GenomicaRama de la gentica que estudia el genoma de los
organismos.Involucra proyectos de secuenciacin a gran
escalaTecnologa de la secuencacin de ADNEl costo de la secuenciacin
fue disminuyendo a medida q pasaron los aos gracias a las nuevas
tecnologas con un gran decremento a partir del 2007. 2001
100millones a 2007 10millones 2014 1000 pe.Asi tambin aumenta la
cantidad de genomas secuenciados 2014 229mil genoma s y se calcula
para el 2017 1.620.000. La mayor cantidad de genomas secuenciados
es de bacterias seguido por eucariotas y por ultimo
arqueobacterias, a medida que avanzaron las tecnologas esta
cantidad de secuencias aumento proporcionalmente, se mantienen las
dif.
Tecnologa de la secuencacinde ADN.Mtodo de los ddNTPs (Sanger)Se
inicia la sntesis con altas concentrciones de dntps y baja
concentracin de ddNTP, le falta el OH en el 3, tiene un H, por lo
que la sntesis no continua. Se electroforean cada uno de los cuatro
tubos con el ddNTP (A T C y G) y se det la sec en base a los fragm
sintetisados, de abajo para arriba el gel se lee 5-3. Se revela por
autorradiografia.Secuencian automtica re piola vago con
fluorocromos de diferente color se puede poner en el mismo pocillo
de gel de electroforesis los cuatro tubos. El color de cada banda
corresponde al del dideoxinucleotido 3 terminal de ese fragmento.
Se detecta los cuatro colores tras acabar la separacin
electrofortica, tambin puede segn va transcurriendo la separacin el
detector puede medir la presencia de bandas que van pasando por el
haz laser y su color. Generando un registro informatizadfo de los
cuatro perfiles de color, que combninados se interpretan como una
secuencia.Para la secuenciacin se necesita gran cantidad de DNA por
lo que primero se realiza un clonado en bacteria para tener mayor
cantidad y luego se procede a la extensin de primerso con ddntp
marcados y por ultimo se realiza la separacin por electroforesis y
se leen las marcas.En forma automtica son graficos feos
Lapirosecuenciacinosecuenciacin 454, de454 Life Sciences, es una
tecnologa de determinacin de secuencia deADNa gran escala,
aplicable agenomascompletos, medianteluminiscencia. A diferencia
del sistema deSanger, capaz de resolver 67.000 bases cada hora,1el
mtodo 454 puede determinar la secuencia de 20 millones en 4,5
horas, lo cual abarata enormemente el coste del
proceso.2Procedimiento[editar] Mediante unaemulsinse generan
microrreactores (microesferas); se intenta que en cada microesfera
haya un nico fragmento de ADN. En cada microrreactor se encuentran
los elementos necesarios para la reaccin dePCR: iniciadores,
dNTPs,polimerasa, cuentas de secuenciacin y, por lo comn, un nico
fragmento deADNmolde. Mediante la amplificacin porPCR, se generan
muchas copias del mismo fragmento de ADN original. Despus se
liberan las cuentas de la emulsin y se colocan en placas donde se
procede con la secuenciacin en paralelo. Para realizar la
secuenciacin se vierte la emulsin sobre una fase slida con
celdillas. Tras aadir las microesferas se incorporan esferas que
inmovilizan a estas y se realiza en cada celdilla una
pirosecuenciacin. La secuenciacin se realiza en paralelo aadiendo
uno de los cuatro nuceltidos y observando qu celdilla se ilumina,
se lava y se aade el siguiente nucletido (se repite el mismo
proceso hasta completar la secuencia).Su bajo coste y
velocidad,
Esta tcnica comienza con el procesado y adaptacin del ADN para
obtener una librera de pequeos fragmentos monocatenarios. Lo
primero es fragmentar el ADN a secuenciar mediante un proceso fsico
conocido como nebulizacin donde el ADN se rompe en fragmentos de
200 a 800 pares de bases aproximadamente.
Posteriormente, mediante protocolos estandarizados de biologa
molecular, se aaden dos pequeas secuencias adaptadoras a cada
fragmento de ADN obtenido en la nebulizacin. El adaptador A y el B.
Las secuencias adaptadores estn diseadas para cumplir funciones en
los pasos de seleccin, amplificacin y secuenciacin.
El siguiente paso es seleccionar los fragmentos de ADN a los que
se han unido correctamente los adaptadores. Para esto, los
fragmentos de ADN se unen a unas esferas especiales por la parte 3
del adaptador B. Esta unin no es por complementariedad de bases.
Los fragmentos que solo contengan adaptador A no se unirn a las
esferas y son eliminados y los que contengan dos adaptadores B se
unirn por dos puntos. Los fragmentos de doble cadena unidos a estas
esferas son sometidos a alta concentracin de NaOH que provoca la
separacin de las cadenas simples. Si el fragmento tiene dos
adaptadores B se separarn las cadenas pero ambas permanecern unidas
a las esferas. Como resultado de este sencillo proceso se liberan
de las esferas los fragmentos de cadena simple que tienen un
adaptador de cada clase con el B situado en el extremo 5 del
fragmento, ya que los fragmentos complementarios a estos
permanecern unidos por el extremo 3 del adaptador B. Se busca en
tonces adaptadores correctamente posicionads A 3 y B 5ara el
proceso de amplificacin, los fragmentos libres de cadena simple se
unen a otras esferas que tienen un gran nmero de secuencias
complementarias del adaptador A. Esta unin est optimizada para que
solo se una un fragmento a una esfera. Una vez unidos los
fragmentos a las esferas se introducen en una emulsin de agua y
aceite de forma que cada esfera quede dentro de una gota con todos
los reactivos y encimas necesarios para la PCR. Tras una serie de
termociclos de PCR se habrn generado en cada esfera un gran nmero
de secuencias de doble cadena idnticas y unidas por el adaptador A.
De nuevo, las esferas son sometidas a alta concentracin de NaOH
para separar las cadenas complementarias. El resultado es que cada
esfera tiene adherido a su superficie un gran nmero de cadenas
simples idnticas unidas por el extremo 3.
Antes de empezar la secuenciacin en s misma se aaden cebadores
complementarios al adaptador B en posicin 5, ADN polimerasas y los
cofactores necesarios para la sntesis de la cadena complementaria a
los fragmentos unidos a las esferas.
El siguiente paso es cargar las esferas en un dispositivo
conocido como PicoTiterPlate que es el que se introduce en el
secuenciador. Este dispositivo consta de ms de un milln de pocillos
de 44 micras de dimetro de forma que solo quepa una esfera con
fragmentos de ADN por pocillo. Adems de las esferas con ADN, se
introducen otro tipo de esferas que contienen las enzimas
necesarias para detectar la incorporacin de nucletidos durante la
sntesis de la cadena complementaria.
Estas enzimas son la sulfurilasa y la luciferasa. La sulfurilasa
genera ATP a partir de pirofosfato y la luciferasa se transforma en
oxiluciferina en presencia de ATP con emisin de luz. De esta forma
se construye una cascada enzimtica que empieza cuando la ADN
polimerasa incorpora un nucletido a la cadena creciente
complementaria del ADN a secuenciar liberando un pirofosfato y
termina cuando la luciferasa emite luz.
Una vez cargadas las esferas con ADN y las esferas con enzimas,
el PicoTiterPlate se introduce en el secuenciador. El secuenciador
automatiza el proceso de secuenciacin, la captura de imgenes y su
interpretacin. El secuenciador vierte automticamente sobre los
pocillos los reactivos necesarios y un tipo de nucletido cada vez.
As de forma cclica se irn vertiendo As, Cs, Gs y Ts. En cada
pocillo, la ADN polimerasa aadir uno o ms nucletidos dependiendo de
la secuencia que acta como molde y se emitir luz con una intensidad
proporcional al nmerro de nucletidos incorporados a la nueva cadena
que se va sintetizando durante el proceso de secuenciacin. El
secuenciador consta de un sistema ptico especial que recoge el
patrn de destellos luminosos que se emiten en el PicoTiterPlate.
Mediante programas informticos se interpretan estos patrones de luz
y se generan unas grficas que indican si ha habido incorporacin o
no de nucletidos y su nmero.
Despus de esto se lava el exceso de nucletidos y reactivos y se
repite el proceso con otro tipo de nucletido de forma cclica hasta
que finalice la sntesis de una cadena complementaria a la cadena
que acta como molde. El resultado es la secuenciacin de los
fragmentos que hay en cada pocillo.
En los adaptadores hay unas secuencias conocidas que sirven para
calibrar los aparatos de recepcin e interpretacin de imgenes. Uno
de los defectos de este sistema es la prdida de precisin en las
regiones homopolimricas.
La posibilidad de automatizar y de paralelizar el proceso de
secuenciacin que ofrece esta tcnica es una de las principales
ventajas frente a otros mtodos de secuenciacin. La pirosecuenciacin
permite la secuenciacin de grandes cantidades de ADN en menos
tiempo que otras tcnicas y con un coste menor. El DNA es Nebulizado
Se fragmenta en tamaos aleatorios Se agregan adaptadores
universales (Adaptador A y B) a los Extremos Se denatura Cada Perla
bead contiene miles de adaptadores, pero solo se le adhiereun
fragmento de DNA que queda atrapado en una emulsin que contiene en
su interior los elementos para una PCR. El DNA se amplifica en esta
emulsin Generando cientos de copias en cada perla Estas son puestas
en la PicoTiter Plate (PTP). El diseo de esta permite una bead por
orificio.
Illumina Se fragmenta el DNA Se reparan los extremos Se agregan
los adaptadores Se agrega el DNA a la placa Se hibrida
aleatoriamente con los adaptadores que estan en la placa Se agregan
NTPs sin marcar y DNA polimerasa. Comienza la amplificacin se
forman puentes con otros adaptadores en la placa Se denatura el DNA
y se vuelve a realizar la amplificacin puente. Se han generado
millones de Clsters en la placa. Se agregan los dNTPs, cada uno
posee un fluoroforo de color particular: G - Amarillo. C Azul A
Rojo T - Verde Se excita con un laser y se captura una imagen. La
imagen capturada en una posicin especfica corresponde al primer
nucletido. Los ciclos de secuenciacin se repiten hasta determinar
la secuencia del templado. Una base a la vez.
RendimientoLargoCalidadCostoAplicacionesPpl Fuente de
errores
Sanger6mb x Dia800nt500$/MbPequeas muestras,genomas,
Indels/SNPS, haplotipos largos, regiones de baja complej
etc.Polimerasa/amplificacion, bajas intensidades/variaciones de
terminacin perdidas, secuencias contamintantes
454/Roche750mb400nt$20Genomas complejos, SNPS, variacin
estrucura, small RNA, mRNAs, etcAmplificacion, perlas mezcladas,
umbral de intensidad, homopolimeros, ajuste de fase, interferencia
vecina
Illumina5000mb100nt$0.5Genomas complejos, (Sage ChiP, Smal RNA)
mRNAS,Indels/homopolimeros, variacin estructura, datos bisulfito,
snps, etcAmplificacion, mezcla de clusters/interferencia vecina,
ajuste de fase, marcado de base
SOLiD5000mb50nt$0.5
Helicons5000mb32nt