UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN MARTÍN – TARAPOTO FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS DEPARTAMENTO ACADÉMICO AGROSILVO PASTORIL INFORME DE PRÁCTICAS PRE – PROFESIONALES OBTENCIÓN DE CALLOS EMBRIOGÉNICOS EN SACHA INCHI (Plukenetia volubilis L.), EN EL LABORATORIO DE CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES – UNSM – T. PRESENTADO POR: Est: JUAN CARLOS GUERRERO ABAD TARAPOTO – PERÚ 2006
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UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN MARTÍN – TARAPOTO
FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS
DEPARTAMENTO ACADÉMICO AGROSILVO PASTORIL
INFORME DE PRÁCTICAS PRE – PROFESIONALES
OBTENCIÓN DE CALLOS EMBRIOGÉNICOS EN SACHA INCHI (Plukenetia
volubilis L.), EN EL LABORATORIO DE CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES –
UNSM – T.
PRESENTADO POR:
Est: JUAN CARLOS GUERRERO ABAD
TARAPOTO – PERÚ
2006
UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN MARTÍN – TARAPOTO
FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS
DEPARTAMENTO ACADÉMICO AGROSILVO PASTORIL
AREA DE BIOLOGÍA
INFORME DE PRÁCTICAS PRE – PROFESIONALES
OBTENCIÓN DE CALLOS EMBRIOGÉNICOS EN SACHA INCHI (Plukenetia
volubilis L.), EN EL LABORATORIO DE CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES –
UNSM – T.
Ing. M.Sc. Armando D. Cueva Benavides Blgo.Msc. Winston Franz Ríos Ruiz
REVISOR ASESOR
Ing. Henri Delgado Haya Est. Juan Carlos Guerrero Abad
CO – ASESOR PRÁCTICANTE
TARAPOTO – PERÚ
2006
DEDICATORIA
A Dios por la maravillosa vida
A mis queridos padres Crecencio Guerrero y
María Luisa Abad, por que han sido
el bastón de mis pasos como estudiante.
A mis queridos y
traviesos hermanos: Maria,
Gladis, Roger, Alexander
AGRADECIMIENTO
A la Universidad Nacional de San Martín por permitirme realizar mis
practicas pre – profesionales.
Al Blgo. M. Sc. Winston F. Ríos Ruiz, por brindarme su apoyo como
asesor en el presente trabajo.
De una manera muy especial al Ing. Henri Delgado Haya, por brindarme su
gran apoyo incondicional y el empuje a ser investigador.
Al Blgo. Marco León Martínez, por ser el iniciador de la idea del presente
trabajo.
A mis queridos compañeros de laboratorio, para Melissa Castro Sánchez,
Engels Padilla Gómez, Mike Anderson Corazón Güivin, Flor Gonzáles
Dávila, Salvith Ortiz Ramírez, quienes de alguna manera me brindaron su
apoyo y valiosas recomendaciones.
RESUMEN DEL INFORME
La presente práctica pre – profesional se llevo acabo en el Laboratorio de Tejidos
Vegetales de la Universidad Nacional de San Martín – Facultad de Ciencias
Agrarias. Busco el adiestramiento en el manejo de técnicas del cultivo In Vitro,
que consistía en el uso y manejo adecuado de materiales, equipos y reactivos
aplicados en diferentes áreas, paralelo a ello se desarrollo a manera de
investigación una metodología de regeneración artificial para la especie
Plukenetia volubilis L.
Es por ello que se realizaron ensayos en Embriogénesis somática, para determinar
una posible ruta de regeneración en tejidos cultivados a nivel In Vitro. Iniciándose
de esa manera con la introducción de embriones de semillas de Sacha Inchi a
condiciones In Vitro, con la finalidad de obtener brotes terminales sanos. Obtenidos
los brotes terminales en las plantas cultivadas, estos fueron cultivados e inducidos
a un medio de cultivo (M&S a concentración total – con vitaminas B5,
suplementado con 20 g/l de sucrosa, 2,5 g/l de phytagel, 5 mg/l de ANA, 2 mg/l de
BAP, 1 mg/l de KIN, 100 mg/l de myo-inositol y 10 mg/l de ácido cítrico), dando
origen a la formación de callos no diferenciados en forma desordenada.
Para el proceso del desarrollo, maduración y germinación de la formación callosa,
se subcultivo los callos formados alrededor del explante, a un medio de cultivo
(M&S a media concentración, suplementado con 3,5 g/l de agar + 4 g/l de carbón
activado + 20 g/l de sucrosa + 0,4 mg/l de Tiamina – HCl. + 0,5 mg/l de ácido
nicotínico), que genero la emergencia de primordios foliares.
ÍNDICE
Contenido Pág.
I. INTRODUCCIÓN…………………………………………………... 01
II. OBJETIVOS………………………………………………………... 02
III. ANTECEDENTES………………………………………………….. 03
3.1 Características del Cultivo………………………………… 03
3.1.1. Origen y Distribución………………………………. 03
3.1.2. Clasificación botánica……………………………… 03
3.1.3. Morfología General………………………………….. 04
3.1.4. Condiciones Edafoclimaticas para su cultivo…. 06
3.1.5. Plagas y enfermedades……………………………. 07
3.2. Cultivo de Tejidos Vegetales………………………………. 08
3.2.1 Generalidades………………………………………... 08
3.2.2 Medios de Cultivo…………………………………… 09
3.2.3 Técnicas de cultivo In Vitro……………………….. 11
3.2.3.1. Regeneración de Plantas
(Organogénesis y Embriogénesis)…... 11
3.2.3.2. Factores que influyen la
embriogénesis somática……………….. 14
IV. ACTIVIDADES DESARROLLADAS……………………………... 17
4.1. Reconocimiento de áreas, equipos, reactivos
y materiales del laboratorio de cultivo de tejidos
vegetales de la UNSM – T………………………………... 17
4.1.1. Áreas del laboratorio……………………………... 17
4.1.2. Equipos del laboratorio………………………….. 22
4.1.3. Materiales y reactivos…………………………… 25
4.2. Callogénesis en Sacha Inchi……………………………. 27
4.2.1. Formulación y preparación
de medios de cultivo……………………………… 28
4.2.2. Protocolos para la preparación
de medios de cultivo……………………………. 29
4.2.3. Selección y recolección del material vegetal... 31
4.2.4. Preparación del material vegetal………………. 32
4.2.5. Procesos para la introducción de embriones.. 32
4.2.6. Inicio al proceso de la generación de
callos embriogénicos…………………………….. 39
V. CONCLUSIONES………………………………………………….. 42
VI. RECOMENDACIONES……………………………………………. 43
VII. LITERATURA CONSULTADA…………………………………… 44
ANEXOS…………………………………………………………… 47
1. Composición del medio de cultivo de la
primera formulación (Germinación de embriones)………. 48
2. Composición del medio de cultivo de la
segunda formulación (Estimulación a la callogénesis)….. 49
3. Composición del medio de cultivo de la
tercera formulación (Maduración y
Germinación de embrioides)………………………………….. 50
4. Terminologías…………………………………………………. 51
5. Abreviaturas…………………………………………………… 52
6. Diagrama de flujo……………………………………………... 53
ÍNDICE DE FOTOS
Nº de Fotos Descripción Pág.
Foto Nº 01 Muestra prensada – acc. acchilla 03
Foto Nº 02 Planta – acc. Pacchilla 04
Foto Nº 03 Disposición de hojas 04
Foto Nº 04 Hoja 04
Foto Nº 05 Disposición de flores 05
Foto Nº 06 Inflorescencia 05
Foto Nº 07 Frutos inmaduros 05
Foto Nº 08 Fruto maduro 05
Foto Nº 09 Semillas 06
Foto Nº 10 Almendras 06
Foto Nº 11 Hormigas 07
Foto Nº 12 Atrofiamiento 07
Foto Nº 13 Diabrotica en sacha inchi 07
Foto Nº 14 Phytium sp.. 08
Foto Nº 15 Meloydogine spp. 08
Foto Nº 16 Colletrotrichum sp. 08
Foto Nº 17 Área de lavado de materiales 18
Foto Nº 18 Área de preparación de medios 19
Foto Nº 19 Área de siembra y transferencia 19
Foto Nº 20 Área de incubación 20
Foto Nº 21 Aclimatación – Fase I 21
Foto Nº 22 Aclimatación – Fase II 21
Foto Nº 23 Biblioteca 21
Foto Nº 24 Computadora 21
Foto Nº 25 Olla autoclave 22
Foto Nº 26 Balanza analítica 22
Foto Nº 27 Destilador 23
Foto Nº 28 Peachimetro 23
Foto Nº 29 Refrigerador 24
Foto Nº 30 Materiales de vidrio 25
Foto Nº 31 Materiales de de metal 26
Foto Nº 32 Reactivos 27
Foto Nº 33 Preparación de medios de cultivo 28
Foto Nº 34 Selección del material vegetal 31
Foto Nº 35 Escarificación 32
Foto Nº 36 Cámara húmeda 32
Foto Nº 37 Preparación de soluciones desinfectantes 33
Foto Nº 38 Retiro de testa 35
Foto Nº 39 Almendras 35
Foto Nº 40 Preparación del área de siembra 36
Foto Nº 41 Desinfección con 1,5% de NaOCl 37
Foto Nº 42 Enjuague 37
Foto Nº 43 Excisión de almendras 38
Foto Nº 44 Desarrollo In Vitro de plantas 39
Foto Nº 45 Inicio de callogenésis 40
Foto Nº 46 Callo no diferenciado 40
Foto Nº 47 Germinación de embrioides 41
I. INTRODUCCIÓN
La Región San Martín esta ubicada dentro del llano Amazónico del Perú,
albergando una gran biodiversidad de especies vegetales promisorias intactas a la
investigación, capaces de poder generar alternativas a la problemática de la
alimentación, la medicina, la artesanía, etc. Sacha inchi (Plukenetia volubilis L.),
es una oleaginosa oriunda del Perú, por ser utilizada desde nuestro incanato como
un sustituto alimenticio y encontrarse en forma silvestre conviviendo con las
comunidades nativas y zonas rurales de la Región San Martín.
En la actualidad Sacha Inchi (Plukenetia volubilis L.), tiene una gran perspectiva
para la producción y exportación de aceites a los mercados europeos por contener
ácidos grasos esenciales como los Omega 9, Omega 6 y Omega 3 esenciales en la
nutrición alimenticia.
El Cultivo de Tejidos Vegetales es una herramienta de la biotecnología de gran
utilidad, aplicada en aquellas especies vegetales que puedan ejercer la
“totipotencialidad celular”, que no es más que la capacidad que tiene una célula
vegetal en dar origen a un nuevo individuo bajo ciertas condiciones físicas y
químicas que se les brinda a nivel In Vitro. La embriogénesis somática es una
eficiente forma de multiplicación clonal, que consiste en cultivar células o tejidos
somáticos bajo la inducción de ciertas concentraciones hormonales (auxinas,
citoquininas y/o giberelinas), generando un proceso de multiplicación celular, que al
ser acondicionados a medios de cultivo enriquecidos dan origen a la formación de
embriones sin tener que pasar obligatoriamente por la unión de células gameticas
(sexuales).
II. OBJETIVOS
2.1. Objetivo general
Desarrollar un protocolo para la obtención de callos embriogénicos en
Sacha Inchi (Plukenetia volubilis L), a partir de Ápices meristematicos,
en el Laboratorio Cultivos de Tejidos Vegetales de la UNSM – Morales
2006.
2.2. Objetivos específicos:
Adiestramiento en los procesos y técnicas del cultivo In Vitro.
Establecer embriones de sacha inchi a condiciones In Vitro.
Acondicionar brotes terminales que permitan la obtención de callos a
partir de plántulas cultivas In Vitro.
Analizar y publicar los resultados obtenidos.
III. ANTECEDENTES
3.1. CARACTERÍSTICAS DEL CULTIVO
3.1.1. ORIGEN Y DISTRIBUCIÓN.
Según Valles (1991), menciona que el Sacha Inchi (P. volubilis
L.) es una planta voluble, trepadora y semileñosa. Fue descrita en
1753. Botánicamente pertenece a la Familia Euforbiacea. Esta
distribuida en el trópico latinoamericano desde el sur de México,
Indias Occidentales, la Amazonia y el Acre de Bolivia. En nuestro
país se ha recolectado en Madre de Dios, Huanuco, Oxapampa, San
Martín, Rodríguez de Mendoza, Ucayali (Pucallpa, Contamana y
Requena), Putumayo, Iquitos, Junín, Cuzco y Caballococha.
3.1.2. CLASIFICACIÓN BOTÁNICA
Arévalo (1996), menciona la clasificación botánica del sacha inchi
como se muestra en la (Foto Nº 01)
Foto Nº 01: Muestra prensada – acc. pacchilla
ORDEN : Euphorbiales
FAMILIA : Euphorbiaceae
GENERO : Plukenetia
ESPECIE : volubilis L.
3.1.3. MORFOLOGÍA GENERAL
La Planta se caracteriza
por ser:
Las Hojas son:
Alternas, acorazonadas, aseruladas, trinervadas con una nervadura
central dirigida al ápice acuminado (fotos Nº 03 y 04), así mismo en
la base del limbo presenta 2 glándulas laterales (albergando en las
mañanas gotitas de azucares orgánicos) y una pequeña proyección
intermedia denominada estipela (muy variable en los diversos
ecotipos).
Voluble, perenne,
semileñosa con
crecimiento indeterminado,
como se muestra en la
(Foto Nº 02)
Foto Nº 02: Planta – acc. pacchilla
Foto Nº 03: Disposición de Hojas Foto Nº 04: Hoja
Con respecto a las Flores, estas son:
Hermafroditas monoicas, las flores masculinas son pequeñas,
blanquecinas y dispuestas en racimos, en la base del racimo y
lateralmente se encuentra una, dos y hasta tres flores femeninas, en
las flores femeninas se aprecia que el número de estigmas es igual al
número de ovarios como se muestran en las (fotos Nº 05 y 06).
Los frutos son cápsulas dehiscentes, distribuidos en lóculos, el
número de lóculos esta en función a la variabilidad genética de sacha
inchi, presentando cuatro, cinco y hasta siete lóculos (fotos Nº 07 y
08).
Foto Nº 05: Dispos. de flores Foto Nº 06: Infloresc.
Foto Nº 07: Fruto Foto Nº 08: Fruto maduro
La Semilla.
Tiene forma ovalada de color marrón-oscura, abultada hacia el centro
y aplastada hacia los costados (foto Nº 09), al abrir la testa de la
semilla observamos la almendra de color blanco que esta protegido
por una película blanquecina (foto Nº 10).
3.1.4. CONDICIONES EDAFOCLIMATICAS PARA SU CULTIVO
Altitud.
Sacha Inchi se adapta desde los 100 a 2000 msnm (Manco, 2005).
Registrándose así mismo las mejores semillas (> 12mm) a
plantaciones establecidas desde los 600 m.s.n.m.
Clima.
Manco (2005), menciona que los parámetros de temperaturas
adaptables a esta planta esta entre 10 y 36ºC, temperaturas altas
son desfavorables por que ocasiona aborto en flores y la
conformación de semillas pequeñas.
Foto Nº 09: Semillas Foto Nº 10: Almendras
Luz.
Uno de los factores ecológicos importantes en esta especie es la luz,
mientras mas luz reciba la cubierta vegetal mayor es la población de
brotes, flores y frutos.
Suelo.
Valles (1991), menciona que se adapta a suelos ácidos con
contenidos muy significativos en aluminio, así mismo prospera en
áreas pobladas por shapumba (Pteridium aquilinun) y Cashucsha
(Imperata brasiliensis).
Para tener un buen suelo en la producción de Sacha Inchi, este
debe tener un nivel de fertilidad que va de medio a alto, que tenga un
buen drenaje y una buena profundidad.
Agua.
La disponibilidad del agua al inicio es importante en el marco de la
siembra directa y dentro del transplante si se hace mediante
viverización, es indispensable también en su etapa de giamiento y
dentro de la floración y fructificación, al efectuar los riegos tratar de
hacer a su capacidad de campo y no encharcarlos para evitar el
riesgo de favorecer condiciones que permiten elevar altas
poblaciones del Nematodo del nudo (Meloidogyne spp.).
3.1.5. PLAGAS Y ENFERMEDADES
Plagas.
Las plagas más visibles son indaneros, diabróticas, grillos
cortadores, hormigas azucareras, etc. Como se observa en las
fotos (Nº 11, 12 y 13).
Enfermedades.
La enfermedad más saltante es el nemátodo del nudo asociado a
Fusarium spp. Que aniquila a la planta durante su periodo de
producción, también existen otras enfermedades como se muestra