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Obtención de bacterias transgénicas mediante Ingeniería genética.
Autora: Martina Escorial García Tutoras: Mª Rosario Iglesias Álvaro y Teresa Martín Bayón. IES Andrés Laguna. Facultad de Ciencias. Dpto. Bioquímica y Biología Molecular y Fisiología Universidad de Valladolid.
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Índice
1. INTRODUCCIÓN 2. MARCO TEÓRICO 3. OBJETIVOS 4. MÉTODOS 5. RESULTADOS 6. CONCLUSIONES
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Introducción § Nobel en Química 2008 (O. Shimomura, M. Chalfie, R.Y. Tsien)
v LA PROTEÍNA VERDE FLUORESCENTE “GFP”
APLICACIONES§ Biotecnología§ Medicina§ Biologíacelular
Aequorea victoria
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v LA INGENIERÍA GENÉTICA: CLONACIÓN DEL GEN DE LA GFP EN E. COLI TÉCNICAS BIOTECNOLÓGICAS q Lasendonucleasasderestricciónylosvectoresdeclonación:plásmidosq LatecnologíadelADNrecombinante.q Latransformaciónbacteriana.
Marco teórico
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Objetivos • TransformarlasbacteriasE.coliHB101conelplásmidorecombinantepGLOquecontieneelgendelaGFPydeterminarlaeficienciadetransformación.
• SeleccionarunacoloniabacterianatransformadaypurificarelplásmidopGLOutilizandominicolumnasdegeldesílice.
• Analizarelplásmidopurificadomedianteelectroforesisengeldeagarosaeidentificarlasconformacionessuperenrolladasyrelajadasdelosplásmidos.
• DeterminareltamañodelgendelaGFPmediantedigestióndelplásmidopGLOconlaendonucleasaderestricciónHindIII.
• InducirlaexpresiónlaproteínaGFPmediantelaactivaciónelpromotorpBADconarabinosaydeterminarlamasamoleculardelaGFPmedianteelectroforesisengeldepoliacrilamidaSDS.
• Analizarelefectodeladesnaturalizaciónsobrelaestabilidaddelcromóforoysobrelamovilidadelectroforética.
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Métodos
CULTIVODELASBACTERIASA37ºCdurante14h
Ø Resistencia a Ampicilina Ø Expresión de GFP: fluorescencia verde
v TRANSFORMACIÓNDEE.COLICONPGLO
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Métodos v PURIFICACIÓN DEL PLÁSMIDO PGLO
� Lisisalcalina.
� Neutralización.
� Recuperacióndelsobrenadantefijadoalamembranadegeldesílice.
� Elución.
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A = C x Ɛ x l
ü Cuantificarü AnalizarGenGFP
Métodos v DETERMINACIÓN ESPECTROFOTOMÉTRICA DE LA CONCENTRACIÓN DEL PLÁSMIDO
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Métodos
v DIGESTIÓNDELPLÁSMIDOCONENZIMASDERESTRICCIÓNYANÁLISISELECTROFORÉTICOENGELDEAGAROSA
v Tinción del ADN con un compuesto fluorescente (GelRed). Las bandas se observan con luz uv
Ø LasmuestrasdeADNsedepositanenlospocillosdelgel.
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v EXPRESIÓNDELAPROTEÍNAGFP:ANÁLISISELECTROFORÉTICO ENGELDEPOLIACRILMIDA-SDS(SDS-PAGE)
E. coli-pGlO No inducida
(-Ara)
E. coli-pGlO Inducida
(+Ara)
Tinción Luz uv
+SDS / + DTT
TRANSFORMACIÓN CON PGLO
PREPARACIÓN DE MUESTRAS: SDS-PAGE
ANÁLISIS DEL RESULTADO
Métodos
Ø TINCIÓNDELGELCONAZULCOOMASSIE
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v ANÁLISIS DE LA TRANSFORMACIÓN DE E. COLI CON PGLO
Resultados
Bacteriassintransformar(-pGLO)
Bacteriastransformadas(+pGLO)
+amp-ara +amp+ara
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Eficiencia de transformación =CFU ( nº total colonias)/ cantidad de pGLO (�g)
Luz ultravioleta 400nm
40X
v CÁLCULODELAEFICIENCIADETRANSFORMACIÓN
v COLONIASOBSERVADASALMICROSCOPIOÓPTICOINVERTIDO
µl sembrados en placa
µg de plásmido
Nº de colonias
Eficiencia (cfu/µg)
10 µl 0,15686 µg
73 4,65x103
Resultados
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Resultados
• Concentración:(�g/ml)=(A260)50�g/mlxfactordedilución• Rendimiento:• (�g)=�pGLO�xVolumentotal
v ANÁLISIS DE LA PURIFICACIÓN DEL PLÁSMIDO
Muestras
A260-A320
A280-A320 Concentració
n (mg/ml) Rendimiento
Rendimiento total
Tubo 1
Elución 1
0,0162
0,0155 0,155 16,2 21,3 µg Elución
2 0,005
1 0,0047 0,047 5,1
Tubo 2
Elución 1
0,0225
0,0211 0,211 22,5 31,5 µgElución
2 0,009 0,0071 0,071 9
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v ANÁLISIS DEL PLASMIDO PGLO MEDIANTE ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA
PGlo
/Hin
dIII
564 831 947
1375 1584 1904 2027
3520 4268 4973
Pb
Patr
ones
Patr
ones
PGlo
RLS
PGLOLineal
GenGFP
Relajado
Lineal
Superenrollado
Resultados
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Resultados v CÁLCULO DEL TAMAÑO DEL GEN DE LA GFP
pGLO
/Hin
dIII
pGLO lineal
Gen GFP
Electroforesis en gel de agarosa 0,8 %
y=-1,8938x+4,3443
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9
LogPb
RF
cm banda RF log Pb Tamaño (Pb)
GFP 6,3 0,808 2,849 706
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Resultados
1 2 3 4 P 1 2 3 4
KDa
66 54 37
29
20
- + - + Ara - + - + 22ºC 100ºC 22ºC 100ºC
A. Azul Coomassie B. Luz uv (400nm)
29 KDa
E.Coli+pGLO+ARA-ARA
ELECTROFORESISENGELDEPOLIACRILAMIDA-SDS
DESNATURALIZACIÓN
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v DETERMINACIÓN DEL PM DE LA GFP
M P
66 54 37
29
20
KDa
y=-0,8486x+1,921
0,000
0,200
0,400
0,600
0,800
1,000
1,200
1,400
1,600
1,800
2,000
0,000 0,100 0,200 0,300 0,400 0,500 0,600 0,700 0,800
LogKDa
RF
ElectroforesisenSDS-PAGE
cmbanda RF logKdaPesomolecular
(KDa)
GFP 5,9 0,571 1,436 ≈27
Resultados
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• LabacteriaE.ColiHB101sehatransformadoconelplásmidopGLOconunaeficienciamuyaltaysehanobtenidocoloniasfluorescentes.
• ElplásmidoPGLOsehapurificadoyanalizadomedianteelectroforesisengeldeagarosaysehanobtenidolasbandascaracterísticasdelasconformacionesrelajada,linealysupenrollada.
• ElgendelaGFPsehacaracterizadomedianteladigestióndelplásmidopGLOconHindIIIyseobtenidounabandacuyotamañocorrespondea706pb
• LaproteínaGFPexpresadaenpresenciadearabinosasehaanalizadomedianteelectroforesis,obteniéndoseunabandaquecorrespondeaunaMasamolecularde27kda.
• SehainvestigadoelefectodeladesnaturalizaciónconDTTySDSsobrelaestabilidaddelcromóforoysehaobservadoquelafluorescenciadesaparececuandolaproteínasesometeadesnaturalizacióntérmicaa100ºC.
Conclusiones