTENTE ALL’INTERNO
DELLA STESSA SPECIE
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http://www.google.it/url?sa=i&rct=j&q=&esrc=s&frm=1&source=images&cd=&cad=rja&docid=mYeDQQTB-KfnoM&tbnid=Cj_pKyBVVCCWYM:&ved=0CAUQjRw&url=http%3A%2F%2Fen.wikipedia.org%2Fwiki%2FFile%3AStep-by-step_procedure_of_using_ARISA_analysis_in_microbiology.pdf&ei=AwuBUr39FNOn0wW26IG4CA&bvm=bv.56146854,d.ZGU&psig=AFQjCNF1Y0A8xIjITy2xh4ulOs93pA1kew&ust=1384275071660313
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http://www.google.it/url?sa=i&rct=j&q=&esrc=s&frm=1&source=images&cd=&cad=rja&docid=Rw0Rq9ollgEbgM&tbnid=L3aRgbQlU9dYBM:&ved=0CAUQjRw&url=http%3A%2F%2Fwww.sciencedirect.com%2Fscience%2Farticle%2Fpii%2FS0038071705003676&ei=xAuBUqnFDaG60wWGqYHQBw&bvm=bv.56146854,d.ZGU&psig=AFQjCNF1Y0A8xIjITy2xh4ulOs93pA1kew&ust=1384275071660313
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DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)
Tecnica comunemente impiegata per studi di ecologia
microbica
È UNA TECNICA SEPARATIVA ELETTROFORETICA CHE PERMETTE DI
IDENTIFICARE SINGOLE VARIAZIONI DI
SEQUENZA IN UN FRAMMENTO DI DNA
1. Estrazione del DNA totale dalla matrice ambientale 2.
Amplificazione di regioni ipervariabili del 16S o altri geni
codificanti per rRNA 3. Separazione elettroforetica su gel di
poliacrilammide in
presenza di un denaturante chimico(urea e formammide)
-
La separazione si ottiene sfruttando la diversa mobilità
elettroforetica, su gel di poliacrilammide contenente un gradiente
lineare di denaturante, di molecole di DNA a doppio filamento di
medesima lunghezza ma differente sequenza nucleotidica
Come avviene la separazione elettroforetica
Frammenti con sequenze diverse possiedono profili di
denatuazione differenti e cessano di migrare lungo il gel in
corrispondenza di posizioni non uguali
La denaturazione dei frammenti di DNA procede per domini di
melting ovvero stretch di paia di basi aventi la stessa temperatura
di denaturazione (Tm).
Una volta che il dominio avente la temperatura di denaturazione
più bassa raggiunge raggiunge il punto nel gel a cui corrisponde la
sua Tm, si assiste al passaggio da una conformazione a elica ad una
conformazione parzialmente svolta del frammento di DNA
ARRESTO DELLA MIGRAZIONE DELLA MOLECOLA IN QUEL DETERMINATO
PUNTO DEL GEL
-
Quale tipo di informazione si ottiene
L’analisi PCR-DGGE fornisce una serie di profili elettroforetici
con una distribuzione caratteristica di
bande, ciascuna riconducibile ad una specie batterica,
descrivendo nel suo complesso la struttura tassonomica e
il grado di diversità della comunità microbica associata alla
matrice ambientale in studio
I primers utilizzati
All’estremità 5’ del primer forward viene aggiunto un clamp
(stringa di basi nuceotidiche) in GC di circa 30-40 paia di basi,
caratterizzato da una Tm più elevata rispetto a qualsiasi altra
regione del frammento del DNA 16S amplificato.
Il GC-clamp quindi funge da dominio ad alta temperatura di
melting impedendo così la completa dissociazione del filamento di
DNA in molecole a singolo filamento
Questa sequenza viene co-amplificata nella reazione di PCR e
incorporata nei frammenti
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http://www.google.it/url?sa=i&rct=j&q=&esrc=s&frm=1&source=images&cd=&cad=rja&docid=BJ1pJkvuCpEtxM&tbnid=ufBokcaqXJJKWM:&ved=0CAUQjRw&url=http%3A%2F%2Fen.wikipedia.org%2Fwiki%2FCommunity_Fingerprinting&ei=TwiBUv25NqLP0AXr64GADA&bvm=bv.56146854,d.ZGU&psig=AFQjCNEtlSt67BrJaX8bUivoF-9CevCsFw&ust=1384274371324081
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LA DGGE VIENE CONSIDERATA UN POTENTE STRUMENTO IN GRADO DI
MONITORARE ILCOMPORTAMENTO DELLE COMUNITA’
BATTERICHE A SEGUITO DI CAMBIAMENTI AMBIENTALI IN QUANTO POSSONO
ESSERE ANALIZZATI SIMULTANEAMENTE MOLTI
CAMPIONI COLLEZIONATI A DIVERSI INTERVALLI DI TEMPO, COSA CHE
NON PUO’ ESSERE FATTA ALTRETTANTO AGEVOLMENTE CON
PROCEDIMENTI DI CLONAGGIO
• conoscere la composizione di una comunità microbica
complessa
• seguire nel tempo l’evoluzione di una comunità microbica, per
esempio a seguito di un intervento di bonifica o a causa di una
pressione sellettiva esercitata da un agente contaminante
• monitorare la persistenza di alcuni ceppi microbici
all’interno di una comunità complessa a seguito di inoculo massivo
(bioaugmentation)
• monitorare la presenza di genotipi di interesse all’interno
della comunità microbica e la loro evoluzione nel tempo
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Per conoscere la composizione di una comunità microbica
complessa:
le bande caratteristiche dei profili possono essere tagliate da
gel e successivamente sequenziate per avere una correlazione
filogenetica dei membri della comunità microbica
1. Taglio delle bande maggiormente rappresentative 2. Eluizione
della banda da gel 3. Ri-amplificazione del frammento di interesse
4. Sub-clonaggio del frammento in un opportuno vettore 5.
Sequenziamento e confronto in banca dati
il profilo DGGE può essere ibridato con sonde gruppo-specifiche
per determinare la presenza di una specifica popolazione
batterica
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DG-DGGE (Double Gradient – Denaturing Gradient Gel
Electrophoresis
Il doppio gradiente è costituito dal gradiente chimico e da un
gradiente di porosità (% di poliacrilammide)
La presenza del gradiente in porosità aumenta il grado di
risoluzione delle singole bande
Il gradiente in porosità viene realizzato parallelamente a
quello di denaturante
RT-DGGE (Reverse Trascriptase – DGGE)
In questa variante migrano nel gel di poliacrilammide i cDNA
derivanti dalla retrotrascrizione dell’RNA estratto dal
campione
Questa analisi fornisce importanti informazioni sulla vitalità
dei microrganismi che compongono la comunità microbica di
interesse
TGGE (Temperature Gradient Gel Electrophoresis)
In questo caso il gradiente non è costituito da un agente
chimico ma dalla temperatura. Un apposito dispositivo infatti crea
un gradiente di temperatura nello spazio. Gli ampliconi ottenuti
con PCR vengono ancora una volta separati sfruttando la loro
diversa Tm
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DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)
LIMITI
• La DGGE è in grado di evidenziare solo gli amplificati
ottenuti dalle specie predominanti presenti nella comunità, infatti
non è possibile ottenere la separazione di tutti i frammentidi16S
rDNA (o di altri geni target)ottenuti dall’intera gamma di
microorganismi presenti all’interno di una matrice complessa
Numerosi studi hanno mostrato che solo le popolazioni batteriche
rappresentanti l’1% o aliquote maggiori della
comunità microbica possono essere evidenziate mediante
PCR-DGGE
• Con la DGGE è possibile separare solo frammenti di piccole
dimensioni,fino a 500 bp
• spesso si osserva la migrazione nella stessa posizione di
frammenti di DNA di diversa sequenza ma con comportamento di
melting molto simile che rende difficile il recupero di essi dal
gel di poliacrilammide
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D1 G H D2 D3
I II III I II III
E1 E2 E3 F1 F2 F3
I II III I II III I II III I II III I II III I II III I II
III
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SSCP (Single-Stranded Conformational Polymorphism)
Come la DGGE è una tecnica che permette di studiare le diversità
di comunità microbiche complesse attraverso l’analisi dei geni 16S
rDNA
I prodotti di PCR ottenuti vengono digeriti con esonucleasi in
modo da ottenere singoli filamenti
In condizioni non denaturanti i singoli filamenti assumono una
diversa conformazione in base alla loro sequenza nucleotidica
Quindi, a causa della loro diversa mobilità elettroforetica, le
diverse conformazioni possono essere separate per elettoforesi su
gel di poliacrilammide in condizioni non denaturanti
Le analisi SSCP richiedono un’elevata ottimizzazione delle
condizioni operative e basse temperature di lavoro. La capacità
discriminatoria della SSCP, generalmente più efficiente per
frammenti fino a 400 bp, dipende dalla posizione delle variazioni
nella sequenza del gene studiato
I prodotti possono essere rilevati marcando uno o entrambi i
primers con composti fluorescenti
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https://www.google.it/url?sa=i&rct=j&q=&esrc=s&frm=1&source=images&cd=&cad=rja&docid=HPz5Qxjg1TopZM&tbnid=n6KFUi9avpSKPM:&ved=0CAUQjRw&url=https%3A%2F%2Fwww.nationaldiagnostics.com%2Felectrophoresis%2Farticle%2Fsscp-analysis&ei=LIidUsPnHanX0QX-t4HQDw&bvm=bv.57155469,d.ZGU&psig=AFQjCNEn28DlXP9KwvElnVedYgx5oJ5pVA&ust=1386142056820375
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RAPD (Random amplified polymorphic DNA)
Analisi di variabilità tra ceppi batterici Non impiegata per
analisi di comunità
Amplificazione sul DNA genomico utilizzando un singolo
oligonucleotide, generalmente molto corto (10 bp), come innesco
bassa stringenza generazione di più frammenti di diversa
lunghezza (variabile da 100 a 2000 bp)
Separazione elettroforetica su gel di agarosio o
poliacrilammide: ottengo impronta molecolare del microrganismo
analizzato
Ceppi batterici diversi possono dare profili RAPD diversi: tanto
maggiore è la differenza tra ceppi tanto maggiore è la differenza
tra i profili ottenuti
METODICHE DI TIPIZZAZIONE
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http://www.cmjournal.org/content/4/1/21/figure/F3
-
http://www.google.it/url?sa=i&rct=j&q=&esrc=s&source=images&cd=&cad=rja&docid=Jnpl1wz088O9mM&tbnid=EbgsnH7E8JeydM:&ved=0CAUQjRw&url=http%3A%2F%2Fwww.scielo.br%2Fscielo.php%3Fpid%3DS1415-47572008000300029%26script%3Dsci_arttext&ei=Ef-vUvCwA-aR1AWpiIDIAg&bvm=bv.57967247,d.d2k&psig=AFQjCNFDlqIREtNy9VgQ-5GmEzKMS8AhuA&ust=1387352180989615
-
Rep-PCR is molecular biology based method very suitable for
rapid grouping and tentatively identification of microorganisms.
Eukaryotic and prokaryotic DNA contains so-called repetitive DNA
elements distributed more or less randomly over the genome. In
rep-PCR primers that anneals to these repetitive elements are used.
The PCR-products are separated using agarose gel electrophoresis
and a species (sometimes strain)-specific pattern is obtained.
These patterns can be analysed using e.g. BioNumerics. Isolates
with similar patterns (i.e. belonging to the same species) will
cluster together. Full identification can be achieved by e.g.
sequencing a limited number of isolates from each group within the
cluster. Various rep-PCR-primers have been developed. The primer
GTG5 (5’GTG GTG GTG GTG GTG 3’) seems to be very suitable for
grouping of LAB and yeast at the species level, but other primers
may prove better depending on the specific task (use the same over
all approach, just change primers and possibly annealing and
elongation temperature).
Repetitive element sequence based PCR – rep-PCR genomic
fingerprinting
-
Repetitive element sequence based PCR – rep-PCR genomic
fingerprinting
Three categories of conserved repetitive sequences are used for
bacterial typing: 1. the enterobacterial repetitive intergenic
consensus
sequence ERIC; they are127-bp imperfect palindromes that occur
in multiple copies in the genomes of enteric bacteria and
vibrios
2. the repetitive extragenic palindromic sequence REP; 3. The
BOX element. Often, the three categories are used in combination in
order to achieve better discrimination.
http://www.google.it/url?sa=i&rct=j&q=&esrc=s&source=images&cd=&cad=rja&docid=8mN_Y7n1hiOz1M&tbnid=y0VDxU37exm_YM:&ved=0CAUQjRw&url=http%3A%2F%2Fwww.msu.edu%2F~debruijn%2Fdna1-4.htm&ei=gfSvUvfFCuTt0gX-o4HgAg&bvm=bv.57967247,d.d2k&psig=AFQjCNGmHbN_tbFwXWyiTEKFGNudP440aA&ust=1387349468486331
-
http://www.google.com/url?sa=i&rct=j&q=&esrc=s&source=images&cd=&cad=rja&docid=HaOX0xLbOKChCM&tbnid=Hq8Zj79n4uhbrM:&ved=0CAUQjRw&url=http%3A%2F%2Fstaff-www.uni-marburg.de%2F~werner%2Frhizobial_diversity.htm&ei=OSmvUpTwAvKa1AW6uIHoCA&bvm=bv.57967247,d.bGQ&psig=AFQjCNEq-4twVxHT0XuLkNceSGXvnKl_iw&ust=1387297442933085
-
rep-PCR
http://www.google.it/url?sa=i&rct=j&q=&esrc=s&source=images&cd=&cad=rja&docid=UDTLwYkIyFfbqM&tbnid=1JHGZvJE5KsFGM:&ved=0CAUQjRw&url=http%3A%2F%2Fwww.nyas.org%2Fpublications%2FEBriefings%2FDetail.aspx%3Fcid%3D6a3dd141-d2f0-46e0-b95c-59077c059da9&ei=MvWvUsnTF8iY0QWxpIDIAg&bvm=bv.57967247,d.d2k&psig=AFQjCNF7eAC3hjsg1C9KDUJA_eRrFGDnLg&ust=1387349610709059http://www.google.it/url?sa=i&rct=j&q=&esrc=s&source=images&cd=&cad=rja&docid=YpHvsG7LqSlLwM&tbnid=WkevkPmjIC8tWM:&ved=0CAUQjRw&url=http%3A%2F%2Fbiomicrolab.web.ua.pt%2Fservices.html&ei=OfWvUt7iCeyo0wXo_IC4Ag&bvm=bv.57967247,d.d2k&psig=AFQjCNF7eAC3hjsg1C9KDUJA_eRrFGDnLg&ust=1387349610709059
-
BOX-PCR FINGERPRINTING
A highly conserved repeated DNA element has been identified in
the chromosome of Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) and given
the name of the BOX repetitive element. This was the first
demonstration of the presence of such a repetitive DNA moiety in a
Gram positive bacterial species. Approximately 25 of these elements
are found in noncoding regions dispersed throughout the entire
pneumococcal genome. The BOX repeat is found to consist of three
discriminate regions: boxA, boxB, and boxC, which are 59, 45, and
50 basepairs in length, respectively. Various different
combinations of these three elements are found to be present in
different BOX loci and limited sequence heterogeneity is
encountered among different elements from the same strain or
elements sequenced from different strains. The first publication on
the BOX repetitive elements also described its intricate secondary
structure, supported by compensating basepairing in different loci
where the repeat is Encountered. Moreover, their location in the
vicinity of genes involved in the regulation of various aspects of
bacterial competence, genetic transformation and virulence suggest
that the elements might well be involved in coordination of the
control of gene expression. More recently has been demonstrated
that the presence of a BOX element is associated with variation in
colony opacity of the pneumococcus. The frequency with which the
colonies switched from transparent to opaque clearly depended on
the presence of boxA and boxC elements. It has also been shown that
BOX elements form targets for site-specific recombination events,
which provides another possibility
-
AFLP (Amplified Fragment Lenght Polymorphism)
Tecnica di fingerprinting molecolare che si basa sulla
restrizione e amplificazione del DNA
1. Restrizione – il DNA viene digerito con enzimi di restrizione
in modo da produrre frammenti di dimensioni inferiori a 1kb
2. Ligazione – i frammenti vengono ligati ad adattatori che
presentano le estremità complementari ai siti di taglio
3. Amplificazione – con primer disegnati su sequenza
oligonucleotidica degli adattatori. L’aggiunta di una o due basi al
3’ della sequenza dei primers riduce il numero dei frammenti che
vengono amplificati 4. Separazione – elettroforesi su gel di
poliacrillamide; elettroforesi capillare mediante l’uso di
sequenziatori automatici
Applicazioni: identificazione di ceppi batterici (patogeni),
studi di genetica di popolazioni microbiche
-
http://www.google.it/url?sa=i&rct=j&q=&esrc=s&source=images&cd=&cad=rja&docid=M-7BXHyrkSAeOM&tbnid=95aR2gDjqYXOKM:&ved=0CAUQjRw&url=http%3A%2F%2Fduybiotech.wordpress.com%2Ftag%2Faflp%2F&ei=MvqvUqOaBIrb0QXVoYHIAg&bvm=bv.57967247,d.d2k&psig=AFQjCNECEXDNujRxOImgbuYxpBLfZoykEA&ust=1387350595164733http://www.google.it/url?sa=i&rct=j&q=&esrc=s&source=images&cd=&cad=rja&docid=Vk8FnNnQouop6M&tbnid=88xSU41aEaM8ZM:&ved=0CAUQjRw&url=http%3A%2F%2Fwww2.warwick.ac.uk%2Ffac%2Fsci%2Flifesci%2Fresearch%2Fvegin%2Fgeneticimprovement%2Fgeneticmarker%2Faflp%2F&ei=nvqvUrveMe6y0AX8t4HIAg&bvm=bv.57967247,d.d2k&psig=AFQjCNECEXDNujRxOImgbuYxpBLfZoykEA&ust=1387350595164733
-
PULSED FIELD GEL ELECTROPHORESIS
https://www.google.com/imgres?imgurl=http%3A%2F%2Fwww.pulsenetinternational.org%2Fassets%2FPulseNet%2Fimages%2FpicMisc%2Fpfge_process.gif&imgrefurl=http%3A%2F%2Fwww.pulsenetinternational.org%2Finternational%2Fpulsenetexplained%2F&docid=IO8WhpGFn0w5oM&tbnid=PrY4fm6cDtZngM%3A&w=300&h=198&ei=0CyvUrPpHInO0wXyhoDwCQ&ved=0CAIQxiAwAA&iact=c
-
PFGE uses molecular scissors, called restriction enzymes, to cut
bacterial DNA at certain locations known as restriction sites.
These molecular scissors are selected to generate a small number of
DNA pieces that can be separated based on size. Usually these DNA
pieces, or restriction fragments, are large and need to be
specially treated and separated to generate a DNA fingerprint. -
First the bacteria are loaded into an agarose suspension, similar
to gelatin, - then the bacterial cell is opened to release the DNA.
- Once the DNA is released then the agarose and DNA suspension,
also known as a plug, is treated with restriction enzymes. - The
treated plugs are then loaded onto an agarose gel and the
restriction fragments are separated based on size using an electric
field. - What makes PFGE different from how scientists usually
separate DNA is because PFGE can separate several large restriction
fragments. To do this an electric field that constantly changes
direction to the gel is used to generate a DNA fingerprint.
-
Advantages of PFGE PFGE subtyping has been successfully applied
to the subtyping of many pathogenic bacteria and has high
concordance with epidemiological relatedness. PFGE has been
repeatedly shown to be more discriminating than methods such as
ribotyping or multi-locus sequence typing for many bacteria. PFGE
in the same basic format can be applied as a universal generic
method for subtyping of bacteria. Only the choice of the
restriction enzyme and conditions for electrophoresis need to be
optimized for each species. DNA restriction patterns generated by
PFGE are stable and reproducible.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17661654http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17661654http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17661654
-
Limitations of PFGE Time consuming Requires a trained and
skilled technician Does not discriminate between all unrelated
isolates Pattern results vary slightly between technicians Can’t
optimize separation in every part of the gel at the same time Don’t
really know if bands of same size are same pieces of DNA Bands are
not independent Change in one restriction site can mean more than
one band change “Relatedness” should be used as a guide, not true
phylogenetic measure Some strains cannot be typed by PFGE
-
http://www.google.it/url?sa=i&rct=j&q=&esrc=s&source=images&cd=&cad=rja&docid=lfgmtNfNHPt5eM&tbnid=90vy3bb-8ztBUM:&ved=0CAUQjRw&url=http%3A%2F%2Fwpage.unina.it%2Fsacoppol%2FGuidaMicrogen%2F8Gener.htm&ei=uf2vUvrwE-fD0QXu9IDAAg&bvm=bv.57967247,d.d2k&psig=AFQjCNGt1KztA-IRuBP41PRA5e-I6XpOYA&ust=1387351862863358http://www.google.it/url?sa=i&rct=j&q=&esrc=s&source=images&cd=&cad=rja&docid=lfgmtNfNHPt5eM&tbnid=90vy3bb-8ztBUM:&ved=0CAUQjRw&url=http%3A%2F%2Fwpage.unina.it%2Fsacoppol%2FGuidaMicrogen%2F8Gener.htm&ei=uf2vUvrwE-fD0QXu9IDAAg&bvm=bv.57967247,d.d2k&psig=AFQjCNGt1KztA-IRuBP41PRA5e-I6XpOYA&ust=1387351862863358http://www.google.it/url?sa=i&rct=j&q=&esrc=s&source=images&cd=&cad=rja&docid=lfgmtNfNHPt5eM&tbnid=90vy3bb-8ztBUM:&ved=0CAUQjRw&url=http%3A%2F%2Fwpage.unina.it%2Fsacoppol%2FGuidaMicrogen%2F8Gener.htm&ei=uf2vUvrwE-fD0QXu9IDAAg&bvm=bv.57967247,d.d2k&psig=AFQjCNGt1KztA-IRuBP41PRA5e-I6XpOYA&ust=1387351862863358
-
FISH (Fluorescence In situ Hybridisation)
È una metodica frequentemente utilizzata in microbiologia
ambientale per lo studio di comunità microbiche complesse
L’ibridazione,basata sull’impiego di oligonucleotidi marcati con
composti fluorescenti, viene indotta su cellule intere fissate
Le cellule bersaglio vengono osservate con un microscopio a
epifluorescenza
L’impiego di sonde molecolari prevede la conoscenza del gene da
studiare. Quando il gene target è il 16S possono essere costruite
sia sonde universali in grado di appaiarsi con gli rRNA di
eubatteri o archebatteri su regioni conservate,sia sonde
specie-specifiche aventi come bersaglio le regioni altamente
variabili dell’rRNA
La FISH può essere applicata sia per monitorare la presenza di
particolari gruppi di microorganismi in una matrice
complessa, sia per individuare la presenza di una determinata
specie batterica
-
The sample is first fixed to stabilize the cells and
permeabilize the cell membranes. The labelled oligonucleotide probe
is then added and allowed to hybridize to its intracellular targets
before the excess probe is washed away. The sample is then ready
for single-cell identification and quantification by either
epifluorescence microscopy or flow cytometry.
-
FISH
-
http://www.google.it/url?sa=i&rct=j&q=&esrc=s&source=images&cd=&cad=rja&docid=m_UardgWkkXKCM&tbnid=AE_g2rVuxOWQHM:&ved=0CAUQjRw&url=http%3A%2F%2Fbiosearch.berkeley.edu%2Fimage.php%3Fimg%3Dimages%252Fopensearch%252Fartid%253D1952070%2526blobname%253D1471-2407-7-128-4.jpg%26pmid%3D17626639%26fig%3D4&ei=Z_6vUuDnNoGu0QWu7IHQAg&bvm=bv.57967247,d.d2k&psig=AFQjCNHfzvTIQHqDUuMpYj5cp5qhAbVsbg&ust=1387352015025576
-
CULTURE-INDEPENDENT methods
-
IBRIDAZIONE SU MICROARRAY
TECNOLOGIA GENOMICA utilizzata per lo studio dell’espressione
genica e per la ricerca di mutazioni puntiformi
MICROARRAY: supporto solido (plastica, vetro) cui sono adesi in
modo covalente e in una disposizione ordinata acidi nucleici che
funzionano come sonde
Estrazione del DNA o RNA dal ceppo batterico Frammentazione e
marcatura con fluorocromi Ibridazione con le sonde fissate sul
microarray Analisi con uno scanner a fluorescenza per rilevare
quale sonda ha ibridato
1. Quali sequenze e quali geni sono presenti anche nel ceppo o
campione ambientale analizzato
2. Quanti e quali geni sono espressi in quel ceppo
-
IBRIDAZIONE SU MICROARRAY
In contesto microbiologico-ambientale:
Collezioni di geni funzionali
Collezioni di geni marcatori tassonomici (16S rDNA)
Interi genomi di ceppi di riferimento
Per evidenziare la presenza di geni che codificano enzimi
coinvolti nei processi biogeochimici
Per identificare le specie presenti in un campione
ambientale
Metodo molto potente in quanto permette di descrivere una
comunità batterica in ‘tempo reale’
Per valutare le differenze nel contenuto genomico tra un ceppo
di riferimento e un ceppo naturale isolato nell’ambiente
-
METAGENOMICA
ISOLAMENTO DIRETTO DI DNA DALL’AMBIENTE E SUO SUCCESSIVO
CLONAGGIO E SEQUENZIAMENTO
è un potente strumento per la scoperta della genetica e
fisiologia dei microrganismi non coltivabili
isolamento del DNA genomico dall’ambiente clonaggio del DNA in
apposito vettore trasformazione di un ceppo ricevente screening
della libreria metagenomica così ottenuta
Selezione dei cloni per PCR o ibridazione (per la presenza di
marcatori filogenetici o di geni di interesse)
Sequenziamento casuale massivo
Selezione dei cloni per espressione di un fenotipo particolare
(specifiche attività enzimatiche o produzione di antibiotici)
-
L’ANALISI STATISTICA
Quantificazione della diversità genetica
Misura della distanza genetica
Analisi della struttura genetica
Analisi delle relazioni genetiche tra le popolazioni
Confronto dei profili (aplotipi): numero di bande diverse o in
comune
Misura del rapporto tra le bande condivise tra i due campioni
rispetto alle bande totali presenti
Per correlare la diversità osservata alle variabili presenti
nell’ambiente e quindi dare significato biologico-funzionale alle
differenze osservate
AMOVA (analisi della varianza molecolare)
Analisi multivariata
Stima della distanza tra sequenze con numero di nucleotidi
differenti
UPGMA
I trattamenti statistici utilizzati includono quattro diversi
livelli di analisi
-
L’evoluzione è il processo per il quale i cambiamenti che
intervengono in una linea di discendenti portano, nel tempo, alla
formazione di nuove varietà, ed eventualmente di nuove specie di
organismi. L’evoluzione avviene in ogni sistema autoreplicantesi in
cui la variazione è il risultato del processo di mutazione e la
selezione si basa sulla capacità adattativa differenziale. Così nel
tempo evolvono sia le cellule sia i virus.
-
Le relazioni evolutive tra gli organismi sono oggetto di studio
della filogenesi. Le relazioni filogenetiche tra cellule possono
essere dedotte confrontando l’informazione genetica (sequenza
nucleotidica o amminoacidica) che esiste nei loro acidi nucleici o
nelle proteine. Le macromolecole che formano il ribosoma , RNA
ribosomali, sono strumenti eccellenti per valutare le relazioni
evolutive.
-
http://www.google.it/url?sa=i&rct=j&q=&esrc=s&source=images&cd=&cad=rja&docid=bmez5N0KTFpN0M&tbnid=J5hdGTvME-hTpM:&ved=0CAUQjRw&url=http%3A%2F%2Fwww.nature.com%2Fnrg%2Fjournal%2Fv6%2Fn11%2Fbox%2Fnrg1709_BX1.html&ei=VrOxUtfUEI6c0wWAgIGgAQ&bvm=bv.58187178,d.bGQ&psig=AFQjCNG-NPr6dQNXoC7J8hTxgcgblZOPow&ust=1387463846414765
-
ATTTTGTTCACTAATAGGGGGCGATTGGGCCGACGTCGCATGCTCCCGGCCGCCATGGCGGCCGCGGGAATTCGATTACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCCAGTCATCGGCCACACCGTGGCAAGCGCCCTCCCGAAGGTTAAGCTACCTGCTTCTGGTGCAACAAACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCAGCAATGCTGATCTGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCATGGAGTCGAGTTGCAGACTCCAATCCGGACTGAGATAGGGTTTCTGGGATTGGCTTACCGTCGCCGGCTTGCAGCCCTCTGTCCCTACCATTGTAGTACGTGTGTAGCCCTGGCCGTAAGGGCCATGATGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCGGTCTCCTTAGAGTTCCCACCATTACGTGCTGGCAACTAAGGACAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACGCGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTGTTCGAGTTCCCGAAGGCACCAATCCATCTCTGGAAAGTTCTCGACATGTCAAGGCCAGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCATCGAAATTAAACCACATACTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTCTGAGTTTCAGTCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGCGAACTTAACGCGTTAGCTTCGATACTGCGTGCCAATTGCACCCCAACATCCAGTTCGCATCGTTTAGGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGTGCCTCAGTGTCAGTGTTGGTTCCAGGTAGCTGCCTTTCGCCAATGAGATGTTCCTTCCCGATCTCTACGCATTTCCACTGCTACACCGGGAATTTCCGCTACCCTTCTACCACACTTCTAGTTGTCAGTTTCCACCTGCAGTTCCCAGGGTTGGAGGCTCAGGGCTTTTCCACAACAGACTTAAACAAACCCACCCTACGCACGCCTTTAGCGCCCAGGTAATTCCGGAGTTACGGCTTGCACCCCTTTCGTATTACCGGCGGCTGCCTGGACGAAGTTACCGGTGCCTTATTCTTTGGAACCGTCTATCCCGACCAAGATTACGCTTGAATCCTTTCCACAAGCCTTTACAACTCGGAGCCTCTATTTCA
http://www.google.it/url?sa=i&rct=j&q=&esrc=s&source=images&cd=&cad=rja&docid=p9oQDbmf86n84M&tbnid=TEYxDFxVL5UPiM:&ved=0CAUQjRw&url=http%3A%2F%2Febook.scuola.zanichelli.it%2Fsadavabiologiablu-plus%2Fle-basi-molecolari-della-vita-e-dell-evoluzione-plus%2Fle-biotecnologie%2Fil-sequenziamento-del-genoma-plus&ei=ScmxUrzuG6LO0AXsVQ&bvm=bv.58187178,d.bGQ&psig=AFQjCNE1_QcKF3VpEzl0iKtGEKsvxqZgCg&ust=1387469370041309
-
GenBank Overview What is GenBank? GenBank ® is the NIH genetic
sequence database, an annotated collection of all publicly
available DNA sequences (Nucleic Acids Research, 2013
Jan;41(D1):D36-42). GenBank is part of the International Nucleotide
Sequence Database Collaboration , which comprises the DNA DataBank
of Japan (DDBJ), the European Molecular Biology Laboratory (EMBL),
and GenBank at NCBI. These three organizations exchange data on a
daily basis. The complete release notes for the current version of
GenBank are available on the NCBI ftp site. A new release is made
every two months. GenBank growth statistics for both the
traditional GenBank divisions and the WGS division are available
from each release. An example of a GenBank record may be viewed for
a Saccharomyces cerevisiae gene.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23193287http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23193287http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23193287http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23193287http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23193287http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/collabhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/collabftp://ftp.ncbi.nih.gov/genbank/gbrel.txthttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/statisticshttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/Sitemap/samplerecord.html
-
Choose a BLAST program to run.
Program Program Description
nucleotide blast Search a nucleotide database using a nucleotide
query
Algorithms: blastn, megablast, discontiguous megablast
protein blast Search protein database using a protein query
Algorithms: blastp, psi-blast, phi-blast, delta-blast
blastx Search protein database using a translated nucleotide
query
tblastn Search translated nucleotide database using a
protein
query
tblastx Search translated nucleotide database using a
translated
nucleotide query
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthomehttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthomehttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/Blast.cgi?PROGRAM=blastx&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthomehttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/Blast.cgi?PROGRAM=tblastn&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthomehttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/Blast.cgi?PROGRAM=tblastx&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthomehttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&BLAST_PROGRAMS=deltaBlast&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=BlastHomeAd
-
1) Connect to the NCBI BLAST Homepage with your browser.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/
-
2) In the Nucleotide section on the page choose the link to the
Nucleotide-nucleotide BLAST (blastn) search algorithm
-
3) Enter your DNA sequence into the Search text box Copy your
DNA sequence by either selecting the sequence with the mouse and
using the Copy command in the Edit menu of your browser. Click on
the Search dialog box in the NCBI window and paste your DNA
sequence into the box by choosing the Paste command under the Edit
menu, or the paste keyboard command. If you only want to search
with a subset of your sequence you can select these bases by
putting in the appropriate numbers in the Set subsequence dialog
boxes. However it is often easier just to edit the sequences that
you want in text edit program (Word), and paste them in. .
-
4) Seelct the default (nr) database in the Choose database menu
box. There are many different databases that you can choose among
to do your searches. Some databases only contain DNA or protein
sequences for a specific organism, such as humans or mouse. Others
contain different types of DNA (genomic vs cDNA sequences, etc.).
To search only a specific database, click on the Database Menu box
and while holding on the mouse button, scroll to the database you
want, and release the mouse button. The nr is the default value.
The nr nucleotide database search includes all Non-redundant
GenBank + EMBL + DDBJ + PDB sequences (but no EST, STS, GSS, or
HTGS sequences). The nr peptide sequence database includes all
non-redundant GenBank CDS (coding sequence) translations + PDB +
SwissProt + PIR + PRF. Note that the program is smart enough to
determine which nr database to search according to which blast
program you run (e.g. peptide database for blastp, nucleotide
database for blastn). If you want to search the EST sequences, you
have to do a separate blast
-
5) Click on the BLAST! button to perform the search. To run the
Blast search click on the BLAST! button. However, if desired, there
are other options that you may want to alter before doing your
search to reduce or increase the number of matches or to change the
output from of the data from the search. A short description of
these options is shown below.
-
Task
s
R
a
n
k
Name Strain Authors Taxonomy Access
ion
Pairw
ise
Simil
arity
(%)
Diff/
Total
nt
Comp
leten
ess
(%)
meg
aBLA
ST
score
BLASTN
score
1
Lysobacter
yangpyeong
ensis
GH19-
3(T)
Weon et al.
2006
Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria;
Xanthomonadales; Xanthomonadaceae; Lysobacter;
Lysobacter yangpyeongensis;
DQ191
179
47.47
47.47
622/1
184 99.7 0
2 Lysobacter
oryzae
YC6269
(T)
Aslam et al.
2009
Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria;
Xanthomonadales; Xanthomonadaceae; Lysobacter;
Lysobacter oryzae;
EU376
963
47.17
47.17
626/1
185 97.0 0
3 Lysobacter
daejeonensis
GH1-
9(T)
Weon et al.
2006
Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria;
Xanthomonadales; Xanthomonadaceae; Lysobacter;
Lysobacter daejeonensis;
DQ191
178
45.95
45.95
640/1
184 99.7 0
4
Stenotropho
monas
pavanii
ICB
89(T)
Ramos et al.
2011
Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria;
Xanthomonadales; Xanthomonadaceae;
Stenotrophomonas; Stenotrophomonas pavanii;
FJ7486
83
45.62
45.62
640/1
177 100 0
5 Pseudomona
s pictorum
ATCC
23328(
T)
Gray and
Thornton
1928
Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria;
Xanthomonadales; Xanthomonadaceae;
Stenotrophomonas; Pseudomonas pictorum;
AB021
392
45.62
45.62
640/1
177 98.7 0
6 Pseudomona
s hibiscicola
ATCC
19867(
T)
Moniz 1963
Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria;
Xanthomonadales; Xanthomonadaceae;
Stenotrophomonas; Pseudomonas hibiscicola;
AB021
405
45.54
45.54
641/1
177 98.8 0
7
Stenotropho
monas
koreensis
TR6-
01(T)
Yang et al.
2006
Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria;
Xanthomonadales; Xanthomonadaceae;
Stenotrophomonas; Stenotrophomonas koreensis;
AB166
885
45.42
45.42
644/1
180 99.7 0
8 Lysobacter
bugurensis
ZLD-
29(T)
Zhang et al.
2011
Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria;
Xanthomonadales; Xanthomonadaceae; Lysobacter;
Lysobacter bugurensis;
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