SÁVIA PERINA PORTILHO FALCI ÓLEO DE MELALEUCA SP. COMO AGENTE ANTIMICROBIANO EM FERIDAS CONTAMINADAS POR STAPHYLOCOCCUS AUREUS EM RATAS Trabalho Final do Mestrado Profissional, apresentado à Universidade do Vale do Sapucaí, para obtenção do título de Mestre em Ciências Aplicadas à Saúde. POUSO ALEGRE – MG 2015
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SÁVIA PERINA PORTILHO FALCI
ÓLEO DE MELALEUCA SP. COMO
AGENTE ANTIMICROBIANO EM
FERIDAS CONTAMINADAS POR
STAPHYLOCOCCUS AUREUS EM
RATAS
Trabalho Final do Mestrado Profissional,
apresentado à Universidade do Vale do
Sapucaí, para obtenção do título de Mestre
em Ciências Aplicadas à Saúde.
POUSO ALEGRE – MG
2015
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SÁVIA PERINA PORTILHO FALCI
ÓLEO DE MELALEUCA SP. COMO
AGENTE ANTIMICROBIANO EM
FERIDAS CONTAMINADAS POR
STAPHYLOCOCCUS AUREUS EM
RATAS
Trabalho Final do Mestrado Profissional,
apresentado à Universidade do Vale do
Sapucaí, para obtenção do título de Mestre
em Ciências Aplicadas à Saúde.
Orientador: Prof. Dr. Manoel Araújo Teixeira
Coorientadora: Prof.ª Dr. ª Beatriz Bertolaccini Martinez
POUSO ALEGRE – MG
2015
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UNIVERSIDADE DO VALE DO SAPUCAÍ
MESTRADO PROFISSIONAL EM
CIÊNCIAS APLICADAS À SAÚDE
COORDENADOR: Prof. Dr. Taylor Brandão Schnaider
Linha de Atuação Científico-Tecnológica: Fitoterapia
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DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho ao meu pai Benedito (in memorian) e minha mãe Helena por sua
capacidade de acreditar e de investir em mim, à minha irmã Rúbia, aos meus familiares e
amigos pelas alegrias, tristezas e dores compartilhadas no processo de obtenção deste título
tão almejado.
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AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Dr MANOEL ARAÚJO TEIXEIRA, professor orientador do programa de
pós-graduação em Ciências Aplicadas a Saúde da Universidade do Vale do Sapucaí
(UNIVÁS), orientador deste trabalho, pelo direcionamento, orientações, correções, sugestões
e por sua incansável paciência no decorrer de todo o processo e principalmente por me ensinar
a ser pesquisadora.
À Prof.a Dr.a BEATRIZ BERTOLACCINI MARTINEZ, professora orientadora do
programa de pós-graduação em Ciências Aplicadas a Saúde da UNIVÁS, pela coorientação
deste trabalho, pelas correções e sugestões.
À Prof.a Dr.a DANIELA FRANCISCATO VEIGA, professora orientadora do
programa de pós-graduação em Ciências Aplicadas a Saúde da UNIVÁS pelas orientações e
sugestões, a minha admiração por tanta dedicação e competência.
Aos Professores LYDIA MASAKO FERREIRA, ANDY PETROIANI, DIBA
MARIA SEBBA TOSTA DE SOUZA, JOSÉ DIAS SILVA NETO, GERALDO MAGELA
SALOMÉ, JOEL VEIGA FILHO, MARIA JOSÉ AZEVEDO DE B. ROCHA, TAYLOR
BRANDÃO SCHNAIDER, ANA BEATRIZ ALKMIM TEIXEIRA LOYOLA e ADRIANA
RODRIGUES DOS ANJOS MENDONÇA por todos os ensinamentos, orientações e
sugestões tão importantes para realização deste trabalho.
Ao Prof. Dr NEIL FERREIRA NOVO e à Prof.a Dr.ª YARA JULIANO, professores
de bioestatística do programa de pós-graduação em Ciências Aplicadas a Saúde da UNIVÁS,
pela orientação e condução da análise estatística dos resultados deste trabalho.
À ILZAMARA MOREIRA SANTOS, VÂNIA DE FÁTIMA BARBOSA e
ELIZAMA SIQUEIRA BITTENCOURT, acadêmicas do curso de Enfermagem, LUIZ
ANDRE DE OLIVEIRA COSTA e TIAGO JARDIM DE OLIVEIRA, acadêmicos do curso
de Biologia pelo auxílio durante todo o decorrer da pesquisa, no preparo da anestesia dos
ratos, no processo de confecção, limpeza e curativo das feridas e na realização das culturas no
Laboratório de Cirurgia Experimental da UNIVÁS.
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A PABLO FERREIRA DAS CHAGAS, acadêmico do curso de Biologia da UNIVÁS
por sua ajuda na realização dos testes in vitro no laboratório de microbiologia da UNIVÁS.
A WELLINGTON DELFINO, coordenador do Comitê de Ética no Uso de Animais-
CEUA e veterinário do biotério por seu auxílio nos processos de anestesia, confecção das
feridas, coleta do material biológico e eutanásia dos animais no final do experimento.
A IVAN LÚCIO DE MELO funcionário do Laboratório de Cirurgia Experimental, por
suas sugestões que foram de muita ajuda para que todo o experimento decorresse da melhor
forma e por dispor recursos da estrutura laboratorial da UNIVÁS.
A LUIZ FRANCISLEY DE PAIVA, funcionário do Laboratório de Pesquisas básicas
da UNIVÁS por sua importante ajuda no preparo dos meios de cultura, na realização das
diluições das amostras dos lavados das feridas dos ratos e na realização das culturas.
A JOSÉ DONIZETI DOS REIS, funcionário do Laboratório de Botânica da UNIVÁS
por sua indispensável ajuda na obtenção do óleo de Melaleuca sp.
À amiga SAMANTA BORGES PEREIRA por toda ajuda e incentivo no início deste
projeto e aos meus amigos pela paciência na “fase mestrado”.
Aos amigos e patrões Dr. ANISIO EUSTÁQUIO DOS ANJOS SILVA e Dr.ª LUZIA
HELENA ALMEIDA DOS ANJOS proprietários do Méthodos Laboratório de análises
clínicas de Pouso Alegre por todo o apoio e ajuda financeira na realização deste sonho.
vii
O sucesso nasce do querer, da determinação e persistência em se chegar a um objetivo.
Mesmo não atingindo o alvo, quem busca e vence obstáculos, no mínimo fará coisas
Na determinação da CIM foram utilizados 14 tubos de ensaio com 5 mL de caldo
Tioglicolato (Himedia®) para cada uma das cepas utilizadas. Em 12 tubos foram acrescidas
concentrações progressivas do óleo extraído, sendo o 12o tubo usado como controle, ou seja,
com a menor concentração do óleo, mas sem inóculo. O 13o tubo foi usado como controle
positivo de crescimento, isto é, sem o óleo, porém com o inóculo, e o 14o usado como
controle negativo, sem o óleo e sem o inóculo, apenas o meio de cultura. As concentrações
utilizadas foram 8; 4; 2; 1; 0,4; 0,2; 0,1; 0,05; 0,025; 0,0125 e 0,00625%. O ensaio foi
realizado com três repetições para cada tubo. Após a adição do óleo, os 11 primeiros tubos e o
13º tubo (controle positivo) receberam 250 µL de um mesmo inóculo contendo 1x106
UFC/mL. Todos os tubos foram acondicionados em incubadora a 37°C de temperatura,
durante 18 horas. Decorrido esse período, os tubos foram examinados visualmente para
comprovar a presença de turvação. O primeiro tubo no qual não se observou turvação foi
considerado como contendo a CIM (Figura 2).
A CIM foi estabelecida para a bactéria isolada da lesão do pé, para a lesão do
joelho e para a cepa de Staphylococcus aureus subsp. aureus (ATCC® 25923™), que é uma
cepa americana padronizada (Figura 2).
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FIGURA 2: Ensaio para determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração Bactericida Mínima (CBM). Fonte: Falci, S.P.P.
3.3.3 - DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO BACTERICIDA MÍNIMA (CB M)
Nos tubos que não se mostraram turvos, foram retiradas alíquotas de 100 µL, que
foram depositadas em placas de Petri contendo ágar sal-manitol (Difco Co), espalhadas com o
auxílio da alça de Drigalski e encubadas invertidas a 37º por 18 horas. A primeira
concentração que não permitiu o crescimento de nenhuma colônia sobre a superfície do ágar
foi considerada como a CBM, ou seja, a concentração capaz de matar todos os
microrganismos.
3.4 - INFECÇÃO ESTAFILOCÓCICA EM ANIMAIS
O experimento foi realizado no laboratório de Cirurgia Experimental, para os
procedimentos com os ratos, e no Laboratório de Microbiologia, para os procedimentos de
cultura microbianas e contagem de unidades formadoras de colônias (UFC), da Faculdade de
Ciências da Saúde Dr. José Antônio Garcia Coutinho da Universidade do Vale do Sapucaí
(UNIVÁS), em Pouso Alegre, Minas Gerais.
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Desenho da pesquisa:
Tratou-se de estudo experimental com ratos, primário, intervencional,
prospectivo, analítico e controlado. Os princípios éticos para o uso de animais de laboratório
foram seguidos conforme preconiza o Colégio Brasileiro de Experimentação Animal
(COBEA). O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética no Uso de Animal (CEUA) da
Universidade do Vale do Sapucaí (UNIVÁS), sob o protocolo 187/13 (Anexo 5).
3.4.1 - ANIMAIS
A amostra foi constituída por 40 ratos (Rattus Norvegicus albinus) da linhagem
Wister, fêmeas, com 3 a 4 meses de vida, com massa corpórea de aproximadamente 300 g,
proveniente do biotério da Universidade do Vale do Sapucaí, MG, Brasil (UNIVÁS).
Os animais ficaram dez dias em adaptação, alojados e mantidos no biotério em
caixas moradias individuais de polipropileno (Caixa GK 115 – Beira Mar), com dimensão de
49x34x16 centímetros (cm), identificadas com números de 1 a 40. A iluminação foi
controlada com ciclo claro/escuro de doze horas. Os animais receberam ração padronizada
(ração extrusada presence da marca Evitalis) e água ad libitum. A higienização das gaiolas foi
realizada duas vezes por semana, com troca das maravalhas.
3.4.2 - CONFECÇÃO DAS FERIDAS
Todos os procedimentos cirúrgicos foram realizados sob anestesia geral, por meio
de administração intramuscular de 0,1 mL de cloridrato de quetamina (Dopalen, Agribrands),
associado a 0,05 mL de cloridrato de xylazina (Rompun, Bayer), para cada 100 gramas de
peso do animal.
Com o animal anestesiado, por meio de um molde de papelão e com uma caneta
dermográfica, demarcou-se no dorso uma área quadrangular de 5 cm no eixo longitudinal por
5 cm no eixo transversal, iniciada a partir da margem inferior das escápulas. Essa área foi
epilada manualmente.
Antes da incisão, o local da ferida foi estabelecido como uma área circular de 2,5
cm de diâmetro, no plano transverso, com seu centro na linha mediana dorsal seguindo em
sentido caudal, iniciando-se a 1 cm da margem inferior das escápulas.
Na mesa cirúrgica, a região demarcada em cada rato foi limpa com solução salina
a 0,9%, e a antissepsia realizada com álcool 70% (Figura 3A). Com um “punch” de aço
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inoxidável de 2,5 cm de diâmetro e extremidade cortante em bisel fez-se pressão contra a pele
o que produziu um corte circular superficial (Figura 3B). Com bisturi e tesoura íris foram
completadas a incisão e a ressecção da pele e do panículo carnoso até a fáscia muscular
superficial (Figura 3C), produzindo a ferida conforme técnica preconizada por OLIVEIRA et
al., 2000 com adaptação de ATZINGEN et al.(2013) (Figura 3D).
FIGURA 3: Ato cirúrgico para produção das feridas: A) Área epilada. B) Demarcação sob pressão com o punch. C) Incisão da pele. D) Ferida cutânea expondo a fáscia muscular. Fonte: Falci, S.P.P.
3.4.3 - INFECÇÃO POR S. AUREUS NOS RATOS
A seguir ao procedimento cirúrgico, cada animal recebeu sobre a ferida 0,5 mL de
uma suspensão bacteriana de 1,0 x 106 UFC/mL de S. aureus (turbidez de 0,5 na escala de Mc
Farland). Nesse experimento utilizou-se o S. aureus isolado da lesão do joelho por apresentar
resistência a um número maior de antibióticos que as outras duas cepas utilizadas nos testes
de CIM e CBM (Figura 4A).
A B
C D
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Esse procedimento foi efetuado em todos os animais, sendo esse dia considerado
como dia zero da infecção. Em seguida, a ferida foi coberta com filme transparente adesivo
(Smith & Nephew® Inglaterra, modelo OpSite Flexigrid) com dimensão de 2,5x3,0cm (Anexo
VI). Para a fixação do filme transparente, a película que protege a parte adesiva foi removida,
sendo o filme aderido à área ao redor da ferida e, em seguida, foi removida a camada externa,
ficando, apenas a camada do meio, fina e flexível aderida ao dorso do animal (Figura 4B).
Depois o animal foi recolocado na gaiola.
FIGURA 4: Infecção da ferida: A) Inoculação de 0,5 mL de uma suspensão bacteriana de 1,0 x 106 UFC/mL de S. aureus. B) Fixação de filme adesivo protetor. Fonte: Falci, S.P.P.
Após dois dias da infecção foi realizada a separação dos animais em quatro grupos
distintos a saber:
a) grupo controle (n=10) – o tratamento das feridas dos ratos foi realizado com 1 mL de gel
de carbopol;
b) grupo tetraciclina (n=10) – as feridas deste grupo de ratos receberam 1 mL de tetraciclina
a 1% em gel de carbopol, obtido em farmácia de manipulação;
c) grupo Melaleuca alternifolia (n=10) – neste grupo foi aplicado 1 mL de óleo de Melaleuca
alternifolia a 1% em gel de carbopol, obtido em farmácia de manipulação;
d) grupo Melaleuca sp. (n=10) – as feridas dos ratos receberam 1 mL do óleo de Melaleuca
sp. (extraído no laboratório de botânica da UNIVÁS) a 1% em gel de carbopol que foi
preparado em farmácia de manipulação.
3.4.4 - LIMPEZA DAS FERIDAS E APLICAÇÃO DO PRINCÍPIO ATIVO
Diariamente, sempre antecedendo à aplicação do tratamento, foi realizado o
desbridramento da ferida quando necessário, com o auxílio de pinça e gaze embebida em soro
A B
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fisiológico 0,9% esterilizado por meio de um procedimento rápido, invadindo minimamente
os tecidos vivos. Em seguida foi realizada a limpeza da ferida com 5 mL de soro fisiológico a
0,9%.
Para os tratamentos realizados a partir do estabelecimento da infecção foi usado
um “prompt” com capacidade de dispensação de 1 mL da substância utilizada em cada grupo,
de forma a preencher toda a superfície da lesão e desta forma padronizar a quantidade de
tratamento aplicada nos quatro grupos (Figura 5). Esses tratamentos foram realizados durante
um período de 15 dias.
Após a limpeza e o tratamento, as feridas permaneceram cobertas por filme
transparente adesivo durante todo o experimento. A analgesia dos animais durante o
experimento foi feita com Cetoprofeno (3 dias) e Dipirona gotas (12 dias), diluídos na água
que os ratos beberam, na quantidade de 5 mg/Kg e 15 mg/kg, respectivamente.
FIGURA 5: Aplicação do tratamento com o auxílio do “prompt” de dispensação de 1 mL. Fonte: Falci, S.P.P.
3.4.5 - QUANTIFICAÇÃO DO NÚMERO DE MICRORGANISMOS NAS LESÕE S PELO MÉTODO DA IRRIGAÇÃO-ASPIRAÇÃO
A coleta do lavado da ferida para quantificação das UFC foi realizada nos 1º, 5º,
8º, 12º e 15º dias, contados depois do processo de infecção. A cada avaliação foram
depositados sobre a ferida, com o auxílio de uma seringa com capacidade de dez mL acoplada
a uma agulha estéril de calibre 25x7, 5 mL de soro fisiológico a 0,9%, esterilizado. A solução
do soro fisiológico lavou todo o leito da lesão. Com uma seringa de 3 mL, foi expirado
exatamente 2 mL dessa solução do soro com os microrganismos existentes na lesão e
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transferidos para um tubo de ensaio esterilizado. Este foi vedado com tampa de rosca e
imediatamente encaminhado ao laboratório de microbiologia.
Para possibilitar a coleta do lavado das lesões, evitando a perda dessa solução com
as bactérias, foi utilizado um suporte confeccionado a partir do corte do embolo de seringa de
20 mL e afixado manualmente ao redor da lesão pelo pesquisador. Esse suporte e a seringa de
3 mL foram trocados a cada nova coleta em cada rato (Figura 6A e 6B).
FIGURA 6: Coleta do material da ferida pelo método irrigação e aspiração. A) Obtenção do lavado da ferida. B) Acondicionamento do lavado em tubo de ensaio estéril. Fonte: Falci, S.P.P.
A alíquota de 1 mL da mistura do soro com os microrganismos foi retirada da
amostra e submetida à técnica de diluição seriada. Com uma pipeta automática esterilizada
repassou-se 1,0 mL do lavado da ferida para outro tubo de ensaio com 9,0 mL de solução
esterilizada de cloreto de sódio a 0,9%, obtendo a diluição 10-1. Esse procedimento foi
repetido até a diluição 10-7 (Figura 7). Após a diluição foi transferido 100µL de cada uma das
sete diluições, começando da mais diluída para a menos diluída, para a superfície do meio
ágar sal manitol, seletivo para bactérias do gênero Staphylococcus (Figura 8). Para cada
diluição, foram realizados três plaqueamentos.
A B
16
FIGURA 7: Exemplo do processo de diluição seriada. Fonte: https://bacilosnasopa.wordpress.com/tag/tecnica-de-diluicao-seriada/
FIGURA 8: Ágar sal manitol. Fonte: Falci, S.P.P.
O inóculo foi espalhado com o auxílio da alça de Drigalsky sobre a superfície do
ágar sal manitol (Figura 9A). As placas foram incubadas invertidas, a uma temperatura de
37ºC, por 24h, quando então foi feita a contagem de bactérias com aspecto de colônias
características típicas do crescimento de S. aureus (colônias com halo amarelo ao redor,
resultado da fermentação do manitol (Figura 9B) com o auxílio do contador de colônias
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mecânico CP 602 (Phoenix) (Figura 9C). A quantificação de UFC indicou quantas bactérias
havia, por mililitros, na suspensão original da ferida.
No décimo sétimo dia do experimento, o animal foi submetido à anestesia geral e
em seguida realizada a retirada do material biológico para futuros estudos. A eutanásia foi
realizada com cloreto de potássio 19% via intracardíaca.
FIGURA 9: Cultura e contagem de UFC. A) Inoculação do material para o meio de ágar sal manitol. B) Bactérias com aspecto de colônias características típicas do crescimento de S. aureus C) Contagem de Unidades Formadoras de Colônias (UFC). Fonte: Falci, S.P.P.
A B
C
18
3.5 - ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os dados foram processados pelo software Statistical Package for the Social
Sciences (SPSS), versão 18. Por meio do teste de Kruskal Wallis, foi avaliada entre os grupos
a diferença quantitativa do número de UFC nos 5 dias de coleta do lavado das feridas e nas 7
diluições no decorrer dos 15 dias de tratamento. Foi avaliada também dentro de cada grupo a
variação de crescimento de UFC nos 5 dias de coleta do lavado das feridas no decorrer do
tratamento e nas 7 diluições, pelo teste de Friedman.
O nível de rejeição da hipótese de nulidade foi fixado em 5%, considerando-se
significantes os valores de p menores ou iguais a 0,05.
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4 - RESULTADOS/PRODUTO
4.1 - IDENTIFICAÇÃO CROMATOGRÁFICA DOS COMPONENTES DO ÓLE O
DA MELALEUCA SP.
No óleo de Melaleuca sp. foram detectados 27 picos, dos quais 21 são
apresentados na Tabela 1. Os seis picos não identificados podem estar relacionados a novas
estruturas que não foram reconhecidas pela biblioteca de dados do programa ou podem ser
picos que não se separaram uns dos outros durante a cromatografia. Houve uma pequena
prevalência de monoterpenos (57,2%) em relação à presença de sesquiterpenos (42,8%). Os
principais monoterpenos foram o eucaliptol ou 1,8 cineol com 70,08%, seguidos de terpineol
com 8,95% e limonemos com 8,25%. Dos sesquiterpenos encontrados, o mais abundante foi o
globulol, seguido de octahidro tetrametil ciclopropazuleno com 0,62% e 0,50%. Todos os
constituintes identificados no óleo estão dispostos na Tabela 1.
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TABELA 1 – Analitos identificados no óleo de Melaleuca sp.
Pico: Número do pico pela ordem de eluição da coluna tR = Tempo de retenção do composto na coluna em minutos Nome do composto: Nome mais comum do composto identificado. %A = Porcentagem de área normalizada a qual indica a distribuição relativa dos compostos na amostra. Qualidade: é o índice de pesquisa na base de dados que reflete a similaridade do espectro de massas obtido com os registrados nas bibliotecas utilizadas. Foram adotados índices de qualidade > 70. Fonte: Falci, S.P.P.
21
4.2 - ANÁLISE DA CONCENTRAÇÃO INIBITÓRIA MÍNIMA (CIM) E
CONCENTRAÇÃO BACTERICIDA MÍNIMA (CBM)
A partir de inóculos padronizados de cada amostra bacteriana testada foram
obtidos os resultados de CIM e CBM para o óleo de Melaleuca sp. cultivado no Brasil.
Houve crescimento bacteriano em todos os tubos com meio de cultura sem adição
do óleo teste. A CIM do óleo de Melaleuca sp. mostrou diferentes resultados para as bactérias
testadas, sendo que, os S. aureus, proveniente da lesão do pé e a cepa controle, ATCC®
25923™ foram mais resistentes ao óleo testado, quando comparados ao S. aureus proveniente
da lesão do joelho. O óleo da Melaleuca sp. apresentou CIM de 0,1% para o isolado de S.
aureus proveniente da lesão no pé e para a cepa controle ATCC® 25923™. Para o isolado da
lesão no joelho, a CIM foi de 0,2%
A CBM do óleo de Melaleuca sp. foi a mesma para todas as bactérias testadas, e a
ausência de crescimento se deu a partir do tubo 5 a 0,4%. Portanto, os resultados obtidos para
CIM e CBM foram respectivamente 0,1% e 0,4% para o isolado de S. aureus proveniente da
lesão no pé (Figura 10) e de 0,2% e 0,4% para o isolado da lesão no joelho. Para a cepa
ATCC® 25923™, a CIM e a CBM foram respectivamente 0,2% e 0,4% (Figura 11).
e polisporin (BATRA et al., 2010, SIMOR et al., 2007, HACEK et al., 2008. BODE et al.,
2010, MODY et al., 2003).
A partir do 8º dia de leitura do experimento, o óleo da Melaleuca alternifolia foi
mais eficiente que o óleo da Melaleuca sp., apesar de não haver diferenças estatísticas. No
entanto, a partir dessa leitura também houve uma redução dos microrganismos no tratamento
controle, fato esse que sugere que a aparente ação do óleo da M. alternifolia pode estar
relacionada com a limpeza das feridas por meio da lavagem por aspersão do que pela ação do
óleo da planta.
O óleo de Melaleuca sp. possui uma ação importante nos primeiros dias de
tratamento (até o 5º dia) e depois passou a apresentar resultados menos expressivos no
decorrer de toda a pesquisa. Isso pode ter acontecido por uma série de fatores, que devem ser
melhor estudados, como a via de administração inadequada (tratamento tópico), baixa
concentração do princípio ativo (foi utilizado o óleo da Melaleuca sp. a 1% baseado nos
resultados dos testes “in vitro” CIM = 0,2% e CBM = 0,4%) ou ainda atribuído ao baixo
número de aplicações diárias (1 vez ao dia). Ainda assim, o trabalho mostrou que existe um
resultado positivo desse fitoterápico em relação ao controle e que sua ação é muito similar ao
tratamento realizado com o óleo da Melaleuca alternifolia, que já é um óleo bastante estudado
e comercializado em todo o mundo.
Outros estudos devem ser realizados com o óleo de Melaleuca sp., objetivando,
principalmente, relacionar o teor de 1,8 cineol ou eucaliptol com a atividade antimicrobiana,
assim como determinar a concentração ideal, a melhor via de administração e o número de
aplicações diárias.
A utilização de várias diluições mostrou ser desnecessária para avaliação desse
tipo de experimento, pois os resultados foram obtidos até a diluição de 10-3, enquanto que as
demais não apresentaram crescimento de S. aureus (Tabelas 5, 6, 7, 8, 9 e 10). As diluições
em que se percebem os resultados mais significantes são as de 10-1 e 10-2. Os resultados
avaliados na diluição 10-1 mostraram que a Melaleuca sp. obteve um melhor resultado em
relação à M. alternifolia. Por outro lado, esse resultado não foi confirmado nas demais
diluições 10-2 e 10-3. Neste trabalho a leitura dos resultados foi descrita e tomaram com base a
diluição de 10-1, mas se faz necessária uma melhor discussão sobre qual das diluições pode
ser a melhor indicada para avaliação de resultados ao se empregar a metodologia de irrigação
e de aspiração.
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6 - CONCLUSÕES
O óleo da planta Melaleuca sp. cultivada no Brasil, mais precisamente na cidade
de Pouso Alegre – MG, mostrou um bom potencial bactericida in vitro, mas quando foi
avaliada in vivo a sua capacidade antibacteriana foi diminuída. Ainda assim, o seu
comportamento antibacteriano é igual ao do óleo de M. alternifolia.
Para as cepas testadas neste experimento não se recomenda o tratamento com os
óleos fitoterápicos estudados, e sim com tetraciclina.
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7 - IMPACTO SOCIAL
O óleo da Melaleuca sp. mostrou ser eficiente contra algumas cepas de
Staphylococcus aureus, nas condições in vitro e in vivo, tendo seus resultados semelhantes aos
descritos e observados com o óleo da Melaleuca alternifolia. A contribuição do presente
trabalho está na identificação de uma planta ainda pouco estudada e bem adaptada ao
ambiente na região do sul de Minas Gerais, a qual poderá ser futuramente utilizada como um
fitoterápico no controle de bactérias do gênero S. aureus. Desta forma, contribuirá para um
tratamento mais barato e com eficiência similar ao óleo de Melaleuca alternifolia. Essa planta
é amplamente comercializada em todo mundo, na forma de produtos como shampoos, cremes,
sabonetes, enxaguantes bucais, esmaltes, géis de limpeza, desinfetantes, fungicidas e
bactericidas para a agricultura. Acredita-se que esses produtos também possam ser
desenvolvidos no Brasil com o óleo da Melaleuca sp. Outra forma de impacto social indireto
na região é na agricultura, por meio do cultivo da planta, bem como o uso na indústria, por
meio da produção de um óleo de boa atividade antimicrobiana no Brasil.
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8 - REFERÊNCIAS
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9 - NORMAS ADOTADAS
C.O.B.E.A. (Colégio Brasileiro de Experimentação Animal) – Princípios éticos da
experimentação animal. Disponível no endereço eletrônico:
http://www.meusite.com.br/cobea/index.htm.
Manual de procedimento para painéis de Gram-Positivos Desidratados-
MicroScan®– SIEMENS.2010; 31-32.
A Standards Association of Australian (1985), por meio da AS 2782, e
International Standards Organization (1996),
45
10 - APÊNDICES
Apêndice: Contagem de UFC nas diluições 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6 e 10-7 em cada
grupo, no decorrer do tratamento.
FIGURA 12: contagem de UFC na diluição 10-1 nos quatro grupos de tratamento nos dias 1, 5
, 8, 12 e 15 de tratamento.
FIGURA 13: contagem de UFC na diluição 10-2 nos quatro grupos de tratamento nos dias 1,
5, 8, 12 e 15 de tratamento.
46
FIGURA 14: contagem de UFC na diluição 10-3 nos quatro grupos de tratamento nos dias 1,
5, 8, 12 e 15 de tratamento.
FIGURA 15: contagem de UFC na diluição 10-4 nos quatro grupos de tratamento nos dias 1, 5,
8, 12 e 15 de tratamento.
47
FIGURA 16: contagem de UFC na diluição 10-5 nos quatro grupos de tratamento nos dias 1 5,
8, 12 e 15 de tratamento.
FIGURA 17: contagem de UFC na diluição 10-6 nos quatro grupos de tratamento nos dias 1,
5, 8, 12 e 15 de tratamento.
48
FIGURA 18: contagem de UFC na diluição 10-7 nos quatro grupos de tratamento nos dias 1,
5, 8, 12 e 15 de tratamento.
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11 - ANEXOS
ANEXO I - Microscopia óptica – microorganismos do gênero Staphylococcus: cocos