Скоблов Михаил Юрьевич Молекулярная биология Лекция 2. Структура и свойства нуклеиновых кислот.
Скоблов Михаил Юрьевич
Молекулярная биология
Лекция 2. Структура и свойства нуклеиновых кислот.
Часть 1. Структура нуклеиновых кислот
Состав клетки Вещества в клетке
Неорганические • Вода – 75-85% • Неорганические соли,
кислоты – 1-1,5%
Органические
Малые молекулы • Моносахариды • Аминокислоты • Нуклеотиды • Другие • Липиды (жиры) – 1-5%
Биополимеры (макромолекулы)
• Полисахариды (углеводы) - 0,2-2% • Белки - 10-20% • Нуклеиновые кислоты (ДНК, РНК) - 1-2%
0,5%
История открытия:
Фридрих Мишер
• В 1869 году молодой швейцарский врач Фридрих Мишер в Германии решил изучить химический состав клеток животных, а в качестве материала выбрал лейкоциты, которых было много в гное. Из местной хирургической больницы ему стали привозить корзины с гнойными повязками, снятыми с ран.
• В процессе работы он понял, что кроме белков в лейкоцитах присутствует неизвестное соединение, содержащееся в ядрах клеток.
• Фридрих Мишер назвал его нуклеином, от латинского nucleus — ядро.
• Позже было обнаружено, что бактериальные клетки, в которых нет ядра, тоже содержат нуклеиновые кислоты.
• Джерард Маирбакс изолировал первую матричную РНК, кодирующую гемоглобин кролика и показал, что при её введении в ооциты образуется гемоглобин.
• Северо Очоа получил Нобелевскую премию по медицине в 1959 году за открытие механизма синтеза РНК
ДНК
РНК
Строение нуклеозида и нуклеотидов
Строение нуклеозида и нуклеотидов
Строение нуклеозида и нуклеотидов
Строение рибонуклеотидов
Названия нуклеозидов и нуклеотидов
Сокращение Нуклеозид Нуклеотид
A Аденин Аденозин
G Гуанин Гуанозин
T Тимин Тимидин
C Цитозин Цитидин
U Урацил Уридин
Минорные основания нуклеозидов
Содержание нуклеотидов
Организм A G C T G+C, мол. %
Бактериофаг λ 26 23,8 24,3 25,8 48
Бактериофаг Т2 32,5 18,2 16,72 32,6 35
Escherichia coli 23,8 26 26,4 23,8 52
Bacillus subtilis 29 20,7 21,3 29 42
Вирус папилломы Шоупа
26,6 24,5 24,2 24,7 49
Saccharomyces cerevisiae
31,3 18,7 17,1 32,9 36
Chlamydomonas 19,6 30,2 30 19,7 60
Цыпленок 27,9 21,2 21,5 29,4 43
Мышь 28,9 21,1 20,3 30 41
Корова 27,3 22,5 22,5 27,7 44
Пшеница 27,2 22,6 22,8 27,4 45
Содержание динуклеотидов
Gentles AJ, Karlin S. Genome-scale compositional comparisons in eukaryotes. Genome Res. 2001 Apr;11(4):540-6.
За 400 млн лет позвоночными утрачено 75% CpG динуклеотидов
Ацикловир
ТК вируса
герпеса ? ?
Монофосфат
ацикловира
Дифосфат
ацикловира
Трифосфат
ацикловира
Вирусная ДНК-
полимераза
Ацикловир – самое распространенное противогерпетическое лекарственное
средство. Убирает симптомы заболевания, но не излечивает!
Вирус погибает
Модифицированные нуклеозиды
Джеймс Уотсон и Френсис Крик. 1953 год.
Вторичная структура ДНК
Вторичная структура ДНК
В формировании вторичной структуры ДНК участвуют следующие типы взаимодействий:
• водородные связи между комплементарными основаниями (две между аденином и тимином, три — между гуанином и цитозином);
Принцип комплементарности
Вторичная структура ДНК
В формировании вторичной структуры ДНК участвуют следующие типы взаимодействий:
• стэкинг-взаимодействия
• нековалентное взаимодействие между органическими соединениями, содержащими ароматические компоненты.
• В ДНК параллельный стэкинг имеет место между соседними парами нуклеотидов и повышает стабильность молекулярной структуры.
пурин-пурин>пиримидин-пурин>пиримидин-пиримидин
Неканонические формы ДНК
В-ДНК - основное состояние ДНК показанное на кристаллах и в водных растворах. С-ДНК - форма существующая при пониженной концентрации Na и влажности 44-66%, если GC=31-72%. А-ДНК - форма ДНК-РНК гибридов. Z-ДНК - левозакрученная форма. Переходу B-->Z способствует наличие GC-5' последовательности являющейся местом метилирования у организмов. Z-ДНК обнаружена в междисках политенных хромосом D. melanogaster.
G-квадруплексы последовательности нуклеиновых кислот, обогащенные гуанином и способные образовывать структуры из двух, трёх или четырех цепей.
Часть 2. Свойства нуклеиновых кислот
Химические свойства
• ДНК и РНК - нуклеиновые кислоты, кислоты, слабые, но кислоты • Молекулы нуклеиновых кислот содержат множество
отрицательно заряженных фосфатных групп и образуют комплексы с ионами металлов; их калиевая и натриевая соли хорошо растворимы в воде.
• 2’ гидроксил делает РНК уязвимой к щелочному и кислотному гидролизу
• Концентрированные растворы нуклеиновых кислот очень вязкие и слегка опалесцируют, а в твердом виде эти вещества белые.
• Нуклеиновые кислоты сильно поглощают ультрафиолетовый свет, и это свойство лежит в основе определения их концентрации. С этим же свойством связан и мутагенный эффект ультрафиолетового света.
Оптические свойства ДНК • Поглощение нуклеиновых кислот в ближней УФ-области почти целиком обязано
пуриновым и пиримидиновым основаниям. • Сахарофосфатный остов РНК и ДНК дает незначительный вклад в спектр
поглощения при длинах волн, превышающих 200 нм.
• Спектры всех четырех нуклеозидов чувствительны к рН. Протонирование С и G приводит к значительному сдвигу поглощения в сторону больших длин волн (красное смещение). Депротонирование U или Т при щелочных рН также приводит к существенному красному смещению максимума поглощения. Протонирование А сопровождается гораздо меньшими спектральными изменениями.
Оптические свойства ДНК • Наиболее часто измерения поглощения проводят для определения
концентрации. • Это можно делать, если известен коэффициент молярной экстинкции и
соблюдается закон Ламберта-Бера. Например, для двухцепочечной ДНК D260=1 соответствует 50 мкг/мл, для РНК – 40.
Молекулярный коэффициент экстинкции.
OD - единица измерения количества олигонуклеотидов, соответствует количеству, которое в 1ml на пути 1см дает А260=1 C [µmol/ml] = OD/E олигонуклеотида E олигонуклеотида = сумма всех (Eнуклеотидов)
E [ml/µmol] dG 7 dC 12 dA 16 dT 9,6 dN 10,8
• Расхождение цепей происходит из-за разрушения слабых водородных связей и плоскостных взаимодействий между основаниями.
• На денатурацию также влияют: ионы одно- и двухвалентных металлов, белки, нейтрализующие отрицательные заряды фосфатных групп.
• Температура плавления GC выше чем АТ.
• Денатурация – процесс обратимый, последующее восстановление двухцепочечной структуры ДНК может происходить даже при полном расхождении цепей. Процесс воссоединения, называемый ренатурацией, реассоциацией или отжигом, происходит при
• понижении температуры или рН • При резком понижении температуры или рН правильное воссоединение комплементарных
цепей затрудняется из-за спаривания оснований локально комплементарных участков в пределах одной или разных цепей.
• При ренатурации сначало соединяются участки цепей с повторенной ДНК и затем с уникальными участками
• Если совместно. отжигают одноцепочечные ДНК, происходящие из различных точников, то формирование двухцепочечной структуры ДНК называют гибридизацией.
Плавление ДНК
Денатурация или плавление - расхождение цепей ДНК при нагревании ДНК или при повышении pH.
40%
60%
Плавление ДНК
Tm — температура, при которой половина ДНК-матриц имеет двухцепочечную структуру
Плавление ДНК
• Плавление ДНК - процесс перехода регулярной двойной спирали линейной молекулы ДНК в клубкообразное состояние.
• При переходе ДНК из спирального состояния в клубкообразное поглощение раствора A в области 250-270 нм увеличивается на 30-40%
• Суммарная длина различных присутствующих в геноме последовательностей, оценивается по их реассоциации в процессе ренатурации ДНК
• Метод реассоциации ДНК позволяет судить о близком родстве по способности денатурированных отдельных нитей ДНК одних бактерий реассоциировать перекрестно при инкубации в определенных условиях с нитями ДНК других, образовывая спиральную гибридную молекулу.
Вторичная структура – распределение вторичных структур рибозофосфатного скелета вдоль цепи
Вторичная и третичная структуры тРНК кодированы одним цветом
Вторичная и третичная структуры РНК
Третичная структура – 3D структура молекулы РНК
C A G A G A C G | | C G | G C G | | A U / \ G | A A \ / G C | | C G | | A U / \ / C C G C-A / | | A G-C-A-A-G G C A G-G-U-U-C | | U-G \ C G U | \ \ / A G C | | | U A U | | | C G U | | | A C G / A G A
Элементы вторичной структуры
Петля-шпилька
Внутреняя петля
Выпячивание
Множественная петля Спирали
Псевдоузел
Вторичная структура HIV-1
Часть 3. Методы исследования первичной и вторичной
структуры нуклеиновых кислот.
Фредерик Сенгер
Секвенирование ДНК
Терминаторы элонгации цепи
Дидезоксинуклеотиды
1980г Вторая Нобелевская премия по химии: «for their contributions concerning the determination of base sequences in nucleic acids»
Секвенирование ДНК по Сенгеру
Капилярное секвенирование с флуоресцентными терминаторами
Обратная транскрипция
Обратная транскриптаза (также известная как ревертаза или РНК-зависимая ДНК-полимераза)
• Фермент класса трансфераз, осуществляющий ДНК-зависимый синтез ДНК на матрице РНК (обратная транскрипция).
• Обладает активностью РНКазы Н (т.е. разрушает цепь РНК, входящую в состав ДНК/РНК-дуплекса).
• Подобно всем ДНК-полимеразам функционирует только при наличии затравки.
Потенциал вторичной структуры РНК
Более чем для 3000 транскриптов определены элементы вторичной структуры, что составляет около 50% всех генов Saccharomyces cerevisiae.
SHAPE (selective 2-hydroxyl acylation analysed by primer extension
Предсказание вторичной структуры
• Перебор вариантов (жадные алгоримы)
• Минимизация свободной энергии/ Максимизация числа пар (Динамическое программирование)
• Стохастические алгоритмы (Монте-Карло, генетические алгоритмы)
• Поиск консервативных структур
• Проблема формирования вторичной структуры РНК – сложная комбинаторная и физическая задача
• Результаты минимизации энергии не всегда дают биологически осмысленную структуру
• Наилучшие результаты дает поиск консервативных структур
Реальность: