Dissertação de mestrado 1. INTRODUÇÃO 1.1 – O Arroz (Oryza sativa L.) 1.1.1 – Origem e importância do arroz Diversos historiadores e cientistas apontam o sudeste da Ásia como o local de origem do arroz (EMBRAPA ARROZ E FEIJÃO, 2008). Os dados que culminaram em tal conclusão foram, inicialmente, publicados por NAKAGAHRA e HAYASHI, em 1977. Neste trabalho, análises sobre variações nos genótipos de isoenzimas em variedades nativas de arroz mostraram que o centro da diversidade genética encontrava-se na área de Assam, na Índia, e Yunnan, na China (NAKAGAHRA e HAYASHI, 1977). A figura ao lado ilustra a origem e a possível rota de difusão dos diferentes tipos de arroz presentes na Ásia, baseado na Teoria Centro do Gene. Porém, bem antes de qualquer evidência histórica, o arroz foi, provavelmente, o principal alimento e a primeira planta cultivada na Ásia. As mais antigas referências ao arroz são encontradas na literatura chinesa, há cerca de 5.000 anos. (EMBRAPA ARROZ E FEIJÃO, 2008). National Institute of Crop Science (http://www.nics.go.kr/english/eng_index.htm) Alguns autores apontam o Brasil como o primeiro país a cultivar esse cereal no continente americano. Consta que integrantes da expedição de Pedro Álvares Cabral, após uma peregrinação por cerca de 5 km em solo brasileiro, traziam consigo amostras de arroz, confirmando registros de Américo Vespúcio que trazem referência a esse cereal em grandes áreas alagadas do Amazonas. A prática da rizicultura no Brasil, de forma organizada e racional, aconteceu em meados do século XVIII e daquela época até a metade do século XIX, o país foi um grande exportador de arroz (EMBRAPA ARROZ E FEIJÃO, 2008). Lourenço, G. F. (2009) Dissertação de mestrado – LBT / CBB / UENF 1
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Dissertação de mestrado
1. INTRODUÇÃO
1.1 – O Arroz (Oryza sativa L.)
1.1.1 – Origem e importância do arroz
Diversos historiadores e cientistas apontam o sudeste da Ásia como o
local de origem do arroz (EMBRAPA ARROZ E FEIJÃO, 2008). Os dados que
culminaram em tal conclusão foram, inicialmente, publicados por NAKAGAHRA e
HAYASHI, em 1977. Neste trabalho, análises sobre variações nos genótipos de
isoenzimas em variedades nativas de arroz
mostraram que o centro da diversidade
genética encontrava-se na área de Assam, na
Índia, e Yunnan, na China (NAKAGAHRA e
HAYASHI, 1977). A figura ao lado ilustra a
origem e a possível rota de difusão dos
diferentes tipos de arroz presentes na Ásia,
baseado na Teoria Centro do Gene. Porém,
bem antes de qualquer evidência histórica, o
arroz foi, provavelmente, o principal alimento e a primeira planta cultivada na Ásia.
As mais antigas referências ao arroz são encontradas na literatura chinesa, há cerca
de 5.000 anos. (EMBRAPA ARROZ E FEIJÃO, 2008).
National Institute of Crop Science (http://www.nics.go.kr/english/eng_index.htm)
Alguns autores apontam o Brasil como o primeiro país a cultivar esse
cereal no continente americano. Consta que integrantes da expedição de Pedro
Álvares Cabral, após uma peregrinação por cerca de 5 km em solo brasileiro,
traziam consigo amostras de arroz, confirmando registros de Américo Vespúcio que
trazem referência a esse cereal em grandes áreas alagadas do Amazonas. A prática
da rizicultura no Brasil, de forma organizada e racional, aconteceu em meados do
século XVIII e daquela época até a metade do século XIX, o país foi um grande
exportador de arroz (EMBRAPA ARROZ E FEIJÃO, 2008).
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Atualmente, o arroz constitui uma das mais importantes culturas do
mundo, sendo a fonte primária de alimento para mais da metade da população
mundial. Para tanto, a rizicultura ocupa, anualmente, cerca de 154 milhões de
hectares, o que corresponde a 11% das terras cultivadas no mundo. Mais de 90% de
todo o arroz produzido no mundo é crescido e consumido na Ásia, onde vive 60% da
população do planeta (KHUSH, 2005).
De acordo com as estimativas da Organização das Nações Unidas (ONU),
a população mundial passará de 6 bilhões em 2000 para 8 bilhões em 2025 (KHUSH,
2005). Com o aumento populacional, a produção de arroz deverá aumentar 40% até
2030 para satisfazer a crescente demanda dos países consumidores do grão. Para
que seja alcançado o objetivo de produzir mais arroz, é necessária a obtenção de
variedades com um maior potencial de rendimento e melhor estabilidade do
rendimento. Em prol disso, várias estratégias têm sido empregadas, incluindo
hibridação convencional e procedimentos de seleção, criação de ideotipos, criação
de híbridos, e engenharia genética (KHUSH, 2005).
1.1.2 – O arroz na era da genômica
O início do século XXI marca a era da genômica funcional. Este evento é
devido, principalmente, ao enorme fluxo de informação gerado pela decodificação do
genoma de muitos organismos de vida livre (BERNAL et al., 2001). Haemophilus
influenzae foi o primeiro organismo cujo genoma foi completamente seqüenciado,
em 1995 (FLEISCHMANN et al., 1995). O impressionante progresso nessa área levou
Philip H. Abelson a chamar a genômica – a análise da estrutura do genoma e da
função do gene no contexto do conjunto genético completo de um organismo – de “a
terceira revolução tecnológica” (ABELSON, 1998). Até o início de 2006, o
seqüenciamento dos genomas de 216 organismos já havido sido concluído e
publicado, e outros 965 genomas completos estavam a caminho, sendo 524 de
organismos procariotos e 441 de eucariotos (AGRAWAL e RAKWAL, 2006).
O primeiro “rascunho” da seqüência do genoma do arroz foi anunciado
pela gigante empresa agrícola Monsanto em 2000 (BARRY, 2001). Em 2002, outra
conquista notável foi a conclusão das “seqüências-rascunho” do genoma de dois dos
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principais cultivares de arroz, o cultivar Nipponbare, do tipo japonica (GOFF et al.,
2002) e o cultivar 93-11, do tipo indica (YU et al., 2002).
O completo seqüenciamento do genoma do arroz foi concluído no ano de
2005 (INTERNATIONAL RICE GENOME SEQUENCING PROJECT, 2005), e a partir do
número total de loci expressos e clones de cDNAs inteiros (FL-cDNA) não mapeados
foi estimado que o número de genes de arroz seria de, aproximadamente, 32.000
(RICE ANNOTATION PROJECT, 2007). Entre esses genes, 28.540 são candidatos a
genes que codificam para proteínas. Cerca de 25% (7.189 loci) das potenciais
regiões abertas de leitura (ORFs), tiveram suas funções designadas por buscas
através de BLASTX (RICE ANNOTATION PROJECT, 2007). Porém abordagens
adicionais são necessárias para a elucidação das funções dos genes
remanescentes (NAKAMURA et al., 2007).
Com o intuito de acelerar a identificação e a caracterização dos genes de
arroz com funções até agora desconhecidas, vários recursos têm sido produzidos
(LIN et al., 1998; EBITANI et al., 2005). A infra-estrutura para as análises de
bioinformática em arroz (revisada por SASAKI et al., 2005), incluindo bancos de
dados integrados como RAP-DB (TANAKA et al., 2008; OHYANAGI et al., 2006; RICE
ANNOTATION PROJECT, 2007), TIGR Rice Genome Annotation Database (OUYANG et
al., 2007), BGI-RIS (ZHAO et al., 2004) e MOsDB (KARLOWSKI et al., 2003), tem sido
continuamente desenvolvida e tais ferramentas encontram-se publicamente
disponíveis. Os FL-cDNAs, agrupados em 28.469 clones não-redundantes (RICE
FULL-LENGTH CDNA CONSORTIUM, 2003), e o banco de dados de proteômica em
arroz (KOMATSU, 2005) também apresentam grande potencial para promover a
descoberta e a elucidação da função gênica (NAKAMURA et al., 2007).
A quantidade de informação gerada a partir destes recursos,
inevitavelmente, levará a um ritmo sem precedentes (e eficiente) na análise e
dedução da função gênica em um curto período de tempo, no nível de transcrito
(transcriptômica: análise paralela da expressão do gene), proteína (proteômica:
análise do polipeptídeo complementar), e metabólito (metabolômica: análise paralela
dos metabólitos primários e secundários), que são os pilares integrais da genômica
funcional (AGRAWAL e RAKWAL, 2006).
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1.2 – Regulação gênica em resposta a estresses ambientais em plantas
1.2.1 – Estresses abióticos
Estresses abióticos, tais como seca, salinidade, temperaturas extremas,
toxicidade química e estresse oxidativo, desencadeiam uma série de mudanças
moleculares, bioquímicas, fisiológicas e morfológicas que afetam negativamente o
crescimento e a produtividade das plantas (WANG et al., 2001). Por esse motivo, este
tipo de estresse ambiental é considerado grande ameaça para agricultura (GAO et
al., 2007), sendo responsável por reduzir em até 50% os rendimentos anuais
(BOYER, 1982; BRAY et al., 2000). Porém, durante a evolução, as plantas
desenvolveram sofisticados mecanismos para perceber sutis mudanças nas
condições de crescimento e desencadear respostas necessárias para sua
adaptação às diversas condições ambientais (GAO et al., 2007).
Seca, salinidade, temperaturas extremas e estresse oxidativo estão
geralmente interconectados, e devem induzir danos celulares similares. Por
exemplo, seca e/ou salinização são manifestados, inicialmente, como estresse
osmótico, resultando na interrupção da homeostase e da distribuição iônica na célula
(SERRANO et al., 1999; ZHU, 2001a). O estresse oxidativo, que freqüentemente está
associado aos estresses de alta temperatura, salinidade ou seca, deve causar
desnaturação de proteínas funcionais e estruturais (SMIRNOFF, 1998).
Conseqüentemente, esses diversos estresses ambientais ativam vias de sinalização
e respostas celulares similares (SHINOZAKI e YAMAGUCHI-SHINOZAKI, 2000; KNIGHT e
KNIGHT, 2001; ZHU, 2001b; ZHU, 2002), tais como a produção de proteínas de
estresse, indução de antioxidantes e acúmulo de solutos compatíveis (VIERLING e
KIMPEL, 1992; ZHU et al., 1997; CUSHMAN e BOHNERT, 2000). A figura 1 ilustra a
complexa resposta da planta ao estresse abiótico, que envolve muitos genes e
mecanismos bioquímicos e moleculares. Os mecanismos de controle molecular da
tolerância ao estresse abiótico são baseados na ativação e regulação de genes
específicos relacionados ao estresse (WANG et al., 2003). Esses genes englobam
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três principais categorias: (1) genes envolvidos nas cascatas de sinalização, tais
como MYC, MAP kinases e SOS kinase (SHINOZAKI e YAMAGUCHI-SHINOZAKI, 1997;
MUNNIK et al., 1999; ZHU, 2001b), fosfolipases (CHAPMAN, 1998; FRANK et al., 2000),
e fatores de transcrição como HSF, e as famílias CBF/DREB e ABF/ABAE
(STOCHINGER et al., 1997; SCHÖFFL et al., 1998; CHOI et al., 2000; SHINOZAKI e
YAMAGUCHI-SHINOZAKI, 2000); (2) genes que funcionam diretamente na proteção de
membranas e proteínas, como proteínas heatshock (HSPs) e chaperonas, proteínas
LEA (late embryogenesis abundant) (VIERLING, 1991; INGRAM e BARTELS, 1996;
THOMASHOW, 1998; THOMASHOW, 1999; BRAY et al., 2000), osmoprotetores, e
removedores de radicais livres (BOHNERT e SHEVELEVA 1998); e (3) genes envolvidos
na absorção e transporte de água e íons, como aquaporinas e transportadores de
íons (MAUREL, 1997; SERRANO et al., 1999; TYERMAN et al., 1999; ZIMMERMANN e
SENTENAC, 1999; BLUMWALD, 2000).
Portanto, para manter o crescimento e a produtividade, as plantas devem
adaptar-se às condições do estresse ativando mecanismos específicos de
tolerância. Dessa forma, a modificação de plantas visando aumentar a tolerância
está baseada, principalmente, na manipulação desses genes, que protegem e
mantêm a função e a estrutura dos componentes celulares (WANG et al., 2003).
1.2.2 – Estresses bióticos
Estresses bióticos podem ser causados por uma vasta gama de potenciais
patógenos. Fungos, bactérias, nematódeos e insetos interceptam os produtos da
fotossíntese produzidos pelas plantas, e os vírus utilizam a maquinaria de replicação
a custo do hospedeiro. Porém ao longo da evolução, as plantas desenvolveram
sofisticados mecanismos para perceber tais ataques, e traduzir essa percepção em
uma resposta adaptativa (DANGL e JONES, 2001).
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Transporte de água e íons (aquaporinas e
transportadores de íons)
Função chaperonas(Hsp, SP1, LEA, COR)
Osmoproteção(prolina, glicina-
betaína)
Detoxificação(SOD, PX)
Controle da transcrição
Detecção, percepção e transdução de sinal
Osmossensores, Enzimas de clivagem de fosfolipídios, Mensageiros secundários, MAP kinases, Sensores de Ca2+, Proteínas kinases
Rompimento da homeostase iônica e osmótica; danificação
de proteínas funcionais e estruturais e membranas
Fatores de transcrição(Ex.: CBF/DREB, ABF, HSF, bZIP, MYC/MYB)
Fatores de transcrição(Ex.: CBF/DREB, ABF, HSF, bZIP, MYC/MYB)
Ativação de genesAtivação de genes
Re-estabelecimento da homeostase celular, proteção estrutural e funcional de proteínas e
membranas
Tolerância ao estresse ou Resistência
Mecanismos de resposta a estresse
Figura 1. A complexidade da resposta da planta ao estresse abiótico. Estresses primários, como seca, salinidade, frio, calor e poluição química, estão normalmente interconectados, e causam dano celular e estresses secundários, como estresse oxidativo e osmótico. Os sinais iniciais de estresse (por exemplo, efeitos osmóticos e iônicos, e mudanças na fluidez da membrana) disparam um processo de sinalização em cadeia e controles de transcrição que ativam mecanismos de resposta ao estresse a fim de restabelecer a homeostase e proteger e reparar proteínas e membranas defeituosas. Uma resposta inadequada a um ou muitos passos na sinalização e ativação do gene deve resultar em mudanças irreversíveis de homeostase celular e na destruição de proteínas funcionais e estruturais, e membranas, levando a morte celular. Adaptação de WANG et al., 2003.
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A percepção envolve a detecção de moléculas do patógeno ou, algumas
vezes, da própria planta ferida. Essas moléculas, chamadas elicitores, são divididas
em dois grupos. O primeiro grupo corresponde aos elicitores intrínsecos do
organismo invasor, tais como os fragmentos de chitina da parede celular de fungos
ou a proteína flagelina que compõem a cauda flagelar de bactérias. Receptores para
esse tipo de elicitores estão presentes na membrana plasmática das plantas. O
segundo grupo corresponde aos produtos, geralmente proteínas, que são
codificadas por genes de avirulência (Avr) do patógeno. Esses produtos podem ser
secretados no espaço intercelular ou injetados diretamente na célula via um sistema
de secreção do tipo-III. Eles são reconhecidos por plantas que expressam o
correspondente gene de resistência a doença (gene R) (PECK, 2003).
Muitos dos mecanismos de defesa são ativados dentro de minutos após a
percepção e funcionam para matar o patógeno ou limitar sua dispersão na planta
(DANGL e JONES, 2001). A morte celular programada no local da invasão é um
mecanismo comum de defesa contra patógenos biotróficos e insetos sugadores, que
dependem de células vivas do hospedeiro para obter nutrientes. No entanto, a morte
celular é um pré-requisito para o crescimento de patógenos necróficos, uma vez que
estes se alimentam de tecidos mortos. É, portanto, essencial que as plantas ativem
a resposta de defesa apropriada de acordo com o tipo de patógeno (SPOEL e DONG,
2008). Nesse contexto, a resistência mediada por ácido salicílico (SA) é efetiva
contra biotrófos, enquanto respostas mediadas por ácido jasmônico (JA) ou etileno
(ET) são predominantemente contra necrótrofos ou insetos herbívoros (GLAZEBROOK,
2005).
De forma intrigante, alguns patógenos são capazes de induzir múltiplas
moléculas sinalizadoras e fitormônios. Em tais casos, a comunicação entre essas
vias de sinalização permite que a planta priorize a resposta de defesa em detrimento
de suas funções celulares normais (SPOEL e DONG, 2008). Como uma estratégia de
virulência, muitos patógenos desenvolveram mecanismos que mimetizam hormônios
e interferem na resposta imune do hospedeiro. As plantas, por sua vez, utilizam a
comunicação das vias como um mecanismo direto de defesa contra a perturbação,
desencadeada pelo patógeno, na sinalização hormonal (SPOEL e DONG, 2008).
Diversos estudos demonstraram que os fitormônios, tais como SA, JA, ET
e ácido abscísico (ABA), que são moléculas endógenas de baixo peso molecular,
participam na resposta contra ambos os estresses ambientais através de ações
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sinérgicas e antagônicas, sugerindo uma comunicação cruzada entre as vias de
sinalização dos estresses bióticos e abióticos (BOSTOCK, 2005; LORENZO e SOLANO,
2005; MAUCH-MANI e MAUCH, 2005). Adicionalmente, diversos resultados de análises
de transcriptoma em larga-escala utilizando a tecnologia de microarray de DNA
suportam, fortemente, a existência de uma comunicação cruzada entre as vias de
sinalização dos estresses bióticos e abióticos (SCHENK et al., 2000; CHEONG et al.,
2002; SEKI et al., 2002; NARUSAKA et al., 2003; DAVLETOVA et al., 2005). Nos dois
tipos de estresse ambiental, conjuntos de genes diferentes, porém sobrepostos, são
regulados. Dessa forma, as elaboradas vias de sinalização, com freqüentes pontos
de intersecção, permitem que as plantas regulem tanto a tolerância a estresses
bióticos quanto a resistência a doenças (FUJITA et al., 2006). A figura 2 ilustra os
pontos de convergência molecular entre as vias de sinalização dos estresses
bióticos e abióticos (FUJITA et al., 2006).
1.3 – Regulação gênica em resposta a estresses ambientais em arroz
O arroz carrega características únicas de tolerâncias e susceptibilidades a
estresses abióticos quando comparados a outras culturas. O arroz é capaz de tolerar
solos encharcados e submersão em níveis que matariam outras culturas, é
moderadamente tolerante a salinidade e à acidez do solo, mas é altamente sensível
à seca e frio. Muito embora a resposta do arroz ao estresse seja superior à resposta
de outras culturas, contudo, muitos ambientes onde o arroz é cultivado demandam
ainda maiores níveis de tolerância que aqueles encontrados na maioria dos
germoplasmas (LAFITTE et al., 2004). Em regiões tropicais, o arroz é cultivado em
climas de monção, estando sujeito à submersão intermitente, seca e, em regiões
costeiras, salinidade. O arroz também é crescido nos trópicos, durante a estação
seca, onde a adequada irrigação está disponível, e a cultura fica exposta às baixas
temperaturas na germinação e altas temperaturas na época de floração. Nas regiões
temperadas, onde virtualmente todo o arroz é irrigado, a baixa temperatura é o
principal estresse abiótico que afeta a produção (LAFITTE et al., 2004). Já nos solos
não irrigados nos trópicos úmidos, a cultura é afetada pelo déficit de água, acidez do
solo, e deficiência de fósforo, nitrogênio e zinco (WHITE e ZASOSKI, 1999).
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Figura 2. Pontos de convergência nas vias de sinalização dos estresses bióticos e abióticos. O esquema simplificado ilustra as vias de sinalização
desencadeadas pelos estresses abióticos e bióticos, bem como os pontos de
comunicação entre estas vias. Tal comunicação permite que a planta regule
tanto a tolerância a estresse quanto a resistência a doenças. Figura adaptada de
FUJITA et al., 2006.
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Os conhecimentos acerca de como os genes de arroz respondem às
condições adversas vêm aumentando diariamente. Muitos estudos relataram
mudanças na expressão de genes individuais quando o arroz é desafiado tanto por
estresses bióticos quanto abióticos (LAFITTE et al., 2004). Tais mudanças incluem a
regulação de diversos genes, como MAP kinases (AGRAWAL et al., 2003), genes
DREB (DUBOUZET et al., 2003), proteína-kinase dependente de cálcio (SAIJO et al.,
2001), uma endo-1,3-beta-glucanase (AKIYAMA e PILLAI, 2001), um fator de
elongação da tradução (LI ZI e CHEN SHOU, 1999) e glutathiona redutase (KAMINAKA
et al., 1998). Estudos de transformação demonstraram que alterando a expressão de
diferentes genes de distintas vias a resposta do arroz ao déficit de água e
desidratação pode ser afetada. Tais genes incluem aqueles associados com
diversas funções, tais como absorção de água (aquaporinas) (MARTRE et al., 2002),
sinalização (kinases) (SAIJO et al., 2001; LIU et al., 2003), integridade da membrana
(proteínas LEA) (XU et al., 1996; ROHILA et al., 2002; BABU et al., 2004), e
metabolismo de carboidrato (TPS) (JANG et al., 2003). Adicionalmente, evidências
que se acumularam ao longo da última década mostraram que o arroz, assim como
outras plantas, sintetiza lectina(s) em resposta a situações de estresse como seca,
alta concentração de sal, ferimento, ou tratamento com alguns fitormônios (VAN
DAMME et al., 2008).
1.4 – O gene salT e a proteína SALT
Em 1990, CLAES e colaboradores identificaram e caracterizaram o gene
salT, bem como seu produto, a proteína SALT. Nesta ocasião, a SALT, uma proteína
de 145 resíduos de aminoácidos, ponto isoelétrico (pI) de 5.5 (CLAES et al., 1990), e
peso molecular de 14,5 kDa (CLAES et al., 1990; BRANCO et al., 2004), foi
caracterizada como uma proteína induzida por estresse salino em arroz (CLAES et
al., 1990). Posteriormente, foi demonstrado que a expressão desta proteína não está
restrita a resposta a estresses ambientais, sugerindo, desta forma, sua participação
num mecanismo global de resposta da planta (DE SOUZA FILHO et al., 2003).
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Evidências bioquímicas demonstraram, ainda, que a proteína SALT exibe
atividade lectina de ligação à mannose. Adicionalmente, foi mostrado que a atividade
lectina é dependente de uma associação não-covalente de dois monômeros de 14,5
kDa (HIRANO et al., 2000; ZHANG et al., 2000). Por se tratar de uma lectina com
apenas um único domínio Jacalina, a proteína SALT pode ser considerada uma
hololectina (lectinas que contém apenas domínios de ligação ao carboidrato), mais
especificamente uma merolectina – lectinas compostas de um único domínio (VAN
DAMME et al., 2008), como mostra a figura 3.
Microarrays de DNA constituem uma das mais poderosas ferramentas
para analisar rapidamente a expressão gênica sob diversas condições ambientais,
bem como em diferentes tecidos de uma planta (SUDO et al., 2008). Com o início dos
projetos de seqüenciamento do arroz, surgiram diversos projetos de microarrays em
arroz e, até 2004, mais de 600 experimentos em 25 condições fisiológicas já haviam
sido realizados (TYAGI et al., 2004).
A proteômica, outra ferramenta de extrema importância, tornou-se uma
metodologia essencial para a análise em larga-escala de proteínas em muitos
campos da biologia de plantas (PANDEY e MANN, 2000). Assim, combinada à
disponibilidade de dados de seqüências do genoma, ela tem aberto enormes
possibilidades para identificar o grupo total de proteínas expressas, assim como
mudanças no perfil de expressão, durante o crescimento e desenvolvimento e em
resposta a estímulos bióticos e abióticos (YANG et al., 2005). Neste contexto,
diversos trabalhos têm se dedicado à construção de proteomas e caracterização
funcional das proteínas expressas em arroz, seja em tecidos, tais como
folha,embrião, endosperma, raiz, caule, broto e calos (KOMATSU et al., 1993; ZHONG
et al., 1997; KOMATSU et al., 1999a,b; TSUGITA et al., 1994; SHEN et al., 2002; IMIN et
al., 2001; KOLLER et al., 2002; TANAKA et al., 2004a), ou em organelas, como
complexo de Golgi, mitocôndria, e outros compartimentos celulares (MIKAMI et al.,
2001; HEAZLEWOOD et al., 2003; TANAKA et al., 2004b).
A expressão do gene salT e o acúmulo da proteína SALT puderam ser
detectados em inúmeros destes trabalhos, tanto naqueles de análise de microarray e
northern blotting, quanto nos de estudos proteômicos e western blotting, que
analisaram diversos cultivares de arroz sob diferentes condições fisiológicas e entre
diferentes tecidos. Sendo assim, a tabela 1 se refere aos trabalhos encontrados,
bem como os estresses e condições de cultivos, onde houve a expressão do gene
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Figura 3. Ilustração da lectina SALT e seu domínio Jacalina. O esquema, gerado
através do banco de dados de Domínio Conservado (Conserved Domain Database
(NCBI): MARCHLER-BAUER et al., 2007 – acessado em 2008) ilustra o único domínio
Jacalina presente na lectina SALT, caracterizando-a como uma merolectina de ligação à
mannose da família das Jacalinas.
salT, enquanto a tabela 2 lista os trabalhos, estresses e condições de cultivo onde a
lectina SALT foi encontrada. Juntas, as tabelas 1 e 2 reúnem todos os trabalhos
publicados até 2008 que apontam a expressão do gene salT, bem como o acúmulo
da lectina SALT, quando plantas de arroz são submetidas à diversos tipos de
estresses ambientais, tais como salinidade (sais MS, NaCl, KCl), seca, calor, frio,
metais pesados (arsênico, cobre), baixos níveis de nitrogênio, ferimentos,
fitormônios (ABA, JA, SA e ET), entre outros.
Em estudos acerca da região promotora do gene salT, GARCIA (1993) revelou
a presença de um íntron de 609 pb, nomeado íntron salT, situado entre 1117 pb e
1725 pb. Adicionalmente, foi detectada a presença de elementos de transposição
das famílias Castaway e Stowaway na região 5’ flanqueadora do gene salT.
Somente nove pares de bases separam tais transposons, presentes na região
promotora deste gene (BUREAU e WESSLER, 1994; NELSON et al., 1994; BUREAU et al.,
1996). Desta forma, entre o elemento móvel Stowaway e o íntron salT encontra-se
uma região que compreende 256 pb. A Figura 4 mostra um esquema ilustrativo do
promotor do gene salT.
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Íntron salTRegião 256 pbCastaway Stowaway
1 332 695 705 860 1116 1725
Íntron salTRegião 256 pbCastaway Stowaway
1 332 695 705 860 1116 1725
Figura 4. Esquema ilustrativo do promotor do gene salT. A região de 256 pb está
compreendida entre 861 pb e 1116 pb e o íntron salT localiza-se entre 1117 pb e 1725
pb. Castaway e Stowaway são elementos de transposição presentes na região
promotora salT.
Uma característica predominante na regulação da transcrição é a ligação de
proteínas regulatórias, os chamados fatores de transcrição, a sítios de ligação ao
DNA conhecidos como sítios de ligação de fatores de transcrição ou elementos
regulatórios. A identificação computacional desses sítios de ligação ao DNA através
da análise de seqüências de DNA em banco de dados tem sido, na última década, a
principal técnica utilizada na elucidação de vias regulatórias da transcrição
(THOMPSON et al., 2003).
Os elementos regulatórios são pequenos motivos conservados de
aproximadamente 5 a 20 nucleotídeos. A detecção desses motivos no promotor não
é precisa, porque estatisticamente espera-se encontrar essas pequenas seqüências
aleatoriamente a cada poucas centenas de pares de bases. Portanto, o principal
problema consiste em distinguir os elementos regulatórios falsos dos verdadeiros
(BLANCHETTE & SINHA, 2001). Comparada aos motivos desconhecidos, a detecção de
motivos conhecidos é mais favorável e consiste no rastreamento de seqüências de
DNA em bancos de dados especializados como TRANSFAC (WINGENDER et al.,
1996) e TFD (GHOSH, 2000), bem como em bancos de dados específicos para
plantas como OSIRIS (MORRIS et al., 2008), PLACE (HIGO et al., 1999) e PlantCARE
(LESCOT et al., 2002).
Lourenço, G. F. (2009) Dissertação de mestrado – LBT / CBB / UENF 13
Dissertação de mestrado
O OSIRIS (http://www.bioinformatics2.wsu.edu/cgi-bin/Osiris/cgi/home.pl),
escolhido para as análises realizadas nesse trabalho, é um banco de dados
integrados de promotores exclusivamente de O. sativa que contém, além de
diversas outras informações, seqüências de promotores, baseadas na anotação do
genoma do arroz, e sítios de ligação para fatores de transcrição já previamente
descritos. Com a integração de diversas ferramentas, o website OSIRIS fornece
uma compreensiva plataforma para análises de promotores, permitindo ao usuário
visualizar sítios de ligação para fatores de transcrição em múltiplos promotores, além
de outros tipos de análises (MORRIS et al., 2008). Portanto, análises in silico têm
demonstrado ser uma alternativa privilegiada de aumentar o conhecimento sobre o
promotor de forma mais rápida e com menores custos, especialmente em plantas
(ROMBAUTS et al., 2003). Nesse sentido, a análise in silico da região promotora do
gene salT torna-se de extrema relevância na elucidação dos possíveis elementos
regulatórios em cis presentes na mesma.
Além disso, outro ponto fundamental no estudo da regulação gênica
consiste em avaliar a influência do íntron do gene salT na regulação da transcrição,
já que vários trabalhos sugerem a participação de íntrons na expressão de genes.
Lourenço, G. F. (2009) Dissertação de mestrado – LBT / CBB / UENF 14
4.1 – Estudo da influência dos elementos de transposição Castaway e Stowaway sobre a atividade do promotor do gene salT de O. sativa
4.1.1 – Detecção dos transposons Castaway e Stowaway na região promotora do gene salT dos diferentes cultivares de arroz através de amplificações por PCR
A presença de elementos de transposição na região promotora do gene
salT pode ser sugerida a partir de diferenças no tamanho dos promotores de
diferentes cultivares. Desta forma, a amplificação através de PCR do promotor
inteiro, e de partes dele, consiste em uma eficiente estratégia para avaliar e
comparar esta região promotora de cada cultivar.
Com tal finalidade, os ensaios iniciais dedicaram-se à germinação e cultivo
de plantas dos cultivares de arroz Cica 8, Guarani, IAC 201, IAC 4440, Metica-1,
Minami Hata Mochi e Taichung Native 1. Posteriormente, foi realizada a extração do
DNA genômico dos diferentes cultivares. As amostras obtidas foram quantificadas
usando o sistema Qubit™ (Invitrogen) e sua integridade foi avaliada em gel de
agarose 1% (dados não mostrados). Os fragmentos correspondentes ao promotor
do gene salT inteiro e à “região de 256 pb + íntron salT” foram amplificados por
PCR, em todos os cultivares, utilizando o DNA genômico extraído como molde e
uma combinação específica de oligonucleotídeos previamente deduzidos. A tabela 3
(Materiais e Métodos) mostra o par de primers utilizado em cada amplificação por
PCR e a figura 5 (Materiais e Métodos) indica o local de anelamento e a direção de
cada primer no promotor do gene salT.
As amostras foram avaliadas em gel de agarose 1%. A figura 6 apresenta
o resultado da análise do promotor salT inteiro. Através desta análise foi possível
verificar que os cultivares de arroz Cica 8, Guarani, IAC 201, IAC 4440 e Metica-1
possuem promotor salT com tamanho em torno de 1200 pb, e que os cultivares
Minami Hata Mochi e Taichung Native 1 possuem promotores de maior tamanho,
Lourenço, G. F. (2009) Dissertação de mestrado – LBT / CBB / UENF 39
Dissertação de mestrado
com cerca de 1700 pb, sugerindo a presença dos elementos de transposição nos
dois cultivares cujo promotor apresenta maior tamanho. Com o intuito de certificar
que a diferença no tamanho dos promotores não é inerente a diferenças em outras
regiões do mesmo, foi realizada a amplificação do fragmento que corresponde a
“região de 256 pb + íntron salT”. A figura 7 mostra que todos os cultivares de arroz
analisados possuem tal região com o mesmo tamanho.
2 Kb1.650 pb
1 Kb
1 2 3 4 5 6 7 M
2 Kb1.650 pb
1 Kb
1 2 3 4 5 6 7 M
Figura 6. Visualização eletroforética do resultado da amplificação por PCR do promotor do gene salT nos diferentes cultivares de arroz. O fragmento correspondente ao promotor salT
foi amplificado a partir do DNA molde dos sete cultivares. 1 – Cica
Hata Mochi; 7 – Taichung Native 1. M – Marcador de peso
molecular 1 kb Plus DNA Ladder™ (Invitrogen). Todos os géis de agarose mostrados no presente trabalho foram corados com brometo de etídio e correspondem à imagens negativas.
Lourenço, G. F. (2009) Dissertação de mestrado – LBT / CBB / UENF 40
Dissertação de mestrado
M 1 2 3 4 5 6 7
850 pb650 pb
M 1 2 3 4 5 6 7
850 pb650 pb
Figura 7. Visualização eletroforética do resultado da amplificação por PCR da região de 256 pb + íntron salT nos diferentes cultivares. O fragmento correspondente à região de
256 pb + íntron salT foi amplificado a partir do DNA molde dos sete
Metica-1; 6 – Minami Hata Mochi; 7 – Taichung Native 1. M –
Marcador de peso molecular 1 kb Plus DNA Ladder™ (Invitrogen).
Lourenço, G. F. (2009) Dissertação de mestrado – LBT / CBB / UENF 41
Dissertação de mestrado
4.1.2 – Análise do nível de indução do gene salT em cultivares de arroz expostos ao estresse salino através de ensaios de PCR em Tempo Real
Para avaliar se a atividade do promotor salT, no que diz respeito à sua
capacidade de induzir a transcrição do gene, possui alguma relação com a
presença/ausência dos elementos de transposição na sua região promotora, o nível
de indução deste gene em bainhas de plantas em condições normais e de estresse
salino foi avaliado através de PCR em Tempo Real (RT-PCR).
Com tal finalidade, os ensaios iniciais dedicaram-se à germinação e cultivo
de plantas de arroz dos cinco cultivares sem os transposons no promotor salT – Cica
8, Guarani, IAC 201, IAC 4440 e Metica-1 – e dos dois cultivares com transposons –
Minami Hata Mochi e Taichung Native 1. Com 21 dias de idade, metade das plantas
de cada cultivar foi submetida ao estresse salino (NaCl 1%) durante 24 h. As
amostras de RNA total extraídas da bainha de plantas em condição normal
(controle) e estressadas foram quantificadas usando o sistema Qubit™ (Invitrogen) e
sua integridade foi avaliada em gel de agarose 1% (dados não mostrados), e
posteriormente, tais amostras serviram de molde para a síntese de cDNA.
Adicionalmente, para a realização do RT-PCR são necessários pares de primers
específicos, previamente deduzidos, para a amplificação do gene salT e do gene
18S, cuja expressão não é alterada em diferentes condições fisiológicas (controle
interno). Tais pares de primers foram submetidos a um teste de especificidade a fim
de garantir a ausência de amplificações inespecíficas (dados não mostrados).
O resultado apresentado pela figura 8 demonstra que os cultivares de
arroz que não possuem a inserção de elementos móveis no promotor salT – IAC
201, IAC 4440 e Metica-1 – e os cultivares que possuem tal inserção – Minami Hata
Mochi e Taichung Native 1 – apresentaram diferentes níveis transcricionais do gene
salT em condições de estresse porém, aparentemente, não há correlação entre a
presença dos elementos de transposição e o perfil transcricional do gene salT em
tais condições. Adicionalmente, foi possível observar que os cultivares, cujos
resultados puderam ser avaliados, apresentam diferentes níveis basais de
transcrição do gene salT, indicando a transcrição deste gene mesmo na ausência do
fator estressante. O cultivar Guarani não apresentou indução da transcrição na
situação de estresse, porém apresentou um alto nível transcricional na situação
normal, e o cultivar Cica 8 foi desconsiderado do presente ensaio devido à um
Lourenço, G. F. (2009) Dissertação de mestrado – LBT / CBB / UENF 42
Dissertação de mestrado
aparente erro nas amostras-controle do controle interno (18S) de uma das réplicas
que inviabilizou tal análise neste cultivar.
0
60
120
180
240
300
360
420
480
540
Guarani IAC 201 IAC 4440 Metica-1 MinamiHataMochi
TaichungNative 1
Nív
el d
e In
duçã
o
Controle Estresse (NaCl 1%)
Figura 8. Análise do nível de indução transcricional do gene salT de arroz através de PCR em Tempo Real das bainhas de diferentes cultivares de arroz. Guarani, IAC 201,
IAC 4440 e Metica-1 – Cultivares cujo promotor do gene salT não possui a inserção dos
elementos de transposição Castaway e Stowaway. Minami Hata Mochi e Taichung Native 1 – Cultivares que não possuem tais elementos de transposição. Os cultivares apresentaram
diferentes níveis transcricionais do gene salT em condições de estresse, mostrando a não
correlação entre a presença dos transposons e o perfil transcricional do gene em estudo.
Lourenço, G. F. (2009) Dissertação de mestrado – LBT / CBB / UENF 43
Dissertação de mestrado
Parte dos tecidos macerados – bainhas foliares de plantas dos diferentes
cultivares de arroz, na situação controle e estresse (NaCl 1%) – que seriam
utilizados para a extração do RNA total, foi reservada para a obtenção de extrato
protéico total. Após quantificação usando o sistema Qubit™ (Invitrogen), as amostras
de proteína foram utilizadas em ensaios de western blotting com a finalidade de
detectar o nível de acúmulo da proteína SALT nas mesmas amostras utilizadas para
a análise de indução da transcrição do gene salT. Interessantemente, os resultados
obtidos (figura 9) demonstram claramente que os níveis basais (controle) e finais
(estresse) da proteína SALT não refletem os níveis de transcrição do gene salT nas
mesmas situações.
1 2 3 4 5 6
7 8 9 10 11 12 13 14
1 2 3 4 5 6
7 8 9 10 11 12 13 14
Figura 9. Ensaio de western blotting utilizando anticorpo monoclonal contra a proteína SALT de diferentes cultivares de arroz. 1, 3, 5, 7, 9, 11 e 13 – Amostras controles dos
cultivares Cica 8, Guarani, IAC 201, IAC 4440, Metica-1, Minami Hata Mochi e Taichung
Native 1. 2, 4, 6, 8, 10, 12 e 14 – Amostras estressadas por NaCl 1% dos cultivares Cica 8,
Guarani, IAC 201, IAC 4440, Metica-1, Minami Hata Mochi e Taichung Native 1. O anticorpo
anti-SALT foi produzido no LBT/CBB/UENF pelo aluno Marcos Vinícius Viana de Oliveira.
‘
Lourenço, G. F. (2009) Dissertação de mestrado – LBT / CBB / UENF 44
Dissertação de mestrado
4.2 – Identificação de sítios regulatórios presentes na região de 256 pb do promotor do gene salT através de análises in silico
Com o objetio de analisar a região de 256 pb quanto à presença de
possíveis elementos regulatórios em cis, o nome referente ao gene salT, baseado no
Projeto de Anotação do Arroz, foi submetido ao banco de dados OSIRIS, que reúne
e analisa promotores contidos no genoma de O. sativa (MORRIS et al., 2008). O fato
relevante inicialmente observado foi a detecção da presença do elemento TATA Box
nesta região na posição indicada pela figura 10. Para fins de confirmação deste
importante dado, a mesma seqüência foi submetida a outros bancos de dados de
elementos regulatórios encontrados em promotores de plantas, PlantCARE (LESCOT
et al., 2002) e PLACE (HIGO et al., 1999), que confirmaram a presença de tal sítio na
posição indicada pelo OSIRIS (dados não mostrados).
De acordo com essa informação, os 53 nucleotídeos a partir do sítio de
início da transcrição foram desconsiderados para análise pelo banco e, desta forma,
somente a seqüência de 203 pb que precede o sítio de início da transcrição foi
analisada. O resultado da análise in silico desta região de 203 pb através do banco
de dados OSIRIS revelou a presença de 10 diferentes potenciais sítios de ligação
para fatores de transcrição, como ilustra a figura 10. Dentre estes, foi possível
observar a presença de regiões conservadas para a ligação de proteínas
regulatórias relacionadas à resposta de plantas a estresses ambientais, tais como os
elementos em cis MYB1AT, MYCATERD1, MYCATRD22, MYBCORE (relacionados
à resposta ao estresse provocado pela desidratação), AGC Box (relacionado à
resposta ao etileno) e ACGT Box (sitio de ligação de proteínas bZIP, que participam
de diversos processos nas plantas, como sinalização de estresses). Nenhum
potencial sítio regulatório foi encontrado entre o TATA Box e o ponto inicial da
transcrição. Informações adicionais sobre os sítios de ligação de fatores de
transcrição presentes na seqüência de 203 nucleotídeos, encontrados pelo banco de
dados OSIRIS, são descritos na tabela 5.
Lourenço, G. F. (2009) Dissertação de mestrado – LBT / CBB / UENF 45
Dissertação de mestrado
TAGCACTCACCAGCTTGTCAAAAACCAAGGCTTGGTGACGGCGGCT
TCAGAATGAAGGATAGATGGATAAATGTCTAGAATATTATAAAGTCC
AACAAAAGATGGAGCACATGCATGAAAGATTACGTACACGAATG
CAGGTGATACAGTGGATGTTAGGCATAAGAAGCACTATAAATAGAG
GGTGCAATCCCCATTGCCCTACACAACTACACAAGCCGACTATCATC
ACAAGAAAATTTAAGCGACCACGAAG
TAGCACTCACCAGCTTGTCAAAAACCAAGGCTTGGTGACGGCGGCT
TCAGAATGAAGGATAGATGGATAAATGTCTAGAATATTATAAAGTCC
AACAAAAGATGGAGCACATGCATGAAAGATTACGTACACGAATG
CAGGTGATACAGTGGATGTTAGGCATAAGAAGCACTATAAATAGAG
GGTGCAATCCCCATTGCCCTACACAACTACACAAGCCGACTATCATC
ACAAGAAAATTTAAGCGACCACGAAG
Figura 10. Identificação in silico de diferentes sítios de ligação para fatores de transcrição através banco de dados OSIRIS. Os dez sítios para proteínas regulatórias
encontrados na região de 203 pb (até a região sublinhada) estão representados por caixas
coloridas. A relação dos sítios é apresentada na tabela 5. O TATA Box encontra-se na
região circulada. A seta vermelha indica o sítio de início da transcrição e, por isso, a
seqüência sublinhada foi desconsiderada na análise de sítio de fatores de transcrição.
Lourenço, G. F. (2009) Dissertação de mestrado – LBT / CBB / UENF 46
Dissertação de mestrado
Tabela 5. Descrição dos sítios de ligação para fatores de transcrição identificados na região de 203 pb através de análises in silico no banco de dados OSIRIS.
Lourenço, G. F. (2009) Dissertação de mestrado – LBT / CBB / UENF 47
Dissertação de mestrado
Tabela 5. (continuação)
Lourenço, G. F. (2009) Dissertação de mestrado – LBT / CBB / UENF 48
Dissertação de mestrado
4.3 – Construção de vetores de expressão induzidos por estresses ambientais
As análises in silico da região de 256 pb do promotor do gene salT,
através do banco de dados OSIRIS, revelaram a presença de sítios de ligação para
fatores de transcrição envolvidos com resposta de plantas a estresses ambientais,
sugerindo sua regulação. Outra forma de regulação, que tem sido sugerida em
diversos trabalhos, é o aumento da expressão gênica mediado por íntrons. Neste
contexto, é possível que a presença de um íntron na porção 5’ do gene salT esteja
envolvida, de alguma forma, na regulação de sua expressão.
Com a finalidade de avaliar esta possível influência do íntron na regulação
do gene salT, portanto, tornou-se interessante a construção dos seguintes vetores
de expressão em plantas – o primeiro contendo somente a Região de 256 pb e o
segundo contendo a Região de 256 pb seguida do Íntron salT. Adicionalmente, um
terceiro vetor foi construído utilizando a Região de 256 pb seguida do íntron Act1,
amplamente caracterizado como ativador de expressão gênica em vetores deste
tipo. Tal abordagem permitiu, além de avaliar o grau de influência que o íntron salT
exerce sobre a atividade promotora da região de 256 pb, comparar os níveis de
expressão obtidos com o vetor que possui tal íntron e com outro que possui um
íntron com atividade já descrita na literatura. Essa avaliação foi realizada através da
detecção da atividade da enzima β-glucuronidase codificada pelo gene repórter
GUS, tornando-se, então, essencial a presença desse gene no vetor.
Lourenço, G. F. (2009) Dissertação de mestrado – LBT / CBB / UENF 49
Dissertação de mestrado
4.3.1 – Obtenção dos fragmentos utilizados na construção dos vetores de expressão em plantas
A etapa inicial dos estudos que tiveram como objetivo avaliar a influência
do íntron salT sobre a atividade promotora da região de 256 pb consistiu no
desenvolvimento de três vetores de expressão em plantas “Região de 256 pb”,
“Região de 256 pb + Íntron salT” e “Região de 256 pb + Íntron Act1”. Tais
construções moleculares utilizaram como “base” o plasmídeo pA19-GUS. Como
ilustrado pela figura 11A, este plasmídeo comporta em sua estrutura o gene repórter
GUS, o gene Amp que confere resistência ao antibiótico ampicilina e sítios para
diversas enzimas de restrição. Além disso, a presença do íntron Act1 do gene da
actina de arroz na porção 5’ do gene GUS foi decisiva na escolha desse plasmídeo
para “base” dos vetores.
Desta forma, o DNA plasmidial foi extraído de bactérias E. coli DH5α, e,
após sua integridade ter sido avaliada em gel de agarose 1% (dados não
mostrados), o material obtido foi submetido ao tratamento com enzimas de restrição
para a liberação dos fragmentos correspondentes a região promotora 35S e a região
promotora 35S mais o íntron Act1. O primeiro tratamento consistiu na utilização das
enzimas de restrição EcoRI e BamHI para liberar um fragmento de 855 pb contendo
o promotor 35S e o íntron Act1. Tal procedimento resultou na linearização do
plasmídeo pA19-GUS sem a região regulatória do gene repórter. Tal vetor linear foi
denominado pA19-GUS-1. O segundo tratamento consistiu na utilização das
enzimas de restrição EcoRI e XhoI para liberar um fragmento 350 pb correspondente
apenas ao promotor 35S. Esse procedimento resultou na linearização do plasmídeo
pA19-GUS, e a conservação do íntron Act1 na porção 5’ do gene repórter. O vetor
linearizado contendo o íntron Act1 foi denominado pA19-GUS-2 (figura 11B).
Os dois plasmídios lineares obtidos foram utilizados em diferentes
abordagens. O plasmídeo pA19-GUS-1 foi utilizado para a clonagem do fragmento
correspondente a região de 256 pb do promotor do gene salT, e nessa condição foi
chamado de plasmídeo pA19-GUS-1A. Dessa forma, será possível avaliar a
funcionalidade dessa região, que regulará a expressão do gene repórter GUS. Numa
segunda abordagem, foi feita a ligação do mesmo plasmídeo linear ao fragmento
correspondente a região de 256 pb acompanhada do íntron salT, e nessa condição
foi chamado de pA19-GUS-1B. Assim, será avaliada a possível influência do íntron
Lourenço, G. F. (2009) Dissertação de mestrado – LBT / CBB / UENF 50
Dissertação de mestrado
salT na ativação da região de 256 pb do promotor salT. Foi realizada ainda a ligação
do fragmento correspondente a região de 256 pb do promotor do gene salT ao
plasmídeo pA19-GUS-2. Como este comporta o íntron Act1 na porção 5’ do gene
GUS, será possível analisar a influência desse íntron na atividade da região de 256
pb, bem como a análise comparativa com a expressão obtida pelo vetor contendo o
íntron salT.
A)
B)
500 pb
250 pb
750 pb1 kb
M 1 2 3
10 kb
A)
B)
500 pb
250 pb
750 pb1 kb
M 1 2 3
10 kb
Figura 11. Esquema ilustrativo e visualização eletroforética do resultado da restrição enzimática do plasmídeo pA19-GUS. Em (A) Esquema do plasmídeo pA19-Gus. Em (B)
Linearização do plasmídeo pA19-GUS através de restrição enzimática. 1 – plasmídeo pA19-
GUS não digerido (indicado pela seta vermelha). 2 – plasmídeo pA19-GUS digerido com as
enzimas EcoRI e BamHI. A seta vermelha indica o plasmídeo linear pA19-GUS-1 e a seta
azul indica o fragmento liberado correspondente ao promotor 35S + Act1. 3 – plasmídeo
pA19-GUS digerido com as enzimas EcoRI e XhoI. A seta vermelha indica o plasmídeo
linear pA19-GUS-2 e a seta azul indica o fragmento liberado correspondente ao promotor
35S. M – Marcador de peso molecular 1 kb DNA Ladder™ (Fermentas).
Lourenço, G. F. (2009) Dissertação de mestrado – LBT / CBB / UENF 51
Dissertação de mestrado
Os fragmentos de interesse que seriam utilizados para a construção de
tais vetores de expressão foram amplificados a partir de DNA genômico,
previamente extraído de folhas de arroz do cultivar IAC 4440 (dados não
mostrados), utilizando combinações específicas de primers. O fragmento
correspondente a região de 256 pb que seria clonado no vetor pA19-GUS-1A foi
amplificado utilizando os primers Pro 250 Eco e Bea 02 Bam. Como os primers
possuíam sítios de restrição, os fragmentos gerados com essa abordagem tiveram
extremidades coesivas com as enzimas de restrição EcoRI e BamHI, compatíveis
com as extremidades do vetor linear onde foram clonados. Outra abordagem utilizou
os primers Pro 250 Eco e Bea 04 Bam. Essa combinação amplificou o fragmento
correspondente a região de 256 pb acompanhada do íntron salT. Os fragmentos
gerados por esta abordagem também tiveram sítios de restrição compatíveis com as
enzimas EcoRI e BamHI, e assim, foram clonados no vetor linear pA19-GUS-1B.
Adicionalmente, o fragmento correspondente à região de 256 pb foi amplificado
utilizando os primers Pro 250 Eco e Bea 02 Xho. O resultado dessa amplificação
foram fragmentos com extremidades compatíveis com as enzimas EcoRI e XhoI, que
puderam ser então clonadas no plasmídeo linear pA19-GUS-2. A tabela 3 (Materiais
e Métodos) mostra o par de primers utilizado em cada amplificação e os sítios de
restrição gerados nos fragmentos, e a figura 5 (Materiais e Métodos) indica o local
de anelamento e a direção de cada primer no promotor do gene salT.
Após a amplificação por PCR, as amostras foram tratadas com as enzimas
de restrição correspondentes aos primers utilizados, no intuito de gerar
extremidades coesivas, e os materiais foram avaliados em gel de agarose 1%.
Como demonstrado na figura 12, os fragmentos de interesse foram eficientemente
amplificados. Embora tenha ocorrido amplificação inespecífica, a eficácia do
procedimento é verificada pela intensidade dos fragmentos alvos. As bandas foram,
então, isoladas diretamente do gel e o DNA purificado para posteriores ensaios de
clonagem.
Lourenço, G. F. (2009) Dissertação de mestrado – LBT / CBB / UENF 52
Dissertação de mestrado
500 pb
250 pb
750 pb
1 kb
M 1 2 3
500 pb
250 pb
750 pb
1 kb
M 1 2 3
Figura 12. Visualização eletroforética da amplificação por PCR dos fragmentos de interesse. M – Marcador de peso molecular 1 kb DNA Ladder™ (Fermentas); 1 –
Fragmento de 256 pb EcoRI/BamHI; 2 – Fragmento de 256 pb EcoRI/XhoI; 3 – Fragmento
256 pb + íntron salT EcoRI/BamHI. As setas vermelhas indicam a posição dos fragmentos
amplificados em cada raia.
Lourenço, G. F. (2009) Dissertação de mestrado – LBT / CBB / UENF 53
Dissertação de mestrado
4.3.2 – Ligação dos insertos aos seus respectivos vetores de clonagem e
transformação de E. coli DH5α
O primeiro ensaio de ligação foi realizado utilizando o plasmídeo pA19-GUS-1A, digerido com as enzimas de restrição EcoRI e BamHI, e o fragmento correspondente a região de 256 pb do promotor salT com as extremidades compatíveis EcoRI e BamHI. Em seguida, bactérias E. coli competentes linhagem DH5α foram transformadas com o DNA obtido e plaqueadas. Foi observado o crescimento de 31 colônias nas placas, e tais colônias foram, então, analisadas quanto à presença do clone “pA19-GUS-1 + 256 pb EcoRI / BamHI” pela amplificação do inserto através de PCR, onde a combinação de primers utilizada foi Pro 250 Eco e Gus 5’ Rev e as próprias colônias da bactéria transformada foram utilizadas como DNA molde. A figura 13 mostra que das 31 colônias obtidas, 11 colônias tiveram o inserto amplificado, indicando que receberam o clone.
A construção do segundo vetor de expressão seguiu as mesmas etapas. Foi utilizado o plasmídeo pA19-GUS-1B, digerido com as enzimas de restrição EcoRI e BamHI. O fragmento correspondente a região de 256 pb do promotor salT, seguida do íntron salT, também foi digerido com as mesmas enzimas. Após a ligação e transformação de E. coli DH5α foi observado o crescimento de 177 colônias nas placas, das quais 39 foram escolhidas aleatoriamente para serem analisadas quanto à presença do clone “pA19-GUS-1 + 256 pb + íntron salT EcoRI / BamHI” pela amplificação do inserto utilizando a mesma combinação de primers da construção anterior. A figura 14 mostra que 28 colônias tiveram o inserto amplificado, indicando que receberam o clone.
O terceiro vetor foi construído utilizando a mesma abordagem, porém com uma pequena modificação. A ligação foi realizada utilizando o plasmídeo pA19-GUS-2, digerido com as enzimas de restrição EcoRI e XhoI, e o fragmento correspondente a região de 256 pb do promotor salT com as extremidades compatíveis EcoRI e XhoI. Após a ligação e transformação de E. coli DH5α foi observado o crescimento de diversas colônias, das quais 65 foram escolhidas aleatoriamente para serem analisadas quanto à presença do clone “pA19-GUS + 256 pb EcoRI / XhoI” pela amplificação do inserto utilizando a mesma combinação de primers das construções anteriores. Os resultados mostraram 45 colônias apresentaram resultado positivo, indicando que receberam o clone. Porém, neste caso, o fragmento amplificado corresponde a região de 256 pb + íntron Act1 (figura 15).
Lourenço, G. F. (2009) Dissertação de mestrado – LBT / CBB / UENF 54
Dissertação de mestrado
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
M 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26
27 28 29 30 31 M
500 pb
250 pb
500 pb
250 pb
500 pb
250 pb
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
M 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26
27 28 29 30 31 M
500 pb
250 pb
500 pb
250 pb
500 pb
250 pb
Figura 13. Confirmação da clonagem do inserto “256 pb EcoRI/BamHI” através de PCR das 31 colônias crescidas. As posições 5, 6, 7, 9, 14, 19, 24, 26, 27, 28 e 29 indicam
as colônias positivas. M – Marcador de peso molecular 1 kb DNA Ladder™ (Fermentas). 1 –
Controle negativo (ausência de fita molde). As setas vermelhas indicam o inserto
amplificado.
Lourenço, G. F. (2009) Dissertação de mestrado – LBT / CBB / UENF 55
Dissertação de mestrado
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
M 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26
M 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39
500 pb250 pb
750 pb1 kb
500 pb250 pb
750 pb1 kb
500 pb250 pb
750 pb1 kb
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
M 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26
M 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39
500 pb250 pb
750 pb1 kb
500 pb250 pb
750 pb1 kb
500 pb250 pb
750 pb1 kb
Figura 14. Confirmação da clonagem do inserto “256 pb + íntron salT EcoRI/BamHI” através de PCR de 39 colônias formadas. As posições 10 a 30 e 33 a 39 indicam as
colônias positivas. M – Marcador de peso molecular 1 kb DNA Ladder™ (Fermentas). 1 –
Controle negativo (ausência de fita molde). As setas vermelhas indicam o fragmento
amplificado.
Lourenço, G. F. (2009) Dissertação de mestrado – LBT / CBB / UENF 56
Dissertação de mestrado
M 1 2 3 4 5 M 6 7 8 9 10 11 12
M 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25
M 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38
500 pb250 pb
750 pb1 kb
500 pb250 pb
750 pb1 kb
500 pb250 pb
750 pb1 kb
M 1 2 3 4 5 M 6 7 8 9 10 11 12
M 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25
M 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38
500 pb250 pb
750 pb1 kb
500 pb250 pb
750 pb1 kb
500 pb250 pb
750 pb1 kb
Figura 15 (1ª parte).
Lourenço, G. F. (2009) Dissertação de mestrado – LBT / CBB / UENF 57
Dissertação de mestrado
M 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51
M 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63
M 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74
500 pb250 pb
750 pb1 kb
500 pb250 pb
750 pb1 kb
500 pb250 pb
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M 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51
M 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63
M 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74
500 pb250 pb
750 pb1 kb
500 pb250 pb
750 pb1 kb
500 pb250 pb
750 pb1 kb
Figura 15 (continuação). Confirmação da clonagem do inserto “256 pb EcoRI/XhoI” através de PCR de 65 colônias crescidas. Os fragmentos amplificados correspondem ao
“256 pb + íntron Act1”. Muito embora 45 colônias tenham sido positivas, as posições 10, 15,
colônias com as melhores amplificações. M – Marcador de peso molecular 1 kb DNA
Ladder™ (Fermentas). 1 a 5 – Controles negativos (ausência de fita molde). As posições 6,
13, 26 e 39 são amostras erradas que foram carregadas no gel, não fazendo, portanto, parte
das colônias positivas. As setas vermelhas indicam os produtos amplificados.
Lourenço, G. F. (2009) Dissertação de mestrado – LBT / CBB / UENF 58
Dissertação de mestrado
4.4 – Estudo da influência do íntron salT através da análise de expressão transiente do gene GUS em tecido foliar de Arabidopsis thaliana
Com o intuito de avaliar a influência do íntron salT sobre a atividade
regilatória da região de 256 pb do promotor do gene salT, bem como comparar os
níveis de expressão obtidos com a presença dos diferentes íntrons, os três vetores
de expressão em plantas previamente construídos – “Região de 256 pb”, “Região de
256 pb + Íntron salT” e “Região de 256 pb + Íntron Act1” – foram extraídos das
bactérias E. coli DH5α, tiveram sua integridade avaliada em gel de agarose 1%
(dados não mostrados) e, posteriormente, tais moléculas foram eletroporados em A.
tumefaciens LBA 4440. O plasmídeo original pA19-GUS, utilizado como “base” para
a construção dos vetores, também foi inserido por eletroporação em A. tumefaciens.
A presença do promotor constitutivo CaMV 35S dirigindo a expressão do gene GUS
em tal plasmídeo permitiu sua utilização como controle positivo nos ensaios
posteriores.
Inicialmente, as quatro cepas transformadas com os vetores de expressão
(três construções e o plasmídeo original), bem como a Agrobacterium tumefaciens
selvagem, foram submetidas à análise de detecção da expressão do gene GUS
através da reação enzimática da β-glucuronidase com seu substrato x-gluc. A figura
16 demonstra que apenas a cepa de A. tumefaciens contendo o plasmídeo pA19-
GUS apresentou a coloração azul, indicando a expressão do gene GUS. Se as
cepas contendo cada um das três construções fossem capazes de expressar o gene
GUS, a análise histoquímica em A. thaliana seria inviável, pois implicaria em um
resultado falso-positivo.
Os experimentos in vivo foram conduzidos utilizando folhas da parte
inferior de plantas de Arabidopsis thaliana com 28 dias de idade. As soluções de
infecção, contendo as cepas transformadas, foram injetadas em diversos pontos da
superfície abaxial dos tecidos foliares de A. thaliana com o auxílio de uma seringa.
Após dois dias de infecção, as folhas que tiveram as cepas injetadas foram
excisadas das plantas de origem e incubadas durante 20 h em tampão contendo o
substrato x-gluc. Como demonstrado na figura 17, a análise histoquímica da
expressão transiente do gene GUS em tecidos foliares de Arabidopsis thaliana
revelou, através da coloração azul, a expressão deste gene repórter nas folhas
transformadas com as cepas de A. tumefaciens contendo os vetores com o íntron
Lourenço, G. F. (2009) Dissertação de mestrado – LBT / CBB / UENF 59
Dissertação de mestrado
salT e o íntron Act1. Aparentemente, não houve expressão do gene GUS na folha
infectada com a cepa que possuía o vetor “Região de 256 pb”.
1 2 3 4 51 2 3 4 5
Figura 16. Detecção da expressão do gene GUS em diferentes cepas de
Agrobacterium tumefaciens. A expressão da enzima β-glucuronidase (GUS) foi
mensurada através do tratamento das cepas com tampão contendo seu substrato, x-
gluc. 1 – A. tumefaciens transformada com o plasmídeo original pA19-GUS, que contém o
promotor 35S dirigindo a expressão do gene repórter (controle positivo); 2 – A. tumefaciens
selvagem (não transformada); 3 – A. tumefaciens contendo o vetor de expressão “Região de
256 pb”; 4 - A. tumefaciens contendo o vetor “Região de 256 pb + Íntron salT”; 5 – A.
tumefaciens contendo o vetor “Região de 256 pb + Íntron Act1”.
Lourenço, G. F. (2009) Dissertação de mestrado – LBT / CBB / UENF 60
Dissertação de mestrado
1 2 3 41 2 3 4
Figura 17. Análise histoquímica da expressão transiente do gene GUS em tecidos foliares de Arabidopsis thaliana. As folhas infectadas com as cepas transformadas foram
excisadas das plantas de origem e submetidas ao tratamento com tampão contendo o
substrado x-gluc. A intensidade da cor azul está relacionada ao nível de expressão do gene
repórter GUS. 1 – Folha injetada com a cepa de A. tumefaciens contendo o vetor plasmidial
pA19-GUS (controle positivo); 2 – Folha transformada com a A. tumefaciens contendo a
construção “Região de 256 pb”; 3 – Folha transformada com a A. tumefaciens contendo a
construção “Região de 256 pb + Íntron salT”; 4 – Folha transformada com a A. tumefaciens
contendo a construção “Região de 256 pb + Íntron Act1”.
Lourenço, G. F. (2009) Dissertação de mestrado – LBT / CBB / UENF 61
Dissertação de mestrado
4.5 – Análise do perfil transcricional do gene salT em diferentes tecidos de O.
sativa através de northern eletrônico
A identificação, através de análise in silico, do sítio “RY Repeat” na região
de 256 pb do promotor do gene salT sugeriu uma possível participação deste gene
em processos que ocorrem nas sementes. Poranto, com a finalidade de investigar o
perfil de expressão deste gene nos diferentes tecidos desta parte da planta, foi
utilizado o Projeto de Arroz da Universidade de Yale (Yale Rice Project). Tal projeto
tem como objetivo a construção, ainda em andamento, de um banco de dados do
perfil transcricional de todo o genoma de arroz em diversos tipos de células e tecidos
isolados por micro dissecação, o Centro Virtual da Universidade de Yale para o Perfil
de Expressão Celular em Arroz (Yale Virtual Center for Cellular Expression Profiling
of Rice Yale Rice Project: http://bioinformatics.med.yale.edu/riceatlas/overview.jspx).
A figura 18 mostra os resultados obtidos pelos ensaios de microarray
desenvolvidos pelo banco da Universidade de Yale para o perfil transcricional do
gene salT em cinco diferentes tecidos do embrião de sementes, em três momentos –
semente seca (0h) e 12 h e 24 h após a embebição. Os valores expressos dentro
das células representam a intensidade do sinal, após a normalização dos dados, e
determinam os níveis de transcrição do gene. Segundo os dados gerados, o gene
salT possui alto nível de transcrição nas células do escutelo, coleóptilo, epiblasto e
radícula após 12 h, e baixo nível transcricional nas células da plúmula de sementes.
Adicionalmente, foram realizadas análises dos níveis de transcrição do
gene salT em outros tecidos de plantas. De acordo com os dados gerados pelo
banco da Universidade de Yale, mostrados na figura 19, o gene salT apresenta alto
nível de transcrição somente em amostras de folha inteira e na raiz inteira.
Lourenço, G. F. (2009) Dissertação de mestrado – LBT / CBB / UENF 62
Figura 18. Perfil transcricional do gene salT em cinco diferentes tecidos do embrião de sementes. Análises de microarray de escutelo, coleóptilo, epiblasto, plúmula e radícula
em três momentos [semente seca (0hr), 12 h e 24 h após embebição] desenvolvidos pelo
banco de expressão da Universidade de Yale (Yale Virtual Center for Cellular Expression
Profiling of Rice Yale Rice Project). Acima é fornecida uma chave mostrando a abundância
relativa de RNA, sendo a cor amarela para baixas concentrações e vermelho e marrom para
altas concentrações.
Lourenço, G. F. (2009) Dissertação de mestrado – LBT / CBB / UENF 63
Dissertação de mestrado
Figura 19. Perfil transcricional do gene salT em tecidos de plantas de arroz. Análises
de microarray de diversos tecidos e tipos celulares de broto, folha e raiz de plantas de arroz
desenvolvidos pelo banco de expressão da Universidade de Yale (Yale Virtual Center for
Cellular Expression Profiling of Rice Yale Rice Project). Acima é fornecida uma chave
mostrando a abundância relativa de RNA, sendo a cor amarela para baixas concentrações e
vermelho e marrom para altas concentrações.
Lourenço, G. F. (2009) Dissertação de mestrado – LBT / CBB / UENF 64
Dissertação de mestrado
5. DISCUSSÃO
5.1 – Estudo da influência dos elementos de transposição Castaway e Stowaway sobre a atividade da região regulatória do gene salT de arroz
Em trabalho prévio de comparação de seqüências em bancos de dados
(NCBI – GenBank), BUREAU e colaboradores (1996) analisaram a ocorrência de
elementos de transposição em genes já seqüenciados de A. thaliana e O. sativa.
Nesta ocasião, foi detectada a presença de transposons pertencentes às famílias
Castaway e Stowaway, os quais encontram-se separados por apenas nove pares de
bases, na região promotora do gene salT de arroz. Elementos de transposição são
seqüências capazes de se replicar e se mover dentro do genoma (FESCHOTTE,
2008), e além do gene salT, diversos outros genes de arroz tiveram relatada a
presença de tais elementos em suas regiões regulatórias 5’ flanqueadoras (BUREAU
et al., 1996). Estas inserções, muitas vezes conservadas entre diferentes
organismos, impulsionaram diversos estudos acerca de suas possíveis funções
regulatórias (FESCHOTTE, 2008).
Nas tabelas 1 e 2, previamente apresentadas, foi possível observar que
diversos cultivares de arroz foram utilizados em análises de diferentes estresses,
porém não há informações a cerca da presença/ausência dos elementos de
transposição no promotor salT de tais cultivares. Tal constatação despertou o
interesse sobre uma possível correlação entre presença de tais transposons com a
atividade do promotor salT, que até então não havia sido relatada. Portanto, com a
finalidade de determinar se a presença dos elementos móveis afetam de alguma
forma a transcrição do gene salT, mediante resposta ao estresse provocado por
salinidade, foi necessário, inicialmente, determinar quais cultivares de arroz
apresentavam tais inserções na região promotora através de amplificações por PCR.
Uma vez que o promotor salT inteiro (com os dois elementos de
transposição) consiste de 1725 pb (GARCIA et al., 1998; NCBI – acesso n° Z25811),
e os transposons Castaway e Stowaway juntos (sem os nove pares de bases que os
separam) correspondem a 520 pb, a região promotora sem os elementos de
transposição deveria corresponder a 1205 pb. Sendo assim, o resultado de
amplificação por PCR sugeriu a presença dos transposons apenas nos cultivares
Lourenço, G. F. (2009) Dissertação de mestrado – LBT / CBB / UENF 65
Dissertação de mestrado
Minami Hata Mochi e Taichung Native 1 (figura 6). Adicionalmente, foi demonstrado
que a região de 256 pb + íntron salT possui exatamente o mesmo tamanho em todos
os cultivares (figura 7), o que corrobora a idéia que a diferença no tamanho dos
fragmentos correspondentes aos promotores nos diferentes cultivares é devido à
presença dos elementos de transposição. Tomados juntos, então, os resultados
obtidos pelo presente trabalho indicaram a presença dos elementos de transposição
Castaway e Stowaway no promotor salT somente dos cultivares Minami Hata Mochi
e Taichung Native 1, enquanto que Cica 8, Guarani, IAC 201, IAC 4440 e Metica-1
não apresentaram tais inserções.
A detecção dos transposons tanto em cultivares da subespécie Japônica,
como Guarani e Minami Hata Mochi, quanto em cultivares da subespécie Indica,
como IAC 4440, Metica 1 e TN1, indicou que a inserção de tais elementos de
transposição ocorreu, na escala evolutiva, em algum ponto antes da diferenciação
em subespécies, permanecendo conservada em ambas. Visto que teorias recentes
têm postulado que a persistência evolucionária de alguns elementos de transposição
deve-se ao papel chave que tais elementos vêm exercendo sobre a evolução da
regulação gênica (FESCHOTTE, 2008), torna-se ainda mais interessante a análise de
uma possível participação dos transposons Castaway e Stowaway na regulação do
gene salT.
Tem sido amplamente mostrado que os transposons são capazes de
influenciar diretamente, de forma benéfica ou não, a regulação da expressão de
genes localizados fisicamente próximos a eles, tanto em níveis transcricionais
quanto pós-transcricionais (MASIDE et al., 2002; SILVA et al., 2003; SCHLENKE et al.,
2004; CHUNG et al., 2007; FESCHOTTE et al., 2007). No nível transcricional, elementos
de transposição inseridos na região 5’ flanqueadora de um gene podem influenciar
sua expressão de três diferentes formas – inserindo seqüências promotoras e
introduzindo um sítio alternativo de inicio da transcrição; interrompendo seqüências
que compreendiam importantes elementos regulatórios em cis; ou introduzindo
novos elementos em cis, tais como sítios de ligação para fatores de transcrição
(FESCHOTTE, 2008).
Uma vez que o promotor de um gene compreende os sítios de ligação a
fatores de transcrição, a inserção dos transposons nesta região regulatória implica
em um possível distanciamento de 520 pb entre potenciais sítios e o ponto de início
da transcrição, e portanto, tal inserção poderia afetar negativamente a transcrição do
Lourenço, G. F. (2009) Dissertação de mestrado – LBT / CBB / UENF 66
Dissertação de mestrado
gene. Porém, a partir da determinação de cultivares de arroz com e sem a inserção
de transposons e posteriores ensaios conduzidos através de RT-PCR em bainhas
de plantas em condições normais e submetidas a estresse salino, foi mostrado que
as inserções não prejudicaram a habilidade do promotor salT em induzir a
transcrição do gene salT (figura 8). Contudo, muito embora tenha ficado claro que a
inserção dos elementos de transposição não afeta negativamente a transcrição do
gene, o pequeno número de cultivares analisados neste trabalho não permite afirmar
que a presença de tais elementos possua função benéfica na regulação do gene
salT. Apenas análises moleculares mais apuradas, como a identificação in silico de
elementos regulatórios em cis e a utilização de vetores repórteres, contendo tais
transposons, em ensaios de expressão, poderão fornecer maiores informações
sobre a participação dos elementos de transposição na regulação gênica e confirmar
possíveis funções benéficas.
Adicionalmente, os resultados obtidos nos ensaios de western blotting,
demonstraram que o acúmulo da proteína SALT, nas mesmas condições, não
refletem os níveis de transcrição do gene salT (figura 9). O fato de haver grande
discrepância entre o acúmulo de transcritos e de proteínas, como mostrada pelo
cultivar Minami Hata Mochi, sugere fortemente uma intensa regulação pós-
traducional da proteína SALT.
5.2 – Estudo dos potenciais sítios regulatórios identificados na região de 256 pb do promotor do gene salT através de análises in silico
A diversidade de respostas apresentadas pelo gene salT de arroz pode
estar relacionada à presença de diferentes sítios para ligação de fatores de
transcrição na sua região promotora. Visto que os resultados obtidos pelos ensaios
de PCR em Tempo Real demonstraram que a inserção dos elementos de
transposição não influencia a atividade do promotor quanto à sua capacidade de
induzir a transcrição do gene salT, foi possível inferir que os potenciais sítios de
ligação para fatores de transcrição estejam situados na região de 256 pb do
promotor salT. Tendo em vista que uma das aplicações da bioinformática consiste
em localizar possíveis sítios para proteínas regulatórias em seqüências de DNA, e a
identificação de regiões conservadas pode sugerir os possíveis meios de regulação
do gene em estudo, a análise in silico da região de 256 pb do promotor salT tornou-
Lourenço, G. F. (2009) Dissertação de mestrado – LBT / CBB / UENF 67
Dissertação de mestrado
se de extrema relevância na elucidação dos possíveis elementos regulatórios em cis
presentes na mesma.
Tal análise, realizada no trabalho aqui apresentado, consistiu na
submissão do nome referente ao gene salT de arroz, baseado no Projeto de
Anotação do Arroz (RAP-DB: TANAKA et al., 2008), no banco de dados OSIRIS, que
reúne e analisa promotores contidos no genoma de O. sativa (MORRIS et al., 2008).
Este banco de dados gera uma imagem da região promotora do gene submetido,
bem como os sítios de ligação para fatores de transcrição presentes no mesmo.
Inicialmente, tal abordagem permitiu a confirmação da presença do TATA Box nesta
região. O TATA Box é uma seqüência de DNA (elemento regulatório em cis)
encontrada na região promotora da maioria dos genes de eucariotos. Considerado a
seqüência essencial do promotor, é geralmente encontrado como sítio de ligação da
RNA polimerase II, responsável por dar início ao complexo processo de transcrição
25 pares de bases após o seu sítio de ligação. A presença deste elemento em cis
nesta posição já havia sido relatada por GARCIA e colaboradores (1998), porém,
através do avanço tecnológico das ferramentas de bioinformática, do acúmulo de
informações in vivo e da utilização combinada de três diferentes banco de dados de
elementos regulatórios encontrados em promotores de plantas – OSIRIS (MORRIS et
al., 2008), PlantCARE (LESCOT et al., 2002) e PLACE (HIGO et al., 1999) – foi
possível afirmar de forma mais consistente tratar-se do elemento TATA Box.
De acordo com os dados obtidos pelo OSIRIS, os 53 nucleotídeos a partir
do sítio de início da transcrição fazem parte do transcrito primário e, desta forma,
não houve análise quanto à presença de sítios de fatores de transcrição nesta
seqüência. Somente os 203 pb precedentes ao sítio inicial da transcrição são
considerados pelo banco. O resultado da análise in silico desta região de 203 pb
através do banco de dados OSIRIS revelou a presença de 10 diferentes potenciais
sítios de ligação para de proteínas regulatórias. Dentre estes, pelo menos seis
elementos em cis – MYB1AT, MYCATERD1, MYCATRD22, MYBCORE, AGC Box e
ACGT Box – referem-se a regiões conservadas para a ligação de proteínas
regulatórias relacionadas à resposta de plantas a estresses ambientais.
MYB1AT e MYCATRD22 são sítios de reconhecimento das proteínas
regulatórias MYB e MYC encontrados nos promotores dos genes rd22, e de muitos
outros genes de A. thaliana, e funciona como elemento em cis na expressão
induzida por ABA e seca de tais genes (ABE et al., 1997, 2003, BUSK e PAGES, 1997).
Lourenço, G. F. (2009) Dissertação de mestrado – LBT / CBB / UENF 68
Dissertação de mestrado
O fitormônio ABA é produzido sob condições de estresse hídrico, o que causa
fechamento do estômato e tolerância a seca, e estresse salino (BRAY, 1997; BUSK e
PAGES, 1998; SHINOZAKI e YAMAGUCHI-SHINOZAKI, 2000) estando, portanto,
relacionado a uma variedade de processos fisiológicos, incluindo respostas aos
estresses provocados pela seca e pela salinidade (ABE et al., 2003). MYBCORE
também funciona como sítio de reconhecimento para proteínas MYB de Arabidopsis,
funcionando, portanto, da mesma forma (URAO et al., 1993), e MYCATERD1 foi
descrito como sítio necessário para a expressão do gene erd1 de Arabidopsis, que
participa dos processos de resposta à desidratação (TRAN et al., 2004) e à
senescência induzida pelo escuro (SIMPSON et al., 2003) em Arabidopsis. Juntos,
esses dados apontam a presença de elementos em cis relacionados ao estresse
provocado pela desidratação e ABA e, uma vez que diversos trabalhos relataram a
expressão do gene salT sob condições de seca e ABA, é possível que tais sítios
regulatórios sejam funcionais na regulação do gene salT.
O elemento AGC Box consiste na seqüência de ligação para fatores
AtERFs de Arabidopsis, que são fatores que se ligam a elementos responsivos à ET
(FUJIMOTO et al., 2000). Tal elemento é também encontrado em genes de defesa
cuja transcrição é induzida por ET (OHME-TAKAGI et al., 2000) e em genes cujos
promotores são induzidos por patógenos e ferimentos (RUSHTON et al., 2002). O fato
da expressão do gene salT ter sido induzida por ET (KIM et al., 2004), por patógenos
(XIONG et al., 2001; AKIMOTO-TOMIYAMA et al., 2003; KIM et al., 2001, 2003, 2004;
VENTELON-DEBOUT et al., 2004; MICHÉ et al., 2006; SWARBRICK et al., 2008) e por
ferimento (DE SOUZA FILHO et al., 2003; SHEN et al., 2003) indica a possível influência
do elemento AGC Box na regulação do gene salT. Já o sítio ACGT Box ligam
proteínas regulatórias da família bZIP. Em plantas, os fatores de transcrição bZIP
regulam diversos processos, tais como defesa de patógenos, sinalização de
estresse e luz, maturação de sementes e desenvolvimento da flor.
O motivo conservado RY Repeat consiste em um elemento em cis
presente em genes de proteínas de estoque de sementes. Está envolvido na
regulação gênica específica em sementes (DICKINSON et al., 1988; BÄUMLEIN et al.,
1992; HATTORI et al., 1992). O fato de este ter sido o único sítio tecido-específico
encontrado na região de 256 pb levou à posterior análise do perfil transcricional do
gene salT tecido-específica. Nenhum potencial sítio regulatório foi identificado pelo
banco de dados OSIRIS entre o TATA Box e o ponto inicial da transcrição.
Lourenço, G. F. (2009) Dissertação de mestrado – LBT / CBB / UENF 69
Dissertação de mestrado
A regulação gênica ocorre em todas as etapas que constituem este
complexo processo, e muitos são os fatores envolvidos em cada um destes cruciais
pontos da regulação. Nesse contexto, diversos trabalhos sugerem uma importante
participação de íntrons na regulação da expressão gênica. Uma vez que o gene salT
possui um íntron na sua porção 5’, tornou-se interessante analisar se a presença
deste íntron influencia, de alguma forma, a expressão gênica do gene em estudo.
5.3 – Estudo da influência do íntron salT sobre a atividade promotora da região de 256 pb através da análise de expressão transiente do gene GUS em tecido foliar de A. thaliana
A expressão de qualquer gene é regulada por sua seqüência promotora
através da interação desta com fatores de transcrição específicos, permitindo que o
gene responda a vários estímulos, dependendo do gene em questão. Em 1987,
JEFFERSON e colaboradores utilizaram o gene β-glucuronidase (GUS) de E. coli como
uma fusão de gene marcador para análise de expressão gênica em plantas
transformadas, e até o ano de 2003 mais de 3500 trabalhos já citavam a utilização
do sistema repórter GUS para tal finalidade (VAIN, 2007). Seqüências promotoras
têm sido testadas mensurando a expressão deste gene repórter uidA, que codifica a
enzima β-glucuronidase (GUS). Tal enzima é facilmente mensurada utilizando o
substrato x-gluc para produzir uma cor azul no ensaio histoquímico e o substrato 4-
methyllumbelliferyl-glucuronide (MUG) que produz um composto fluorescente no
ensaio sensitivo quantitativo in vitro (INABA et al., 2007).
Diversos trabalhos avaliaram seqüências promotoras através da análise
histoquímica da expressão transiente do gene GUS em tecidos de plantas e,
adicionalmente, estudos que demonstraram a influência de íntrons sobre promotores
utilizaram a mesma abordagem (LU et al., 2008). Portando, com o intuito de avaliar a
atividade da região de 256 pb do promotor do gene salT e a influência do íntron salT
sobre a regulação deste gene, foram construídos três vetores de expressão em
plantas contendo fragmentos correspondentes à “Região de 256 pb”, “Região de 256
pb + Íntron salT” e “Região de 256 pb + Íntron Act1” regulando a expressão do gene
GUS. Adicionalmente, tornou-se possível uma análise comparativa dos níveis de
expressão obtidos pelos vetores contendo o íntron salT e o íntron Act1 do gene da
actina de arroz.
Lourenço, G. F. (2009) Dissertação de mestrado – LBT / CBB / UENF 70
Dissertação de mestrado
A transferência gênica mediada por Agrobacterium tem sido amplamente
utilizada como uma poderosa ferramenta para análise de genomas e melhoramento
de culturas (POTRYKUS, 1990; HOOYKAAS e SCHILPEROORT, 1992; TZFIRA e CITOVSKY,
2006; CITOVSKY et al., 2007; DAFNY-YELIN et al., 2008), e durante os últimos 30 anos,
a transformação mediada por Agrobacterium constitui o principal sistema de
transferência de DNA para novas tecnologias de obtenção de transgênicos (VAIN,
2007). Sendo assim, cada uma das construções obtidas pelo presente trabalho foi
introduzida em A. tumefaciens linhagem LBA 4440 via eletroporação. Visto que o
protocolo de transformação da planta modelo A. thaliana foi estabelecido na década
de 80 (ZAMBRYSKI et al., 1983) e desde então é amplamente utilizado (VAIN, 2007),
as diferentes cepas de A. tumefaciens foram infiltradas na superfície abaxial de
folhas de A. thaliana com o auxílio de seringas sem agulhas. Acredita-se que os
ferimentos gerados no processo de infecção poderiam induzir as vias de resposta a
estresses ambientais nas plantas, e desta forma, o promotor salT seria ativado.
Após a infecção, as plantas foram mantidas em câmara de cultivo por dois dias,
quando as folhas infectadas foram excisadas das plantas de origem e incubadas
com tampão x-gluc para a detecção da atividade do gene GUS.
A análise histoquímica da expressão transiente do gene GUS em tecidos
foliares de A. thaliana revelou a expressão deste gene repórter nas folhas
transformadas com as cepas de A. tumefaciens que portavam os vetores com o
íntron salT e o íntron Act1. Visto que a intensidade da cor azul está relacionada ao
nível de expressão do gene, os dados obtidos sugeriram que a região de 256 pb
sozinha não induziu a expressão do gene GUS, pelo menos não em níveis
detectáveis pelos ensaios histoquímicos. Os resultados sugeriram, ainda, que o
íntron salT exerce forte influência sobre a atividade promotora da região de 256 pb,
uma vez que sua presença na porção 3’ desta região ativou a expressão do gene
repórter (figura 17).
O efeito do aumento da expressão gênica mediado por íntrons (IME) já foi
demonstrado para diversos íntrons de plantas (SAMADDER et al., 2008), porém a
eficiência do IME difere em espécies de monocotiledôneas e dicotiledôneas (KOZIEL
et al., 1996). Íntrons que estimulam a expressão em monocotiledôneas incluem os
íntrons dos genes de milho Adh1, Sh1, Bz1, Hsp82, actina e GapA1 (CALLIS et al.,
1987; LUEHRSEN e WALBOT, 1991; MAAS et al., 1991; SINIBALDI e METTLER, 1992;
DONATH et al., 1995) e de arroz salT, Act1 e tpi (MCELROY et al., 1990; XU et al.,
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Dissertação de mestrado
1994; RETHMEIER et al., 1997). Similarmente, íntrons de dicotiledôneas que elevam a
expressão incluem os íntrons dos genes SSU301 de petúnia rbcS (DEAN et al.,
1989), ST-LS1 de batata (LEON et al., 1991) e os genes de Arabidopsis UBQ3,
UBQ10, PAT1, atpk1, A1 EF-1α, e At eEF-1β (CURIE et al., 1993; NORRIS et al.,
1993; ZHANG et al., 1994; GIDEKEL et al., 1996; ROSE e LAST, 1997). Em plantas, a
inclusão de um ou mais íntrons em construções genéticas, geralmente, acarreta o
aumento do acúmulo de mRNA e proteínas comparado a construções similares onde
faltam íntrons (KOZIEL et al., 1996; SIMPSON e FILIPOWICZ, 1996).
Particularmente, o aumento da expressão gênica mediado pelo íntron salT
foi avaliado por RETHMEIER e colaboradores, em 1997. Nesta ocasião, o mecanismo
de IME foi estudado em milho utilizando os genes cat (chloramphenicol acetyl
transferase synthase gene) e bar (bialaphos resistence gene), flanqueados por
seqüências regulatórias idênticas. A inclusão do primeiro íntron do gene salT de
arroz na região 5’ não traduzida de ambos os genes, estimulou a expressão apenas
do gene cat. A presença do íntron salT não aumentou os níveis de proteína e do
mRNA codificados pelo gene bar, indicando que o aumento da expressão mediada
pelo íntron é um processo dependente do gene. Adicionalmente, seus resultados
mostraram que o processo de IME não tem um componente traducional, não tendo
efeito na estabilidade citoplasmática do mRNA de cat em células de milho
cultivadas, sugerindo que o IME atua no núcleo (RETHMEIER et al., 1997). Portanto,
os resultados apresentados pelo presente trabalho, corroboram os estudos prévios,
indicando que o íntron salT possui a habilidade de aumentar a expressão gênica.
Adicionalmente, a partir dos dados gerados pela expressão transiente do
gene GUS em tecidos foliares de A. thaliana tornou-se possível a análise
comparativa dos níveis de expressão obtidos pelos íntrons salT e Act1. Tais estudos
revelaram que o íntron salT apresenta maior capacidade de aumentar a expressão
gênica quando comparado ao íntron da actina de arroz, Act1. Porém, para que tais
hipóteses sejam confirmadas, será necessária a utilização de técnicas mais
sensíveis, como PCR em Tempo Real. Outra abordagem interessante será a
utilização de tecidos foliares de O. sativa para o estudo da expressão do gene GUS.
Desta forma, a identificação da melhor região regulatória consistirá em um sistema
de expressão induzível apropriado para a utilização em engenharia genética de
plantas, a fim de se obter plantas transgênicas tolerantes a estresses abióticos.
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Dissertação de mestrado
5.4 – Análise do perfil transcricional do gene salT em diversos tipos de células e tecidos de O. sativa através de northern eletrônico
O estudo acerca dos sítios de ligação para fatores de transcrição
presentes na região de 256 pb, realizado através de análises in silico utilizando o
banco de dados OSIRIS, revelou a presença de 10 diferentes possíveis locais para
ligação de elementos regulatórios nesta região do promotor salT. Dentre este
resultado, que sugere a forma pela qual o gene é regulado, foi possível observar a
presença de uma única seqüência conservada relacionada à expressão tecido-
específica. Tal sítio, conhecido como “RY Repeat”, tem sido caracterizado em genes
cuja expressão é regulada especificamente em sementes e, portanto, o motivo RY
Repeat é considerado tecido-específico (DICKINSON et al., 1988; BÄUMLEIN et al.,
1992; HATTORI et al., 1992).
O Projeto de Arroz da Universidade de Yale (Yale Rice Project) tem como
objetivo a construção, ainda em andamento, de um banco de dados do perfil
transcricional de todo o genoma de arroz em diversos tipos de células e tecidos
isolados por micro dissecação, o Centro Virtual da Universidade de Yale para o Perfil
de Expressão Celular em Arroz (Yale Virtual Center for Cellular Expression Profiling
of Rice Yale Rice Project: http://bioinformatics.med.yale.edu/riceatlas/overview.jspx).
Uma vez que foi identificada a presença do elemento RY Repeat na região
promotora do gene salT, tornou-se interessante a utilização desta ferramenta de
bioinformática para a análise do perfil transcricional do gene salT nos tecidos de
semente de arroz.
Segundo os resultados obtidos pelos ensaios de microarray desenvolvidos
pelo banco da Universidade de Yale, o gene salT apresenta alto nível de transcrição
em quatro tecidos de embrião de sementes, 12 h após a embebição – escutelo,
coleóptilo, epiblasto e radícula (figura 18). Nas células da plúmula o nível
transcricional do gene salT é baixo. Juntos, o escutelo (que absorve nutrientes do
tecido nutritivo) e o coleóptilo (que envolve e protege a plúmula) formam o
cotilédone, cuja função é transferir reservas alimentares do endosperma da semente
para o embrião até que as raízes e folhas estejam formadas, dando início aos
processos de fotossíntese e respiração. O epiblasto é uma formação de pequenas
dimensões em sementes, tida como um segundo cotilédone rudimentar, e a radícula
é o primórdio da raiz embrionária. O banco ainda não disponibilizou informações
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