Ο Ο Κυτταρικός Κυτταρικός Κύκλος Κύκλος The Cell Cycle The Cell Cycle
ΟΟ ΚυτταρικόςΚυτταρικός ΚύκλοςΚύκλος
The Cell CycleThe Cell Cycle
HH ζωήζωή τουτου κυττάρουκυττάρου
Αντιγραφή τουDNA και
Κυτταρική αύξηση
ΚυτταρικόςΚύκλος
Θυγατρικά Κύτταρα
Κυτταρική∆ιαίρεση
Γήρανση(Senescence)
Κυτταρικός θάνατος
ΟιΟι φάσειςφάσεις τουτου κυτταρικούκυτταρικού κύκλουκύκλου
G1S
MG2
∆ιαχωρισμόςχρωμοσωμάτων
Κυτταροπλασματική∆ιαίρεση
(Κυτταροκίνηση)
G0
Z Ζ Ζ Ζ Quiescence
S
G2
M
G1
Η φάση G0
• Είναι περίοδος στην οποία το κύτταρο ευρίσκεται«έξω» από τον κυτταρικό κύκλο, σε κατάστασηληθάργου (quiescent), δηλαδή δεν διπλασιάζει το DNA και δεν διαιρείται, επιτελεί όμως άλλες λειτουργίες(μεταβολισμός, επικοινωνία, κίνηση, κ.α.)
• Σε συνθήκες κυτταροκαλιέργειας, τα κύτταραπηγαίνουν από τη G1 στη G0 όταν οι θρεπτικές ουσίεςδεν επαρκούν, έως ότου υπάρξουν πάλι προϋποθέσειςνα πολλαπλασιαστούν οπότε επιστρέφουν στην G1 καισυνεχίζουν τον κυτταρικό κύκλο
• Στον οργανισμό, τα διαφοροποιημένα κύτταρα (ποιαείναι?) είναι μόνιμα σε φάση G0
ΡύθμισηΡύθμιση τουτου κυτταρικούκυτταρικού κύκλουκύκλου
Οι φάσεις του κυτταρικού κύκλου (G1, S, G2 και M)πρέπει να διαδραματίζονται:
• Με τη σωστή σειρά
• Στον κατάλληλο χρόνο
• Μόνο μία φορά σε κάθε κύκλο
Cyclin-dependent kinase (Cdk)
cyclin
TaTa σύμπλοκσύμπλοκaa κινκινaaσώνσών Cdk/CyclinCdk/Cyclin είναιείναιυπεύθυναυπεύθυνα γιαγια τοτο συντονισμόσυντονισμό τωντωνγεγονότωνγεγονότων τουτου κυτταρικούκυτταρικού κύκλουκύκλου
S Cdk/Cyclin
ΕνεργοποίησηΕνεργοποίηση/ / απενεργοποίησηαπενεργοποίηση συμπλόκωνσυμπλόκων Cdk/CyclinCdk/Cyclinρυθμίζειρυθμίζει τηντην πρόοδοπρόοδο τουτου κυτταρικούκυτταρικού κύκλουκύκλου
G1S
MG2
G1 Cdk/Cyclin
G1/S Cdk/Cyclin
M Cdk/Cyclin
G2 Cdk/Cyclin
Anaphase onset
Growth factors Mitogens
No Cdkactivity
Ποιοι μηχανισμοί ρυθμίζουν τηνενεργότητα των Cdks?
Cdk
INACTIVE
ATP
Cyclin
active site
Cyclin
T-loop
ATP
Cdk-activating kinase (CAK)
activating phosphorylation T161
ACTIVE
ATP
P
1. 1. ΕνεργοποίησηΕνεργοποίηση τωντων CdksCdks μέσωμέσω πρόσδεσηςπρόσδεσηςκυκλινώνκυκλινών καικαι φωσφορυλίωσηςφωσφορυλίωσης
Cdc25 phosphatases
Activating phosphorylation T161
Cdk
cyclin
ACTIVE
P
Wee1 kinase
Inhibitory phosphorylationsT14 & Y15
INACTIVE
P
P
2. 2. ΑναστολήΑναστολή τηςτης ενεργότηταςενεργότητας τωντωνCdksCdks μέσωμέσω φωσφορυλίωσηςφωσφορυλίωσης
3. 3. ΑναστολήΑναστολή τηςτης ενεργότηταςενεργότητας τωντωνCdksCdks απόαπό CdkCdk inhibitor proteins inhibitor proteins
(CKI)(CKI)
INACTIVE
CKI
ACTIVE
Cdk
cyclin
P P
All Cdksp21cip/waf1
p27kip1
p57Cip/ Kip
G1 Cdksp15INK4B
p16INK4A
P19 INK4D
INK4
TargetsMembersCKI family
Cyclin
CdkT-Y- -T p
ACTIVE
CDC25
Cyclin
CdkT-Y- -T p
Wee1
p
CdkT-Y- -T p
Cyclin
CKI
CdkT-Y- -T p
CKI
Cyclin
CdkT-Y- -T
PP
CAK (Cdk7/CycH)
ΜηχανισμοίΜηχανισμοί ρύθμισηςρύθμισης τηςτηςενεργότηταςενεργότητας τωντων CdksCdks
4. 4. ΡύθμισηΡύθμιση τηςτης ενεργότηταςενεργότηταςτωντων CdksCdks μέσωμέσω πρωτεόλυσηςπρωτεόλυσης
εξαρτώμενηςεξαρτώμενης απόαπό τοτοΠρωτεάσωμαΠρωτεάσωμα
ToTo ΠρωτεάσωμαΠρωτεάσωμα ((ProteasomeProteasome))• Είναι μια ενδοκυτταρική πρωτεάση και η δράση της απαιτείυδρόλυση ATP
• Ρόλος του πρωτεασώματος είναι η αποικοδόμηση πρωτεϊνώνλόγω βλαβών, λαθών κατά τη σύνθεσή τους ή αναγκών τουκυτταρικού κύκλου
• Αποτελείται από ένα κεντρικό «κούφιο» κυλινδρικό τμήμα
• και από δύο υπομονάδες (caps) στα άκρα του κυλίνδρου
caps
Adapted from MBC, Alberts et al, 4th Edition
ΓιαΓια νανα δράσειδράσει τοτο πρωτεάσωμαπρωτεάσωμα πρέπειπρέπει ηηπρωτεΐνηπρωτεΐνη--στόχοςστόχος νανα ««σημανθείσημανθεί»» μεμε αλυσίδααλυσίδα
μορίωνμορίων ubiquitinubiquitin
• Ubiquitin: μικρή πρωτεΐνη 76 αα. Προσδένεται σε πλευρικές αλυσίδες Lysineτων πρωτεϊνών-στόχων από ubiquitinationένζυμα και σχηματίζει αλυσίδες poly-ubiquitin
Ubiquitin
HOOC
NH2
Πρόσδεσησε Lysine
Υδρόφοβοσφαιρικό τμήμα
Adapted from MBC, Alberts et al, 4th Ed
ΛειτουργίαΛειτουργία τουτου ΠρωτεασώματοςΠρωτεασώματος
normal proteinmisfolded protein
poly-ubiquitin chain
proteasome
ATP
poly-ubiquitin chain
misfolded protein
UbiquitinationUbiquitination ΈνζυμαΈνζυμα
• Για το σχηματισμό αλυσίδων poly-ubiquitinχρειάζονται ubiquitination ένζυμα
• Κατηγορίες Ubiquitination ενζύμων :
E1: ubiquitin activating enzyme
E2: ubiquitin conjugating enzyme
E3: ubiquitin ligase
• Υπάρχουν περισσότερα από 300 σύμπλοκα Ε2-Ε3 τα οποία αναγνωρίζουν διαφορετικά σήματααποικοδόμησης πρωτεϊνών-στόχων (ειδικέςαμινοξικές αλληλουχίες, φωσφορυλιώσεις, κ.ά.)
Ubiquitin
HOOC
NH2
Πρόσδεσησε Lysine
Υδρόφοβοσφαιρικό τμήμα
Adapted from MBC, Alberts et al, 4th Ed
ΟυμπικιτινίωσηΟυμπικιτινίωση πρωτεϊνώνπρωτεϊνών ((protein protein ubiquitinationubiquitination))
E2
E3
Phosphorylationtargets protein
for ubiquitination
prot
einkinase
p
prot
ein
Misfoldedprotein to be
degraded
E2
E3
prot
ein
p
E1 SH COO-
Ub
ATPE1 SC=O
E2
E3
E1
prot
ein
Poly-Ub protein is targeted for degradation by the proteasome
E2
E3
prot
ein
p
∆ύο∆ύο κατηγορίεςκατηγορίες συμπλόκωνσυμπλόκων μεμεενεργότηταενεργότητα E3 E3 ubiquitinubiquitin ligaseligase
ρυθμίζουνρυθμίζουν τηντην ενεργότηταενεργότητα τωντων CdksCdks
SCF
(Τέλος G1, S, G2)
APC/C
(M και αρχή G1)
•• ΕίναιΕίναι σύμπλοκοσύμπλοκο πρωτεϊνώνπρωτεϊνών (Skp1/CUL1/F(Skp1/CUL1/F--Box protein) Box protein) μεμεενεργότηταενεργότητα ΕΕ3 3 ubiquitinubiquitin ligaseligase
•• ΑναγνωρίζειΑναγνωρίζει φωσφορυλιωμένεςφωσφορυλιωμένες πρωτεΐνεςπρωτεΐνες--στόχουςστόχους, , τιςτιςουμπικιτινιώνειουμπικιτινιώνει καικαι τιςτις σημαίνεισημαίνει γιαγια πρωτεόλυσηπρωτεόλυση απόαπό τοτοπρωτεάσωμαπρωτεάσωμα
•• ΣυμμετέχειΣυμμετέχει στηστη ρύθμισηρύθμιση τηςτης ενεργότηταςενεργότητας τωντων CdksCdks κατάκατά τιςτιςG1, S G1, S καικαι G2 G2 μέσωμέσω αναγνώρισηςαναγνώρισης καικαι ουμπικιτινίωσηςουμπικιτινίωσης CKICKI καικαιΚυκλινώνΚυκλινών
ΤοΤο σύμπλοκοσύμπλοκο SCFSCF
ΡύθμισηΡύθμιση τηςτης ενεργότηταςενεργότητας τωντων CdksCdksαπόαπό τοτο σύμπλοκοσύμπλοκο SCFSCF
Cdk inhibitor protein (CKI)
INACTIVE
Pkinase
P
Pactive SCF
ubiquitin, E1 + E2
enzymes
poly-ubiquitinchain
P
P
ACTIVE
Cdk
cyclin
P
kinaseP
P
active SCF
ubiquitin, E1 + E2
enzymes
P
P
active Cdk
Pproteasome
P
inactive Cdk
proteasome
ΜηχανισμοίΜηχανισμοί ρύθμισηςρύθμισης τηςτης ενεργότηταςενεργότηταςτωντων CdksCdks
• Πρόσδεση Κυκλινών και φωσφορυλίωση ενεργοποίησης στηνThr161
• Φωσφορυλιώσεις απενεργοποίησης στις Thr14 & Tyr15
• Πρόσδεση πρωτεϊνών CDK-inhibitors (CKI)
• Αποικοδόμηση Κυκλινών από το πρωτεάσωμα
• Αποικοδόμηση CKI από το πρωτεάσωμα
ΤαΤα κυριότερακυριότερα σύμπλοκασύμπλοκα Cdk/CyclinCdk/Cyclinσεσε κύτταρακύτταρα σπονδυλοζώωνσπονδυλοζώων
Cyclin BCdk1 (Cdc2)M
Cyclin ACdk1 (Cdc2)G2
Cyclin ACdk2S
Cyclin ECdk2G1/S
Cyclin DCdk4, Cdk6G1
CyclinCdkCdk/Cyclin
Cdk4,6/Cyclin DG1S
MG2
Cdk2/Cyclin E
Cdk2/Cyclin Α
Cdk1/Cyclin Α
Cdk1/Cyclin Β
ΜεταβολέςΜεταβολές στηνστην ενεργότηταενεργότητα συμπλόκωνσυμπλόκωνCdk/CyclinCdk/Cyclin ρυθμίζουνρυθμίζουν τοντον κυτταρικόκυτταρικό κύκλοκύκλο
Anaphase onset
Growth factors Mitogens
No Cdkactivity
Cdk4,Cdk6/Cyclin DG1S
MG2
Cdk2/Cyclin E
Growth factors Mitogens
ΗΗ ολοκλήρωσηολοκλήρωση τηςτης G1G1 καικαι ηη έναρξηέναρξη τηςτηςSS ρυθμίζεταιρυθμίζεται απόαπό τιςτις CdksCdks
Το μονοπάτι CDK-Rb-E2F
No Cdkactivity
ΗΗ πρωτεΐνηπρωτεΐνη τουτου ΡετινοβλαστώματοςΡετινοβλαστώματος((Retinoblastoma proteinRetinoblastoma protein,, RbRb))
• Είναι ογκοκατασταλτική πρωτεΐνη. Απενεργοποίηση και τωνδύο αλληλομόρφων του γονιδίου προκαλεί καρκίνο τουρετινοβλαστώματος στον άνθρωπο
• Εκφράζεται σταθερά αλλά μεταβάλλονται τα επίπεδαφωσφορυλίωσης της πρωτεΐνης κατά τον κυτταρικό κύκλο
• Φωσφορυλιώνεται στη G1 από τις CDK4, CDK6 και CDK2. Ημη φωσφορυλιωμένη μορφή της Rb προσδένει και απενεργοποιείτο μεταγραφικό παράγοντα E2F
• O ενεργός E2F προσδένεται σε αλληλουχίες υποκινητών καιεπάγει την έκφραση γονιδίων-στόχων του E2F
Growth factor-activated signaling pathways (mitogens)
Cdk4,Cdk6/ Cyclin D
Rb partially inactive Rb
PP
Rb
E2FInactive E2F No expression of E2F target
genes
E2FLow E2F activity Low expression of E2F target
genes
E2FHigh E2F activity High expression of E2F target
genes
active Rb
Cdk2/ Cyclin E
Rb inactive RbP P
P P
Cdk4,Cdk6/ Cyclin D
Το μονοπάτι CDK-Rb-E2F
No Cdk activity
ΟΟ μεταγραφικόςμεταγραφικός παράγονταςπαράγοντας E2FE2F• Προσδένει τη μη φωσφορυλιωμένη πρωτεΐνη Rb
• Απουσία προσδεδεμένης Rb εντοπίζεται σε ειδικές αλληλουχίες στονυποκινητή και επάγει την έκφραση γονιδίων-στόχων
• Προσελκύει ένζυμα που προκαλούν «άνοιγμα» της δομής της χρωματίνηςώστε αυτή να είναι μεταγραφικά ενεργή
Closed chromatin
Transcriptional inactive
Ε2FHAT
Open chromatin
Gene expression
RbE2
FRb
P P
P P
CDKs
ΟΟ μεταγραφικόςμεταγραφικός παράγονταςπαράγοντας E2FE2F
• Οι μεταγραφικοί του στόχοι περιλαμβάνουν γονίδια:
Κυτταρικού κύκλου (Cdk2, Cyclin Ε, Cyclin A, E2F)
Αντιγραφής DNA (PCNA, MCM2-7, RPA, H2A, DNA polα, δ)
Επιδιόρθωσης DNA (BRCA1,2, FANC, RAD51)
Απόπτωσης (APAF1, CASPases 3,7,8)
Cdk4,Cdk6/Cyclin DG1S
MG2
Cdk2/Cyclin E
Growth factors Mitogens
ΗΗ ολοκλήρωσηολοκλήρωση τηςτης G1G1 καικαι ηη έναρξηέναρξη τηςτηςSS ρυθμίζεταιρυθμίζεται απόαπό τιςτις CdksCdks
Το μονοπάτι CDK-Rb-E2F
No Cdkactivity
G1 S
+
+
active Rb
inactive E2F
Cdk2/ CycEactive
Cdk4, 6/ CycD p27
G1/S restriction
point
ΕνεργότηταΕνεργότητα τωντων CDKsCDKs κατάκατά τηντην G1G1καικαι αρχήαρχή τηςτης SS
P
Ubiquitination by SCF & degradation
by proteasomeGrowth factors
Mitogens
Active Cdk4,6/ Cyclin D
Cdk2/ Cyclin E
G1/S restriction point
Gene expression Cdk2, CycE
Cdk2/ CycEactive
active E2F
inactive RbP PPP
No Cdk activity
ΡύθμισηΡύθμιση τωντων CDKsCDKs κατάκατά τηντην G1G1-- αρχήαρχή τηςτης SS
• Στην αρχή της G1 η συνολική ενεργότητα Cdk είναι χαμηλή
• Η Rb προσδένει και απενεργοποιεί το μεταγραφικό παράγονταE2F
• Μιτογόνες ουσίες ενεργοποιούν τις Cdk4,6/ Cyclin D καιCdk2/ Cyclin Ε
• Φωσφορυλίωση του Rb οδηγεί σε ενεργοποίηση του E2F καιμεταγραφή γονιδίων που εμπλέκονται σε περεταίρω ενεργοποίησηCDK συμπλόκων και έναρξη της αντιγραφής του DNA
G1S
MG2
Cdk1/Cyclin Β
Anaphase onset
ΈναρξηΈναρξη τηςτης μιτωτικήςμιτωτικής διαίρεσηςδιαίρεσης
Ενεργοποίηση τουσυμπλόκου Cdk1/ Cyclin B
ΕνεργότηταΕνεργότητα τηςτης Cdk1/ Cdk1/ CyclinCyclin B B είναιείναιαναγκαίααναγκαία γιαγια τηντην έναρξηέναρξη τηςτης μιτωτικήςμιτωτικής
διαίρεσηςδιαίρεσης
Cdk1/ Cyclin B
∆ιάλυσηπυρηνικούφακέλου
Σχηματισμόςμιτωτικήςατρακτου
∆ιάταξηχρωμοσωμάτων
ΕνεργοποίησηΕνεργοποίηση τηςτης Cdk1/ Cdk1/ CyclinCyclin B B καικαιέναρξηέναρξη τηςτης μιτωτικήςμιτωτικής διαίρεσηςδιαίρεσης
G2 M
Cdk1
Cyclin B
+
Cdk-inhibitory kinase
Wee1
PP
activating phosphorylation
inhibitory phosphorylation
P
Cdc25 Cdk-activating phosphatase
Cdk1/ Cyclin B
Mitotic entry
active Cdk1
• Για να μπούμε στη φάση της μιτωτικής διαίρεσης απαιτείταιενεργοποίηση του συμπλόκου Cdk1/CyclinΒ
• Η φωσφατάση Cdc25 αποφωσφορυλιώνει τις Υ14 και Τ15 της Cdk1 και την ενεργοποιεί
• Η ενεργή Cdk1/ CyclinB ενισχύει την ενεργότητα της Cdc25
• Η ενεργή Cdk1/ CyclinB φωσφορυλιώνει και απενεργοποιείτην κινάση Wee1
΄Εναρξη΄Εναρξη τηςτης μιτωτικήςμιτωτικήςδιαίρεσηςδιαίρεσης
ΠώςΠώς μπορούμεμπορούμε νανα διακρίνουμεδιακρίνουμε σεσεποιαποια φάσηφάση τουτου κυτταρικούκυτταρικού κύκλουκύκλου
βρίσκεταιβρίσκεται τοτο κύτταροκύτταρο;;
• Ανοσοφθορισμός (immunofluorescence)
• Κυτταρομετρία ροής (flow cytometry)
∆ιάκριση∆ιάκριση τωντων φάσεωνφάσεων τουτουκυτταρικούκυτταρικού κύκλουκύκλου
• Μονιμοποίηση των κυττάρων και χρώση με ουσίες οι οποίες φθορίζουν μετάτην πρόσδεσή τους στο DNA (DAPI, Propidium Iodide)
• Ανίχνευση επιτόπων ειδικών για τη συγκεκριμένη φάση του κυτταρικούκύκλου (markers), με χρήση αντισωμάτων συνδεδεμένων σε φθορίζων μόριο
• Μικροσκοπία φθορισμού
S-phase G1-phase
ΜελέτηΜελέτη τωντων φάσεωνφάσεων τουτου κυτταρικούκυτταρικούκύκλουκύκλου μεμε ανοσοφθορισμόανοσοφθορισμό
Φθορίζων μόριο
Ab
S-ειδικήπρωτεΐνηξέπλυμα
Φθορισμός
ΑνίχνευσηΑνίχνευση κυττάρωνκυττάρων στηστη φάσηφάσηδιπλασιασμούδιπλασιασμού τουτου DNADNA
Παράδειγμα S- phase marker: PCNA
phase contrastPCNA
ΑνίχνευσηΑνίχνευση κυττάρωνκυττάρων στηστη φάσηφάση τηςτηςμιτωτικήςμιτωτικής διαίρεσηςδιαίρεσης
Παράδειγμα Μ- phase marker: φωσφορυλιωμένη Ιστόνη Η3 στηΣερίνη 10 (pH3)
pH3 PI pH3 PI
ΜελέτηΜελέτη τωντων φάσεωνφάσεων τουτου κυτταρικούκυτταρικού κύκλουκύκλου μεμεκυτταρομετρίακυτταρομετρία ροήςροής (flow (flow cytometrycytometry))
• Μέθοδος ανάλυσης πληθυσμού κυττάρων η οποία δείχνει το ποσοστόκυττάρων που έχουν συγκεκριμένη ποσότητα DNA
• Μονιμοποίηση κυττάρων
• Χρώση με Propidium Iodide (PI). Η χρωστική PI φθορίζει (στο κόκκινο) όταν προσδεθεί στο DNA και η ένταση του φθορισμού είναι ανάλογη τηςποσότητας του DNA κάθε κυττάρου
• Η ποσότητα του DNA (2N, 4N ή ενδιάμεση) είναι χαρακτηριστική τηςφάσης του κυτταρικού κύκλου (G1, G2 ή S)
• Ανάλυση φθορισμού των κυττάρων με κυτταρομετρία ροής μας δείχνει τοποσοστό αυτών στις διάφορες φάσεις του κυτταρικού κύκλου
flow
FACS: fluorescence-activated cell sorter
Analysehistogram
ΚυτταρομετρίαΚυτταρομετρία ροήςροής-- PI profilesPI profiles
Even
ts (n
umbe
r of c
ells
)
Flow cytometer
DNA (PI fluorescence)
G1 G2+M
SSub-G1 (dead) polyploid
2N 4N
4.4polyploid21.3G2+M32.4S40.1G11.8Sub-G1
Percentage (%)Fraction
PI
Μικροσκόπιο φθορισμού
Κυτταρική σειρά 1 Κυτταρική σειρά 2
∆είχνονται καλλιέργειες δύο κυτταρικών σειρών σε τυπικόθρεπτικό μέσο
Ποιες διαφορές εντοπίζετε στα PI profiles των δύο σειρών? ∆ώστε πιθανή εξήγηση
PI profiles: Quiz 1 PI profiles: Quiz 1
PI profiles: Quiz 2 PI profiles: Quiz 2
A B C D
1. Τυπική καλλιέργεια κυττάρων σε θρεπτικό μέσο
2. παρουσία αναστολέα της μιτωτικής διαίρεσης (nocodazole)για 12 hrs
3. Καλλιέργεια κυττάρων παρουσία αναστολέα της αντιγραφήςτου DNA (hydroxyurea) για 12 hrs
4. Καλλιέργεια κυττάρων σε θρεπτικό μέσο χωρίς ορό (FBS)για 24 hrs
Κάντε τις αντιστοιχίες
Molecular Biology of The Cell,
Alberts et al, 4th Ed,
Chapter 17