Universidad de Chile. Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas Departamento de Ciencia de los Alimentos y Tecnología Química OBTENCIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE INULINA ENTRECRUZADA COMO AGENTE ENCAPSULANTE DE α-TOCOFEROL Investigación financiada por el proyecto FONDECYT 1090209. Tesis para optar al título de Químico Farmacéutico AUTOR: JUAN ANDRÉS VEGA VELÁSQUEZ Profesor Patrocinante: Dra. Paz Robert Canales. Departamento de Ciencia de los Alimentos y Tecnología Química, Universidad de Chile. Director de Memoria: Dr. Jorge Chávez Arrué. Departamento de Ciencias y Tecnología Farmacéutica, Universidad de Chile. Santiago, Chile 2011
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Universidad de Chile. Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas
Departamento de Ciencia de los Alimentos y Tecnología Química
OBTENCIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE
INULINA ENTRECRUZADA COMO AGENTE
ENCAPSULANTE DE
α-TOCOFEROL
Investigación financiada por el proyecto FONDECYT 1090209.
Tesis para optar al título de Químico Farmacéutico
AUTOR: JUAN ANDRÉS VEGA VELÁSQUEZ
Profesor Patrocinante:
Dra. Paz Robert Canales.
Departamento de Ciencia de los
Alimentos y Tecnología Química,
Universidad de Chile.
Director de Memoria:
Dr. Jorge Chávez Arrué. Departamento
de Ciencias y Tecnología
Farmacéutica, Universidad de Chile.
Santiago, Chile
2011
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999999999999
Nota y Firma
Autoridad Responsable
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DEDICATORIA
A Dios.
Por haberme permitido llegar hasta este punto y haberme dado la perseverancia para
lograr mis metas, además de su infinita bondad y amor.
A mi Madre y Padre.
Por su gran amor y esfuerzo, por sus consejos que me han permitido ser un hombre de
bien y por el sacrificio que tan desinteresadamente han llevado a cabo todos estos
años por nosotros, sus hijos.
A mis Abuelos.
Por su amor, por su apoyo incondicional y por todas aquellas cosas que para ustedes
parecían mínimas, pero que para mí fueron de un valor incalculable. En especial
dedico mi esfuerzo de años a mi abuelo Delfín Velásquez Lizana, quien dejó una huella
indeleble en mi vida y quien contribuyo en gran medida a quien soy.
A mi Hermana y mi Sobrina.
Por los grandes momentos de felicidad que me han dado.
A mi profesora.
Doctora Paz Robert por su apoyo, confianza y motivación para la culminación de mis
estudios profesionales y elaboración de esta tesis. En quien encontré una maravillosa
persona y amiga.
A Paula García.
Por toda su ayuda en este trabajo, por compartir conmigo durante meses, por hacer
más llevaderas las infinitas horas que significó realizar este proyecto y más que nada
por la gran persona que eres.
iv
A mis amigos.
Que nos apoyamos mutuamente en nuestra formación profesional y que hasta ahora,
seguimos siendo amigos: Sebastián Silva, Francisco Ormazábal, Carolina Velasco,
Cesar Vásquez y Francisco Mura y a quienes conocí durante el desarrollo de esta tesis
y pasaron a formar parte de mi vida: Paula Jiménez y Andrés Bustamante.
A la Universidad de Chile y en especial a la Facultad de Facultad de Ciencias
Químicas y Farmacéuticas.
Por permitirme ser parte de una generación de triunfadores y gente productiva para el
país.
v
AGRADECIMIENTOS
Agradezco la colaboración, participación y ayuda en el desarrollo de esta tesis a:
Doctora Paz Robert Canales y Paula García Concha, Facultad de Ciencias Químicas y
Farmacéuticas, Universidad de Chile.
Proyecto FONDECYT 1090209.
Departamento de Ciencia de los Alimentos y Tecnología Química, Universidad de
Chile.
Departamento de Ciencias y Tecnología Farmacéutica, Universidad de Chile.
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TABLA DE CONTENIDOS
I. INTRODUCCIÓN .................................................................................................... 1
II. HIPÓTESIS ............................................................................................................ 3
III. OBJETIVOS ........................................................................................................ 4
2.1. Diseño de α-tocoferol con inulina nativa (AT-InN) y entrecruzada (AT-InE1 y AT-INE2). .............................................................................................................. 36
2.2. Microcápsulas obtenidas en condiciones óptimas: ..................................... 39
2.2.1. Condiciones de Microencapsulación: .................................................. 39
2.2.2. Porcentajes de encapsulación de las microcápsulas óptimas: ............ 40
2.2.3. Morfología de las microcápsulas óptimas: ........................................... 41
3. Evaluación de la cesión del activo: .................................................................... 44
3.1. Cinética de Liberación de α-tocoferol en n-hexano: ................................... 44
3.2. Cinética de Liberación de α-tocoferol en agua-tween 80: ........................... 45
VII. CONCLUSIONES ............................................................................................. 50
VIII. BIBLIOGRAFIA ................................................................................................. 51
IX. GLOSARIO ....................................................................................................... 57
FIGURA Nº25: PERFIL DE LIBERACIÓN DE AT PARA LAS MICROPARTÍCULAS OBTENIDAS BAJO CONDICIONES ÓPTIMAS, PARA LOS
SISTEMAS AT-INN, AT-INE1 Y AT-INE2, UTILIZANDO N-HEXANO COMO MEDIO DE DISOLUCIÓN. ............................. 44
FIGURA Nº 26: PERFIL DE LIBERACIÓN DEL AT FRENTE AL TIEMPO PARA LAS MICROCÁPSULAS DE INE2 OBTENIDAS BAJO
CONDICIONES ÓPTIMAS EN AGUA-TWEEN-80 COMO MEDIO DE DISOLUCIÓN. ....................................................... 46
FIGURA Nº27: PERFIL DE LIBERACIÓN DE AT PARA LAS MICROPARTÍCULAS OBTENIDAS BAJO CONDICIONES ÓPTIMAS, PARA LOS
SISTEMAS AT-INN, AT-INE1, AT-INE2, UTILIZANDO AGUA-TWEEN 80 COMO MEDIO DE DISOLUCIÓN. ..................... 47
INDICE DE ECUACIONES
ECUACIÓN Nº1: ECUACIÓN DE HIGUCHI. .............................................................................................................. 14
ECUACIÓN Nº2: ECUACIÓN DE KORSMEYER & PEPPAS: ........................................................................................... 14
ECUACIÓN Nº3: DETERMINACIÓN DE LA CAPACIDAD DE RETENCIÓN DE AGUA (WBC). .................................................. 19
ECUACIÓN Nº4: DETERMINACIÓN DE LA SOLUBILIDAD. ............................................................................................ 19
ECUACIÓN Nº5: CALCULO DEL PORCENTAJE SUPERFICIAL DE TOCOFEROL. .................................................................. 22
ECUACIÓN Nº6: CALCULO DEL PORCENTAJE DE ENCAPSULACIÓN DE TOCOFEROL. .......................................................... 23
ECUACIÓN Nº7: CALCULO DEL GRADO DE ENTRECRUZAMIENTO (DC). ........................................................................ 32
xi
RESUMEN
El alfa tocoferol (AT) es uno de los antioxidantes más utilizados en diferentes
industrias, aunque su baja estabilidad y pobre solubilidad en medio hidrofílico limitan
sus aplicaciones. Estas desventajas pueden ser superadas utilizando la tecnología de
Microencapsulación, para esto la técnica más utilizada es el secado por atomización.
Para propósitos de liberación controlada el agente encapsulante es esencial, siendo
posible a través de modificaciones químicas, cambiar las características físico-
químicas de los polímeros y su perfil de liberación. El objetivo de este trabajo fue
estudiar el efecto del entrecruzamiento químico de la inulina (dos grados: InE1 e InE2)
como agente encapsulante sobre el porcentaje de encapsulación y evaluar el
comportamiento de liberación de AT desde las microcápsulas obtenidas bajo
condiciones óptimas en solventes modelos hidrofóbico (n-hexano) e hidrofílico (agua-
tween 80), utilizando inulina nativa (InN) como control. Las microcápsulas fueron
elaboradas mediante secado por atomización, utilizando un secador mini spray-dryer
Büchi modelo B-290. Se aplicó un diseño estadístico central compuesto 22 más
estrella, considerando como variables independientes: la razón AT/agente
encapsulante (1:10 – 1:30) y la temperatura del aire de entrada al secador (160-200
ºC) y como variable dependiente el porcentaje de encapsulación de AT. Se
desarrollaron 10 experimentos para cada sistema estudiado (AT-InN, AT-InE1 y AT-
InE2). Se utilizó la metodología de superficie respuesta para optimizar la variable
dependiente.
El porcentaje de encapsulación de las microcápsulas de AT obtenidas bajo condiciones
óptimas para los sistemas AT-InN, AT-InE1 y AT-InE2 fue de 86%, 88% y 90%,
respectivamente, mostrando que un aumento en el grado de entrecruzamiento de la
inulina aumentó significativamente (p<0,05) el porcentaje de encapsulación de AT,
favoreciendo la interacción AT-polímero.
El perfil de liberación de AT (Mt/M0 versus tiempo) desde las microcápsulas obtenidas
bajo condiciones óptimas en n-hexano mostró un perfil limitante, mientras que en agua
xii
tween 80 a 25°C presentó un perfil bifásico para los tres sistemas estudiados (AT-InN,
AT-InE1 y AT-InE2). La primera fase se caracterizó por una liberación correspondiente
al AT superficial. Los perfiles de liberación se ajustaron a modelos matemáticos de
primer orden, Higuchi y Korsmeyer & Peppas. Las constantes de liberación de AT
superficial fueron significativamente mayores (p<0,05) para las inulinas entrecruzadas,
respecto a la inulina nativa. La segunda fase sugeriría el comienzo de la liberación del
AT encapsulado.
Las microcápsulas de AT con inulina entrecruzada, representan un interesante aditivo
alimentario para el diseño de alimentos funcionales.
xiii
ABSTRACT
Obtention and characterization of crosslinked inulin as encapsulting agent of
alpha-tocopherol.
Alpha tocopherol (AT) is one of the most used food antioxidants. However its low
stability and poor aqueous solubility have limited their application. The use of
microencapsulation technology, such as spray drying is a form of overcome this
limitation.
The encapsulating agent is essential for purposes of controlling the release in food, yet
few biopolymers are available for spray-drying microencapsulation. However, they can
be chemically modified to change their physical and chemical properties. The aim of
this research was to study the chemical cross-linking of the inulin (two degrees: CIn1
and CIn2) on AT encapsulation percentage and to evaluate the release behavior of AT
from microcapsules obtained under optimal conditions in a hydrophobic solvent (n-
hexane) and hydrophilic solvent (water-tween 80), using native inulin (NIn) as a control.
AT microcapsules were prepared by a spray-drying method with a laboratory scale
Büchi spray drier (B-290). The experiments were performed with a 22 central composed
design constituted by 10 experiments of each system studied (AT-NIn, AT-CIn1 and AT-
CIn2). The independent variables were the AT/encapsulating agent ratio (1:10 – 1:30)
and the inlet air temperature (160-200ºC); the dependent variable was AT
encapsulation percentage. The response surface methodology was applied to optimize
the performance of the dependent variable.
The encapsulation percentage of the microcapsules obtained under optimal condition in
the AT-NIn, AT-CIn1 and AT-CIn2 systems were 86%, 88% and 90%, respectively.
These results showed that an increase in the cross-linking degree of the inulin provided
a significant higher (p<0.05) AT encapsulation percentage, showing a better AT-
polymer interaction between. The AT release profiles (Mt/M0 versus time) from AT-NIn,
AT-CIn1 and AT-CIn2 systems obtained under optimal conditions in hexane showed a
limiting profile. However, in aqueous medium a two phase profile can be distinguished,
with a first phase corresponding to AT superficial release. Different mathematical
xiv
models (First order, Higuchi and Korsmeyer-Peppas) were adjusted to the release
profiles. The AT release rate constant were significantly higher (p<0.05) in the cross-
linked inulin than native inulin. The second phase would suggest the beginning of AT
release from the microcapsules.
The AT–crosslinked inulin microcapsules studied represent an interesting food additive
for to design functional foods.
1
I. INTRODUCCIÓN
El α-Tocoferol (AT) se ha utilizado como aditivo en alimentos por su rol antioxidante
y como material funcional en la prevención de enfermedades relacionados con
estrés oxidativo, como enfermedades cardiovasculares y cáncer (Mergens et al.,
1980). Sin embargo, su labilidad frente a la exposición a oxígeno y temperatura
limita su utilización y por lo tanto su biodisponibilidad, ya que se transforma de
manera irreversible en una quinona, vía formación de un epóxido, inactivando la
molécula (Barrera et al., 1999; Verleyen et al., 2001). Una forma de superar estas
limitantes, dando mayor estabilidad al α-tocoferol, es a través de la aplicación de la
tecnología de encapsulación (Somchue et al., 2009). Esta técnica permite proteger
al α-tocoferol de las exposiciones deletéreas que puedan resultar de su interacción
con el medio ambiente y/o con los constituyentes de la matriz a la cual podría ser
adicionado (Gharsallaoui et al., 2007). Existen algunos trabajos sobre
encapsulación de α-tocoferol, principalmente con el objetivo de protegerlo para
aumentar su vida útil, empleando diferentes agentes encapsulantes y métodos de
encapsulación como: proteínas de arvejas y carboximetilcelulosa por secado por
atomización (Pierucci et al., 2007), proteínas de huevo y β-lactoglobulinas por
gelificación iónica (Somchue et al. 2009), alginato por gelificación iónica (Yoo et al.,
2006), maltodextrinas y gelatina por freeze-dried (Campagnaro et al., 2007).
Además algunos de estos se enfocan en la cesión del AT en diferentes medios:
gastrointestinales (Yoo et al., 2006; Somchue et al., 2009) e hidrofóbicos (Duclairoir
et al., 2002).
En este trabajo, se utilizará inulina debido a que presenta algunas características
destacables como lo son: su buena compatibilidad con los tejidos y su paso intacto
a través de la mayor parte del tracto gastrointestinal, siendo metabolizada sólo en el
colon por bacterias intestinales. Esto permitiría la liberación controlada de
compuestos bioactivos en un sitio específico del organismo (Hovgaard y Brondsted,
1996). Además los polisacáridos en general son una alternativa atractiva debido a
que presentan una amplia disponibilidad, bajos costos, capacidad de ser
modificados químicamente (Bogdansky, 1990) y son biodegradables; sitúandolos
como sustancias de amplia versatilidad y aplicabilidad. La modificación química de
2
inulina por entrecruzamiento con tricloruro de fosforilo (POCl3) permitiría obtener
polímeros con nuevas características físico-químicas.
3
II. HIPÓTESIS
La cesión en medio hidrofóbico (n-hexano) e hidrofílico (agua) de α-tocoferol desde
las microcápsulas (MCPs) obtenidas bajo condiciones óptimas, elaboradas con
inulinas entrecruzadas será menor, cuanto mayor sea su grado de
entrecruzamiento, en comparación con la inulina nativa.
4
III. OBJETIVOS
1. Objetivo General:
Desarrollar microcápsulas de α-Tocoferol (antioxidante), mediante el método de
secado por atomización, utilizando inulina nativa e inulina entrecruzada con dos
grados de entrecruzamiento, como agentes encapsulantes, para su posterior
aplicación a matrices alimentarias modelos.
2. Objetivos Específicos:
1.1. Modificar inulina por medio de entrecruzamiento químico (con POCl3) y
caracterizarlo mediante pruebas físico-químicas, térmicas y morfológicas.
1.2. Estudiar la razón AT/agente encapsulante y la temperatura de secado
(variables independientes), sobre el porcentaje de encapsulación (variable
dependiente), por medio de metodología de superficie de respuesta (MSR).
1.3. Caracterizar las microcápsulas de α-tocoferol obtenidas bajo condiciones
óptimas para cada material encapsulante en estudio.
1.4. Caracterizar cinéticamente el patrón de liberación de α-tocoferol desde las
microcápsulas obtenidas bajo condiciones óptimas para cada polisacárido,
tanto nativo como entrecruzado, en una matriz alimentaria modelo:
hidrofóbica (n-hexano) e hidrofílica (agua).
5
IV. MARCO TEÓRICO
Las especies reactivas de oxígeno, se forman de manera natural como un
subproducto del metabolismo normal del oxígeno, pero también se forman por una
serie de factores ambientales (humo del cigarro y radiación UV entre otros). Estas
especies son capaces de oxidar lípidos, proteínas y ADN. La exposición a especies
reactivas de oxígeno induce un aumento en la peroxidación lipídica, la cual puede
causar daños en distintos sitios del organismo, debido a un desequilibrio entre la
producción de EROs (especies reactivas del oxígeno) y la capacidad antioxidante
del sistema biológico.
La exposición a radicales libres puede promover cataratogénesis (Trevithick et al.,
1992) y enfermedades cardiovasculares debido a la toxicidad de los lípidos
peroxidados en las células endoteliales de los vasos sanguíneos (Kaneko et al.,
1991) o daños a la piel, tales como envejecimiento prematuro (Epstein, 1983),
fragilidad de la piel y algunos tipos de cánceres (melanomas entre otros) (Sober,
1987). Es también esta oxidación de lípidos la que limita la vida útil de grasas y
aceites en alimentos, produciendo el enranciamiento de éstos.
La autoxidación de lípidos es una reacción en cadena de ácidos grasos
insaturados, que incluye tres etapas: iniciación, propagación y término (figura Nº1).
Figura Nº1: Ecuaciones que describen el deterioro oxidativo de lípidos. RH: ácido graso insaturado; R.: radical alquil; ROO.: radical peroxil.
Iniciación:
RH + Iniciador � R•
Propagación:
R• + O2
� ROO•
ROO• + RH � ROOH + R•
Término:
R• + R• � R-R
ROO• + R• � ROOR
ROO• + ROO• � Productos no radicalarios
6
1. Antioxidantes: α-Tocoferol
Los tocoferoles están compuestos por cuatro tipos homólogos de 6-hidroxi
cromanoles que poseen actividad de vitamina E en la dieta (Azzi y Stocker, 2000).
α-, β-, γ- y δ-Tocoferol; consisten de un grupo hidroxil en la posición 6 y uno o más
grupos metil en las posiciones 5, 7 u 8 del anillo cromanol con un grupo fitilo de 16
carbonos saturados (figura Nº2). El grupo fitilo tiene 3 centros quirales en los
carbonos 2, 4’ y 8’. Todos los tocoferoles que existen naturalmente, tienen
configuración R en las tres posiciones antes mencionadas del grupo fitilo, RRR-α-
Tocoferol (2D, 4’D, 8’D) (Gregory, 1996). Las posiciones de los grupos metil sobre
el anillo cromanol determinan las formas α-, β-, γ- y δ-Tocoferol (tabla Nº1).
El tocoferol es una molécula capaz de retrasar el deterioro oxidativo, debido a su
acción antioxidante, al donar un hidrógeno del grupo 6-hidroxi del anillo cromano al
radical peroxil, formando un hidroperóxido y por lo tanto inhibiendo la reacción de
propagación. Es así como el tocoferol con un potencial de reducción de 300-400
mV fácilmente dona un hidrógeno al radical peroxil (ROO•) que posee un potencial
de reducción de 1000 mV, obteniéndose como resultado un hidroperóxido más un
radical tocoferoxil (T•). Los radicales tocoferoxil pueden ser estabilizados por
resonancia. La velocidad de reacción entre el α-tocoferol y los radicales peroxil es
del orden de 107 M-1s-1 y 105-106 veces más rápido que la reacción entre los lípidos
insaturados y el radical peroxil (Niki et al., 1984; Choe y Min, 2005). Además los
radicales tocoferoxil son capaces de reaccionar con radicales peroxil para formar
productos no radicalarios (T-T y T-OOL) (figura Nº3) (Kamal-Eldin y Appelqvist,
1996).
Figura Nº2: Estructura general del tocoferol.
7
Tabla Nº 1: Nombre de los distintos tipos de tocoferol.
Figura Nº3: Ecuaciones que describen el efecto antioxidante del tocoferol. TH: tocoferol; ROO.: radical peroxil; T.: radical tocoferoxil; T-T y T-OOR: productos no radicalarios.
El tocoferol es capaz de prevenir daños agudos o crónicos en membranas lipídicas
(Kligman y Kligman, 1986). Además, cuando es aplicado sobre la piel reduce el
daño causado por la peroxidación fosfolipídica de la membrana celular (Burton y
Ingold, 1981), retrasando el daño producido por el envejecimiento (Mayer et al.,
1993). Estas características hacen interesante su uso, ya sea para prevenir el
deterioro oxidativo de alimentos y/o para ser añadido como un componente
funcional de ellos. El problema reside en que la exposición a la luz, calor y oxígeno
promueven una rápida degradación. En este sentido, se ha reportado que el α-
tocoferol presenta la mayor actividad antioxidante en aceites vegetales, pero la
menor estabilidad durante su almacenamiento en ellos (Kamal-Eldin y Appelqvist,
1996). Por esta razón es tan necesario proteger el tocoferol de condiciones
deletéreas.
2. Microencapsulación:
La microencapsulación es un procedimiento complejo por el cual ciertas sustancias
activas sólidas, líquidas o gaseosas (antioxidantes, bactericidas, etc.) son
� HPLC compuesto por bomba Merck–Hitachi L-6200 con detector de
fluorescencia Merck-Hitachi F-1050, acoplado a un computador con software
Clarity versión 2.4.1.43; columna LiChrocart Superspher Si-60 (5 µm, 4,0
mm d.i. x 250 mm, Merck).
� HPLC compuesto por bomba Merck–Hitachi L-6200 con detector de arreglo
de diodos Waters 996, acoplado a un computador con software Empower
Pro; columna C18 (3 µm, 4,6 mm d.i. x 250 mm, Atlantis.).
� Secador Spray Büchi modelo B-290, Suiza.
� pH – metro HANNA HI 111 pH/ORP meter, Alemania.
4. Metodología:
4.1. Elaboración de inulina entrecruzada:
El entrecruzamiento de inulina se realizó de acuerdo a una modificación del método
descrito por Woo y Seib (2002) para entrecruzar almidones. Como agente
entrecruzante se ensayó el reactivo: tricloruro de fosforilo.
4.1.1. Tricloruro de Fosforilo:
Se adicionó la inulina (25 g) en agua destilada (100 g) a 50ºC con agitación suave
hasta lograr la disolución y se dejó adicionalmente 1h a 25ºC. Luego de esto, se
añadió el sulfato de sodio anhidro (3,75 g) y se ajustó el pH de la mezcla a 11,5 con
hidróxido de sodio 1M. Alcanzado dicho pH se procedió a adicionar el tricloruro de
fosforilo (0,3% y 1% con respecto al peso de inulina) por goteo, manteniendo el pH
entre 10,5-11,5. Se dejó reaccionar la inulina con el tricloruro de fosforilo por 1 hora
y se añadió ácido clorhídrico (1M) hasta alcanzar un pH de 5,5. Posteriormente, se
precipitó la inulina entrecruzada con acetona, se filtró a vacio con un embudo
Büchner y la torta se enjuagó con 3 porciones sucesivas de una mezcla 60:40 de
acetona-agua (200 mL cada una). El precipitado se dejó en estufa a 50ºC por 24
horas, para posteriormente triturarlo en mortero. Finalmente se colocó el polvo por
dos horas más en estufa a 50ºC para eliminar rastros de solvente. Como resultado
18
se obtuvo la inulina entrecruzada InE1 e InE2, correspondientes a la reacción con
0,3 y 1% de tricloruro de fosforilo, respectivamente.
4.2. Análisis realizados a la inulina nativa y entrecruzada:
� Espectroscopia de Infrarrojo (IR): Se realizó para estudiar la modificación del
espectro de inulina y la inclusión de grupos fósforo a la molécula. Los
espectros se obtuvieron empleando un espectrofotómetro de Infrarrojo
Mediano con Transformada de Fourier (FT-MIR) marca BRUKER, modelo
VECTOR 22, realizando un barrido entre 4000 y 600 cm-1. Las muestras
fueron analizadas en comprimidos de KBr. Estos ensayos fueron realizados
por la Unidad Central de Instrumentación de la Facultad de Química de la
Pontificia Universidad Católica de Chile.
� Espectroscopia Resonancia Magnética Nuclear de Fósforo 31 (31P-RMN):
Se realizó como análisis cualitativo de la inclusión de fósforo a la molécula.
Estos ensayos se realizaron por la Unidad Central de Instrumentación de la
Facultad de Química de la Pontificia Universidad Católica de Chile.
� Espectroscopia Resonancia Magnética Nuclear de Protones (1H-RMN): Este
análisis se realizó para estudiar cambios en la molécula de inulina. Los
espectros fueron obtenidos por medio de un equipo BRUKER AVANCE-400.
Las muestras fueron suspendidas en dimetilsulfóxido deuterado (d-DMSO).
Estos ensayos se realizaron por la Unidad Central de Instrumentación de la
Facultad de Química de la Pontificia Universidad Católica de Chile.
� Microscopia Electrónica de Barrido (SEM): se efectuó para determinar la
morfología (forma y tamaño de partícula) de la inulina (nativa y
entrecruzada). Se realizó mediante un microscopio JEOL JSM-25SII. Este
análisis fue realizado por el Servicio de Microscopía de la Pontificia
Universidad Católica de Chile.
� Calorimetría Diferencial de Barrido (DSC): se realizó para determinar las
propiedades térmicas de la inulina (tanto nativa, como entrecruzada).
Este análisis fue realizado por el Departamento de Química de los
Materiales de la Universidad de Santiago de Chile.
� Determinación de fósforo por espectrofotometría de emisión atómica (ICP-
AES): Esta técnica se utilizó para determinar cuantitativamente el contenido
19
de fósforo de las muestras de inulina entrecruzadas y posterior cálculo del
grado de entrecruzamiento. La técnica de análisis fue espectroscopia de
emisión atómica plasma inductivamente acoplado. Este análisis fue
desarrollado por CEQUC de La Pontificia Universidad Católica de Chile.
� Determinación de la capacidad de unir agua (WBC) y solubilidad: Se utilizó
la técnica descrita por Medcalf y Gilles (1965) con modificaciones. Se pesó
en un tubo de ensayo (previamente tarado: Po), se le adicionó 0,5 g de
muestra (Pm), se añadió 10ml de agua destilada, luego se agitó en vortex
por 1 minuto y se dejó hinchando por 24 hrs. Transcurrido este lapso de
tiempo se centrifugó el tubo a 5000 rpm por 30 minutos y se eliminó el
sobrenadante. Se procedió a pesar el tubo (Ph) y se dejó por 24 horas en
estufa a 105ºC. Se pesó el tubo con la muestra seca (Ps). La capacidad de
unir agua y la solubilidad, se calcularon a partir de las ecuaciones 3 y 4,
respectivamente.
�� =��� − ��� − ��� − ���
��� − ���
Ecuación Nº3: Determinación de la capacidad de retención de agua (WBC).
% Perdida de peso = Solubilidad =P& − �P' − P��
P&
Ecuación Nº4: Determinación de la solubilidad.
Donde se tiene que:
Ph : Peso muestra húmeda + tubo de ensayo.
P0 : Peso tubo de ensayo.
Ps : Peso muestra seca + tubo de ensayo.
Pm : Peso muestra inicial.
20
4.3. Elaboración de microcápsulas:
4.3.1. Preparación del vehículo:
Para la preparación de estos vehículos se consideró 100 g de emulsión de acuerdo
a una relación AT/agente encapsulante que varió desde 1:10 hasta 1:30 (anexo
Nº1).
La pre-emulsión se preparó mezclando caseinato de sodio (0,8 g), α-tocoferol (0,5
g) y una parte del agua (20%), la cual se homogeneizó con un homogeneizador
Polytron PT-2100 (Kinematica AG, Switzerland) a 20.000 rpm por 3 minutos.
Paralelamente se disolvió el agente encapsulante inulina nativa (InN) o inulina
entrecruzada (InE) (5 g, 10 g o 15 g dependiendo de la relación empleada) en agua
destilada a 55ºC, se dejó enfriar a 30ºC y luego se añadió sobre la pre-emulsión,
completando el volumen con agua destilada (csp. 100 g). Finalmente, se
homogeneizó la mezcla resultante a 20.000 rpm por 3 minutos y la emulsión
resultante se atomizó inmediatamente en el secador spray.
4.3.2. Microencapsulación:
Las emulsiones obtenidas fueron alimentadas a un secador mini Spray-Dryer Büchi
modelo B-290 (Alemania) con alimentación y flujo de aire de secado en
configuración co-corriente. La temperatura de entrada del aire al secador fluctuó
entre 160ºC-200ºC dependiendo del diseño. El flujo de aire, la velocidad de
alimentación, temperatura de alimentación y la presión de atomización fueron de
600 L/h, 10 mL/min, 40ºC-45ºC, y 20 psi, respectivamente. Las microcápsulas
resultantes fueron almacenadas en envases de polipropileno a -20 ºC hasta el
momento de su utilización.
4.4. Diseño estadístico:
Para este análisis se utilizó un diseño estadístico compuesto central 22 más estrella
con un total de 10 experimentos para cada sistema (AT-InN, AT-InE1 y AT-InE2).
Las variables independientes para este estudio fueron la relación AT/agente
encapsulante y la temperatura del aire de entrada al secador. En la tabla Nº 2 se
21
presentan las variables que se utilizaron para el diseño estadístico. La variable de
respuesta fue el porcentaje de encapsulación y la matriz de respuesta utilizada se
presenta en la tabla Nº 3.
Tabla Nº 2: Niveles para las variables independientes usadas en el diseño estadístico compuesto central 22 más estrella, para la encapsulación de AT en los diseños: AT-InN, AT-InE1 y AT-InE2.
Variable Nivel
-1 0 1
Relación AT/Agente
encapsulante
1:10
1:20
1:30
Temperatura (ºC)
160ºC
180ºC
200ºC
Tabla Nº 3: Matriz de Respuesta para cada sistema (AT-InN, AT-InE1, AT-InE2).
PE: porcentaje de encapsulación.
AT-InN AT-InE1 AT-InE2
Relación
AT/InN
Temperatura
(ºC)
PE Relación
AT/InE1
Temperatura
(ºC)
PE Relación
AT/InE2
Temperatura
(ºC)
PE
1:10 160 1:10 160 1:10 160
1:10 180 1:10 180 1:10 180
1:10 200 1:10 200 1:10 200
1:20 160 1:20 160 1:20 160
1:20 180 1:20 180 1:20 180
1:20 180 1:20 180 1:20 180
1:20 200 1:20 200 1:20 200
1:30 160 1:30 160 1:30 160
1:30 180 1:30 180 1:30 180
1:30 200 1:30 200 1:30 200
22
4.5. Determinación del porcentaje de Encapsulación de α-tocoferol:
4.5.1. Contenido de α-tocoferol superficial:
Las microcápsulas de inulina nativa (InN) o entrecruzadas (InE1 ó InE2) (50 mg) se
trataron con 2 mL de hexano y se agitaron en vortex por 1 minuto. Las muestras se
filtraron (filtro Millipore 0,22 µm), luego se tomó una alícuota de 200 µL y se aforó
con hexano (grado HPLC) a 25 mL. La concentración de α-tocoferol superficial fue
obtenida a través de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) (AOCS, 1993)
mediante una curva de calibración entre 1,05 a 5,25 [µg/mL] (R2=0,9992) (anexo
Nº2).
El equipo HPLC, estuvo compuesto de una bomba Merck-Hitachi L-6200 A (Merck,
Darmstadt, Alemania), inyector Rheodyne 7725i, loop 20 µL, detector de
fluorescencia Merck-Hitachi F-1050 acoplado a un computador con el software
Clarity 2.4.1.43. La detección se realizó a 290 nm (longitud de onda de excitación) y
330 nm (longitud de onda de emisión). Se utilizó una columna LiChrocart
Superspher Si60 (5µm x 4 mm d.i. x 250 mm, Merck, Alemania). La fase móvil
correspondió a 2-propanol en hexano (0,5: 99,5 v/v) con un flujo de 1 mL/min. El
análisis se realizó en duplicado.
4.5.2. Porcentaje de encapsulación:
El porcentaje de α-tocoferol superficial se calculó de acuerdo a la siguiente
Tabla Nº5: Capacidad de retención de agua (WBC) y solubilidad (%) de InN, InE1 e InE2.
Muestra Retención agua (WBC) Solubilidad (%)
InN 3,73±0,32 (a) 59,32±3,10 (a)
InE1 5,46±0,04 (b) 26,20±0,17 (b)
InE2 5,76±0,10 (b) 22,54±0,06 (b) Letras distintas entre sistemas indican diferencias significativas (p<0,05), para WBC y %Solubilidad.
1.7. Morfología de la inulina nativa y entrecruzada:
La figura Nº16 muestra la morfología de la inulina nativa. Es posible apreciar que se
trata de estructuras amorfas, de diferentes tamaños, con partículas pequeñas
adsorbidas en las superficies de las de mayor tamaño.
Figura Nº16: Fotomicrografías de inulina nativa. La fotografía de la izquierda posee una amplitud x45 y
la de la derecha una amplitud de x1500 veces.
35
Figura Nº17: Fotomicrografías de inulina entrecruzada con POCl3 al 0,3% (InE1). La fotografía de la izquierda posee una amplitud x200 y la de la derecha una amplitud de x1000 veces.
Figura Nº18: Fotomicrografías de inulina entrecruzada con POCl3 al 1,0% (InE2). La fotografía de la izquierda posee una amplitud x200 y la de la derecha una amplitud de x1000 veces.
En las figuras Nº17 y 18 se puede apreciar que tanto la InE1, como la InE2 poseen
una morfología similar entre sí, pero diferente de la InN. Probablemente esto se
deba a que el tricloruro de fosforilo afecta la conformación helicoidal de cinco
vueltas de la inulina (Stevens et al., 2001), provocando una alteración de estas y así
un cambio en su morfología.
36
2. Microencapsulación.
2.1. Diseño de α-tocoferol con inulina nativa (AT-InN) y entrecruzada (AT-
InE1 y AT-INE2).
Las microcápsulas fueron preparadas según el método anteriormente descrito,
usando un rango de temperaturas entre 160° y 200ºC y una relación de AT/(InN o
InE) que varió desde 1:10 hasta 1:30. En la tabla Nº6, se muestra el porcentaje de
encapsulación para los sistemas AT-InN, AT-InE1 y AT-InE2.
El rango de encapsulación de AT para los sistemas AT-InN, AT-InE1 y AT-InE2 varió
entre 84,3 a 90,4%; 81,8 a 88,2% y 83,4 a 90%, respectivamente. Estos resultados
muestran la alta interacción entre el α-tocoferol y los polímeros de inulina (en sus
tres formas).
TablaNº6: Porcentajes de encapsulación de α-tocoferol para los sistemas AT-InN, AT-InE1 y AT-InE2.
Ensayo Relación
AT:(InN ó InE)
Temperatura
(ºC)
InN
PE (%)*
InE1
PE (%)*
InE2
PE (%)*
1 1:10 160 88,8±0,1 86,9±0,1 90,0±1,0
2 1:10 180 88,5±0,2 87,5±0,2 87,5±0,1
3 1:10 200 87,4±0,4 88,2±0,0 85,2±0,1
4 1:20 160 88,1±0,4 86,5±0,1 84,5±0,0
5 1:20 180 86,4±0,3 87,3±0,2 84,1±0,2
6 1:20 180 87,7±0,4 87,5±0,1 84,3±0,1
7 1:20 200 86,9±0,3 86,5±0,4 84,8±0,1
8 1:30 160 84,3±0,3 81,8±0,1 83,4±0,3
9 1:30 180 86,8±0,4 87,7±0,2 86,2±0,2
10 1:30 200 90,4±0,2 86,5±0,3 85,0±0,2
* Valores expresados como media ± DS; PE: porcentaje e encapsulación.
El análisis de varianza (ANDEVA) para el porcentaje de encapsulación, mostró que
la temperatura de aire de entrada al secador en su forma lineal y cuadrática no
presentó un efecto significativo (p>0,05) en ninguno de los tres sistemas
estudiados. Mientras que, la relación AT/agente encapsulante en su forma lineal y
cuadrática tuvo un efecto significativo (p<0,05) solamente en el sistema AT-InE2.
37
Superficie de Respuesta Estimada
160 170 180 190 200Temperatura
1014
1822
2630
Relacion84
85
86
87
88
89
90
Por
c E
ncap
sula
cion
Por otro lado, la interacción entre la relación AT/agente encapsulante y la
temperatura de secado, mostraron un efecto significativo (p<0,05) sobre el
porcentaje de encapsulación de AT para los sistemas AT-InN y AT-InE2 (anexo Nº4,
5 y 6).
A pesar del efecto deletéreo de la temperatura sobre la estabilidad del AT (Kamal-
Eldin y Appelqvist, 1996), los resultados muestran que esta variable no ejerce un
efecto importante en el contenido de AT en ninguno de los tres sistemas
estudiados. Estos resultados están de acuerdo con Gharsallaoui et al. (2007),
quienes muestran que altas temperaturas con bajos tiempos de residencia en la
cámara de secado (5 a 100 s) no afectan el contenido de compuestos bioactivos.
En las figuras 19, 20 y 21 se presentan los gráficos de superficie respuesta para los
diseños AT-InN, AT-InE1 y AT-InE2, respectivamente.
Figura Nº19: Gráfico de superficie de respuesta para el diseño AT-InN.
38
Figura Nº20: Gráfico de superficie de respuesta para el diseño AT-InE1.
Figura Nº21: Gráfico de superficie de respuesta estimada para el diseño AT-InE2.
Se puede afirmar que en este estudio tanto la técnica de secado por atomización,
como el uso de inulina nativa y de inulinas entrecruzadas como agentes
encapsulantes permitieron lograr porcentajes de encapsulación sobre un 80%.
Resultados similares para la encapsulación de AT obtuvieron Pierucci et al. (2007)
(77,8% a 96,7%) utilizando proteína de arveja, carboximetilcelulosa y mezclas de
estos materiales con maltodextrina, como agentes encapsulantes y secado por
atomización como método de encapsulación. Mediante otras técnicas de
encapsulación, como coacervación, Duclairoir et al. (2002) también obtuvieron
Superficie de Respuesta Estimada
160 170 180 190 200Temperatura
1014
1822
2630
Relacion
83
84
85
86
87
88
89
Por
c E
ncap
sula
cion
Superficie de Respuesta Estimada
160 170 180 190 200Temperatura
1014
1822
2630
Relacion83
85
87
89
91
Por
c E
ncap
sula
cion
39
sobre un 77% de encapsulación para AT al elaborar nanopartículas con gliadina de
trigo como encapsulante. Sin embargo Yoo et al. (2006), obtuvieron entre 31,2 a
58,3% de encapsulación utilizando alginato como agente encapsulante mediante
gelificación iónica.
2.2. Microcápsulas obtenidas en condiciones óptimas:
2.2.1. Condiciones de Microencapsulación:
Para la optimización de la variable respuesta (porcentaje de encapsulación), en
función de las variables independientes: relación AT/agente encapsulante y
temperatura del aire de entrada, se utilizó la metodología de superficie de respuesta
(MSR). La maximización de la variable respuesta para el diseño AT-InN se logró
con una relación de 1:30 y una temperatura de entrada de 200 ºC (figura Nº19);
para el diseño AT-InE1 con una relación de 1:10 y una temperatura de entrada de
180 ºC (figura Nº20) y finalmente para el diseño AT-InE2 con una relación de 1:10 y
una temperatura de entrada de 160 ºC (figura Nº21). En la tabla Nº7 se resumen las
condiciones óptimas para la elaboración de las microcápsulas de cada uno de los
diseños estudiados. En general diferentes agentes encapsulantes tienen diferentes
parámetros óptimos en el secado por atomización debido a que ciertas
características como solubilidad, viscosidad y conformación, entre otras, afectan la
formación de la costra en la superficie de la partícula durante el proceso de secado
(Kenyon, 1995; Gharsallaoui et al., 2007).
Tabla Nº7: Condiciones óptimas para la elaboración de las microcápsulas de los sistemas AT-InN, AT-
InE1 y AT-InE2.
Óptimo Relación AT/Agente encapsulante
T (°C) Secado
AT-InN 1:30 200
AT-InE1 1:10 180
AT-InE2 1:10 160
40
En la tabla Nº7 se puede apreciar que el entrecruzamiento produjo una disminución
en la cantidad de agente encapsulante utilizado para la obtención de los óptimos,
esto se debe a que la modificación química de la inulina mejora sus propiedades
como agente encapsulante. Esto último claramente representa una ventaja desde el
punto de vista de la aplicabilidad industrial, ya que el entrecruzamiento permitió
disminuir un 67% la cantidad de agente encapsulante utilizada para el diseño de los
óptimos, aun manteniendo altos porcentajes de encapsulación (resultados en la
tabla Nº6).
2.2.2. Porcentajes de encapsulación de las microcápsulas óptimas:
En la tabla Nº8 se presenta el AT superficial y el porcentaje de encapsulación para
las micropartículas obtenidas bajo condiciones óptimas. El entrecruzamiento de la
inulina produjo un aumento significativo (p<0,05) en el porcentaje de encapsulación
de los óptimos.
Tabla Nº8: α-tocoferol superficial y encapsulado en las micropartículas obtenidas bajo condiciones óptimas de los sistemas AT-InN, AT-InE1 y AT-InE2.
Diseño Grado de
entrecruzamiento
AT total teórico
(mg AT/g polvo)
AT superficial
(%)* PE (%)*
AT-InN 0,001 30,9535 13,9±0,3a 86,1±0,3a
AT-InE1 0,052 79,5696 12,0±0,4b 88,0±0,4b
AT-InE2 0,091 80,6201 10,2± 0,2c 89,8±0,2c
Letras distintas indican diferencias significativas entre sistemas (p<0,05), para el %superficial y el
%encapsulación; * Valores expresados como media ± DS; PE: porcentaje de encapsulación.
En la medida que aumenta el grado de entrecruzamiento de la inulina, disminuyó
significativamente el porcentaje de AT superficial de las microcápsulas óptimas.
Esta disminución del contenido de AT superficial podría ser debida a que la
inclusión de moléculas de fósforo y de uniones entre dos o más segmentos de la
misma o de diferentes cadenas de inulina mejora la tendencia a la formación de
redes finas y densas de agente encapsulante en la superficie de las microcápsulas
41
durante el proceso de secado. De este modo, al aumentar el grado de
entrecruzamiento en la inulina va disminuyendo la separación y migración hacia la
superficie de AT durante el secado (Gharsallaoui et al., 2007).
2.2.3. Morfología de las microcápsulas óptimas:
En las figuras Nº22, 23 y 24 se muestran las microfotografías electrónicas de
barrido (SEM) de las micropartículas obtenidas bajo condiciones óptimas de los tres
sistemas estudiados.
Figura Nº22: Microfotografía de microcápsulas obtenidas bajo condiciones óptimas para el sistema AT-InN. La fotografía de la izquierda posee una amplitud x3000 y la de la derecha una amplitud de x8000 veces.
Figura Nº23: Microfotografía InE1. La fotografía de la izquierda posee una amplitud x3000veces.
Figura Nº24: Microfotografía AT-InE2. La fotografía de la x8000 veces.
Las microcápsulas óptimas
presentan superficies
asociativo entre ellas (forman aglomerados
por Poulain et al. (2003)
método de coacervación.
que utilizan polisacáridos como materia
superficie, las cuales s
de microcápsulas obtenidas bajo condiciones óptimas para el sistema zquierda posee una amplitud x3000 y la de la derecha una amplitud de x8
grafía de micropartículas obtenidas bajo condiciones óptimas izquierda posee una amplitud x3000 y la de la derecha una amplitud de
óptimas elaboradas tanto con inulina nativa como entrecruzada
con abolladuras y además exhiben un comportamiento
forman aglomerados). Resultados similares fueron obtenidos
2003), al estudiar microesferas de inulina obtenidas por el
do de coacervación. De acuerdo con Finotelli et al. (2010) las microcápsulas
polisacáridos como material pared exhiben notables indentaciones en la
las cuales son atribuidas al efecto de la composición de la pared
42
para el sistema AT-de la derecha una amplitud de x8000
óptimas para el sistema de la derecha una amplitud de
entrecruzadas
además exhiben un comportamiento
ron obtenidos
, al estudiar microesferas de inulina obtenidas por el
) las microcápsulas
pared exhiben notables indentaciones en la
efecto de la composición de la pared
43
(propiedades viscoelásticas), la atomización y los parámetros de secado; las
abolladuras se pueden formar por la contracción de las partículas durante el secado
y enfriado. Ronkart et al. (2007) estudió la influencia de la temperatura de
alimentación en el secado por atomización de inulina sobre sus propiedades físicas,
encontrando superficies lisas o rugosas dependiendo si la mezcla de alimentación
correspondía a una solución o a una dispersión, respectivamente. La presencia de
abolladuras tiene un efecto adverso sobre las propiedades de flujo de las
microcápsulas, debido a que los polvos que presentan irregularidades en su
superficie poseen una relación superficie/volumen bastante mayor comparados con
partículas perfectamente esféricas y esto hace que las propiedades de flujo de
dichas partículas sean escasas por un aumento del roce entre ellas.
44
3. Evaluación de la cesión del activo:
3.1. Cinética de Liberación de α-tocoferol en n-hexano:
El estudio de liberación de α-tocoferol desde las microcápsulas óptimas se realizó
en un equipo de disolución USP/NF 1, utilizando n-hexano como medio de
disolución. Los resultados se presentan en la figura Nº25 (anexo Nº7).
Figura Nº25: Perfil de liberación de AT para las micropartículas obtenidas bajo condiciones óptimas, para los sistemas AT-InN, AT-InE1 y AT-InE2, utilizando n-hexano como medio de disolución.
El perfil de liberación de AT en n-hexano para los sistemas AT-InN, AT-InE1 y AT-
InE2, mostró un comportamiento limitante, donde en la primera fase (0-30 min) se
produce una liberación rápida de AT de alrededor de un 10%, correspondiente al
AT superficial. En la segunda fase (30-540 min) no se observó liberación de AT,
manteniéndose un valor constante a través del tiempo. Gráficos bifásicos reportó
Duclairoir et al. (2002) en el perfil de liberación de nanopartículas de α-tocoferol-
gliadina en decano. Sin embargo, en la segunda zona observó una dependencia en
0,0
2,0
4,0
6,0
8,0
10,0
12,0
14,0
16,0
18,0
20,0
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550
Po
rcen
taje
AT
liber
ado
(%
)
Tiempo (min)
Mcps InN
Mcps INE1
Mcps InE2
45
el tiempo, debido a la difusividad del componente activo desde la matriz hacia el
medio. En el presente trabajo no se observó liberación de AT en la segunda fase,
debido a que la inulina tanto nativa, como entrecruzada en hexano adquieren una
conformación ovillada debido a la baja interacción polímero-solvente evitando la
entrada de solvente al interior de las microcápsulas e impidiendo la difusión de α-
tocoferol desde el interior hacia el medio de disolución.
El perfil de liberación de AT desde las microcápsulas obtenidas bajo condiciones
óptimas para los sistemas AT-InN, AT-InE1 y AT-InE2, se ajustaron a cinéticas de
orden cero y orden uno. Las constantes de liberación calculadas hasta los 30
minutos se presentan en la tabla Nº9.
Tabla Nº9: Constantes de orden cero y uno para la liberación de AT superficial desde las microcápsulas óptimas para los sistemas AT-InN, AT-InE1 y AT-InE2 en n-hexano.
Letras distintas entre sistemas indican diferencias significativas (p<0,05).
3.2. Cinética de Liberación de α-tocoferol en agua-tween 80:
Antes de realizar la cinética de cesión del activo, se realizó un screening para
observar el comportamiento de liberación de α-tocoferol desde las microcápsulas
utilizando agua-tween 80 como medio de disolución (0,5% de tween 80, para
mejorar la solubilidad del AT liberado). Para esto se escogió de forma aleatoria las
microcápsulas del sistema InE2 obtenidas bajo condiciones óptimas. El perfil de
liberación, se muestra en la figura Nº26.
46
Figura Nº 26: Perfil de liberación del AT frente al tiempo para las microcápsulas de InE2 obtenidas bajo condiciones óptimas en agua-tween-80 como medio de disolución.
De la figura Nº26 se puede concluir que el porcentaje liberado de α-tocoferol entre
0-500 min alcanzó un 12% aproximadamente, luego entre 500-1500 min
permaneció relativamente constante en este valor y luego de los 1500 min se
presenta una caída en la concentración de AT en el medio. Resultados similares
mostró Duclairoir et al. (2002), con una caída en la concentración de AT observada
a partir de las 20 horas, atribuida a la formación de micelas, las cuales actuarían
como reservorios de AT (enmascarándolo). Además la caída de AT a partir de las
20 horas en este estudio se debería a la degradación que sufre el AT frente a la luz
y oxígeno (Kamal-Eldin y Appelqvist, 1996), en el equipo de disolución. De acuerdo
con estos resultados, se procedió a realizar las cinéticas de liberación hasta los 540
minutos (figura Nº27 y Anexo Nº8).
-1,0
1,0
3,0
5,0
7,0
9,0
11,0
13,0
15,0
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500
Po
rce
nta
je A
T lib
era
do
(%
)
Tiempo (min)
InE1
47
Figura Nº27: Perfil de liberación de AT para las micropartículas obtenidas bajo condiciones óptimas, para los sistemas AT-InN, AT-InE1, AT-InE2, utilizando agua-tween 80 como medio de disolución.
La liberación en medio acuoso presenta un gráfico bifásico, en donde la primera
fase comprendida entre 0-90 min se ajustó mejor a una cinética de primer orden
(tabla Nº10). La segunda fase sugeriría el comienzo de la liberación del AT
encapsulado, pero debido a lo lento de esta y a la caída en la concentración de AT
en el medio no fue posible ajustar a los modelos matemáticos utilizados en este
estudio.
En forma general se puede apreciar bajos porcentaje de liberación en los tres
sistemas en estudio debido, entre otras cosas, a la baja solubilidad del AT en medio
acuso. Además podemos concluir que el porcentaje de liberación de AT para las
inulinas entrecruzadas superan al de la nativa, específicamente la curva de cesión
de las microcápsulas óptimas de AT-InE2 está por sobre las demás; esto se debería
a que las inulinas entrecruzadas presentan una mayor interacción con el medio de
disolución, lo que les permite lograr una mayor cesión con respecto a la nativa.
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550
Po
rcen
taje
de
AT
lib
erad
o (
%)
Tiempo (min)
InN
InE1
InE2
48
Tabla Nº10: Constantes de liberación de AT en agua-tween 80 a 25 ºC para modelos de orden cero y uno.
Mcps óptimas
sistema
(k ± DS) x 10-3
orden cero
([µg/ml] min-1)
R2
orden
cero
(k ± DS) x 10-4
primer orden
(min-1)
R2
primer orden
AT-InN 9,2±0,01 (a) 0,929 3,0±0,01 (a) 0,932
AT-InE1 45,8±0,2 (b) 0,926 6,0±0,01 (b) 0,933
AT-InE2 54,6±0,3 (c) 0,916 9,0±0,01 (c) 0,921
Letras distintas entre sistemas indican diferencias significativas (p<0,05).
Las constantes de liberación de AT desde las microcápsulas con inulina
entrecruzada fueron significativamente mayores (p<0,05) con respecto a la de
inulina nativa, de tal forma que un aumento en el grado de entrecruzamiento
aumentó significativamente (p<0,05) la constante de liberación de AT (tabla Nº10).
Este comportamiento se puede explicar debido a que un aumento en el grado de
entrecruzamiento aumenta la capacidad de retención de agua (WBC), facilitando la
difusión de AT. Estos resultados muestran el efecto del tipo de agente encapsulante
sobre la constante de liberación.
Al comparar las magnitudes de las constantes de liberación de AT de la primera
fase en medio acuoso con respecto a las obtenidas en medio apolar se puede
apreciar que estas son alrededor de 10 veces menores en magnitud, lo que denota
que la cesión en medio acuoso es más lenta, sugiriendo que la solubilidad de AT en
el medio de disolución juega un rol importante sobre la velocidad de liberación.
49
Tabla Nº11: Ajuste de los perfiles de liberación de α-tocoferol.
Error total 3,8583 4 0,964575 Total (corr.) 34,1462 9
R-cuadrada = 88,7007 porciento R-cuadrada (ajustada por g.l.) = 74,5765 porciento Error estándar del est. = 0,982128 Error absoluto medio = 0,521643
Diagrama de Pareto Estandarizada para Porc Encapsulacion
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3Efecto estandarizado
BB
AB
AA
A:Temperatura
B:Relacion +-
65
Estadístico Durbin-Watson = 1,70173 (P=0,6015) Auto-correlación residual de Lag 1 = 0,10317 Optimizar Respuesta Meta: maximizar Valor óptimo = 89,5327
Factor Bajo Alto Óptimo
Temperatura 160,0 200,0 160,0
Relación 10,0 30,0 10,0
Diagrama de Pareto Estandarizada para Porc Encapsulacion
0 1 2 3 4
Efecto estandarizado
AA
A:Temperatura
BB
AB
B:Relacion +-
66
7.
An
exo
Nº7
: C
inét
ica
de
liber
ació
n d
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-to
cofe
rol
des
de
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de
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(µ
g/m
L)
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M
asa
en
10
mL
(µ
g)
Ma
sa e
n
500
mL
(µ
g)
Mas
a (µ
g)
Can
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To
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%
Dis
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(vs
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p)
% n
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Dis
uel
to
0 0
0 0
1
0 0
0 0
0,0
10
0,0
5 0,
083
86
3,4
14
1,
1887
49
1
1
1,8
874
9
594
,37
45
0
594
,374
5
3,8
96
,2
10
0,
167
1
254
,00
2
1,64
804
3
1
16,
480
43
82
4,0
21
4
11,8
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728
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376
4
227
,63
6 1
0,5
8
9,5
75
Tabla resumen: Valores de porcentajes de liberación de AT desde las microcápsulas obtenidas en condiciones óptimas para los tres sistemas en estudio. Utilizando Agua-Tween 80 como medio de disolución.